CN101402948B - 耐高温α-淀粉酶生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物工程酶制剂技术领域，公开了一种耐高温α-淀粉酶的生产方法。该生产方法采用地衣芽孢杆菌为菌株，以玉米为碳源、氮源，通过一级种子罐发酵、大罐补料分批发酵、精滤、杀菌处理生产出耐高温、高活性α-淀粉酶。发酵单位最高达到13480u/ml，平均发酵产酶水平12360u/ml，较工艺优化前的发酵水平7982u/ml提高54.5％；每标吨酶消耗淀粉量19.8kg，较分批发酵24.8kg减少5kg，形成了一套完整的耐高温α-淀粉酶发酵补料工艺，实现了耐高温α-淀粉酶工业化规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程酶制剂的生产方法，具体涉及一种耐高温α-淀粉酶的生产方法。
背景技术
耐高温α-淀粉酶作为一种新型酶制剂在发酵与粮食深加工工业有广泛的应用和良好的市场前景，目前广泛用于酒精、啤酒、味精、有机酸、淀粉糖及制药等行业，其产量和销售额逐年增加。我国从80年代起，开始耐高温α-淀粉酶的生产技术研究，上海工业微生物研究所以地衣芽孢杆菌为出发菌株通过诱变处理，使产酶单位由1-2单位/毫升提高到100单位/毫升左右。直到1989年开始引进国外菌种进行工业化生产，经过这十几年的努力，发酵活力从不足500u/m1提高到8000u/m1，个别厂家达到8500-9000u/m1，但这与美国、丹麦等国家的耐高温α-淀粉酶发酵水平25000u/ml相比还有很大差距。
目前，国内对耐高温α-淀粉酶的研究多集中于菌株传统诱变选育或通过基因工程构建基因工程菌研究上，对发酵工艺进行系统研究的不多，相关文献报道较少。林剑、崔京春等(无锡轻工大学学报，2003年七月第22卷期)通过对培养剂配方或发酵工艺的调整，使发酵活力有所提高，但未对培养基和发酵工艺同时进行优化，活力提高也未超过10％；余诗庆等(食品与发酵工业，2007年第33卷第七期)通过 摇瓶实验对发酵培养基和工艺进行了优化研究，在50L全自动发酵罐进行了验证，发酵活力提高了14％，达到14900u/ml，而没有进行更大的中试和工业化试生产。而中国专利2007100361599报道了一种高活性、高纯度耐高温α-淀粉酶生产工艺，采用二次发酵，基础料加补料、脉冲进氨，以熟豆粕为氮源的工艺，采用控制发酵温度43℃，PH6.8进行发酵，经絮凝、压滤、循环初滤、精滤得耐高温α-淀粉酶产品，其工艺较为复杂，使其规模化推广受到影响。
目前，在耐高温α-淀粉酶的工业化生产过程中，由于缺少系统的理论依据，生产厂家多根据生产经验来指导生产，生产管理和技术指导盲目性大，加之耐高温α-淀粉酶属于中性发酵环境，发酵成功率不高，造成生产成本偏高，市场竞争力不强。适时开展耐高温α-淀粉酶发酵工艺技术系统研究意义重大。
发明内容
本发明目的在于提供一种以玉米淀粉和玉米粉为碳源，对培养基和发酵工艺同时优化，工艺条件简单，适合工业化生产的高活性、耐高温α-淀粉酶新工艺。
为实现本发明目的，技术方案通过如下步骤实现：
1、选取菌种：采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，购于广州微生物研究所。
2、1.5吨种子罐发酵，培养基配方：玉米淀粉6％～10％，玉米浆1％～3％，豆粕2％～5％，磷酸二氢钾0.3％～0.6％，磷酸氢二钾0.5％～2％，柠檬酸钠0.1％～0.3％，余量为水，各组分以重量百分比计；加 高温淀粉酶液化，消后pH6.2—6.5。用茄子瓶接入种母，温度37±1℃，通风量25-40m3/h，pH值6.4，培养时间24-36小时。3.35吨发酵罐发酵，培养基配方：玉米淀粉15％～30％，玉米粉5％～10％，豆粕1％～8％，玉米浆2％～5％，磷酸二氢钾0.1％～0.8％，磷酸氢二钾0.8％～2％，柠檬酸钠0.05％～0.4％，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，pH6.2—6.4。温度42±1℃，风量400—1000m3/h，pH值6.4—6.8，培养时间80—100小时；在上述条件下补料分批发酵：以淀粉浓度为150～280g/L为发酵初糖浓度，以质量百分比40％～70％的淀粉糖溶液作为发酵补料物，在DE值降至10～60mg/ml时以阀门开启程度的大小为依据开始持续流加补料，维持发酵液中DE值约为10～60mg/ml，控制总糖浓度达到220～320g/L时停止补料。
4.提取浓缩工艺：经絮凝、压滤，二次过滤后，采用国外进口超滤膜浓缩设备(超滤膜系美国星达公司生产，UF809型，截留分子量为10000)，加装料液循环冷却装置进行超滤，保持料液浓缩过程中温度20℃--45℃，以减少酶活性损失；最后采用精滤板框过滤机，配合硅藻土预涂工艺进行过滤除菌，最终生产出高质量成品。
本发明有益效果在于：1.以产耐高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌为研究对象，通过大量实验研究，优化了发酵工艺技术，探讨了耐高温α-淀粉酶发酵培养基初始DE值对发酵的影响，以及发酵过程中溶氧、PH值等各种参数的变化与控制，掌握了该菌种的发酵产酶规律；2.采用间歇补料分批发酵工艺生产耐高温α-淀粉酶，经过多批 次的工业化生产试验，发酵单位最高达到13480u/ml，平均发酵产酶水平12360u/ml，较工艺优化前的发酵水平7982u/ml提高54.5％；每标吨酶消耗淀粉量19.8kg，较分批发酵24.8kg减少5kg，形成了一套完整的耐高温α-淀粉酶发酵补料工艺，实现了年产2000吨耐高温α-淀粉酶工业化规模生产；3.开发出酶活力在40000u/ml的成品新剂型，填补了国内耐高温α-淀粉酶只有10000u/ml、20000u/ml剂型而没有40000u/ml剂型的空白；4、产品提取工艺中增加了二次过滤、精滤及硅藻土预涂工艺过滤除菌，解决了产品耐温性差、细菌总数居高不下难题，并开发出高活性产品。
具体实施方式
为对本发明进行更好的说明，举实施例进一步说明本发明工艺：1、选取菌种：采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其摇瓶发酵产酶能力为6000u/ml，购于广州微生物研究所。
2、1.5吨种子罐发酵，培养基培养条件：玉米淀粉8％，玉米浆3％，豆粕5％，磷酸二氢钾0.4％，磷酸氢二钾1％，柠檬酸钠0.14％，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，消后pH6.5。用茄子瓶接入种母，温度37±1℃，通风量40m3/h，pH值6.4，培养时间30小时。
3、35吨发酵罐发酵，培养基培养条件：玉米淀粉25％，玉米粉10％，豆粕5％，玉米浆2％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.5％，磷酸氢二钾1％，柠檬酸钠0.2％，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，pH6.4；温度42±1℃，风量800m3/h，pH值6.5，培养时 间102小时。
4、采用35吨发酵罐进行补料分批发酵，依据上述确定的参数，选择以淀粉浓度为240g/L为发酵初糖浓度，以质量百分比60％的淀粉糖溶液作为发酵补料物，在DE值降至50mg/ml时以阀门开启程度的大小为依据开始持续流加补料，维持发酵液中DE值约为50mg/ml，控制总糖浓度达到300g/L时停止补料。
5、提取浓缩工艺：经絮凝、压滤，二次过滤后，采用国外进口超滤膜浓缩设备(超滤膜系美国星达公司生产，UF809型，截留分子量为10000)，加装料液循环冷却装置进行超滤，保持料液浓缩过程中温度35℃，以减少酶活性损失；最后采用精滤板框过滤机，配合硅藻土预涂工艺进行过滤除菌，最终生产出高质量成品。硅藻土选用江西萍乡助滤剂厂生产的300#硅藻土；精滤板框过滤机，是板框过滤机中的一种，它是利用特殊工艺材料编织而成的滤布(本试验选用杭州市兴源板框过滤机厂提供的维尼纶合成纤维专用滤布)作过滤介质，并配以硅藻土预涂工艺，达到除菌目的，其原理是利用硅藻土较大的比表面积(10-20m2/g)，较少粒度2-100um，这种颗粒具有较大的吸附和渗透能力，能滤降0.1-1.0um粒子和菌体，在以滤布为支持介质的表面上预涂硅藻土薄层(预涂层)以保护支持介质的毛细孔道在较长时间内不被悬浮液中的固体粒子所堵塞，从而提高过滤速度，达到稳定过滤除菌效果。
对比实验实施例
1.分批发酵与补料分批发酵试验结果对比
| 发酵 方式 | 投入淀 粉量 (kg) | 投料浓度 (m/v)， g/L | 发酵 周期(h) | 放罐 体积 (m<sup>3</sup>) | 放罐平均 酶活力 (u/ml) | 标吨酶 (V*E) | 标吨酶耗 淀粉量 (kg) | 经济 效益 |
| 分批 | 3600 | 200 | 86 | 18.15 | 7982 | 145 | 24.8 | 一般 |
| 补料 分批 | 5400 | 245 | 102 | 22 | 12360 | 272 | 19.8 | 好 |
上表表示不同工艺条件下，二者的变化趋势基本相同，但补料分批发酵除发酵周期增加20h外，其余的酶活力、放罐体积、标吨酶耗淀粉量等结果都明显好于分批发酵。每标吨酶耗淀粉量减少5kg，能耗也大幅下降，综合经济效益显著。补料分批发酵最终产酶12360u/ml，而分批发酵的最终酶活只有7982u/ml。这主要是由于分批发酵后期，原料已基本消耗，没有足够的原料用于产物合成，而补料分批发酵中原料能更加合理地被菌体利用，从而合成更多的耐高温α-淀粉酶。
1.国内外同类产品对比
优化了耐高温α-淀粉酶发酵工艺技术，并开发出酶活力在40000u/ml的成品剂型，实现了年产2000吨耐高温α-淀粉酶的工业化规
模生产。与国内外同类生产厂家相比较，优化后的工艺技术更科学合理，开发的新剂型产品性能稳定，填补了国内耐高温α-淀粉酶只有10000u/ml、20000u/ml剂型而没有40000u/ml剂型的空白。
2.精滤除菌试验结果
注：除菌率＝(精滤前细菌总数—精滤后细菌总数)/精滤前细菌总数×100％
上述试验可以看出，通过精滤工艺成品中酶活力基本没有损失，杂菌数大幅度降低，细菌总数控制在5000个/ml以下(标准为5×104个/ml)，除菌率稳定在95％以上。产品经成品精滤除菌后，常温存放90天，杂菌数几乎没有增长或增长甚少，达到了试验设计的目的，效果明显，提高了产品质量。
Claims (1)
1.耐高温α-淀粉酶生产工艺，采用地衣芽孢杆菌为菌株，通过一级种子罐发酵、大罐发酵、过滤、成品处理制得，其特征在于，通过如下步骤实现：(1)选取菌种：采用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)；(2)、1.5吨种子罐发酵，培养基配方：玉米淀粉6％～10％，玉米浆1％～3％，豆粕2％～5％，磷酸二氢钾0.3％～0.6％，磷酸氢二钾0.5％～2％，柠檬酸钠0.1％～0.3％，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，消后pH6.2—6.5；用茄子瓶接入种母，温度37±1℃，通风量25-40m3/h，pH值6.4，培养时间24-36小时；(3)、35吨发酵罐发酵，培养基配方：玉米淀粉15％～30％，玉米粉5％～10％，豆粕1％～8％，玉米浆2％～5％，磷酸二氢钾0.1％～0.8％，磷酸氢二钾0.8％～2％，柠檬酸钠0.05％～0.4％，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，pH6.2—6.4；温度42±1℃，风量400—1000m3/h，pH值6.4—6.8，培养时间80—100小时；在上述条件下补料分批发酵：以淀粉浓度为150～280g/L为发酵初糖浓度，以质量百分比40％～70％的淀粉糖溶液作为发酵补料物，在DE值降至10～60mg/ml时以阀门开启程度的大小为依据开始持续流加补料，维持发酵液中DE值约为10～60mg/ml，控制总糖浓度达到220～320g/L时停止补料；(4)、提取浓缩工艺：经絮凝、压滤，二次过滤后，采用超滤膜浓缩，保持料液浓缩过程中温度20℃--45℃；最后采用精滤板框过滤机，配合硅藻土预涂工艺进行过滤除菌，最终生产出成品。
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