CN101404873A - 用于选择显示减少的损伤诱导的表面变色的植物的筛选方法和所获得的植物及植物部分 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于针对其中存在的个体筛选植物或植物部分的群体的方法，所述个体与对照植物或植物部分相比，显示减少的损伤诱导的表面变色，所述方法包括提供植物群体或来自群体的植物的部分；在待筛选的植物或植物部分以及对照植物或植物部分上产生损伤表面；温育损伤表面以允许在其内或其上面发生变色；在植物或植物部分内或上面观察损伤表面变色；将观察到的待筛选的植物或植物部分内或上面的损伤表面变色与在对照植物或植物部分上或内观察到的变色进行比较。本发明还涉及所选择的植物。

Description

用于选择显示减少的损伤诱导的表面变色的植物的筛选方法和所获得的植物及植物部分
发明领域
本发明涉及用于针对其中存在的个体(所述个体与对照植物相比，显示减少的损伤诱导的表面变色)筛选植物或植物部分的群体的方法。本发明还涉及通过该方法获得的显示不存在或减少的损伤诱导的表面变色的植物和来源于其的部分以及涉及其部分和后代。
发明背景
由于不断增加的需要，新鲜产品特别是莴苣的加工近年来获得长足的发展。莴苣的收获和加工包括叶子的大量切割，这诱导了强烈的损伤反应。该损伤反应导致加工的产品的快速变质。该变质表现在由于损伤表面上和周围的酶促褐变或变粉红引起的变色、由于蒸腾作用引起的呼吸和脱水。特别地，酶促褐变或变粉红被认为是非常重要的，其直接或间接决定了鲜切包装的莴苣的总体质量。
此外，作为变质的结果，微生物在数量上可显著增加，这可危害食品安全。加工的莴苣的高度易腐坏的性质导致消费者感觉到强烈的变色(off-colour)、变味(off-odour)和质地变化，这妨碍了比所谓的便利市场的流通增长更快速的增长。
为了抑制变质过程，已发展了可用于减缓加工的莴苣的变质的许多化学或物理的收获后处理。
其中这些方法是在改良的大气下包装鲜切莴苣、使用可食用的涂层、热激处理和加入抑制酶促褐变的化学物质。当在低温下在减少氧气的大气下包装鲜切莴苣时，可显著地减少酶促褐变。然而这样的改良的、低氧的环境导致无氧呼吸，这产生了令人感觉非常不快的产品的臭味和变味。
可食用的涂层是用作物理隔离屏障和有效保护产品免受各种变质例如脱水和褐变侵害的材料的薄层。这些涂层可以例如由树脂、多糖或蛋白质构成。
已进一步证明，可通过在加工后即刻在45℃下使用90秒的短暂热激来防止鲜切莴苣的褐变。热激很可能使蛋白质的生物合成从参与变色的酶转向热激蛋白，从而减少了酶促褐变的能力。可选择地，可通过参与变色通路的酶的热敏感性(thermosensitivity)来解释热激处理对褐变的作用。
可使用的化学物质可以是例如还原剂如维生素C、螯合剂如EDTA、络合剂如环糊精和酶抑制剂如L半胱氨酸。化学物质在新鲜食品中的应用明显地牵涉到食品安全性问题和要求法规批准(regulatoryapproval)。可以考虑上述收获后技术的组合，最终，使用的方法是技术功效、成本和食品安全性之间的平衡结果。
不论所使用何种技术，加工的莴苣的收获后质量的提高来之不易，从而在本领域存在提供可选择的技术来消除或减少使用物理的或化学的收获后技术的需要的明确需要。
发明概述
本发明的目的是提供筛选方法，所述方法用于选择显示减少的损伤诱导的变色反应的植物，从而提供对收获后的加工障碍例如酶促褐变或变粉红具有抗性的植物和从其产生的后代。本发明的进一步目的是提供在损伤后显示显著减少变粉红色或褐变的变色的植物。损伤后的变色也可见于在植物的部分例如茎、种子、果实、叶、花、块茎、枝。因此本发明的进一步目的是提供选择在它们的植物部分显示减少的损伤诱导的变色反应的植物的筛选方法。
因此本发明提供了用于针对其中存在的个体(所述个体与对照植物或植物部分相比，显示减少的损伤诱导的表面变色)筛选植物或植物部分的群体的方法，所述方法包括：
a)提供植物群体或来自该群体的植物的部分；
b)在待筛选的植物或植物部分以及对照植物或植物部分上产生损伤表面；
c)温育损伤表面以允许在其内或其上发生变色；
d)在植物或植物部分内或上观察损伤表面变色；
e)将观察到的待筛选的植物或植物部分内或上的损伤表面变色与在对照植物或植物部分上或内观察到的变色进行比较，从而鉴定显示没有变色的或显示与对照植物或植物部分相比变色减少的植物或植物部分。
本发明的方法可用于可经历变色的任何植物，但特别适合用于产品，特别是用于蔬菜或果实或花。该方法尤其适合于用于叶类蔬菜例如莴苣，适合用于块茎类，如马铃薯或甘薯(sweet potato)，适合用于根类植物，例如块根芹菜(celeriac)，适合用于枝类(shoots)，例如witloof或适合用于蘑菇。此外方法可用于果实，例如苹果、香蕉、鳄梨、桃子、梨子、杏子、芒果、茄子和适合用于花类或花茎类(flower stem)，例如大丁草茎、菊花、朝鲜蓟基部(artichokebottoms)等。
本发明的筛选方法意欲用于鉴定在一个或多个它们的部分或组织中具有减少的损伤诱导的表面变色的植物。因此，为了进行筛选，使用易于变色的部分或组织是非常实用的。在莴苣中，这样的部分或组织可以是叶或其部分例如打孔部分，在香蕉中，可合适地使用去皮果实的切片，在花类植物中，茎的切片是非常实用的受试载体(testvehicle)。
在特定的实施方案中，方法特别适合用于选择菊科(Asteraceae)的植物，特别是莴苣属(lactuca)的植物和更特别地属于莴苣种(Lactuca sativa)的植物或属于菊苣属(cichorium)的植物，和特别地属于菊苣种(Cichorium intybus)和苦苣(Cichorium endivia)种的植物，所述植物显示不存在或减少的损伤诱导的表面变色。
使用本发明的方法筛选的植物群体可以是任何植物群体，但优选是具有许多不同成员的变异植物群体，以增加发现显示减少的损伤诱导的变色的植物的机会。可通过使用例如化学物质和/或辐射的诱变处理产生这样的变异群体，所述的变异群体在本文中被称为突变体植物群体。可选择的群体是种质集合体，所述集合体是显示天然变异的植物的集合体。此外，还可使用转基因植物的群体。
合适地使用具有损伤表面的植物部分进行本发明的方法。非常有用的受试样品是从叶子穿孔产生的盘，即所谓的叶盘(leaf discs)。可选择地，可使用有叶脉的叶类蔬菜的中脉组织。合适地，从此类叶脉切取叶盘。
合适地在水性环境中进行温育。可用在湿润的滤纸上或滤纸间温育的叶盘很好地进行本发明的方法。然后在滤纸上可以非常清楚地看到围绕损伤的边缘的变色反应。在莴苣属和菊苣属的植物的情况下，变色是变粉红色的反应。
可选择地，水性环境包括水或溶液。在将在下面进一步说明的特定的实施方案中，溶液包含L-3，4-二羟基苯丙氨酸。该化合物通过多酚氧化酶转化成黑色的色素黑色素。可用于该方面的可选择的化合物包括但不限于绿原酸、异绿原酸、L酪氨酸和儿茶酚。
本发明还涉及显示减少的损伤诱导的表面变色的植物，该植物可通过将植物群体经历本发明的筛选方法，从群体选择在筛选中没有显示表面变色的或在筛选中显示与对照植物相比减少的表面变色的植物来获得。
植物合适地是叶类蔬菜植物，更特别地是属于莴苣属，特别地属于莴苣种的植物，或属于菊苣属，特别地属于菊苣和苦苣种的植物。
优选，在筛选中鉴定本发明的植物，然后选择具有减少的或不存在的损伤诱导的表面变色的植物，但随后对其进行检测以确定其是否具有正常的习性。更特别地，植物优选不应当显示负面的多效性。
根据本发明，鉴定和选择没有显示或显示显著减少的损伤诱导的表面变色的植物。通过NCIMB保藏这些植物的种子的后代，并为所述植物种子的后代提供了表1中所列的登录号。在实施例4和实施例6中提供了关于保藏物的种子后代的详细内容。保藏这些种子后代，因为它们具有无损伤诱导的变色或具有显著减少的损伤诱导的变色的单一的特异的特征。不针对用于品种注册(variety registration)的DUS标准即关于所有注册特征的可区别性、均一性、稳定性对它们进行检测，且不期望它们以任何方式满足这些标准。
表1
  植物编号   内部参照(＝NCIMB参照)   NCIMB登录号   保藏日期
  06D.210202   06D.863B2   41454   2007年1月3日
  05D.202539   07G.9979   41441   2006年10月10日
本发明还涉及具有减少的或不存在的损伤诱导的表面变色的植物，和通过将本发明的植物与相同种的另一植物杂交可获得的植物。因此可将特征“减少的或不存在损伤诱导的表面变色”赋予原先不具有该特征的其他植物。通过该杂交产生的植物是否确实是本发明的植物，可通过将这些植物经历本发明的筛选方法来检验。优选，然后还针对具有正常的习性来检测被选择作为本发明的植物的植物。
本发明还涉及本发明的亲本植物的后代，所述后代保持在亲本植物中发现的不存在的或减少的损伤诱导的叶变色。这样的后代可以离开亲本许多代。只要保持特征“减少的或不存在损伤诱导的表面变色”，植物就是本发明的植物。
本发明还涉及本发明的植物的部分。植物部分如莴苣或苦苣(endive)的头或叶通常是具有可经历变色的切面的部分。
本发明的植物部分可用于组织培养，从而再生植物，所述再生的植物保持在用于组织培养的组织所来源的植物中发现的不存在或减少的损伤诱导的叶变色。所再生的植物也是本发明的部分。
本发明还涉及本发明的植物的种子。植物可从种子长成也具有特征“减少的或不存在损伤诱导的表面变色”的植物。可在本发明的筛选方法中检测种子和从而从其长成的植物是否已保持该特征。本发明还涉及保持在原始种子中发现的不存在或减少的损伤诱导的叶变色的更多代的种子。
本发明对于加工的蔬菜的市场具有极大的商业吸收力。如上面所解释的，产品特别是新鲜果实和蔬菜的变色被认为是不希望的，因为消费者拒绝变色的产品。因此本发明的特征“减少的或不存在的损伤诱导的表面变色”适合在加工的蔬菜产品如切开的莴苣、苦苣(endive)或witloof或其组合中发现。当使用本发明的方法筛选时，本发明的加工的蔬菜没有显示或显示有限的损伤诱导的叶变色。满足筛选的所有加工的蔬菜，特别是加工的莴苣、苦苣(endive)和witloof是本发明的部分，因为它们经证明具有导致减少的PAL和/或PPO依赖性代谢流的改良。
发明详述
当通过切割收获和加工莴苣时，产生许多叶损伤表面，所述叶损伤表面导致植物或植物部分的显著反应，表现为损伤表面上或附近的褐色或粉红色变色。还可在远离叶的主脉以及柄(butt)上的损伤表面的位置上观察到变粉红色。有时还可在即将收获前的阶段观察到变粉红色，这据认为是由于农作物的非生物胁迫或过度成熟造成的。
不同形式的变色受到酶活性的影响，所述酶活性由于损伤而获得强烈的增强且产生了几种形式的多酚和从其衍生的反应产物。
参与褐变反应的重要的酶活性是PPO。与酶促褐变相关的PPO活性不限定于莴苣，已描述了该PPO活性在许多其他植物种如苹果、香蕉和马铃薯中与收获后变质有关。事实上，PPO被公认为与许多加工的新鲜果实和蔬菜的收获后变质有关的最重要的酶之一。
因此，PPO一直是目的在于减少或预防其活性以增加食品的收获后质量的许多技术的靶标。PPO催化将存在于植物组织中的多酚氧化，从而引起邻醌的形成的反应。然后，酶促和非酶促反应导致褐色或黑色色素的形成。
在许多植物种类中，PPO由小的基因家族编码，所述基因家族的个体成员可具有指示功能趋异的不同的时间和空间表达模式。例如已显示，莴苣在叶的光合和维管组织中包含不同的PPO同种型(isoform)。
PPO的天然底物在不同的物种之间可以不同。在莴苣中，咖啡酸衍生物如绿原酸和异绿原酸主要用作PPO的底物。
PPO酶的水平不是在植物组织的损伤后特异性诱导的，而是无活性地存在于叶绿体中。受伤后，由于存在于液泡中的酚类底物因为组织的破裂而与PPO接触的事实的原因，PPO被激活由此被表现出来。
在莴苣中，作为PPO的底物的多酚的产生由损伤诱导。因此，莴苣组织的褐变潜能似乎不受叶组织中PPO的量的限制而是受到损伤后多酚生物合成速度的限制。
在该方面，不同的农作物之间情况可以不同。例如，在苹果中，多酚的量足以在损伤后1小时内产生果实的褐变反应，然而在莴苣中，由于莴苣中多酚库大部分需要在损伤后重新合成的事实，因而褐变反应可花费数天时间。
通过称为苯基丙酸类通路(phenylpropanoid pathway)的详尽表征的生物化学通路进行多酚类的合成。首先，该通路的关键步骤由苯丙氨酸解氨酶催化(PAL，Hahlbrock，K和Scheel，D(1989)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40，347-369)。PAL将通过莽草酸酯通路合成的氨基酸苯丙氨酸转化成肉桂酸(cinnamic acid)。
在莴苣，叶子的损伤导致PAL基因表达和PAL活性的强诱导。多酚的形成与该酶促活性相关，这表明由莴苣的损伤诱导的PAL活性是造成褐变的重要因素(Campos，R.等人(2004)PhysiologicaPlantarum 121，429-438和其中的参考资料)。然而，哪一个其他因素决定损伤诱导的变色反应的最终结果目前还不清楚。例如，据认为过氧化物酶(POD)的活性在建立变色的最终水平中同样重要(Fukumoto，L.R.等人(2002)J.Agric.Food Chem.540，4503-4511；Martin-Diana A.等人(2005)Biosci.Biotechnol.Biochem.69，1677-1685)。
由于酶活性依赖于内部过氧化氢的可获得性，因而POD对变色的贡献可能是有限的。
进一步明显的是，植物以某种不为人知的方式感觉到损伤，随后通过级联反应产生信号，对于莴苣，该信号目前未被充分确定。似乎明显的是，这些活性主要被靶向伤口愈合和抗病原体的防御。因而，许多遗传因子可能参与发动损伤的莴苣组织的变色反应，这些因子中的各因子是减少或消除损伤诱导的变色的遗传修饰的潜在的靶标。
这些遗传因子的大部分目前是未知的，对于已知的涉及到的因子，不清楚这些因子在变色反应中所起的特定作用达到何种程度，或这些因子可能具有与植物的损伤生理学相关的更一般的功能。
例如，尽管认为损伤诱导的PAL活性确定莴苣的褐变水平，但苯基丙酸类通路的产物已知参与尤其细胞壁的生物合成或也参与防御反应。因此为了减少褐变潜能而减少损伤诱导的PAL活性可削弱除了损伤诱导的褐变以外的与莴苣栽培的其他方面相关的其他功能，这可能是较不希望的。
同样地，PPO的活性据认为参与防御反应，因此通过减少PPO水平来减少褐变潜能可增加对病原体的易感性(Thipyapong，P.等人(2004)Planta 220，105-117)。因此，本发明者推论出，更加无偏性的方法可在该方面获得更大的成功。这样的方法包括下列步骤：
1.植物的变异体群体，特别是突变体群体的产生。可通过用诱变剂如乙基甲磺酸(ems)或X射线处理种子或植物组织来产生这样的突变体群体。
2.有效率的表型筛选的建立，在所述筛选中，选择基于通过PAL和/或PPO介导的损伤反应诱导的植物(特别是叶类蔬菜，更特别地莴苣、苦苣(endive)或witloof的变色。
3.在它们的关于收获后变色潜能的损伤反应发生改良的和不存在所述改良的多效性的突变体的表征，根据一般实践，所述多效性削弱植物特别是叶类蔬菜，更特别地莴苣、苦苣(endive)或witloof的生长和加工。
本发明因而在一个实施方案中涉及用于鉴定、选择和获得显示减少的损伤诱导的变色和收获后加工障碍例如酶促褐变或变粉红色的植物的无偏性筛选方法。
本发明在另一个实施方案中涉及更加偏性的方法，该方法使用通过PPO转化成色素的底物。在该测定中，筛选特异针对PPO突变体。合适的底物是可被转化成黑色的色素黑色素的L-DOPA。
本文通过引用叶类蔬菜如莴苣举例说明本发明，但也可以以相同的方法用上面指出的其他植物实施本发明。
例如可如下制备用于本发明的方法的突变体植物群体：
a)使用诱变剂处理待改良植物种的M0种子以获得M1种子；
b)栽培来自所获得的M1种子的植物以获得M1植物；
c)任选地重复步骤b)和c)n次以获得M1+n种子，
d)萌发所获得的M1+n种子，栽培来自这些种子的植物。
根据本发明，随后针对它们的损伤诱导的变色反应测定这些植物。选择不显示或显示减少的对损伤的变色反应的植物。然后，栽培选择的植物的后代，测量损伤诱导的变色反应。
为了产生遗传变异性，可使用诱变。可用于在植物种如莴苣中诱导遗传突变的几中化学或物理处理对于本领域技术人员来说是已知的。
例如，可在包含不同浓度的诱变剂如ems的溶液中处理莴苣的种子。Ems主要烷基化DNA链的G残基，这在DNA复制过程中引起与T配对而非与C配对。从而GC碱基配对以由有效剂量的ems和植物的错配修复系统的活性确定的频率改变成AT碱基配对。
ems的有效剂量取决于所使用的浓度、种子大小和其他物理性质以及种子在ems溶液中的温育时间。已用ems处理的种子通常称为M1种子。作为处理的结果，M1种子的组织在它们的细胞的基因组中包含随机点突变，那些存在于将形成种系组织(生殖细胞)的细胞的亚群中的点突变将被传递至称为M2的下一代。单倍不足从而引起不育或诱导胚胎致死现象的突变或其组合将不被传递至M2代。
如上述使用ems的相似方法同样可用于其他诱变剂。合适的诱变剂在本领域内是熟知的。特别有用的是烷基化诱变剂，例如硫酸二乙酯(des)、乙烯亚胺(ei)、丙磺酸内酯、N-甲基-N-亚硝基脲(nitrosourethane)(mnu)、N-亚硝基-N-甲脲(NMU)、N-乙基-N-亚硝基脲(enu)、叠氮化纳。
可选择地，通过辐射诱导突变，所述辐射选自例如X射线、快中子、紫外线照射。
在本发明的另一个实施方案中，通过基因工程例如通过使用嵌合寡核苷酸、同源重组、基因打靶、与内源产物竞争的经修饰的靶基因的导入、通过RNA干扰进行的下调等来诱导突变。
可将诱变处理的M2群体用于针对通过PAL和PPO介导的损伤反应的筛选方法。对于本领域技术人员明显的是携带遗传变异的任何植物群体可用作该表型筛选的起始材料。
优选，本发明还涉及叠加(pyramiding)引起减少的损伤诱导的变色反应的pyramiding等位基因。
合适地通过自体授粉产生M1和M1+n种子。
本发明还涉及获得具有改变的基因型的植物或植物部分，所述植物或植物部分显示减少的对生理性收获后加工障碍例如酶促褐变或变粉红色的易感性。本发明涉及在它们的基因组中具有遗传信息的植物或植物部分，所述遗传信息负责减少的对收获后加工障碍例如酶促褐变或变粉红色的易感性，且发现于莴苣植物的基因组中。
所述植物的后代也是本发明的部分。本文中所使用的“后代”意欲包括具有与本文中描述的原始植物相同或相似的减少的对收获后加工障碍特别是酶促褐变或变粉红色的易感性的所有植物，以及以任何方式例如通过有性生殖如自体授精或与相同属的另一种植物的异花受精、或营养繁殖例如扦插、组织培养、单倍体培养、原生质体培养、原生质体融合或其他技术从其产生的植物。这样的后代不仅是通过一种或多种此类技术产生的植物的第一代，而且也可以是通过一种或多种这些技术产生的植物的更多代，只要产生的植物具有减少的易感性。
为了进行本发明的表型筛选，必须产生损伤表面，因为酶促变色反应是由损伤诱导的。损伤是通过方法如切割、穿孔、切片、磨损、挤压、破坏、剥皮、压碎、压迫、鞭打、碾磨、液体注射、渗透压休克、分离(detaching)、割、撕碎(shredding)、摩擦(rubbing)和撕裂对天然植物、组织和/或细胞结构的不可逆干扰。
然后，用于诊断导致组织变色的通路和可非常有效地用于突变群体的筛选的表型特征必须逐渐表现出来。
令人吃惊地发现，可通过采集莴苣植物的叶部分，然后在非常特殊的条件(所述条件有利于不同形式的损伤表面变色发生)下温育它们来获得这样的表型特征。然后，这样的测定可用于大量的突变植物以选择显示减少的损伤诱导的变色反应的植物。
本发明的一个实施方案基于令人吃惊的发现，即当采集来自叶子特别是莴苣叶的叶盘并且在5℃下在湿润的滤纸之间温育叶盘时，在大约4天后，叶盘边缘的粉红色染料的形成逐渐变得明显。合适的滤纸是1450CV型滤纸，Ref.no.10313281，来自Schleier & Schuell，Microscience GmbH，Dassel，Germany。在进一步温育后，信号增强，在大约一周后达到最大强度。粉红色染料的形成特异性地在损伤表面发生。
可通过在视觉标度(visual scale)上进行从0(其表示无褐变或变粉红色)至10(其表示与标准莴苣品种(莴苣)相似的褐变和变粉红)的评分来测量变色。在本实施例中，莴苣品种‘Troubadour’用作10的标准。如果希望，可使用图进行比较，从而给0和10之间的中间级别评分。此外，可由具有粉红色染料的滤纸产生数字图像，然后计算每叶盘位置具有强粉红色的像素的数目。通过使用这些测量中的一种，可进行本领域技术人员熟知的简单统计分析如t检验，从而确定植物或植物群体变粉红色的程度是否比标准(如对′Troubadour′)显著更低。单测检验的所使用的显著性水平是0.001。
对于突变体，可在作为最佳的可获得的标准的原始品种的粉红色评分和个体突变体和/或它们的后代的粉红色评分之间进行统计比较。
为了在代表不同变异样品的现有植物中发现本发明的性状，可使用繁殖系(breeding line)和/或基因库登录号(gene bankaccession)。然后可在处于研究的个体登录号的变粉红色的评分与群体的其余部分的变粉红色的评分之间进行统计比较。当针对显著减少的变粉红色对个体进行统计检测时，可能需要多重比较检验来保持适当的总体显著性水平，例如使用一个标准的Dunnett氏多重比较检验(Dunnett CW，J.Amer.Statist.Assoc.50：1096-1121(1955))。
此外，据显示可通过使用不同发育阶段的叶子的许多不同类型的组织获得损伤诱导的变色反应。例如，还可诱导中脉组织产生该对损伤的反应。当用于不同种类的莴苣，例如叶用莴苣(butterhead)、卷心莴苣、直立莴苣、荷兰莴苣或栎叶莴苣时，未发现显示比被研究的群体的剩余部分显著更少的变粉红色的个体登录号。根据本发明，进一步证明PPO的特异性抑制剂L半胱氨酸，当在反应过程中使用时，强烈地抑制粉红色染料的形成。此外，发现肉桂醛(其为PAL活性和鲜切莴苣的褐变的抑制剂)抑制粉红色染料的形成(Fujita，N.等人(2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70，672-676)。这些发现显示莴苣的粉红色变色反应是PAL和PPO依赖性的。
已知通过使用短暂的热激可非常有效地防止鲜切莴苣的酶促褐变。可通过假定将蛋白质的生物合成从苯基丙酸类通路改向热激蛋白，从而减少朝向多酚形成的代谢流来解释观察到的效应。
可选择地，可通过假定参与多酚氧化的酶例如PPO和POD被热激处理失活来解释效应。当对随后针对变粉红色反应进行测定的莴苣使用热激时，显示该反应如酶促褐变被有效抑制。这证明了作为本发明的部分的莴苣的变粉红色反应在生理上与熟知的酶促褐变反应非常相似。
通过将L半胱氨酸用作还原剂来进一步验证该发现。L半胱氨酸，除了是PPO的抑制剂外，还已知与有色的邻醌(o-quinone)反应并且在化学还原反应中将它们转化回无色的二酚。当用L半胱氨酸处理由莴苣叶盘形成的粉红色染料时，证明粉红色化合物被转化成无色的化合物。因此粉红色染料似乎可能是由PPO形成的邻醌。
这通过发现：还原剂如抗坏血酸或谷胱甘肽也可将粉红色染料转化成无色化合物来确证。
此外，当用L半胱氨酸处理采自田间的、显示变粉红色的植物时，也可消除粉红色变色。这证明叶盘变粉红色反应代表了有时可在于田间条件下生长的植物中看到的天然发生的变粉红色现象。
本发明的其他实施方案基于下列实验。通过切割产生头部的莴苣叶的部分，将所述部分在16℃下在空气中进行温育。作为反应，在大约4天后，损伤表面变成褐色。特别地在主脉的损伤表面上，可清楚地观察到褐变。此外，还可通过切割或摩损损坏叶子后在整个植物水平上观察到褐变反应。
L半胱氨酸(PPO的抑制剂)可完全抑制所有这些褐变反应，这证明了这些表型是通过PPO的活性表现的，从而可被当作如在莴苣的加工和包装过程中观察到的收获后褐变的诊断。
这些损伤诱导的褐变反应能够以有效的方式产生，所述方式可在用于鉴定突变体植物的表型筛选方法中使用，所述突变体植物的损伤诱导的褐变潜能减少。
本发明的其他实施方案基于通过使用底物诱导的莴苣组织的损伤表面上的变色，所述底物可被酚氧化酶转化成有色的化合物。
例如，当将莴苣叶盘与PPO底物L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)一起温育时，在损伤表面上观察到深褐色向黑色的变色，该变色是黑素形成(通过PPO)的表现。当同时使用L半胱氨酸，黑色变色被完全抑制，这确认了该变色是PPO介导的假设。
尽管L-DOPA被认为不是莴苣PPO的天然底物，但其可用于目的在于突变体(所述突变体显示减少的损伤诱导的变色)的鉴定的测定。
可以以与对于L-DOPA所描述的相似的方式，使用其他底物以产生变色反应。这些底物包括但不限于绿原酸、异绿原酸、L酪氨酸和儿茶酚。
综合起来，不同染料在植物中产生的损伤表面上的形成监控始于损伤信号的诱导、通过PAL和PPO介导且导致变色的通路中的改变。如所描述的，可容易地通过目检(所述目检允许进行非常有效的突变体筛选方法)来评估这些损伤诱导的变色反应。在图1中图解说明本发明描述的方法背后的原理。
根据本发明，因而发现在体外，叶盘的损伤诱导的变色通路与以工业规模进行加工的莴苣的损伤诱导的变色大部分重叠，从而可被当作该过程的诊断。这受到这样的概念支持，即PAL或PPO的抑制剂抑制在实际的、工业条件下加工的和包装的莴苣的酶促褐变。重要地，由于该方法包括诱导步骤(即损伤和由PPO介导的一个最终的代谢转换)，因而方法允许捕获直接或间接参与该生理过程的所有遗传因子。此外，由于可通过使用不同发育阶段的叶子的整个叶组织产生该反应，因此当考虑相关性时，可将突变体筛选靶向这些不同的阶段或组织。
可进一步表征突变植物，基于一个或多个上述表型测定，所述突变植物已被鉴定为在从损伤导向PAL和PPO依赖性变色的生理过程方面发生改变。可在不同的水平例如在分子、生物化学、生理学和表型水平上进行该表征。
对于本领域技术人员很明显的是，可观察到变色的可变水平(variable level)，其可反映影响原始群体中的变色性状的不同的突变基因座或相同基因座的不同等位基因型的存在。
在隐性突变的情况下，可通过进行等位性检验容易地区分这两种可能性，所述检验包括将两种突变植物杂交和确定杂种的表型。在突变的等位性的情况下，减少的变色性状在F1中将是明显的，然而在突变体中的表型由不同隐性基因座确定的情况下，情况则不是这样。
当将随机诱变用于产生起始群体时，遗传背景中的突变也可在实验条件下促成表型的变异。为了区分不同强度的单突变和遗传背景中的突变的组合效应，应当针对不同的减少的变色事件进行回交以产生均一的遗传背景。
为了确定参与损伤诱导的变色的特定基因座上的突变是否展示多效性，该方法也是适当的。
因此，基于减少的变色反应所选择的M2植物用于生长M3种子。然后，针对它们减少的对损伤的反应重新评估来源于减少的变色事件的近交系。此外，可在不同的遗传背景中和在不同的农作物栽培和加工条件下评估减少的褐变或变粉红色。
可进行生物化学研究以阐明涉及受遗传修饰影响的通路的问题。可进行分子研究以确定假定的参与酶促褐变或变粉红色反应的候选基因如编码PAL、PPO或过氧化物酶的基因是否被修饰。随后进行遗传分析以证明候选基因中发现的修饰是形成改变的表型的原因。
尽管诱导的诱变是用于本发明的优选方法，但对于本领域技术人员来说已知的是，存在允许以特定的方式修饰存在于植物的基因组中的基因靶的技术。例如，已证明嵌合寡核苷酸是具有特定作用模式的有效诱变剂。
另一个方法是通过同源重组或基因打靶修饰基因靶。通过使用该方法，用导入的包含希望的修饰的DNA片段交换基因的片段。转基因方法也是可行的，在所述方法中导入与内源产物竞争的修饰的靶基因。这可导致显性负效应。此外，通过RNA干扰特异性下调基因的表达是可行的。
在诱变的寡核苷酸的情况下，基因打靶或转基因方法用于修饰参与损伤诱导的变色反应的遗传因子，很明显，相关基因的一级结构应当是已知的。
本发明的其他部分涉及基于莴苣叶盘的损伤诱导的粉红色变色鉴定的莴苣突变体和从其产生的后代。将该变粉红色测定用于包含随机的、ems诱导的突变的M2群体的植物导致许多突变体的鉴定，所述突变体显示与对照植物(所述对照植物不包含ems诱导的突变)相比，显著减少的变粉红色反应。
大多数这样的突变体显示矮小的和通常萎黄病样的表型。然而令人吃惊地发现一些具有减少的变粉红色反应的突变体显示正常的生长习性(habitus)，即与对照植物非常相似的大小、形状、生长和颜色。
当针对变粉红色测定从通过自体授精获得的种子生长的该特定突变体的后代植物时，观察到与对于原始鉴定的突变体发现的相似的减少。这证明减少的粉红色变色反应能够遗传且由基因组的修饰引起。
进一步令人吃惊的发现是如下事实，即当将后代植物生长至成熟并且针对损伤的中脉组织的酶促褐变进行检验时，该反应也被强烈抑制。
这显示作为本发明的部分的叶盘变粉红色的测定有因果性地涉及莴苣中的酶促褐变，以及显示变粉红色的测定可用于预测成熟莴苣植物的酶促褐变的水平。
因此，可将叶盘变粉红色的测定用作鉴定具有减少的酶促褐变潜能的莴苣植物的选择工具。该工具可用于从任何类型的植物群体(无论遗传变异的原因是什么)鉴定存在于该群体中的具有减少的酶促褐变潜能的莴苣植物。例如，除了ems群体外，可使用天然获得的材料或繁殖种群。
本发明提供的一种或多种筛选方法可用于其收获后加工质量需要提高的任何叶类蔬菜品种。因此，本发明除了栽培的莴苣外还可用于属于菊科的其他植物种，例如莴苣属的野生型种。此外，本发明可特别地用于属于植物菊苣属(所述属是种如苦苣(Cichoriumendivia)、菊苣和witloof菊苣(Cichorium intybus)属于的属)的植物。
本发明涉及可通过进行本文中公开的一种筛选方法在植物中被检测的表型特征。本发明的植物是与对照植物相比，显示不存在或减少的损伤诱导的表面变色的植物。通过3个变色检测(即变粉红色或褐变的发生或将底物L-DOPA转化成黑色素的能力)中的一个或多个检测确定特征的存在。本发明的植物是在这些检测的至少一个检测中显示至少与对照相比减少的变色的植物。
本文中所使用的“对照”是已知其显示变粉红色、褐变和L-DOPA至黑色素的转化中的一种或多种变色反应的任何植物，所述反应可被L半胱氨酸或肉桂醛抑制。合适地，使用植物，所述植物的其叶盘，当在5℃下在湿润的滤纸之间温育7天时，显示围绕盘的边缘的粉红色变色。
将在下列的且不意欲以任何方式限定本发明的实施例中进一步举例说明本发明。所述实施例涉及莴苣，但可使用其他产品植物或其部分特别是新鲜果实和蔬菜而不使用莴苣。在实施例中参考下列附图。
图1：关于减少的收获后酶促变色的莴苣群体的突变体筛选方法的设计背后的原理的概述。筛选的输入信号是被植物感觉且产生导致许多生理过程(包括衰老、呼吸和组织变色)的不同信号传输反应的叶组织的损伤。该植物信号可与酚类化合物作为PPO底物的应用相结合。
筛选的输出信号是诊断收获后褐变和变粉红色的损伤表面诊断的褐色或粉红色变色(取决于所使用的条件)。这可从输出信号被肉桂醛和L半胱氨酸(其分别为PAL和PPO的特异性抑制剂)完全抑制的事实推断出来。
图2：基于叶盘的粉红色变色的筛选的输出表型的代表性图像。将莴苣植物的叶盘(每植物1个叶盘)排列在湿润的滤纸之间并在5℃下温育7天。可在损伤表面清楚地观察到围绕各叶盘的粉红色变色。
图3：在不同浓度的PAL抑制剂肉桂醛存在的情况下进行的叶盘变粉红色测定(每皿4个叶盘)。各皿上面的数字显示所使用的肉桂醛的百分比。
图4：PPO抑制剂L半胱氨酸对湿润的滤纸之间温育的莴苣叶盘(每皿4个叶盘)的粉红色变色的抑制效应。各皿上方的数字显示所使用的L半胱氨酸的百分比。
图5：PPO抑制剂L半胱氨酸在1.5mM L-DOPA存在的情况下对湿润的滤纸之间温育的莴苣叶盘(每皿4个叶盘)的黑色变色的抑制效应。各皿上面的数目显示所使用的L半胱氨酸的mM浓度。
图6：热激预处理对莴苣叶盘变粉红色的影响。在各皿上指定的温度下对完整的叶子施用热激，进行90秒。
图7：通过L半胱氨酸使通过莴苣的损伤反应形成的粉红色染料至无色化合物的转化。皿的上行显示L-DOPA测定，而皿的下行显示变粉红色的测定。在完成损伤反应后，用L半胱氨酸进行处理各皿中的两个叶盘的下方叶盘。所使用的L半胱氨酸的浓度是上面指定的0、0.001、0.01、0.1、1和10mM。
图8：通过L半胱氨酸产生的田间生长的莴苣中变粉红色的减少。上方的图框(upper panel)显示采自被水浸(water logging)极端胁迫的植物的莴苣叶子的常见的变粉红色症状。主脉显示粉红色染料的存在。下方右图框显示采自在室温下用1mM L-半胱氨处理30分钟后显示变粉红色症状的叶子的叶盘。下方左图框显示在室温下用水处理30分钟后的相似的叶盘。
图9：图框A：根据本发明描述的方法针对叶盘变色对个体莴苣M2植物(按库分组的)进行的表型分析。12000个样品中总共有138个样品在该图框中展示，其中箭头所指的样品显示强烈减少的变粉红色变色。图框B：确认与显示清楚的变色反应的对照样品相比，粉红色变色的形成几乎不存在(中间位置中的样品)的图框A中指出的选择的个体的再检测。
图10：M2莴苣植物的表型。通过使用根据本发明的测定法，标记1、2、4、5、7、10和12的植物显示减少的粉红色叶盘变色。植物3、6、8、9和11是显示与野生型对照相当的粉红色叶盘变色水平的植物。植物1是显示粉红色变色的强烈减少和正常生长习性的突变体的唯一例子。植物2、4、5、7、10和12显示减少的粉红色变色和矮小、变白的表型。
图11：显示减少的变色的莴苣的突变体的后代检测。在左边，展示25个显示正常损伤诱导的变色反应的样品。在右边，展示采自一系列来源于单个突变体的35个后代植物的样品组，所述突变体在其损伤诱导的变色反应方面强烈减少。
图12.基于采自成熟莴苣植物的叶子中脉部分的褐色变色的筛选的输出表型的代表性图像。图像显示在16℃下温育3天后莴苣边叶中脉组织盘。可在损伤表面清楚地观察到常见的褐色变色。各皿包含3个在中脉的不同位置(绿色、淡绿色和白色)采集的叶盘。皿上方的数字表示向滤器中加入的L半胱氨酸的mM浓度。
图13：莴苣叶表面的L-DOPA至黑色素的转化。图框A显示1.5mML-DOPA溶液中的测定。上管是阴性对照，其他3个管相同。图框B显示在包含1.5mM L-DOPA的湿润滤纸之间的叶盘温育的结果。
图14：在中脉褐变上显示减少的损伤诱导的粉红色变色的莴苣突变体的后代检测。图框A显示减少的变粉红的突变体的编号为1至8的8株后代植物的中脉叶盘(每植物3个叶盘)。图框B显示编号为9至16的显示正常褐变反应的8株对照植物的中脉叶盘(每植物3个叶盘)。
图15：在环境大气下切割和包装后，显示减少的损伤诱导的粉红色变色或褐变反应的莴苣的突变体的评估。对照植物的头部的叶碎片示于左边，减少的变色的突变体的叶碎片示于右边。将鲜切叶材料在4℃下贮存6天。可在对照样品中清楚地观察到褐色变色，然而突变体样品保持不变。
实施例
实施例1
使用ems对莴苣进行的遗传修饰
将莴苣品种Troubadour、Apache、Yorvik和Roderick的大约2000粒种子在室温下在24小时期间于0.05％(w/v)或0.07％(w/v)的ems的充气溶液中进行温育。在ems处理后，用水漂洗M1种子，然后在20℃下在16小时光照、8小时黑暗的方案下种植在温室中，让其长成成熟的植物，诱导抽苔和开花以产生M2种子。在成熟后，收获M2种子，聚集成堆，然后贮藏以待进一步使用。基于具有变白的表型的个体植物(所述植物的叶绿素生物合成被扰乱)的相对数目估计突变频率。
实施例2
基于粉红色色素形成诊断莴苣的损伤诱导的变色的表型筛选的发展
发展其中可容易地评估由损伤诱导的莴苣的叶变色的表型测定法。该方法允许针对变色进行幼小植物的筛选。从幼小或成熟的植物采集直径5mm的叶盘并且将其置于皿中的湿润的滤纸之间。将系统在5℃下温育7天。在温育过程中，变得如在滤纸上打印的圆一样清楚可见的粉红色染料在叶盘的损伤位置产生(图2)。
为了证明粉红色染料的产生需要活性苯基丙酸类通路，在该测定中检测PAL(肉桂醛，图3)和PPO(L半胱氨酸，图4)的抑制剂的效应。当在测定过程中使用肉桂醛时，粉红色变色在0.01％或更高的浓度被完全抑制。
使用L半胱氨酸，在0.001％和更高的浓度上获得相似的结果，然而其他氨基酸如L亮氨酸或L丙氨酸不显示任何效果。这证明L半胱氨酸可抑制莴苣叶盘的变粉红色反应且L半胱氨酸的抑制作用是特异性的。
为了证明L半胱氨酸在该系统中确实用作PPO活性的抑制剂，将莴苣叶盘与PPO底物L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)一起温育。尽管认为L-DOPA不是莴苣PPO的天然底物，但在损伤表面观察到深褐色至黑色的变色，所述变色是通过PPO形成黑色素的表现。当同时使用1mM或更高浓度的L半胱氨酸时，如图5中所示，变色被完全抑制。
通过在诱导损伤反应前使用热激来进一步表征莴苣叶盘变粉红色的反应。在21、40、50和60℃的温度下在90秒期间温育分离的叶。在该处理后，采集叶盘，针对变粉红色对其进行测定。当在50℃或更高的温度下进行热激时，变粉红色反应被完全抑制。该结果显示于图6中。
由于已知L半胱氨酸与作为PPO产物的邻醌反应(通过将它们转化回无色的二酚)，因此确定L半光氨酸对来自莴苣叶盘的粉红色染料的影响。平行地确定L半胱氨酸对黑色素形成(与L-DOPA温育后)的影响。
根据上述方法采集和温育叶盘。在完成损伤反应后，向叶盘加入一系列浓度的L半胱氨酸，监测颜色的变化。结果示于图7中。该实验清楚地证明L半胱氨酸将粉红色染料转化回无色化合物，然而L-DOPA测定中形成的黑色的黑色素不受L半胱氨酸影响。这证明粉红色染料很可能是由莴苣多酚氧化系统形成的邻醌。
为证明体外观察到的反应反映生理上相关的反应，将基于L半胱氨酸的变色用于田间生长的植物材料。这可通过从沿着叶脉显示强烈的变粉红色症状的田间生长的莴苣收获叶子来进行。当例如通过严重水浸的条件胁迫植物时，通常观察到该现象。叶子用于制备立即由1mML半胱氨酸温育的叶盘。在室温下在大约30分钟的温育后，如图8中所示，粉红色变色消失。
综合起来，这些实验数据显示，可通过损伤诱导莴苣叶盘以产生PAL和PPO依赖性的粉红色变色。该表型允许针对莴苣突变体的有效率的和有效的筛选方法，所述莴苣突变体具有改良的、通过PAL、PPO或两者介导的损伤反应诱导的变色。
实施例3
筛选具有减少的损伤诱导的变色的突变体
为了鉴定具有低损伤诱导的酶促褐变或变粉红色潜能的莴苣突变体，将实施例2中描述的叶盘测定法用于莴苣突变体群体的植物。
在温室中栽培12000株植物(位置：De Lier，the Netherlands；播种，3月28日；种植，4月18日；在常规的莴苣的生长条件下进行生长)，从各个个体植物采集叶盘(从5月15日开始采样)，将叶盘作为(平均)25个样品的库在5℃下在湿润的滤纸之间温育7天。依赖于粉红色变色的强度给每一个叶盘进行视觉评分。基于该评估，选择其叶盘显示没有或显示具有相对低程度的损伤表面变色的植物。将具有几乎看不到的微量变色的植物编号为06D.210202。
在12000株植物中，最终选择1株只显示微量的几乎看不见的变色的植物和11株显示相对低变色水平的植物。这些测定中的一个测定的结果示于图9。
对最初选择的12个个体重复变色测定，对于大多数个体情况，确认了最初的结果。只选择确认的个体进行进一步的分析和种子生产。
实施例4
筛选具有减少的损伤诱导的变色的突变体
为了鉴定具有低损伤诱导的酶促褐变潜能的莴苣突变体，将实施例2中描述的叶盘测定法用于莴苣突变体群体的植物。将8500株植物种植在温室中直至3周龄(6-8叶期)并且从各个体采集叶盘，将所述叶盘在5℃下于湿润的滤纸之间温育7天。
依赖于粉红色变色的强度给予各叶盘视觉评分。基于该评估，选择其叶盘显示没有或显示相对低程度的损伤表面变色的植物。在8500株植物中，选择8株不显示任何可见变色的植物和10株显示相对低的变色的植物。对18个最初选择的个体重复变色测定，对于大多数个体情况，确认了最初的结果。12个个体示于图10。只选择确认的个体用于进行进一步的分析和种子生产。给1株不具有多效副作用(例如，变白、变矮)的突变植物赋予编号05D.202539。通过该植物的自交产生的种子被编号为05D.810596。通过3株从05D.810596的种子生长而来的植物的自交产生的种子编号为07G.9979并且保藏在NCIMB。NCIMB号是41441(于2006年10月10日保藏)。
实施例5
选择的显示减少的损伤诱导的变色的突变体的表型分析
在选自实施例3中提供的筛选的12个突变体中，6个显示强烈减少的生长表型和变白。其他突变体发育正常，即与诱变实验的起始群体的类型一致。
变矮和变白的突变体的叶绿体功能可能被扰乱。由于PPO存在于这些细胞器中，这可以解释叶盘测定中相对低的反应。由于该多效突变是不希望的，因此这些突变体被认为是不太适切的。
显示最强的叶盘变色的减少的突变植物06D.210202显示了正常表型，因此突变被认为对于变色是特异性的，不具有强多效性。
实施例6
后代中几乎不存在变色表型的确认
为了证明莴苣突变体如来自实施例3和5的植物06D.210202的减少的变色是由通过本文中描述的诱变处理产生的遗传效应引起的，通过自交产生种子。通过植物06D.210202的自交产生的种子编号为06D.819784。将种子在土壤中萌发，使用叶盘变粉红色测定法针对变色检测植物。
实验清楚地显示改变的表型具有遗传基础，因为所有后代植物显示相似的表型，即粉红色变色的强烈减少，与用于产生种子的突变体相似。在图11中说明该结果。
通过3株从06D.819784的种子生长的植物的自交产生的种子编号为06D.863B2并且在NCIMB保藏。NCIMB号为41454(于2007年1月3日保藏)。
实施例7
基于褐色色素形成诊断莴苣的损伤诱导的变色的表型筛选的发展
将莴苣生长至成熟，通过从叶脉组织切割叶盘来采集边叶的部分。将叶盘在16℃下在湿润的滤纸上进行温育。在大约72小时后，损伤表面转变成褐色。在10mM L半胱氨酸存在的情况下，褐变反应被抑制，这表明观察到的变色是PPO介导的。这样的实验的代表性结果显示图12中。
由于如图12中展示的反应是PPO介导的褐变反应，因此为了筛选显示减少的在莴苣的加工过程中发生的褐色变色的突变体，如本实施例中描述的筛选方法可以认为是有效的和无偏性的。
实施例8
基于L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)转化回称为黑色素的黑色色素诊断莴苣的损伤诱导的变色的表型筛选的发展
除了在广义上说明损伤诱导的变色的测定外，根据本发明的方法也允许以更特异的方式筛选具有减少的PPO活性的突变体。通过使用在1.5mM L-DOPA存在的情况下温育的叶盘来发展显示PPO活性的表型测定法。由于黑色变色变得明显，可推断出，可通过多酚氧化系统在莴苣叶的损伤表面容易地将L-DOPA转化成称为黑色素的黑色色素。通过PPO将L-DOPA转化成反应性L-DOPA-醌，该L-DOPA-醌通过多巴色素和吲哚醌非酶促地转化成黑色的黑色素。
此外，显示可在反应期间通过加入1mM L半胱氨酸来抑制反应(图5)。因此，该分析使得能够鉴定突变体，所述突变体在叶的损伤表面产生PPO活性的能力发生改变。如图13中所显示的，可在溶液和湿润的滤纸之间观察到莴苣叶盘对L-DOPA的存在的反应。
实施例9
使用叶脉叶盘褐变测定法(ribdisc browning assay)针对减少的褐变反应评估显示几乎不存在变色的突变体的后代
为了证明莴苣突变体(如来自实施例3、5和6的、叶盘的损伤表面的粉红色变色显著减少的植物编号06D.210202)的减少的变色也在损伤诱导的褐变反应中有效地减少，将许多后代植物生长至成熟。
在发育的该阶段，从许多后代植物的边叶采集3个中脉叶盘。根据实施例7中描述的方法温育这些叶脉叶盘。显示，较早显示强烈减少的损伤诱导的粉红色变色的突变体的后代植物也强烈地减少损伤诱导的中脉褐变。该实验的结果示于图14。
实施例10
使用包装在塑料袋中的鲜切莴苣头针对减少的褐变反应评估显示几乎不存在变色的突变体的后代
使用刀将从来自实施例6的种子编号06D.819784生长而来的、叶盘的损伤表面的粉红色变色显著减少的莴苣植物的成熟头部切成碎片，并且包装在包含环境大气的塑料袋中。以相同的方式处理显示正常叶盘粉红色变色反应的对照植物。在6天期间，在4℃下贮存袋子之后，针对其褐变反应评估叶材料。
该实验显示较早显示损伤诱导的粉红色变色的强烈减少的突变体的后代植物，当使用环境大气进行加工和贮藏在塑料袋中时，损伤诱导的中脉褐变也强烈减少。该实验的结果示于图15。

Claims (41)

1.一种方法，所述方法用于针对其中存在的与对照植物或植物部分相比显示减少的损伤诱导的表面变色的个体而筛选植物或植物部分的群体，所述方法包括
a)提供植物的群体或来自该群体的植物的部分；
b)在待筛选的植物或植物部分以及对照植物或植物部分上产生损伤表面；
c)温育损伤表面以允许变色在其内或其上发生；
d)观察植物或植物部分内或其上的损伤表面变色；
e)将在待筛选的植物或植物部分内或上观察到的损伤表面变色与在对照植物或植物部分内或上观察到的变色比较，从而鉴定显示没有变色或与对照植物或植物部分相比减少的变色的植物或植物部分。
2.权利要求1中所述的方法，其中植物是蔬菜植物、结果的植物或开花植物。
3.权利要求2中所述的方法，其中植物是选自莴苣、苦苣、witloof、马铃薯、甘薯、块根芹菜、蘑菇、朝鲜蓟和茄子的蔬菜植物。
4.权利要求2中所述的方法，其中植物是选自苹果、香蕉、鳄梨、桃子、梨子、杏子和芒果的结果的植物。
5.权利要求2中所述的方法，其中植物是选自大丁草和菊花的开花植物。
6.权利要求1-3任一项中所述的方法，其中植物属于菊科，特别地属于莴苣属，更特别地属于莴苣种。
7.权利要求1-3任一项中所述的方法，所述植物属于菊苣属，和特别地属于菊苣和苦苣种。
8.权利要求1或2中所述的方法，其中植物部分选自叶、头、枝、根、块茎、茎、花、果实、种子或其碎片和细胞。
9.权利要求6或7中所述的方法，其中植物部分是叶盘。
10.权利要求6或7中所述的方法，其中植物部分是来自中脉组织的叶盘。
11.权利要求1-10任一项中所述的方法，其中植物群体是突变体植物的群体、种质集合体、转基因植物的群体或突变的细胞悬浮物。
12.权利要求11中所述的方法，其中通过使用化学物质和/或辐射进行诱变处理获得突变体植物的群体。
13.权利要求1-12任一项中所述的方法，其中温育在水性环境中发生。
14.权利要求13中所述的方法，其中水性环境包括湿润的滤纸。
15.权利要求13中所述的方法，其中水性环境包括水或溶液。
16.权利要求14或15中所述的方法，其中水性环境包含选自L-3，4-二羟基苯丙氨酸、绿原酸、异绿原酸、L酪氨酸和儿茶酚的化合物。
17.权利要求1-16任一项中所述的方法，其中对照植物是当其叶盘在5℃下在两张湿润的滤纸间温育7天时，显示围绕边缘的粉红色变色的植物。
18.显示减少的损伤诱导的表面变色的植物，所述植物可通过将植物群体经历权利要求1-17任一项中所述的筛选方法，然后从群体中选择在筛选中没有显示表面变色的或在筛选中显示与对照植物相比减少的表面变色的植物来获得。
19.权利要求18中所述的植物，其中植物是蔬菜植物、结果的植物或开花植物。
20.权利要求19中所述的植物，其中植物是选自莴苣、菊苣、witloof、马铃薯、甘薯、块根芹菜、蘑菇、朝鲜蓟和茄子的蔬菜植物。
21.权利要求19中所述的植物，其中植物是选自苹果、香蕉、鳄梨、桃子、梨子、杏子和芒果的结果的植物。
22.权利要求19中所述的植物，其中植物是选自大丁草和菊花的开花植物。
23.权利要求18中所述的植物，所述植物属于菊科，特别地属于莴苣属和更特别地属于莴苣种。
24.权利要求18中所述的植物，所述植物属于菊苣属，特别地属于菊苣和苦苣种。
25.权利要求18-24任一项中所述的植物，其中植物显示减少的损伤诱导的叶变色和没有显示负面的多效性。
26.权利要求18-20和23任一项中所述的植物，所述植物是其种子按在表1中所列的日期和登录号由NCIMB保藏的莴苣植物。
27.权利要求18-25任一项中所述的植物，所述植物可通过将权利要求26中所述的植物与相同种的另一植物杂交来获得。
28.权利要求18-27任一项中所述的亲本植物的后代，所述后代显示如在亲本植物中发现的损伤诱导的叶变色的不存在或减少。
29.权利要求18-28任一项中所述的植物的部分。
30.权利要求29中所述的部分，所述部分选自叶、头、茎、枝、根、块茎、果实、花、种子或其碎片和细胞。
31.权利要求29或30所述的部分，所述部分可通过权利要求1-17任一项中所述的方法获得。
32.从权利要求29、30或31中所述的植物部分再生的植物，所述植物显示如在亲本中发现的损伤诱导的叶变色的不存在或减少。
33.权利要求18-28以及32任一项中所述的植物的种子。
34.来自于权利要求33中所述的种子的后代，所述后代显示在亲本中发现的不存在或减少的损伤诱导的叶变色。
35.蔬菜产品，其包括权利要求18-20、23-34任一项中所述的蔬菜植物或其部分。
36.权利要求35中所述的蔬菜产品，其中蔬菜是叶类蔬菜。
37.权利要求36中所述的蔬菜产品，其中蔬菜选自莴苣、苦苣和菊苣。
38.权利要求37中所述的蔬菜产品，其中所述产品是加工的莴苣、加工的菊苣、加工的苦苣或其组合。
39.来源于权利要求18-19、21、28-34任一项中所述的植物的果实。
40.来源于权利要求18-19、22、28-34任一项中所述的植物的花。
41.权利要求38-41任一项中所述的产品，其中当在权利要求1-17任一项中所述的方法中进行筛选时，产品没有显示或显示有限的损伤诱导的叶变色。
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