CN101405027A - 基于病毒颗粒的鼻内流感疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了流感病毒颗粒的组合物，所述病毒颗粒包含所述病毒的重构包膜，其中所述病毒包膜完全从流感病毒粒获得，其中没有从外源向重构病毒颗粒加入脂类，其中病毒颗粒包含流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物，其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂，并且其中所述组合物作为鼻内或吸入给药制剂来设计，所述组合物特征在于所述制剂向人类的单次鼻内或吸入给药足以诱导抵抗所述流感抗原的全身性免疫应答和/或局部免疫应答和/或细胞毒性淋巴细胞应答，所述全身性应答能符合针对流感疫苗的CHMP标准，并且其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素剂量等于或低于30μg。本发明还提供了重构的流感病毒颗粒用于制备所述组合物的用途，以及由此制备的疫苗制剂。

Description

基于病毒颗粒的鼻内流感疫苗
发明领域
本发明涉及，例如，用于灭活流感疫苗的组合物以及给药方式，其中，单次鼻内或吸入给药获得了与临床保护正相关的全身性免疫应答。
发明背景
通过鼻内或口咽途径及使用灭活流感抗原针对流感进行免疫的多种设想已作为皮下或肌肉内免疫的非注射(无针头needle-less)替代途径被研究。已在动物模型中产生了支持非注射手段的实验数据。得到动物数据支持的、使用灭活流感抗原(例如化学方式灭活的完整病毒粒子，或者被进一步加工的病毒组分，例如被切开的病毒，或者经纯化的表面抗原血细胞凝集素(HA)和/或神经氨酸酶(NA))经鼻内途径进行免疫的思路包括：使用佐剂或免疫刺激剂(immunestimulator)与灭活流感抗原组合，或者需要多次免疫。佐剂是能增强与其混合的抗原的免疫原性的任何物质。在人类中，通过鼻内途径抵抗流感的成功疫苗接种仅报道过：(a)活的(冷适应性的株)流感疫苗(FluMistTM，MedImmune Vaccines Inc)(参考文献1、2、3)，(b)病毒颗粒型流感疫苗，其佐有大肠杆菌(E.coli)的热不稳定毒素(NasalFlu，Berna Biotech Ltd)(参考文献4)或(c)使用高剂量抗原并且重复疫苗接种(参考文献5、10、11)。虽然活疫苗能诱导满意的免疫应答，但其能变成活病毒的特定性质带来了额外的安全顾虑，而且由于需要在上呼吸道附近的病毒复制，因此有可能会诱导出副作用。此外，所需的贮藏条件也限制了这些产品的商业化。使用大肠杆菌HLT作为佐剂的鼻内流感疫苗与面瘫(Bell’s Palsy)之间的强烈相关性导致佐有HLT的病毒颗粒疫苗从市场撤出(参考文献6)。
流感疫苗在给定人群中的疗效可通过下述方法来评估：评定与接种后产生的抗流感抗体的数量相关的免疫原性参数。这些免疫原性参数通常被称为CHMP标准，其用于对灭活流感疫苗进行每年重新许可认证(参考文献7)。至今为止，通过使用灭活疫苗的一次单次鼻内施予，不加佐剂(其是疫苗中的附加成分，其不来自将用疫苗来预防的感染性试剂，并且是为了增强对抗原的免疫应答的目的被加入到疫苗制剂中)，就符合这些免疫学要求或者CHMP标准(参考文献7)的、对人类抵抗流感的成功免疫尚未有记载。因此，人们认识到，在本领域中仍有对下述灭活流感疫苗组合物的需求，所述组合物能在单次鼻内给药之后诱导满意的全身性免疫反应，并且不含佐剂，且通过所述单次给药能符合CHMP标准(参考文献7)。
所述“CHMP标准”按照下文所述被定义。在CHMP(Committee forMedicinal Products for Human Use)的Note for Guidance onHarmonisation of Requirements for Influenza Vaccines中，定义了下述血清学参数，以评定灭活流感疫苗的免疫原性：
-血清保护率，其中血清保护被定义为红血球凝聚抑制(Haemagglutination Inhibition，HI)效价≥40，
-血清转化率，其中血清转化被定义为接种前HI效价＜10，接种后HI效价≥40，或者，接种前HI效价≥10以及HI效价至少4倍的增加，
-平均倍数增加值，这是对受试者内增加的几何平均值(即，接种后HI效价/接种前HI效价)。
针对流感疫苗免疫原性的CHMP要求是：对于疫苗中三种病毒株中的每种而言，符合下述标准中的至少一项：
  标准   成年人   老年人
  血清保护率   ＞70％   ＞60％
  血清转化率   ＞40％   ＞30％
  平均倍数增加值   ＞2.5   ＞2.0
本发明还适用于儿童，从他们显示出，他们以与成年人相当的方式作出免疫应答(参考文献8)。本发明还适用于老年受试者。老年人为超过60岁的。
发明描述
令人吃惊地，与临床前啮齿类数据和关于人类临床经历的文献相反，我们发现，对于18-60岁年龄组而言，用包含重构流感病毒包膜的灭活流感疫苗进行单次鼻内接种后，人类的免疫应答符合针对流感疫苗疗效的全部三个CHMP标准。一次单次鼻内施予是：为符合针对灭活流感疫苗免疫原性的上述CHMP标准，通过一个或两个鼻孔进行疫苗制剂的接种，而无需重复施予疫苗制剂。一次单次疫苗施予(通过鼻、吸入、口服、皮下或肌内途径)通常是下述接种安排，其不包括：在本领域作为初次(priming)和强化(boosting)而已知的、以数天或数周的时间间隔对疫苗的多次施予。被设计为鼻内或吸入给药制剂的制剂包含一种或多种活性组分和赋形剂的混合物，是按照允许鼻内或吸入给药的方式制备的。本发明提供了一种方法，用于诱导符合CHMP标准的全身性免疫应答(循环的免疫球蛋白或产生抗体的B细胞)，有利地，所述方法用对病毒颗粒流感疫苗的单次鼻内或吸入给药来进行。本发明还提供了一种方法，用于诱导局部或粘膜免疫应答，所述应答包括粘膜膜表面上作为IgA已知的分泌免疫球蛋白的增加，有利地，所述方法用对病毒颗粒流感疫苗的单次鼻内或吸入给药来进行。鼻内施予之后对特异性IgG和IgA应答的诱导涉及鼻腔中淋巴组织的活性(参考文献12)。此类组织作为鼻相关淋巴组织(NALT)已知，其还被显示为用于细胞免疫应答的粘膜诱导位点(参考文献13)。因为已知病毒颗粒具有诱导细胞内免疫应答的可能性(参考文献14、15)，因此本发明还提供了诱导特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)的方法。
病毒颗粒(virosome)是含有病毒糖蛋白的脂质双层。通常通过用去垢剂从带包膜病毒提取膜蛋白和脂类，接着通过除去所述去垢剂来重构特征性双层来生产病毒颗粒。本发明还提供了流感病毒颗粒的组合物，其包含重构的流感病毒包膜(具体而言，不再加脂类，并且不加免疫刺激剂(通常称为佐剂)的免疫调节剂而重构)，用于通过气溶胶进行接种，所述气溶胶通过一个或两个鼻孔施予鼻咽或口咽的粘膜，以获得抵抗流感的全身性和局部免疫性。通过吸入进行的单次施予也是可行的。单次口服粘膜施予也是可行的。
可从灭活病毒来制备重构流感病毒颗粒，可以用不可透析的去垢剂对灭活病毒加以溶解，通过吸附到疏水珠粒上来除去所述去垢剂。制备物可包含一种或多种流感抗原的经过纯化的悬浮液，所述流感抗原选自血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、血细胞凝集素的衍生物和神经氨酸酶的衍生物。可以在病毒脂类(含有低水平的内毒素和卵清蛋白)构成的膜中，对病毒膜蛋白血细胞凝集素和神经氨酸酶进行重构(见参考文献9)。血清凝集素和/或神经氨酸酶的衍生物是具有经修饰的氨基酸序列和/或结构的血细胞凝集素和/或神经氨酸酶分子。氨基酸可例如被删除、替换或添加到序列中。此外，糖基化方式可被改变。衍生物保留有导入宿主时诱导免疫应答的能力。
可在例如含有胚胎的鸡蛋中，或在附着的细胞或悬浮液中的细胞的细胞培养物中培养用于制备重构病毒颗粒的流感病毒。病毒例如可以是野生型的或重配的(reassortant)或经过遗传修饰的株。病毒类型可例如是任何流感A或B亚型，包括流行性的株。
本发明还提供疫苗。术语疫苗应被理解为具有免疫活性的药物制备物。在某些实施方式中，疫苗可包含病原性微生物的无害变体或衍生物，例如，刺激免疫系统产生针对真实病原体的抵抗。在某些实施方式中，当疫苗施予宿主时例如能诱导适应性免疫。疫苗可含有病原体或病原体组分的已死亡或削弱形式，例如病原体的抗原性组分。疫苗制备物可还含有药物载体，所述药物载体可针对疫苗将被施予的特定模式加以设计，例如针对鼻内或吸入给药设计的药物载体。流感疫苗可包含一种或多种未变性流感抗原，其一种或多种能诱导流感特异的免疫应答。
本发明提供了含流感病毒颗粒的组合物，所述流感病毒颗粒包含所述病毒的重构包膜，其中所述组合物被设计为鼻内或吸入给药制剂。本发明还提供了其中病毒颗粒包含流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物的所述组合物。本发明还提供了其中病毒包膜完全从病毒粒子获得的所述组合物。本发明还提供了其中没有脂类从外源向重构病毒颗粒加入的所述组合物。本发明还提供了其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂的所述组合物。本发明还提供了其中对受试者的单次鼻内或吸入给药能诱导全身性免疫应答的所述组合物。本发明还提供了其中对受试者的单次鼻内或吸入给药还能诱导局部免疫应答的所述组合物。本发明还提供了对受试者的单次鼻内或吸入给药还能诱导细胞毒性淋巴细胞应答的所述组合物。本发明还提供了其中在人类中显示诱导全身性免疫应答和/或局部免疫应答和/或细胞毒性淋巴细胞应答的能力的所述组合物。本发明还提供了其中免疫应答包含针对流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物的免疫应答的所述组合物。在一种优选的实施方式中，本发明还提供了其中免疫应答符合用于流感疫苗的CHMP标准的所述组合物。本发明还提供了其中免疫应答提供下述中的一种或多种的所述组合物：对成年人而言＞70％和/或对老年人而言＞60％的血清保护率，针对成年人＞40％和/或针对老年人＞30％的血清转化率，以及针对成年人＞2.5和/或针对老年人＞2.0的平均倍数增加。在一种特别优选的实施方式中，本发明还提供了其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素剂量等于或低于30μg的所述组合物。最后，本发明还提供了其中组合物是包含用于鼻内或吸入给药的药物载体的疫苗制剂的所述组合物。
本发明还提供了包含所述病毒的重构包膜的流感病毒颗粒用于制备用于鼻内或吸入给药的组合物的用途。本发明还提供了这样的所述用途：其中，流感病毒颗粒包含流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物。本发明还提供了这样的所述用途：其中病毒包膜完全从流感病毒粒子获得。本发明还提供了这样的所述用途：其中没有脂类从外源加入到重构病毒颗粒。本发明还提供了这样的所述用途：其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂。本发明还提供了这样的所述用途：其中向受试者的单次鼻内或吸入给药足以诱导全身性免疫应答。本发明还提供了这样的所述用途：其中向受试者的单次鼻内或吸入给药还诱导局部免疫应答。本发明还提供了这样的所述用途：其中向受试者的单次鼻内或吸入给药还诱导细胞毒性淋巴细胞应答。本发明还提供了这样的所述用途：其中接受给药的受试者是人类。本发明还提供了这样的所述用途：诱导的免疫应答包含针对流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物的免疫应答。在一种优选的实施方式中，本发明还提供了这样的所述用途，其中组合物诱导符合针对流感疫苗的CHMP标准的免疫应答。本发明还提供了这样的所述用途，其中免疫应答提供下述中的一种或多种：对成年人而言＞70％和/或对老年人而言＞60％的血清保护率，针对成年人＞40％和/或针对老年人＞30％的血清转化率，以及针对成年人＞2.5和/或针对老年人＞2.0的平均倍数增加。在一种特别优选的实施方式中，本发明还提供了这样的所述用途，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的施予剂量等于或低于30μg。最后，本发明还提供了其中制备的组合物是疫苗制剂的所述用途。
因此，在一种实施方式中，本发明提供了包含所述病毒的重构包膜的流感病毒颗粒的组合物，其中所述病毒包膜完全从流感病毒粒子获得，其中没有从外源向重构病毒颗粒加入脂类，其中病毒颗粒包含流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物，其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂，以及其中所述组合物作为鼻内或吸入给药制剂来设计，所述组合物特征在于所述制剂向人类的单次鼻内或吸入给药能诱导抵抗所述流感抗原的全身性免疫应答和/或局部免疫应答，所述全身性应答能符合用于流感疫苗的CHMP标准，以及其中，每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素剂量等于或低于30μg。
根据另一种实施方式，本发明提供了包含所述病毒的重构包膜的流感病毒颗粒用于制备用于鼻内或吸入给药的组合物的用途，其中所述病毒包膜完全从流感病毒粒子获得，其中没有从外源向重构病毒颗粒加入脂类，其中病毒颗粒包含流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物，其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂，所述流感病毒颗粒用于制备用于鼻内或吸入给药的组合物的用途的特征在于，所述组合物向人类的单次鼻内或吸入给药足以诱导抵抗所述流感抗原的全身性免疫应答和/或局部免疫应答，所述应答能符合针对流感疫苗的CHMP标准，以及其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素剂量等于或低于30μg。
根据另一种实施方式，本发明提供了一种包含流感病毒颗粒的组合物的疫苗制剂，所述病毒颗粒包含所述病毒的重构包膜，其中，所述病毒包膜完全从流感病毒粒子获得，其中没有从外源向重构病毒颗粒加入脂类，其中病毒颗粒包含流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物，其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂，其中疫苗特征在于针对向人类的单次鼻内或吸入给药来设计疫苗，并且，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素剂量等于或低于30μg。有利地，所述制剂的所述单次鼻内或吸入给药能在所述人类中诱导全身性和/或局部免疫应答。根据本发明还提供了包含一定量的用于单次鼻内或吸入给药的所述疫苗制剂的装置。
每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的根据本发明的应用剂量还可以低于或等于25μg、20μg、15μg、10μg或5μg。
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实施例
实施例1在8周龄的BALB/C小鼠中的LPP病毒颗粒疫苗；次优HA剂量水平上，对多种HA/LPP比例的鼻内比较
流感血清阴性雌性Balb/c小鼠组成的组(每组10只)通过鼻内施予获得LPP(脂肽)-病毒颗粒疫苗，其HA/LPP比例为1∶1.5、1∶0.7、1∶0.4、1∶0(即没有LPP)，并且每份剂量具有2μg的HA。此外，10只雌性小鼠的对照组接受0μg HA/剂量(载体的鼻内施予)。
制备含有LPP的病毒颗粒的四种制备物。简言之，通过离心对30-40％蔗糖溶液中的灭活流感病毒进行沉淀。重新悬浮病毒，溶解于含有去垢剂八聚乙二醇单十二烷基醚(Octaethylene glycolmonododecyl ether)(OEG)的缓冲液中。随后，通过超离心除去病毒核壳体。将含有OEG的上清液分为4等分体积，加入不同量的含OEG缓冲液中的脂肽P3CSK4(P3CSK4：N-棕榈酰-S-[2，3-双(棕榈酰氧)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨酰-[S]-丝氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酸)。用含OEG的缓冲液调节体积。通过吸附到疏水树脂上除去OEG。这导致了含LPP的病毒颗粒的形成，一种在它们膜中含有HA和NA以及(可选地)在它们膜中含有LPP的重构的病毒小泡。OEG去除之后，将病毒颗粒经孔径为0.22μm的PVDF膜过滤。
起始原料为20mg的HA，其来自甲型流感/Wyoming/3/2003X-147(类A/Fujian/411/200(H3N2)株)，含有252I.U.内毒素/100μg HA。溶解后，按照表1所概述的制备4批。
表1病毒颗粒的制备
  批次   作为起始原料的HA的量(mg)   加入的P3CSK4的量(mg)   HA/LPP比例
  VIR-2004-11   5   7.5   1∶1.5
  VIR-2004-12   5   3.5   1∶0.7
  VIR-2004-13   5   2.0   1∶0.4
  VIR-2004-14   5   0   1∶0
载体由5mM Hepes、145mM NaCl、1mM EDTA(pH 7.4)构成。对组E(见表2)来说，将载体经孔径为0.22μm的PVDF膜过滤。按照表2所述，针对鼻内免疫，将制备的4批病毒颗粒稀释至200μg/ml的浓度，针对肌内免疫，稀释至67μg/ml的浓度，分装进1ml的小瓶(每组2瓶)。按照表4所概述的来使用这些疫苗组。
表2疫苗的制备
  组号   制备
  A   VIR-2004-11
  B   VIR-2004-12
  C   VIR-2004-13
  D   VIR-2004-14
  E   载体*
*载体：经孔径为0.22μm的PVDF膜的5mM Hepes、145mM NaCl、1mM EDTA(pH 7.4)过滤。
对制剂的分析
针对表3所示的若干种变量来分析用于本研究的制剂。
表3对于用于制备疫苗的病毒颗粒的分析数据
  待分析物   VIR-2004-11   VIR-2004-12   VIR-2004-13   VIR-2004-14
  蛋白质(mg/ml)a   1.7   1.6   1.5   1.4
  HA(μg/ml)b   776   759   697   757
  磷脂(mmol/l)c   0.658   0.692   0.658   0.682
  内毒素(每100μg HA的I.U.)d   3.1   1.5   1.9   1.0
  卵清蛋白(每100μg HA的μg)e   0.047   0.050   0.055   0.050
  纯度f   主要是HA   主要是HA   主要是HA   主要是HA
aLowry试验，原理：用碱式硫酸铜和Folin-ciocalteu酚试剂处理之后，蛋白质形成蓝色。使用白蛋白BSA标准作为参考，从750nm处的吸光度来测定蛋白质含量。
Lowry，OH，NJ Rosebrough，AL Farr，and RJ Randall.J.Biol.Chem.193：265.1951.
Oostra，GM，NS Mathewson，and GN Catravas.Anal.Biochem.89：31.1978.
Stoscheck，CM.Quantitation of Protein.Methods inEnzymology 182：50-69(1990).
Hartree，EF.Anal Biochem 48：422-427(1972).
bPhEur：专题文章2053和2.7.1节
c原理：每个磷脂含有单个磷原子，其可用于对磷脂进行定量。通过高氯酸来破坏磷脂，通过钼酸盐络合产生的磷酸盐/酯，钼酸盐被抗坏血酸还原产生蓝色的产物。用分光光度计在812nm处测定颜色。通过包括磷酸校准物来对样品中磷脂的量加以定量。
Ames BN.Assay of inorganic phosphate，total phosphate andphosphatases.Meth.Enzymol.1966；8：115-118
Figure A20078001021700171
CJF，van Gent CM & Pries C.A rapid and sensitivesub-micro phosphorus determination.Anal.Chim.Acta 1961；24：203-204
dPh.Eur.2.6.14
e卵清蛋白ELISA是直接的三明治式酶免疫方法，其中使用用于捕捉的固定的多克隆抗卵清蛋白抗体以及抗卵清蛋白-HRP结合物作为检测系统。对结合物和样品进行同时培养。通过洗涤步骤去除未结合的组分。将底物(TMB和H2O2)加入到孔中。通过蓝色的显色来指示孔中特异性结合的结合物的存在。向底物中加入硫酸来终止反应，其导致产物中颜色变化为黄色。在450nm读取吸光度(OD)。为获得最优结果，在620nm处使用参照滤光器。从试验中包括的卵清蛋白标准(0.3-20.0ng/ml)的应答来建立标准曲线。未知样品的浓度从标准曲线内插来读取。
f根据专题文章0869和2053：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来检查单价合并的(monovalent pooled)收集物的纯度。电泳：按照Ph.Eur2.2.31来进行。
测试系统
测试动物
使用七组动物，每组十只雌性Balb/c小鼠(BALB/cAnNCrl)。
在处理的一开始，小鼠为8-9周龄，重量为17-19g。
在第0天和第14天用单价LPP病毒颗粒流感疫苗(A/Wyoming)对动物进行鼻内接种，在第二次接种后21天进行尸体检查。
鼻内：在背部轻度异氟烷/O2/N2O麻醉的动物中鼻内接种测试物质(10μl，分成两个鼻孔上进行)。
表4处理安排
  组号   施予途径   疫苗制剂   雌性编号   动物编号
  A   鼻内   2μg HA，HA/LPP比例为1∶1.5   10   01-10
  B   鼻内   2μg HA，HA/LPP比例为1∶0.7   10   11-20
  C   鼻内   2μg HA，HA/LPP比例为1∶0.4   10   21-30
  D   鼻内   2μg HA，HA/LPP比例为1∶0   10   31-40
  E   鼻内   2μg HA，HA/LPP比例为0∶0   10   41-50
在第一次接种之前以及第一次接种14天之后，在异氟烷/O2/N2O麻醉下收集眼窝血样。第35天，处死动物，收集血样(在O2/CO2麻醉下通过腹部大动脉或心脏穿刺放血)。收集来自全部样品的血清，深度冷冻，于低于-10℃贮存在聚丙烯管中直到进行处理。
流感病毒使红血球细胞(RBCs)凝集，在存在足够的病毒特异性抗体时这会被阻止。该现象提供了血细胞凝集抑制(HI)试验的基础，该试验被用于探测和定量血清中的特异性抗病毒抗体。将血清加入到流感病毒和火鸡RBCs中。对若干稀释液加以测试(效价分析)。HI效价被定义为仍能抑制血细胞凝集的最高稀释度的倒数。按下文所述来计算几何平均值效价(GMT)：
1)对各个log(效价)进行计算，得到两次重复的算术平均值：
[log(效价1)+log(效价2)]/2
2)计算各个log(效价)的算术平均值
3)GMT(组)＝10EXP(组平均值log(效价))
统计学分析
通过接种组和天数，使用几何平均值效价来概括HI效价。通过线性回归来分析经log转化的第35天组的HI效价，以研究疫苗中LPP的量与GMT之间的剂量应答关系。
结果
HI效价分析
GMT示于表5中。
表5几何平均值效价
  组   施予途径   HA/LPP比例  第0天   第14天   第35天
  A   鼻内   1∶1.5  5   8   415
  B   鼻内   1∶0.7  5   6   161
  C   鼻内   1∶0.4  5   7   97
  D   鼻内   1∶0  5   7   12
  E   鼻内   0∶0  5   5   5
第0天，在小鼠中不能探测到HA特异性抗体(即，所有HI效价＜10)。
第14天，在通过鼻内途径(i.n.)接种的小鼠中的大多数中不能探测到HA特异性抗体。所有效价≤10，除了组A中的一只小鼠(HI效价：80)、组C中的一只小鼠(HI效价：35)和组D中的一只小鼠(HI效价：160)之外。
第35天，观察到了HA特异性抗体产生中的剂量应答，即，向疫苗中加入更多的LPP导致更高的抗体效价。
通过线性回归在组间比较(经log转换的)第35天的HI效价。拟合的回归斜率有高度显著差异(P＜0.0001)。因此，观察到的疫苗中的LPP含量与GMT之间的剂量应答关系在统计上是显著的。
结论：
用无佐剂的重构流感病毒颗粒对小鼠进行重复鼻内接种不诱导可被测量到的全身性免疫应答。以同样HA剂量水平(2μg HA/剂量)，采用上升的LPP剂量，用佐以LPP的重构流感病毒颗粒进行的重复鼻内接种显示出了LPP剂量依赖型免疫应答。与本发明完全相反(见下面的实施例2)，这些数据之前被认为支持本领域的公认结论，即，使用免疫刺激剂(在这种情况下LPP)对于用灭活流感疫苗进行鼻内接种是必要的，即使流感抗原(HA)存在于重构病毒颗粒中。
实施例2双盲、随机、平行的组研究，以研究脂肽佐剂的安全性及其对于病毒颗粒亚基流感疫苗疗效的效果(在年龄≥18和≤40的健康年轻成年人中鼻内运送之后)
用含有每株150mcg HA/mL和315mcg LPP/mL的、佐有LPP(脂肽)的重构流感病毒颗粒以0.2ml的剂量体积(每个鼻孔0.1ml)对健康人类志愿者进行鼻内接种。用含有每株150mcg HA/mL的、没有LPP的重构流感病毒颗粒以0.2ml的剂量体积(每个鼻孔0.1ml)对类似的组进行鼻内接种。研究目的是在男人中验证小鼠中展示的观点，即，为在用灭活流感疫苗进行鼻内接种后获得满意的全身性免疫应答，需要使用佐剂(例如LPP)。
研究设计：
这是在年龄≥18和≤40的健康年轻受试者中进行的双盲、随机平行组研究。该研究在一个研究中心进行：Swiss Pharma Contract Ltd.，瑞士巴塞尔。主要的研究者是M.Seiberling博士。研究具有两个部分。在部分I中，在12名受试者中评定佐有LPP的病毒颗粒亚基流感疫苗的安全性。用LPP-RVM(LPP重构的病毒膜；流感疫苗-表面抗原，灭活的，病毒颗粒-佐有LPP)接种九名受试者，用RVM(流感疫苗-表面抗原，灭活的，病毒颗粒-)来接种三名受试者。在研究的部分II中，在一百名受试者中(每组50名)评定LPP-RVM的疗效和安全性。
研究在健康受试者中进行。此外，在研究开始前三年期间，参与研究的部分II的受试者都没有针对流感进行接种。这通过尽量减小具有预先存在的针对流感的抗体的受试者的数目，增加了部分II中研究人群的均一性。
部分I：
在接种前14天(第1次访问)，在所述受试者已经给出知情同意后，针对包括和排除标准对他或她加以筛选，并对他或她进行身体检查。在该次就诊中，采集鼻上皮细胞的样品用于细胞学分析，用糖精试验来测量基线纤毛(cilia)活性。
在第2次就诊(第1天)，取4-6mL血样，用于标准血液学分析，取6-10mL血样用于标准生物化学分析，并评定生命体征。经过随机化后，用两种疫苗制剂之一来接种受试者，在接种之后受试者就地停留第一个24小时，以监测立即产生的局部和全身性反应以及不良事件。在接种后第四和二十四小时评定生命体征。此外，24小时后，取两份血样用于标准血液学(4-6mL)和生物化学(6-10mL)分析；接种后，采集鼻上皮细胞的样品用于细胞学分析，用糖精试验进行接种后纤毛活性分析。向受试者发放调查问卷(调查问卷I)，让他们带回家，评定下一天(第3天)的局部和全身性反应。
受试者必须在他们被释放回家后两周回到研究点：第3次就诊(第4天)。在该次就诊中，评定局部和全身性反应，记录前次和本次就诊之间发生的任何自发不良事件。此外取两份血样用于标准血液学(4-6mL)和生物化学(6-10mL)分析，并评定生命体征。
在第一次接种后两周，在第15天，所述受试者回到研究点(第4次访问)。在该次就诊中，收集鼻上皮细胞的样品用于细胞学分析，用糖精试验测量纤毛活性，记录第3次就诊和第4次就诊间发生的不良事件。
部分II：
在第一次采血和鼻洗出物(wash)采样前14天(第1次访问)，在所述受试者已经给出知情同意后，针对包括和排除标准对他或她加以筛选，通过身体检查来检测他或她的健康。
在第2次就诊(-1天；该就诊可以与第1次就诊合并进行)，取6-10mL血样用于基线血细胞凝集抑制(HI)效价测定，并且取血样进行标准血液学(4-6mL)和标准生物化学(6-10mL)分析。收集鼻洗出物样品用于测定基线鼻IgA抗体效价。
下一天，在第3次就诊(第1天)，在对生命体征的评定之后，对所述受试者进行随机化，用鼻流感疫苗的两种制剂之一的单一剂量进行接种。在接种后的第一个小时中，就地监测任何立即的局部反应、全身性反应和不良事件。之后，重新评定生命体征，受试者获得调查问卷带回家，在接种后的第一个七天，记录每天的局部和全身性反应。
两周后(第4次就诊；第15天)，取6-10mL血样用于HI效价测定，取两份额外血样用于标准血液学(4-6mL)和生物化学(6-10mL)分析，取鼻洗出物样品用于鼻IgA抗体效价分析。
效果评定
为评定效果，在第-1天(基线)和第15天收集血样和鼻洗出物样品。
血样
收集6-10mL血，以测定血细胞凝集抑制(HI)抗体效价。1血液收集和凝固之后(室温下至少30分钟)，分离血清，并保持冷冻(-20℃)，直到进行效价分析。以双份重复进行抗体效价分析。样品的效价是两次测定的几何平均值。接种前和接种后的血清被同时进行效价分析。
鼻洗出物样品
为收集鼻洗出物样品，于一个鼻孔，在鼻镜检查控制下，应用6mL预热的盐水(37℃)。所述受试者被要求将头倾60°角，使得洗液可以流动。收集的洗液应用于第二个鼻孔，其在相同的条件下被洗涤。向样品中加入防腐溶液(样品体积的1/100)。防腐溶液含有10mg/ml溶解于100mM Tris HCl缓冲液中的牛血清白蛋白，pH 8。通过低速离心(800xg，10分钟)来直接澄清样品，将其分为小份(以避免今后对样品的重复解冻)，将其放置在干冰上，直到转移进-80℃。
通过ELISA来测定鼻洗涤样品中的IgA水平，用Wilcoxon试验来进行统计分析。流感疫苗在96孔板中被用作包被抗原。通过与封闭缓冲液一起温育来封闭非特异性结合位点。将鼻洗出物以封闭缓冲液两
——————————
1 Palmer DF，Dowdle WR，Coleman MT，Schild GC.血细胞凝集反应抑制实验.用于流感诊断的先进的实验室技术.U.S.Dept.Hlth.Ed.Welfare，P.H.S.Atlanta；1975：25-62
倍稀释(每份样品12份稀释液)，用于将流感特异性抗体吸附到96孔板的抗原上。在与酶结合的抗人抗体(结合有马辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)一起温育之前对96孔板加以洗涤。通过洗涤除去未结合的抗人抗体，通过在加入用于酶反应的底物之后测量光密度来测定流感株特异性抗体的量。
疫苗制剂
两种不同的流感疫苗制剂用于本项研究。两种制剂都含有WHO为2005年南半球推荐的病毒抗原2，其剂量水平为每0.2ml的剂量每株30mcg。
-A/New Caledonia/20/99/(H1N1)样株
-A/Wellington/1/2004(H3N2)样株
-B/Shanghai/361/2002样株
简言之，通过离心对30-40％蔗糖溶液中的灭活流感病毒进行沉淀。重新悬浮病毒，溶解于含有去垢剂，八聚乙二醇单十二烷基醚(OEG)的缓冲液中。随后，通过超离心除去病毒核壳体。用含OEG缓冲液中的脂肽P3CSK4来调节含OEG的上清液，或者在不含LPP的重构病毒膜的情况下，仅用含OEG的缓冲液来调节(P3CSK4：N-棕榈酰-S-[2，3-双(棕榈酰氧)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨酰-[S]-丝氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酸)。通过吸附到疏水树脂上除去OEG。这导致了含LPP或不含LPP的病毒膜(在膜中含有HA和NA以及可选地在膜中含有LPP的重构病毒小泡)的形成。OEG去除之后，将病毒颗粒经孔径为0.22μm的PVDF膜过滤。
对于病毒的每种株而言，制备具有或不具有LPP的单独的制备物(表6)。加入的LPP的量相应于1∶0.7(w/w)的HA/LPP比例。
————————————
2 WHO推荐的用于2005年流感季节的流感病毒疫苗组合物.Weeklv Epidem Rec.2004；79：369-376
表6病毒颗粒的制备
  批次   LPP   病毒株
  VIR-2005-09   存在   乙型流感/Jiangsu/10/2003
  VIR-2005-11   存在   甲型流感/New Caledonia/20/1999IVR-116重配株
  VIR-2005-13   存在   甲型流感/Wellington/1/2004IVR-139重配株
  VIR-2005-10   不存在   乙型流感/Jiangsu/10/2003
  VIR-2005-12   不存在   甲型流感/New Caledonia/20/1999IVR-116重配株
  VIR-2005-14   不存在   甲型流感/Wellington/1/2004IVR-139重配株
表7对制剂的分析
  待分析物   VIR-2005-09   VIR-2005-10   VIR-2005-11   VIR-2005-12   VIR-2005-13   VIR-2005-14
  蛋白质(mg/ml)a   1.51   1.54   1.86   1.83   1.37   1.18
  HA(μg/ml)b   805   854   711   784   704   644
  磷脂(mmol/l)c   0.494   0.563   0.820   1.03   0.717   0.695
  内毒素(每100μgHA的I.U.)d   ＜0.4   ＜0.4   ＜0.4   ＜0.4   ＜0.4   ＜0.5
  卵清蛋白(每100μg HA的μg)e   0.068   0.088   0.037   0.036   0.132   0.126
  纯度f   主要是HA   主要是HA   主要是HA   主要是HA   主要是HA   主要是HA
aLowry试验，原理：用碱式硫酸铜和Folin-ciocalteu酚试剂处理之后，蛋白质形成蓝色。使用白蛋白BSA标准作为参考，从750nm处的吸光度来测定蛋白质含量。
Lowry，OH，NJ Rosebrough，AL Farr，and RJ Randall.J.Biol.Chem.193：265.1951.
Oostra，GM，NS Mathewson，and GN Catravas.Anal.Biochem.89：31.1978.
Stoscheck，CM.Quantitation of Protein.Methods inEnzymology 182：50-69(1990).
Hartree，EF.Anal Biochem 48：422-427(1972).
bPhEur：专题文章2053和2.7.1节
c原理：每个磷脂含有单个磷原子，其可用于对磷脂进行定量。通过高氯酸来破坏磷脂，通过钼酸盐络合产生的磷酸盐/酯，钼酸盐被抗坏血酸还原产生蓝色的产物。用分光光度计在812nm处测定颜色。通过包括磷酸校准物来对样品中磷脂的量加以定量。
Ames BN.Assay of inorganic phosphate，total phosphate andphosphatases.Meth.Enzymol.1966；8：115-118
Figure A20078001021700251
CJF，van Gent CM & Pries C.A rapid and sensitivesub-micro phosphorus determination.Anal.Chim.Acta 1961；24：203-204
dPh.Eur.2.6.14，
e卵清蛋白ELISA是直接的三明治式酶免疫方法，其中使用用于捕捉的固定的多克隆抗卵清蛋白抗体以及抗卵清蛋白-HRP结合物作为检测系统。对结合物和样品进行同时培养。通过洗涤步骤去除未结合的组分。将底物(TMB和H2O2)加入到孔中。通过蓝色的显色来指示孔中特异性结合的结合物的存在。向底物中加入硫酸来终止反应，其导致产物中颜色变化为黄色。在450nm读取吸光度(OD)。为获得最优结果，使用620nm处的参照滤光器。从试验中包括的卵清蛋白标准(0.3-20.0ng/ml)的应答来制备标准曲线。未知样品的浓度从标准曲线内插来读取。
f根据专题文章0869和2053：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来检查单价合并的收集物的纯度。电泳：按照Ph.Eur 2.2.31来进行。
效果
通过Wilcoxon’s排名总和试验以0.05的双侧显著水平，在两个接种组之间对第15天每种病毒株的经log转化的HI抗体效价与第15天的鼻IgA抗体效价加以比较。
还通过对每种病毒株和每个接种组计算下述三个参数来分析第15天的HI抗体效价。
-血清保护率，其中血清保护被定义为红血球凝聚抑制(H I)效价≥40，
-血清转化率，其中血清转化被定义为接种前HI效价＜10，接种后HI效价≥40，或者，接种前HI效价≥10以及HI效价至少4倍的增加，
-平均倍数增加，即所述HI效价倍数增加的几何平均值。
根据per-protocol和意向治疗(intent-to-treat)的原理对效果数据加以分析。但是，鉴于这是所谓的原理验证型研究，per-protocol分析被认为是基本的一种。意向治疗的样本由被接种受试者的一些接种后效果数据组成。per-protocol样本由完成了方案并且没有发生主要的方案偏差的被接种受试者组成。主要的偏差包括(不限于)：包含或排除标准的偏差，禁药使用等。此外，实验室验证的并发流感感染的受试者以及失去了基本效果数据的受试者也被从per-protocol样品中排除。在研究数据库非盲之前，决定是否将受试者从per-protocol中排除。
结果
表8决定是否将受试者从per-protocol中排除。用病毒颗粒流感疫苗(RVM)进行鼻内接种后对体液免疫应答的CHMP评估
RVM：病毒颗粒流感疫苗
LPP-RVM：佐有脂肽的病毒颗粒流感疫苗
表8用病毒颗粒流感疫苗(RVM)进行鼻内接种后对体液免疫应答的CHMP评估(续)
RVM：病毒颗粒流感疫苗
LPP-RVM：佐有脂肽的病毒颗粒流感疫苗
表8用病毒颗粒流感疫苗(RVM)进行鼻内接种后对体液免疫应答的CHMP评估(续)
RVM：病毒颗粒流感疫苗
LPP-RVM：佐有脂肽的病毒颗粒流感疫苗
表9鼻洗出物IgA效价(GMT)
Figure A20078001021700281
结论
出人意料地并与用同样的疫苗批次的得的临床前数据(实施例1)以及WO 04/110486和临床数据所描述的(Gluck U，Gebbers JO，GluckR，Phase 1 evaluation of intranasal virosomal influenza vaccinewith and without Escherichia coli heat-labile toxin in adultvolunteers.J Virol.1999 Sep；73(9)：7780-6)相反，在用无佐剂的重构病毒颗粒流感疫苗仅进行一次接种的人类群体中，观察到了令人满意的、符合针对流感疫苗的CHMP标准的全身性免疫应答。

Claims (34)

1.包含流感病毒颗粒的组合物，所述病毒颗粒包含所述病毒的重构包膜，其中所述病毒包膜完全从流感病毒粒子获得，其中没有从外源向所述重构病毒颗粒加入脂类，其中所述病毒颗粒包含所述流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物，其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂，并且其中所述组合物作为鼻内或吸入给药制剂来设计，所述组合物特征在于所述制剂向人类的单次鼻内或吸入给药能诱导抵抗所述流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物的全身性免疫应答和/或局部免疫应答。
2.如权利要求1所述的组合物，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素剂量低于或等于30μg。
3.如权利要求1或2中任意一项所述的组合物，其中所述制剂的单次鼻内或吸入给药还能诱导细胞毒性淋巴细胞应答。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的组合物，其中所述免疫应答符合针对流感疫苗的CHMP标准。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述免疫应答提供下述中的一种或多种：对成年人而言＞70％和/或对老年人而言＞60％的血清保护率，针对成年人＞40％和/或针对老年人＞30％的血清转化率，以及针对成年人＞2.5和/或针对老年人＞2.0的平均倍数增加。
6.如权利要求2至5中任意一项所述的组合物，其中，每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于25μg。
7.如权利要求2至5中任意一项所述的组合物，其中，每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于20μg。
8.如权利要求2至5中任意一项所述的组合物，其中，每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于15μg。
9.如权利要求2至5中任意一项所述的组合物，其中，每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于10μg。
10.如权利要求2至5中任意一项所述的组合物，其中，每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于5μg。
11.如权利要求1至10中任意一项所述的组合物，其中，所述组合物是包含用于鼻内或吸入给药的药物载体的疫苗制剂。
12.包含所述病毒的重构包膜的流感病毒颗粒用于制备用于鼻内或吸入给药的组合物的用途，其中所述病毒包膜完全从流感病毒粒子获得，其中没有从外源向所述重构病毒颗粒加入脂类，其中所述病毒颗粒包含流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物，其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂，所述组合物特征在于所述组合物向人类的单次鼻内或吸入给药足以诱导抵抗所述流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物的全身性免疫应答和/或局部免疫应答。
13.如权利要求12所述的用途，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素剂量等于或低于30μg。
14.如权利要求12或13中任意一项所述的用途，其中所述制剂的单次鼻内或吸入给药还诱导细胞毒性淋巴细胞应答。
15.如权利要求12至14中任意一项所述的用途，其中所述免疫应答符合针对流感疫苗的CHMP标准。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述免疫应答提供下述中的一种或多种：对成年人而言＞70％和/或对老年人而言＞60％的血清保护率，针对成年人＞40％和/或针对老年人＞30％的血清转化率，以及针对成年人＞2.5和/或针对老年人＞2.0的平均倍数增加。
17.如权利要求13至16中任意一项所述的用途，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于25μg。
18.如权利要求13至16中任意一项所述的用途，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于20μg。
19.如权利要求13至16中任意一项所述的用途，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于15μg。
20.如权利要求13至16中任意一项所述的用途，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于10μg。
21.如权利要求13至16中任意一项所述的用途，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于5μg。
22.如权利要求12至21中任意一项所述的用途，其中制备的组合物是疫苗制剂。
23.包含流感病毒颗粒的组合物的疫苗制剂，所述病毒颗粒包含所述病毒的重构包膜，其中所述病毒包膜完全从流感病毒粒子获得，其中没有从外源向重构病毒颗粒加入脂类，其中病毒颗粒包含流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物，其中没有向所述组合物加入单独的佐剂和/或免疫刺激剂，该疫苗特征在于针对向人类的单次鼻内或吸入给药来设计所述疫苗，并且其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素剂量等于或低于30μg。
24.如权利要求23所述的疫苗制剂，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于25μg。
25.如权利要求23所述的疫苗制剂，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于20μg。
26.如权利要求23所述的疫苗制剂，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于15μg。
27.如权利要求23所述的疫苗制剂，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于10μg。
28.如权利要求23所述的疫苗制剂，其中每种病毒株每次鼻内或吸入给药的血细胞凝集素的剂量低于或等于5μg。
29.如权利要求23至28中任意一项所述的疫苗制剂，其中所述制剂的单次鼻内或吸入给药能在所述人类中诱导免疫应答，所述免疫应答包括：抵抗流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物的全身性免疫应答，抵抗流感抗原血细胞凝集素和/或神经氨酸酶或其衍生物的局部免疫应答，以及细胞毒性淋巴细胞介导的免疫应答中的一项或多项。
30.如权利要求29所述的疫苗制剂，其中所述免疫应答符合针对流感疫苗的CHMP标准。
31.如权利要求30所述的疫苗制剂，其中，所述免疫应答提供下述中的一种或多种：对成年人而言＞70％和/或对老年人而言＞60％的血清保护率，针对成年人＞40％和/或针对老年人＞30％的血清转化率，以及针对成年人＞2.5和/或针对老年人＞2.0的平均倍数增加。
32.用于鼻内或吸入给药的装置，所述装置包含根据权利要求23至31中任意一项所述的疫苗制剂。
33.如权利要求32所述的装置，其中，所述装置包含一定量的用于单次鼻内或吸入给药的疫苗制剂。
34.如权利要求32或33述的装置，其中，所述装置是一次性的。
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