CN101412909B - 化学发光增强剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种化学发光增强剂，由对苯二酚和3，5-二叔丁基水杨酸及Tris-HCl缓冲液组成，其中有效成份对苯二酚的用量为1-100mMol/L，3，5-二叔丁基水杨酸的用量为0.1-50mMol/L，Tris-HCl缓冲液的离子浓度为0.1-5Mol/L，pH值为7.5-10。本发明的化学发光增强剂的优点在于使用方便、成本低、对鲁米诺化学发光体系的发光强度与发光持续时间改善显著，可广泛用于临床检验、生物学研究、农林牧业及环境科学中对各种生物大分子与生物小分子的化学发光检测。

Description

化学发光增强剂

技术领域

本发明涉及一种化学发光增强剂，用于改善鲁米诺化学发光体系的发光强度与发光持续时间，应用于化学发光分析技术。

背景技术

化学发光是通过高能中间体的分解在化学反应中激发态分子形成，激发态分子不稳定，当它回到基态时部分能量以发光的形式释放出来。1977年Halman首先将净化学发光应用于免疫分析，建立了化学发光免疫分析技术。化学发光免疫分析技术在现代微量分析技术中，具有灵敏度高、简便快速、线性稳定、安全无害等特点。

鲁米诺(Luminol)、异鲁米诺(Isoluminol)及其衍生物是最早在化学发光法中使用的化学发光物质。鲁米诺化学名3-氨基邻苯二甲酰肼，最早由Albrecht报道其发光特性。这类物质通过氧化产生α-羟基过氧化物的中间体，该中间体的分解可释放出光能，所发光的性质与反应系统的pH值有关。鲁米诺类化合物的氧化步骤与溶剂组分有关，在非质子溶剂中，化学发光只需要氧气和一种强碱；在质子溶剂中，需要酶来催化各种氧的衍生物氧化鲁米诺。鲁米诺体系的发光效率并不高，标记后发光强度会随时间降低，而通过对非杂环进行化学修饰可以提高部分发光强度。

目前已有许多荧光剂用于与双草酸酯及过氧化氢发生反应而产生化学发光，如蒽、二萘嵌苯、罗丹明B、9，10-双苯基蒽、9，10-双苯基乙炔基蒽、5，12-双苯基乙炔基并四苯、6，13-双苯基乙炔基并五苯、二羰酰胺二萘嵌苯及其衍生物等。然而，这些荧光剂化合物发光不稳定，产生的化学发光持续时间很短，同样需要在反应体系中加入增强剂以提高发光强度和发光稳定性，延长发光时间。

化学发光酶免疫分析技术常用的两种标记体系是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，它们有各自的发光底物。不同厂家拥有各自受专利保护的发光底物和增强剂。AP酶发光体系的底物价格昂贵，限制了它的应用，而HRP酶体系具有高转换系数、对不同灵敏度分析系统具有通用性而受到广泛应用。HRP酶体系最常用的发光底物是鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物。不过，如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光为闪光型、强度弱、持续时间短。通过加入增强剂，发光时间明显延长，使其从短暂的闪光型改进为持续时间长的辉光型，明显增强了发光强度和提高了信噪比及灵敏度。提高灵敏度最有效的方法是在反应体系中加入增强剂以提高发光强度。增强剂的种类十分广泛，最初的增强剂包括荧光素、取代酚、萘酚和六羟基苯并噻唑，后来又发现了其它增强剂物质，如芳香胺、取代硼酸、靛酚等。由辣根过氧化物酶(HRP)催化的发光反应可通过加入6-羟基苯并噻唑衍生物类和对酚类物质提高发光强度。后来又发现4-酚硼酸可有效增强HRP的碱性同功酶(VI A型)所催化反应的发光强度。此外，为了增强发光强度，延迟发光时间，有研究者在底物溶液中使用水溶性大分子如牛血清白蛋白(BSA)，表面活性剂如CTAB(溴化十六烷基三甲基铵)和SDS(十二烷基磺酸钠)。

关于发光增强剂的研究，近二十年来许多研究者相继发表了研究论文，一些有关化学发光液增强体系的专利也相应问世，如张雯艳等人的《酶促化学发光的新型增强剂》(中国专利：98125659.7)、杨晓林等的《含辅助增强剂和增强剂的增敏化学发光液》(中国专利：200410057390.2)等。目前市场上不同厂家所销售的化学发光酶检测体系也都拥有各自受专利保护的发光增强剂，这表明专利保护机制使新型增强剂正不断涌现。

为适应科学研究及市场的实际需求，需要不断开发研究出新型的化学发光增强剂，以提供研究者与使用者更多的选择，并增强鲁米诺-过氧化脲化学发光体系的发光强度，延长该化学发光体系的发光持续时间，便于结果的观测。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足及实际需求，提供一种化学发光增强剂，用于增强现有鲁米诺-过氧化脲化学发光体系的发光强度，延长该化学发光体系的发光持续时间，为化学发光酶免疫检测技术的发光体系提供一种新的选择。

为实现上述目的，本发明提供的化学发光增强剂中包含作为有效成份的对苯二酚(p-dihydroxybenzene)和3，5-二叔丁基水杨酸(3，5-Bistertbutylsalicylicacid)，由对苯二酚和3，5-二叔丁基水杨酸及Tris-HCl缓冲液组成，其中对苯二酚的用量为1-100mMol/L，3，5-二叔丁基水杨酸的用量为0.1-50mMol/L，Tris-HCl缓冲液的离子浓度为0.1-5Mol/L，pH值为7.5-10。

本发明的化学发光增强剂，其有效成份对苯二酚和3，5-二叔丁基水杨酸的来源为市售。

本发明的化学发光增强剂，可用于鲁米诺-过氧化脲化学发光体系，增强该体系的发光强度、延长其发光持续时间。该体系分A液与B液保存，A液由化学发光增强剂添加1-5mg/mL鲁米诺构成，B液由含有0.1-2g/mL过氧化脲的Tris-HCl缓冲液构成；所述Tris-HCl缓冲液的离子浓度为0.1-5Mol/L，pH值为7.5-10。

本发明的有效成份为对苯二酚和3，5-二叔丁基水杨酸的化学发光增强剂，具有显著改善鲁米诺-过氧化脲化学发光体系、成本低、易溶于水等特点。经过大量的研究和实践发现，在鲁米诺-过氧化脲化学发光体系中加入本发明的新型化学发光增强剂，可以显著增强鲁米诺-过氧化脲化学发光体系的发光强度，同时显著延长化学发光的持续时间。

本发明可广泛用于以化学发光为检测手段的化学、生物、免疫等检测分析产品中，提高化学发光检测技术的灵敏度及稳定性。

附图说明

图1为加入本发明的化学发光增强剂后，鲁米诺-过氧化脲化学发光体系的发光值随时间的变化曲线图。

具体实施方式

以下结合附图并通过具体的实施例对本发明作进一步描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

实施例1

称取10mMol对苯二酚与1mMol 3，5-二叔丁基水杨酸，定容于1L0.1Mol/L，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，获得浓度为10mMol/L对苯二酚和1mMol/L 3，5-二叔丁基水杨酸的化学发光增强剂。向该化学发光增强剂中加入鲁米诺2.5g，使鲁米诺浓度达到2.5mg/mL，该溶液作为化学发光底物A液置4℃冰箱保存。化学发光底物B液为含有过氧化脲0.4g/mL的0.1Mol/L，pH 7.5Tris-HCl缓冲液，置4℃冰箱保存。临用前将含有鲁米诺及对苯二酚与3，5-二叔丁基水杨酸的化学发光底物A液与含有过氧化脲的化学发光底物B液1∶1混合使用。

实施例2

根据实施例1的化学发光体系(含发光剂鲁米诺、化学发光增强剂及氧化剂过氧化脲)，在加入辣根过氧化物酶之外，可出现化学发光反应，发光值与发光时间可通过化学发光检测仪进行检测。检测结果如图1所示，从图1可知，由对苯二酚与3，5-二叔丁基水杨酸组成的化学发光增强剂有效地增强了鲁米诺-过氧化脲化学发光体系的发光强度、延长了其发光持续时间，在2-150min时间内基本保持了发光强度的稳定性。

实施例3

称取1mMol对苯二酚与0.1mMol 3，5-二叔丁基水杨酸，定容于1L 5Mol/L，pH 10的Tris-HCl缓冲液中，获得浓度为1mMol/L对苯二酚和0.1mMol/L3，5-二叔丁基水杨酸的化学发光增强剂。向该化学发光增强剂中加入鲁米诺5g，使鲁米诺浓度达到5mg/mL，该溶液作为化学发光底物A液置4℃冰箱保存。化学发光底物B液为含有过氧化脲0.1g/mL的5Mol/L，pH10Tris-HCl缓冲液，置4℃冰箱保存。临用前将含有鲁米诺及对苯二酚与3，5-二叔丁基水杨酸的化学发光底物A液与含有过氧化脲的化学发光底物B液1∶1混合使用。

实施例4

称取100mMol对苯二酚与50mMol 3，5-二叔丁基水杨酸，定容于1L0.1Mol/L，pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，获得浓度为100mMol/L对苯二酚与50mMol/L 3，5-二叔丁基水杨酸的化学发光增强剂。向该化学发光增强剂中加入鲁米诺2g，使鲁米诺浓度达到2mg/mL，该溶液作为化学发光底物A液置4℃冰箱保存。化学发光底物B液为含有过氧化脲0.5g/mL的0.1Mol/L，pH 8.0Tris-HCl缓冲液，置4℃冰箱保存。临用前将含有鲁米诺及对苯二酚与3，5-二叔丁基水杨酸的化学发光底物A液与含有过氧化脲的化学发光底物B液1∶1混合使用。

Claims (2)

1.一种化学发光增强剂，其特征在于由对苯二酚和3，5-二叔丁基水杨酸及Tris-HCl缓冲液组成，其中有效成份对苯二酚的用量为1-100mMol/L，3，5-二叔丁基水杨酸的用量为0.1-50mMol/L，Tris-HCl缓冲液的离子浓度为0.1-5Mol/L，pH值为7.5-10。

2.一种采用权利要求1所述化学发光增强剂的鲁米诺化学发光体系，其特征在于由A液与B液组成，A液由所述化学发光增强剂添加1-5mg/mL鲁米诺构成，B液由含有0.1-2g/mL过氧化脲的Tris-HCl缓冲液构成；所述Tris-HCl缓冲液的离子浓度为0.1-5Mol/L，pH值为7.5-10。

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