CN101429532A

CN101429532A - 利用生物催化生产亚氨基二乙酸的方法

Info

Publication number: CN101429532A
Application number: CNA2008102410170A
Authority: CN
Inventors: 罗晖; 卫海珍; 常雁红; 王春霞; 李宁; 温荔钧
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2008-12-24
Publication date: 2009-05-13

Abstract

本发明公开了一种利用生物催化制备亚氨基二乙酸的方法，具体地，涉及用腈水解酶催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的方法。本发明的方法包括将包含腈水解酶的催化载体在水溶液中搅拌悬浮得到悬浮液；在搅拌下向所述悬浮液中一次性或逐次加入亚氨基二乙腈，使得亚氨基二乙腈的浓度为50－500mmol/L；调节反应体系的pH保持在6.5－9.0，温度保持在20－45℃，经过5－15小时的催化，得到亚氨基二乙酸。所述的包含腈水解酶的催化载体是游离细胞、固定化细胞或固定化酶。本发明的方法反应条件温和，无需加入大量的酸或碱，因而对环境造成的污染非常小，而且还有利于后续的产品分离及应用。

Description

利用生物催化生产亚氨基二乙酸的方法

技术领域

本发明主要涉及一种亚氨基二乙酸的生产方法，特别涉及利用生物催化生产亚氨基二乙酸的方法，尤其涉及利用腈水解酶催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的方法。

背景技术

亚氨基二乙酸(IDA)其分子中含有亚氨基和羧基，化学性质活泼，是一种重要的化工产品，用途广泛。其最大的用途是与三氯化磷、甲醛在酸性条件下反应生成双甘膦，再经浓硫酸或双氧水氧化生产除草剂草甘膦。此外还广泛地用作螯合剂、化工或医药中间体等。

目前，亚氨基二乙酸的生产方法主要有氯乙酸法、氮川三乙酸法和二乙醇胺法等。以上各种方法都有其缺点，普遍都存在污染严重的问题，而且不是收率低、能耗高、生产成本高和反应条件苛刻，就是对设备要求高。

为此，许多研究单位和机构都在开发能耗低、环境友好的IDA合成新工艺。但是，仅通过改进化学法生产工艺无法根本解决化学法生产亚氨基二乙酸对环境造成的污染。

工业上应用比较普遍的是利用亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的工艺，主要采用酸法或碱法进行水解，具有较高的水解转化率，相比其他几种化学法生产亚氨基二乙酸的工艺具有一定的优势。但由于需要用到高浓度的酸或碱，对设备的腐蚀严重，且给后续的产品分离与应用都带来较大困难。

现有的研究表明腈化合物可以由腈水解酶催化水解，且酶法水解具有高效性、高选择性、反应条件温和、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点，符合原子经济型和绿色化学的发展方向，与反应条件苛刻、副产物多、环境污染严重的化学法相比，有着无可比拟的优越性。

现有技术中还没有发现用腈水解酶水解亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的报道。

发明内容

本发明的目的是为亚氨基二乙酸的生产开辟一条新的途径，为此，本发明提出一种利用生物催化生产亚氨基二乙酸的方法，具体地，采用腈水解酶催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸。

具体地，可以通过以下方法来实现。

1、利用生物催化生产亚氨基二乙酸方法，其特征在于，采用腈水解酶催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸。

2、如1所述的方法，包括：

i)将包含腈水解酶的催化载体在水溶液中搅拌悬浮得到悬浮液；

ii)在搅拌下向悬浮液中一次性或逐次加入亚氨基二乙腈，使得亚氨基二乙腈的浓度为50-500mmol/L；

iii)调节反应体系的pH保持在6.5-9.0，温度保持在20-45℃；经过5-15小时的催化，得到亚氨基二乙酸。

3、如2所述的方法，其中所述的包含腈水解酶的催化载体是游离细胞、固定化细胞或固定化酶。

4、如3所述的方法，其中所述的细胞是基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit。

5、如1所述的方法，其中所述的腈水解酶是基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit所产生的。

6、如2所述的方法，其中用盐酸或氢氧化钠调节反应体系的pH。

本发明的方法在温和反应条件下即可以达到高转化率，并能大大减小常规化学生产方法对环境的污染。因此，本方法是一种清洁生产方法，

具体实施方式

以下更详细地介绍本发明的各种实施方式。

1)用于本发明的菌株

作为用于本发明的菌株，本领域技术人员应该知道，能产生腈水解酶的菌株都可以用于本发明中，但是作为详细介绍本发明的例子，列举了基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit(Luo Hui，et al.Appl BiochemBiotechnol.DOI 10.1007/s12010-008-8324-y)。

基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit的培养

培养基：

LBK培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，甘油0.3％，20mM乳糖，卡那霉素50μg/mL，pH7.0)

玉米浆培养基(5％玉米浆，0.017M KH₂PO₄，0.072M K₂HPO₄，0.4％葡萄糖，20mM乳糖，50μg/mL卡那霉素，pH7.5)

培养：在LBK培养基中，37℃，200r/min，对基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit进行培养10h，以4％接种量接种到玉米浆培养基中，30℃，200r/min，培养12h。

收集：10000rpm离心5min收获菌体。

2)游离细胞制备

将菌体用去离子水或磷酸缓冲液重悬得到菌体悬液。

3)固定化细胞的制备

将菌体用去离子水重悬制成菌体浓度为2％的菌悬液100ml，边搅拌边加入1.5g的海藻酸钠，搅拌均匀后，将菌悬液用针筒注射到500ml浓度为2％的CaCl₂水溶液中，形成的海藻酸钙小球的直径为约3-4mm。将烧杯于4℃冰箱中放置24小时，使形成的海藻酸钙小球固化，再用去离子水清洗小球三次，用纱布过滤即得到所需的海藻酸钙的固定化细胞。

4)固定化酶的制备

将菌体用去离子水重悬，超声波破碎菌体。超声的条件是：超声3秒，间隔3秒，99个循环，超声功率200W，共破碎两次。4℃下，10000rpm离心10min，上清液即为腈水解酶酶液。

调节腈水解酶酶液pH7.5，加入共价偶联固定化酶载体VTE(购自南开大学化工厂)，在20℃摇床中振荡24小时。用去离子水清洗三次，真空抽滤得到所需的固定化腈水解酶。

以下通过实施例对腈水解酶催化亚氨基二乙腈生成亚氨基二乙酸的方法进行详细的阐述。

实施例1：游离细胞的催化

将游离细胞悬浮液用HCl或NaOH调节pH8.0，温度保持在20℃，逐次加入亚氨基二乙腈，使得亚氨基二乙腈浓度为70mmol/L，加入HCl控制反应体系pH8.0，同时监测反应体系中亚氨基二乙酸含量的变化，经过13h的连续催化，亚氨基二乙酸的质量浓度累积达到73.2g/L，亚氨基二乙腈的转化率98.5％。

按照实施例1的催化方法，根据表1改变游离细胞催化的催化条件进行了实施例2-4，产物浓度和转化率见表1。

表1

	反应体系pH	反应体系温度(℃)	亚氨基二乙腈初始浓度(mmol/L)	催化时间(h)	亚氨基二乙酸最终浓度(g/L)	转化率％
	反应体系pH	反应体系温度(℃)	亚氨基二乙腈初始浓度(mmol/L)	催化时间(h)	亚氨基二乙酸最终浓度(g/L)	转化率％	实施例1	8.0	20	70	13	73.2	98.5
实施例2	7.0	20	50	5	74.3	98.7	实施例1	8.0	20	70	13	73.2	98.5
实施例2	7.0	20	50	5	74.3	98.7	实施例3	9.0	35	500	15	70.1	96.8
实施例4	6.0	45	200	8	74.5	97.7	实施例3	9.0	35	500	15	70.1	96.8

从表1可知，在本发明的条件下，可以通过腈水解酶游离细胞的催化实现亚氨基二乙腈的高效率转化，产物亚氨基二乙酸的浓度在70g/L以上，转化率高于96％。但在底物亚氨基二乙腈浓度较高的情况下，其转化率有所下降。

实施例5：固定化细胞的催化

在0.05mol/L浓度的pH 6.5磷酸钾缓冲液中加入上述得到的固定化细胞，在35℃下保温，磁力搅拌。逐次加入亚氨基二乙腈，使得亚氨基二乙腈浓度为100mmol/L，加入HCl控制反应体系pH8.0，同时监测反应体系中亚氨基二乙酸含量的变化，经过13h的连续催化，亚氨基二乙酸的质量浓度累积达到118.9g/L，亚氨基二乙腈的转化率98.7％。

纱布过滤得到固定化细胞后，再以相同的条件进行亚氨基二乙腈的催化，经过15h的连续催化，亚氨基二乙酸的质量浓度累积达到106.3g/L，亚氨基二乙腈的转化率97.6％。

按照实施例5的催化方法，根据表2改变固定化细胞催化的催化条件进行了实施例6-8，产物浓度和转化率见表2。

表2

	反应体系pH	反应体系温度(℃)	亚氨基二乙腈初始浓度(mmol/L)	催化时间^*(h)	亚氨基二乙酸最终浓度^*(g/L)	转化率^*％
	反应体系pH	反应体系温度(℃)	亚氨基二乙腈初始浓度(mmol/L)	催化时间^*(h)	亚氨基二乙酸最终浓度^*(g/L)	转化率^*％	实施例5	8.0	35	100	13/15	118.9/106.3	98.7/97.6
实施例6	7.0	20	50	10/12	120.2/115.6	99.2/99.0	实施例5	8.0	35	100	13/15	118.9/106.3	98.7/97.6
实施例6	7.0	20	50	10/12	120.2/115.6	99.2/99.0	实施例7	9.0	35	500	13/15	113.4/104.3	97.6/96.8
实施例8	6.0	45	200	14/15	117.2/102.7	98.3/97.4	实施例7	9.0	35	500	13/15	113.4/104.3	97.6/96.8

^*其中前一数值是第一次催化，后一数值是用回收的固定化细胞进行的第二次催化。

从表2可知，在本发明的条件下，可以通过腈水解酶固定化细胞的催化实现亚氨基二乙腈的高效率转化，产物亚氨基二乙酸的浓度在100g/L以上，转化率高于96％。但在底物亚氨基二乙腈浓度较高的情况下，其转化率有所下降。利用腈水解酶固定化细胞催化，比游离细胞催化积累更高浓度的产物亚氨基二乙酸，且固定化细胞回收后进行第二次催化，产物浓度和转化率也保持较高水平。

实施例9：固定化酶的催化

在0.1mol/L浓度的pH7.5磷酸钾缓冲液中加入一定的固定化腈水解酶，在25℃下保温，磁力搅拌。逐次加入亚氨基二乙腈，使得亚氨基二乙腈浓度为60mmol/L，加入HCl控制反应体系pH8.0，同时监测反应体系中亚氨基二乙酸含量的变化，经过12h的连续催化，亚氨基二乙酸的质量浓度累积达到102.4g/L，亚氨基二乙腈的转化率99.3％。

抽滤得到固定化酶后，再以上述相同的反应条件进行亚氨基二乙腈的催化，经过13h的连续催化，亚氨基二乙酸的质量浓度累积达到102.1g/L，亚氨基二乙腈的转化率99.2％。

按照实施例9的催化方法，根据表3改变固定化细胞催化的催化条件进行了实施例11-12，产物浓度和转化率见表3。

表3

	反应体系pH	反应体系温度(℃)	亚氨基二乙腈初始浓度(mmol/L)	催化时间^*(h)	亚氨基二乙酸最终浓度^*(g/L)	转化率^*％
	反应体系pH	反应体系温度(℃)	亚氨基二乙腈初始浓度(mmol/L)	催化时间^*(h)	亚氨基二乙酸最终浓度^*(g/L)	转化率^*％	实施例9	8.0	55	60	12/13	102.4/102.1	99.3/99.2
实施例10	7.0	20	50	10/12	109.2/105.1	99.5/99.3	实施例9	8.0	55	60	12/13	102.4/102.1	99.3/99.2
实施例10	7.0	20	50	10/12	109.2/105.1	99.5/99.3	实施例11	9.0	35	500	14/15	106.5/105.8	97.6/97.4
实施例12	6.0	45	200	11/10	103.5/103.1	98.4/98.2	实施例11	9.0	35	500	14/15	106.5/105.8	97.6/97.4

从表2可知，在本发明的条件下，可以通过腈水解酶固定化酶的催化实现亚氨基二乙腈的高效率转化，产物亚氨基二乙酸的浓度在100g/L以上，转化率高于97％。利用腈水解酶固定化酶催化，比游离细胞催化具有更高的产物积累浓度和转化率，比固定化细胞催化的产物浓度略低，但转化率更高。且固定化酶回收后进行第二次催化，产物浓度和转化率也保持较高水平。

Claims

2、如权利要求1所述的方法，其中包括：

ii)在搅拌下向所述悬浮液中一次性或逐次加入亚氨基二乙腈，使得亚氨基二乙腈的浓度为50-500mmol/L；

iii)调节反应体系的pH保持在6.5-9.0，温度保持在20-45℃，经过5-15小时的催化，得到亚氨基二乙酸。

3、如权利要求2所述的方法，其中所述的包含腈水解酶的催化载体是游离细胞、固定化细胞或固定化酶。

4、如权利要求3所述的方法，其中所述的细胞是基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit。

5、如权利要求1所述的方法，其中所述的腈水解酶是基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-Nit所产生的。

6、如权利要求2所述的方法，其中用盐酸或氢氧化钠调节反应体系的pH。