CN101392026A - 用于预防和治疗纤维化类疾病以及肝癌的多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽、其变异形式或其活性衍生物，所述多肽包括SEQID NO：1序列。本发明还涉及编码这种多肽的核酸分子，该多肽在预防和治疗人或动物组织纤维化中的用途，该多肽在预防和治疗肝癌以及预防和治疗肿瘤转移中的用途，以及包含该多肽的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及用于预防和治疗纤维化类疾病以及肝癌的多肽，具体涉及通过抑制血小板衍生生长因子受体来预防和治疗纤维化类疾病、肝癌以及肿瘤转移的多肽。
背景技术
器官(组织)中在外部刺激、损伤等作用下，会产生不正常的纤维化，如肝纤维化、心肌纤维化、腹膜纤维化、椎间盘纤维化、骨髓纤维化、肺纤维化和肾纤维化等等。这些不正常的纤维化能够引起多种疾病的发生，例如肝脏细胞的纤维化最终将导致肝硬化、肝癌等多种肝脏疾病；肾纤维化是各种致肾小管及间质病变的最终结果，也是导致终末期肾衰的主要原因之一；肺纤维化能够导致肺顺应性降低、肺容量减少、弥散功能降低、通气/血流比例失调，最终导致肺衰竭死亡，5年生存率低于50％。
研究显示肝纤维化、骨髓纤维化、肺纤维化和肾纤维化的发生都与血小板衍生生长因子(PDGF)家族及其受体PDGFR的过度合成具有相关性。
由肝炎——肝纤维化——肝硬化组成的“三步曲”是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的主要中间环节。如果肝纤维化得不到及时治疗，必将发展为肝硬化，以至肝癌。
肝纤维化(liver fibrosis，LF)是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的增生与降解失去平衡，导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程，它是一种严重危害人类健康的肝脏疾病。病毒性肝炎、化学性肝损伤、脂肪肝等是引起肝纤维化的重要原因，流行病学调查显示，病毒性肝炎感染者中四分之一的患者会转化为慢性肝炎，慢性肝炎患者中5-20％会发展成肝硬化，而肝硬化患者中50％会最终发展成肝癌，可见肝硬化是肝癌发生的重要环节。一旦形成肝纤维化，正常生理条件下不可逆转，从而导致肝脏功能部分甚至全部丧失，严重威胁人类健康。
尽管各种类型的肝细胞对肝纤维化都有一定的影响，但是肝星状细胞(hepatic stellate cells，英文缩写HSC)在该疾病的发展过程中起了致关重要的作用。
正常肝脏中HSC的数量很少，与肝细胞数量之比为1：20，其总体积占肝体积的1.4％。HSC主要具有以下功能：(1)储存和代谢维生素A；(2)合成和分泌少量的ECM，主要有I、III、VI型；(3)HSC突起包绕在SEC外表，对内皮细胞起支撑作用，并有调节肝窦大小的作用；(4)合成非胶原糖蛋白和蛋白多糖等功能。
研究显示，肝纤维化的发生是由于肝脏组织中的HSC被激活，最先发生的是血小板衍生生长因子C(简称PDGF-C)和血小板衍生生长因子受体(简称PDGFR)mRNA和蛋白过度表达，通过信号传导作用，通过旁分泌和自分泌作用激发了一系列的、与胶原蛋白形成相关的细胞因子如TGF-β1、PDGF-BB等的表达。这些细胞因子的活跃表达和作用使得胶原蛋白过度合成；同时分泌抑制胶原降解的金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1、TIMP-2)等，导致ECM沉积的自我调节能力失衡，胶原蛋白大量沉积并永久存在于肝脏组织内，致使HSC成为类肌纤维母细胞(myofibroblast-like，MFB)，并使周围的肝细胞被胶原包围，丧失了原有的功能。
肝纤维化发展过程中会导致肝组织充血，发生变性，最终形成肝癌。因此针对肝纤维化的预防和治疗药物对防止肝癌的发生和通过抗纤维化对肝癌进行辅助治疗具有积极的意义。
血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)家族包含4种亚型(PDGF-A，-B，-C，和-D)，以及两种受体链(PDGFR-α和-β)，在伤口愈合、动脉粥样硬化、纤维化和恶性肿瘤中发挥了重要作用。PDGF—C是最近才发现的，PDGF—C自身形成二聚体PDGF-CC，具有比PDGF—AA、PDGF—AB和PDGF—BB对间充质细胞(mesenchymal cells)更强的生理作用(Gilbertson et.al)。
利用实时PCR技术，Breitkopf团队研究了HSC培养过程中PDGF—C的mRNA表达量的变化，无论是否给予外界刺激诸如添加PDGF-BB或TGF-β1，HSC细胞变成MFB时，PDGF-C mRNA表达量大大提高。在第2天到第8天，PDGF-C mRNA增长了5倍。这一研究显示PDGF—C对肝纤维化的形成具有一定影响(Breitkopf et.al)。
PDGF—C是一个多结构域蛋白，由345个氨基酸氨基酸组成，N末端(46—163片段)与神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1，NP-1)的CUB区域同源，C末端有一个生长因子区域(growth factor domain，GFD，235-345片段)，与其他PDGF家族成员的同源性在23％。这两个片段能够被来自血液中的蛋白酶剪切形成。PDGF-C能够直接与PDGFR-α和PDGFR-β受体结合，利用竞争结合试验和免疫沉淀试验证实PDGF—CC(PDGF-C的二聚体)和PDGFR-α和PDGFR-β都能够很好的结合(Gilbertson et.al)。而且PDGF—CC可以强烈促进PDGFR-α和PDGFR-β上的酪氨酸被磷酸化和激活。通过上述实验我们可以了解到，PDGF-CC的GFD片断与PDGFR α/α(PDGFR β/β)同型二聚体(homodimer)和PDGFR α/β杂合二聚体(heterodimer)均有非常好的结合力。
肾纤维化是各种致肾小管及间质病变的最终结果，也是导致终末期肾衰的主要原因之一。肾纤维化是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同通道和共同病理改变，其病理特征为进行性细胞外基质(ECM)积聚和肾小球细胞丢失。在肾脏病转归中起主要作用，其发生、发展是一个复杂的病理过程，是由许多因素共同作用的结果，如PDGF、转化生长因子(TGF-β)、结缔组织生长因子等。PDGF与肾脏疾病的各个方面有关，主要是诱导系膜细胞增生和肾小管间质纤维化。在正常大鼠中，PDGF-AA主要位于乳头区，对细胞迁移发挥作用；PDGF-BB在肾小管和间质细胞有微弱表达，表现为促进细胞DNA合成和有丝分裂；PDGF-CC由肾小球内皮细胞、血管平滑肌细胞、肾小管毛细血管内皮细胞表达，当系膜细胞、脏层上皮细胞和间质细胞受到明显损伤时，PDGF-CC在这些细胞中表达上调，其促有丝分裂活性较PDGF-AA强，但较PDGF-BB弱，与肾脏硬化有关。
肾脏慢性炎症过程中，间质中成纤维细胞增生，其活化形式为肌成纤维细胞(Myofibroblast，MyoF)。后者可表达α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin α-SMA)，参与肾小管间质纤维化。对小鼠肾小管间质分别注入PDGF-AA、PDGF-BB，连用7天，结果证实PDGF-AA对肾小管间质不产生影响，而PDGF-BB则以剂量依赖性诱导肾小管间质细胞增生和纤维化。Li等发现PDGF-CC是培养的成纤维细胞致分裂原，数据表明PDGF-CC病理性表达与小管间质纤维化相联系。
对于抗Thy1.1肾炎鼠，用PDGF受体酪氨酸激酶阻断剂STI 571可显著减少系膜细胞增生，系膜细胞活化数目以及小球中IV型胶原的沉积。其机制为STI 571阻断酪氨酸激酶上ATP结合位点，自动磷酸化受抑制，从而阻止信号转导。以上表明PDGF受体拮抗剂可显著减轻肾小球硬化。
在病理状态下，PDGF表达增加，通过诱导小管间质细胞转型、炎性细胞浸润、细胞因子产生等不同机制参与肾小管间质纤维化，促使肾脏病变进一步加重。减少和抑制PDGF的合成和活性，将对肾脏纤维化起到一定的治疗作用。
外源性注入PDGF-B或PDGF-D或者使其过表达可以诱导血管系膜显著增生、肾脏纤维化。干预性研究证实PDGF-C介导肾间质纤维变性，PDGF-B和PDGF-D是血管系膜增生疾病和肾间质纤维变性关键因子。这些数据表明PDGF是肾脏疾病最具有特征性的生长因子，而且它还可以强有力地刺激肾小球膜细胞增殖。
目前，本领域中急需一种能够有效治疗和预防各种器官(特别是肝脏、肾脏和肺)纤维化以及肝癌的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防和治疗人或动物纤维化类疾病的多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的发明人发现了一组多肽序列，所述多肽序列包括PDGF—C的生长因子区域(简称GFD)的C端部分氨基酸形成的多肽，以及在其基础上改变部分氨基酸获得的系列多肽。这些多肽具有与PGDFR相结合的空间构象，而不具有PDGF家族的生理活性，即无法通过信号传导激活一系列与组织(器官)纤维化相关的细胞因子和生长因子，从而达到阻断PDGF家族——PDGFR信号传导通路，达到预防和治疗人或动物组织(器官)纤维化的目的。
本发明提供了一种多肽、其变异形式或其活性衍生物(结构相似衍生物)，所述多肽包括SEQ ID NO：1序列。
在本发明的一个优选实例中，所述多肽选自下述多肽：
(i)SEQ ID NO：2序列和其变异形式或其活性衍生物(结构相似衍生物)；
(ii)SEQ ID NO：2序列中任意半胱氨酸残基变成丝氨酸残基；
(iii)SEQ ID NO：3序列和其变异形式或其活性衍生物(结构相似衍生物)；
或
(vi)SEQ ID NO：3序列中任意半胱氨酸残基变成丝氨酸残基。
在本发明的一个优选实例中，所述多肽选自重组多肽、天然多肽或合成多肽。
本发明还提供了一种核酸序列，其编码本发明所述的多肽。
本发明还提供了本发明所述的多肽在制备用于预防和治疗人或动物组织纤维化的药物中的用途。
在本发明的一个优选实例中，所述组织包括人或动物的肝脏、肾脏或肺。
本发明进一步提供了一种用于预防和治疗人或动物组织纤维化以及肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括本发明所述的多肽以及药学上可接受的载体。
在本发明的一个优选实例中，所述药物组合物还包括其它用于预防和/或治疗人或动物组织纤维化的药物。
在本发明的一个优选实例中，所述药物组合物还与其他作用机理药物的联合使用，该其它药物包括但不限于Gleevec。
在本发明的一个优选实例中，所述药物组合物的形式为口服试剂、皮下试剂、皮内试剂、肌肉注射或静脉注射试剂。
本发明另一方面提供了权利要求1所述的多肽在制备用于预防和治疗人或动物肝癌以及预防和治疗肿瘤尤其是肝癌肿瘤转移的药物中的用途。
附图简述
图1是实施例1所得多肽的纯度HPLC图谱。
图2是实施例1所得多肽的质谱图。
图3是实施例1所得多肽的测序结果。
图4是实施例1所得多肽的抑制其α-SMA mRNA的表达电泳照片。
图5是实施例1所得多肽的引起HSC的α-SMA蛋白表达明显降低电泳照片。
图6描述了实施例1多肽可以抑制肿瘤细胞对基底膜的黏附。
图7描述了实施例1所得多肽可以抑制肿瘤细胞穿透基底膜的迁移能力。
具体实施方式
PDGF-C的活性区域是PDGF—C的C端的GFD片区域(113氨基酸)。本发明的发明人通过与其具有高度同源性的蛋白序列的一级结构和二级结构的计算机模拟，设计出一系列多肽序列，这些多肽的特征在于不会形成二聚体，与PDGFR结合而抑制GFD-PDGF-C与PDGFR结合，从而阻断了PDGF-CC——PDGFR信号传导通路，预防和治疗由于PDGFR激活而导致组织(器官)纤维化及肝硬化、肝癌、肾硬化等疾病。
本发明提供了一种多肽，它包含SEQ ID NO：1序列。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞)中产生。
在本文中，本发明多肽表示氨基酸序列为SEQ ID NO：1的多肽。此外，还包括具有与SEQ ID NO：1序列相同功能的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1—20个，较好为1-10个，更好为1-5个，最好为1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常20个以内，较好10个以内，更好5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近的或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质(多肽)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或多个氨基酸通常也不会改变蛋白质的性质。该术语还包括SEQ ID NO：1序列的活性衍生物。
在本发明中，所述多肽可以是D型、L型或其任意混合物。
在本发明的优选实例中，本发明的多肽还可具体包括以下具体形式：
(i)SEQ ID NO：2序列；
(ii)SEQ ID NO：2序列中任意半胱氨酸残基变成丝氨酸残基；
(iii)SEQ ID NO：3序列；或
(vi)SEQID NO：3序列中任意半胱氨酸残基变成丝氨酸残基。
本发明多肽可用于治疗和预防人或动物的组织(器官)纤维化类疾病，例如肝脏、肾脏和肺。
本发明多肽也可用于与例如BSA、PEG和/或人血白蛋白的等分子量的蛋白偶联，从而形成多肽偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂和BSA构成，其中所述的交联剂优选为戊二醛或EDAC。
此外，本发明的多肽和偶联物还可用于制备预防和治疗人或动物组织(器官)纤维化的药物组合物。
因此，本发明另一方面提供了一种组合物，它包含(a)安全有效量的本发明多肽、偶联物或其组合；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克到100毫克/剂，较好为100微克到50毫克/剂，更好1000微克到10毫克/剂，最好3000到5000微克/剂。
本发明所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、疾病的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然后，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约1微克到100毫克/千克体重/天，较好为100微克到50毫克/千克体重/天本发明的多肽。此外，本发明的多肽还可以与其他治疗剂(例如Gleevec)一起使用。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样的一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的，在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mark Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂(载体)的充分讨论。这类载体包括(但不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。
治疗或预防性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗或预防性组合物制成可注射剂型，例如液体溶液或悬液，还可制成在注射前适合混入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物，尤其是人。
本发明的含本发明多肽的治疗或预防性药物组合物，可以经口服、皮下、皮内、静脉注射、肌内注射等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
合成原料及相关试剂：
氨基酸原料
Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-L-Gln(Trt)-OH，Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Ile-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，Fmoc-L-Met-OH，Fmoc-L-Phe-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-L-Val-OH(苏州天马医药集团精细化学品有限公司)
缩合试剂：HBTU(苏州天马医药集团精细化学品有限公司)，HOBT(苏州天马医药集团精细化学品有限公司)，DIEA(国药集团上海化学试剂公司)
溶剂：DMF(Dikma)，DCM(Dikma)，乙腈(Fisher)
树脂：2-Chlorotrityl Chloride Resin(天津市南开合成科技有限公司)
哌啶(国药集团上海化学试剂公司)
TFA(J.T.Baker)，TIS(ALDRICH)，EDT，TIS(ALDRICH)
氮气(上海比欧气体工业公司)
无水乙醚(上海试一化学试剂有限公司)
精密电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)
仪器设备：
SYMPHONY型12通道多肽合成仪(型号：SYMPHONY，软件：Version.201厂家：Protein Technologies.Inc)
SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.SevialSystem，厂商：SHIMADZU)
LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO，
离心机(上海安亭科学仪器厂型号：TDL-40B)
实施例1：SEQ ID NO：1序列的手工固相合成
1)树脂溶涨
将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂放入反应管中，加DMF(15ml/g)，振荡30分钟。
2)接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Gly-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30分钟。
3)脱保护
去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15分钟。
4)检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃—110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
5)洗
DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
6)缩合
方法a：保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30分钟。
7)洗
DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
8)重复2至6步操作，从右到左依次连接SEQ ID NO：1序列中的氨基酸。
9)最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂。
DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10分钟。
10)从树脂上切割多肽
配制切割液(10/g)TFA 94.5％；水 2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％
切割时间：120分钟。
11)吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干，
12)用HPLC纯化多肽
将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化
Pump A：0.1％在100％水中的三氟乙酸
Pump B：0.1％在100％乙睛中的三氟乙酸
总流速：1.0ml/min
体积：30ul
波长：220nm
分级：时间(分钟) A B
05.00 90％ 10％
30.00 20％ 80％
30.10 停止
<检测器A>
Column：Venusi MRC-ODS C18 30 x 250mm
13)最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。
14)鉴定
分别取少量的成品多肽，进行纯度分析，所得多肽的纯度为97.1％(图1)；质谱分析分子量大小为5107(图2)；进行测序，所测得序列为SEQ ID No：1(图3)。
15)将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。
实施例2：SEQ ID NO：1序列的仪器固相合成
步骤：
1〕根据软件计算配制所需要的保护氨基酸溶液，和缩合试剂，切割试剂，在仪器相应的瓶里加入足量的DMF、DCM；
2〕在反应器中加入100umol FMOC-L-Gly-2-Chlorotrityl ChlorideResin，在收集切割液的管道上放如15mg的离心管；
3〕编辑程序，一般树脂的溶涨时间是30min，脱保护时间是5min、15min两次、缩合时间是30分钟，切割程序是2h；
4〕开机按照程序合成；
5〕最后将切割液用乙醚沉淀，离心，吹干，用HPLC纯化。
分别取少量的成品多肽，进行纯度分析，所得多肽的纯度为97.1％(图1)；质谱分析分子量大小为5107(图2)；进行测序，所测得序列为SEQ ID No：1(图3)。
实施例3：实施例1所得多肽对肝星状细胞增值及活化的影响
材料与方法：
1.雄性SD大鼠5只，体重(250±25)g，DMEM培养基、胰酶(含EDTA)、Lipofectamine 2000、Trizol、新生小牛血清购自Invitrogen公司；链霉蛋白酶、胶原酶B及DNA酶I购自Roche公司；Nycodenz购自Si gma公司；抗p-FAK Tyr397，Desmin及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单抗购自Santa Cruz公司。RT-PCR两步法试剂盒购自MBI公司。
2.HSC的分离和培养
用链霉蛋白酶-胶原酶原位灌注、Nycodenz等密度梯度离心分离SD大鼠HSC。HSC细胞以1.5×105/cm2浓度接种于内置盖玻片的6孔板或直径100毫米的培养皿中，用含20％小牛血清的DMEM培养基培养。HSC细胞的纯度通过维生素A的自发荧光及抗Desmin免疫细胞化学测定来检测。细胞活力用台盼蓝染色鉴定。原代HSC的纯度及活力分别可达90％及95％。HSC生长在未包被基质的塑料培养皿上可自发地获得激活表型，即表达α-SMA，而且维生素A脂滴消失。细胞融合后，激活的HSC用胰酶消化、传代。
3.MTT法测定HSC的增殖
序列为SEQ ID NO：1的多肽1μM作用24、48h或72h，用MTT法测定HSC细胞增殖的变化。
4.RT-PCR检测α-SMA mRNA表达
以Trizol试剂提取总RNA，并根据试剂盒说明进行两步法RT-PCR。
α-SMA上游引物：5’-AAGAGGAAGACA GCA CAG C TC-3’；
下游5’-GATGGATGGGAAAACAGC C-3’，
可扩增出长度为101bp的α-SMA cDNA片断；
GAPDH引物上游：5’-ACCACAGTCCATGCCATC AC-3’，
下游：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，
可扩增出长度为452bp的GAPDH cDNA片断。
5.Western blot检测α-SMA蛋白的表达
收集细胞后加入细胞裂解液，抽提总蛋白，蛋白定量使用Bradford法。取40μg细胞总蛋白10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶中蛋白电转移至PVDF上，以5％脱脂奶粉TTBS液封闭后，加入α-SMA单抗4℃孵育过夜，洗涤后加入二抗，ECL底物化学发光显色后曝光显影。
6.统计学方法
结果以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS10.0软件包进行方差分析，P<0.05认为有统计学差异。
结果
1.SEQ ID NO：1序列的多肽对HSC增殖的影响
SEQ ID NO：1序列的多肽1μM作用24h后，抑制率为45.5％±5.8％。SEQ ID NO：1序列的多肽1μM作用48或72h后，这种抑制作用更为显著，抑制率分别为61.8％±4.3％和85.6％±5.8％。
2.SEQ ID NO：1序列的多肽对HSC表达α-SMA mRNA的影响
与静息HSC不同，表达α-SMA是活化HSC最重要的特征。应用RT-PCR测定SEQ ID NO：1序列的多肽作用后α-SMA基因的表达变化。结果表明，作用48h后，可抑制其α-SMA mRNA的表达(图4)。
3.SEQ ID NO：1序列的多肽对HSC表达α-SMA蛋白的影响
应用Western Blot观察SEQ ID NO：1序列的多肽对HSC表达α-SMA蛋白的变化。结果显示，SEQ ID NO：1序列的多肽作用48h后蛋白表达开始下降，72h后，HSC的α-SMA蛋白表达明显降低(图5)。
实施例4：SEQ ID NO：1序列的多肽对肝纤维化动物模型的有效性试验
为了考察SEQ ID NO：1序列的多肽对四氯化碳诱导大鼠肝损伤的保护作用，本研究采用慢性肝纤维化模型(大鼠CCl4模型)，进行本品的主要药效学评价。
结果显示，对于大鼠CCl4慢性肝损伤模型，SEQ ID NO：1序列的多肽治疗高剂量(50μg/mg)与预防低剂量(10μg/mg)可明显降低肝系数。SEQ ID NO：1序列的多肽治疗组与预防组对多数指标均有不同程度的改善作用，与模型组相比达到统计学显著差异(P<0.01，P<0.05)的指标包括：治疗高剂量组(总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、葡萄糖)，治疗低剂量组(总蛋白、白蛋白、葡萄糖)，预防高剂量组(总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、葡萄糖)，预防低剂量组(总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、葡萄糖)。
与对照组相比，四氯化碳慢性肝损伤模型组大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显增高(P<0.05)，各治疗组均有不同程度的改善，其中治疗高剂量组具有统计学差异(P<0.05)。
病理检查模型组肝组织结构紊乱，大量肝细胞(>80％)明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡。有1例肝组织内纤维组织增生。治疗高剂量给药组较多肝细胞明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡，2例程度略重(>80％)，2例略轻(约50～60％)，4例明显减轻(<30％)。预防低剂量给药组大量肝细胞明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡，但较模型组略减轻(约60～80％)。预防高剂量给药组大量肝细胞明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡，5例程度略重(60％～80％)，3例略轻(约50～60％)。
综上，本研究表明SEQ ID NO：1序列的多肽可显著改善四氯化碳引起的肝损伤，同时亦可显著改善肝损伤引起的血清生化指标、肝脏羟脯氨酸含量和肝脏组织病理学的改变。
材料与方法
1〕受试药物
SEQ ID NO：1序列的多肽(实施例2)；
注射用药，正大天晴提供；
阳性药甘利欣(甘草酸二铵)注射液，10ml:50mg，江苏正大天晴药业股份有限公司。
2〕动物
SD大鼠，180-220g，雌雄各半；
3〕主要试剂
四氯化碳，上海凌峰化学试剂有限公司，批号：061101；
麻油，精制花生油，市售优质品；
羟脯氨酸检测试剂盒，南京建成；
4〕主要仪器
BS210S精密电子天平(0.1mg～10g)，德国赛多利斯(sartorius)；
752C紫外可见分光光度计，上海第三分析仪器厂；
普通离心机(北京医用离心机厂)；
全自动生化测定仪(OLYMPUS Au 800，日本)；
FEJ-200电子天平(0.1～200g)，福州富日衡之宝电子有限公司。
5〕实验方法
大鼠四氯化碳慢性肝损伤模型
剂量与分组
110只大鼠，体重180-220g，本次试验共设组7组，分组如下：
(1)正常组 生理盐水，sc，2ml/kg，10只大鼠。
(2)模型组 40％CCl4，sc，2ml/kg，17只大鼠。
(3)甘利欣 25mg/kg，iv，10ml/kg，15只大鼠。
(4)预防高剂量组 50μg SEQ ID NO：1序列的多肽/kg，iv，10ml/kg，17只大鼠。
(5)预防低剂量组 10μg SEQ ID NO：1序列的多肽/kg，iv，10ml/kg，17只大鼠。
(6)治疗高剂量组 100μg SEQ ID NO：1序列的多肽/kg，iv，10ml/kg，17只大鼠。
(7)治疗低剂量组 20μg SEQ ID NO：1序列的多肽/kg，iv，10ml/kg，17只大鼠。
造模及给药方法
除正常对照组外，(2)～(6)组，每周皮下注射40％ CCl4 2次(周二、五)，给药体积为0.2ml/100g(首次0.5ml/100g)。造模时间为6周。造模同时(4)～(5)组动物在每周皮下注射CCl4的同时，分别iv给予注射预防用药50μg/kg、10μg/kg每天1次，连续给药6周。第5周(3、6)～(7)组动物在每周皮下注射CCl4的同时，分别iv给予甘利欣25mg/kg和治疗用药100μg/kg，20μg/kg每天1次，连续给药2周。
检测指标
造模和给药期间全部动物每周测定体重1次，根据体重调整给药量。最后1次皮下注射CCl424h后测定肝脏重量系数。
全部动物股动脉取血，分离血清，测定血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、总胆红素(TB)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(G)、白球比(A/G)、血糖(GLU)、胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)。
肝匀浆检测胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)
200g肝，110度烘干后检测羟脯氨酸(HPA)。
另取部分肝脏福尔马林固定后进行组织病理学检查。
实验结果
1〕受试物对大鼠体重、肝重及肝脏系数的影响
与对照组相比，四氯化碳慢性肝损伤模型组大鼠肝脏系数显著增高(P<0.01)，各治疗组均有不同程度的改善，其中治疗高剂量组与预防低剂量组具有统计学差异(P<0.05)。见表1(*vs对照，# vs模型)
表1：受试物对大鼠体重、肝重及肝脏系数的影响
2)受试物对大鼠血生化的影响
与对照组相比，四氯化碳慢性肝损伤模型组大鼠表现为血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶水平显著增高(P<0.01，P<0.05)，总蛋白、白蛋白、葡萄糖和甘油三酯水平显著降低(P<0.01、P<0.05)。甘利欣12.5mg/kg对上述各指标均有不同程度的改善，其中对谷丙转氨酶和葡萄糖的改善均具有统计学显著差异(P<0.05)。SEQ ID NO：1序列的多肽治疗组与预防组对多数指标均有不同程度的改善作用，与模型组相比达到统计学显著差异(P<0.01，P<0.05)的指标包括：治疗高剂量组(总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、葡萄糖)，治疗低剂量组(总蛋白、白蛋白、葡萄糖)，预防高剂量组(总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、葡萄糖)，预防低剂量组(总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、葡萄糖)。见表2(*vs对照，# vs模型)
表2：受试物对大鼠血生化的影响
3)受试物对大鼠肝脏羟脯氨酸含量的影响
与对照组相比，四氯化碳慢性肝损伤模型组大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显增高(P<0.05)，各治疗组均有不同程度的改善，其中治疗高剂量组具有统计学差异(P<0.05)。见表3(*vs对照，# vs模型)
表3：受试物对大鼠肝脏羟脯氨酸含量的影响
4)组织病理学检查
正常组：大鼠肝组织肝小叶结构存在，肝板排列整齐，个别例结构稍紊乱，以中央静脉为中心向周围放射状排列，肝细胞多边形，浆丰富，核大而圆，少见双核。VG染色示中心静脉及汇管区有少量纤维组织。
模型组：各鼠肝组织改变大致相似，肝组织结构紊乱，大量肝细胞(>80％)明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡。有1例肝组织内纤维组织增生，将肝组织分割为大小不等的多个假小叶，VG染色示肝组织内大量纤维组织增生呈网状。其余VG染色示中心静脉及汇管区有少量纤维组织。
阳性药组：各鼠肝组织改变与模型组基本相似，肝组织结构紊乱，大量肝细胞明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡，但较模型组均减轻(约50～60％)。VG染色示中心静脉及汇管区有少量纤维组织。
治疗低剂量给药组：各鼠肝组织改变与模型组基本相似，肝组织结构紊乱，大量肝细胞明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡，2例程度略重(>80％)，6例略轻(约50～60％)。VG染色示中心静脉及汇管区有少量纤维组织。
治疗高剂量给药组：各鼠肝组织改变与模型组相似，肝组织结构紊乱，较多肝细胞明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡，2例程度略重(>80％)，2例略轻(约50～60％)，4例明显减轻(<30％)。VG染色示中心静脉及汇管区有少量纤维组织。
预防低剂量给药组：各鼠肝组织改变与模型组基本相似，肝组织结构紊乱，大量肝细胞明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡，但较模型组略减轻(约60～80％)。VG染色示中心静脉及汇管区有少量纤维组织。
预防高剂量给药组：各鼠肝组织改变与模型组基本相似，肝组织结构紊乱，大量肝细胞明显脂肪变性，肝细胞内见较多脂肪空泡，5例程度略重(60％～80％)，3例略轻(约50～60％)。VG染色示中心静脉及汇管区有少量纤维组织。
实施例5：实施例1所得SEQ ID NO：1序列多肽的体外抗肝癌活性评价
1.仪器
数显恒温水浴锅，HH-4，国华电器有限公司；
恒温培养箱：HERA cell 150，Thermo electron Corporation；
倒置显微镜：BDS200-PH，重庆奥特光学仪器厂；
台式高速普通离心机：TGL-16G，上海手术器械厂；
超净工作台：SW-CJ-IFD，苏净集团安泰公司；
漩涡混合器，XW-80A，上海医科大学仪器厂；
倒置相差显微镜：XSZ-D2，重庆光学仪器厂；
酶标仪：Model-550，BIO-RAD公司；
架盘天平：HC-TP-12型，天津市天平仪器有限公司。
2.细胞株
人肝癌细胞株SMMC-7721、人肝癌细胞株BEL-7402、人肝癌细胞株BEL-7402购自中国医学科学院细胞库和中科院上海细胞所。
3.细胞株的培养
各实验细胞株(中国科学院上海细胞生物学研究所提供)在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。培养液为含10％热灭活胎牛血清，青霉素100u/ml和链霉素100u/ml的RPMI1640细胞培养基。48h更换培养液，细胞汇合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代。实验用细胞均处于对数生长期，台盼蓝拒染法表明细胞活力>95％。
4.方法
取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，加入消化液(0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA)消化，计数2~4×104个/ml，制成细胞悬液接种于96孔板上，180μL/孔，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换液，加入受试药物，20μL/孔，培养72小时。将MTT加入96孔板中，20μL/孔，培养箱中孵育4小时。吸去上清液，加DMSO，150μL/孔，平板摇床上振摇10分钟。受试物考察7个浓度(0.1~10μM)，用酶联免疫监测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光度，分别计算各浓度下的细胞抑制率。用LOGIT法(软件)计算受试化合物IC50。
抑制率计算方法：
阴性对照孔相对OD值＝阴性对照孔绝对OD值—空白对照孔绝对OD值
药敏孔相对OD值＝药敏孔绝对OD值—空白对照孔绝对OD值
5.结果
实施例1所得SEQ ID NO：1序列能够显著抑制人肝细胞性肝癌SMMC-7721、BEL-7402、BEL-7404的生长，IC50分别为1.25、1.78、2.33μM。
实施例6：体内抗肿瘤活性研究
实施例2所得SEQ ID NO：1序列的多肽对小鼠H22肝癌有抑制作用，其中1mg/kg剂量作用显著，抑制率为67.8％，接近阳性药紫杉醇10mg/kg的药效。47肽各剂量均能对抗人肝细胞性肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤的生长，其中以中剂量1mg/kg效果最明显，裸小鼠移植瘤T/C值为39.7％。
实施例7：抑制肝癌细胞的粘附迁移能力
实施例1所得SEQ ID NO：1序列的多肽作用12小时，0.01、0.1、1mg/ml浓度下对肝癌BEL-7402对基底膜粘附迁移有不同程度的抑制作用。
图6显示SEQ ID NO：1序列的多肽作用12小时，可以抑制肿瘤细胞对基底膜的黏附。图7显示SEQ ID NO：1序列的多肽作用12小时，可以抑制肿瘤细胞穿透基底膜的迁移能力。
序列表
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周华
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<210>2
<211>105
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
<210>3
<211>80
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Claims (10)
1.一种多肽、其变异形式或其活性衍生物(结构相似衍生物)，所述多肽包括SEQ ID NO：1序列。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下述多肽：
(i)SEQ ID NO：2序列和其变异形式或其活性衍生物(结构相似衍生物)；
(ii)SEQ ID NO：2序列中任意半胱氨酸残基变成丝氨酸残基；
(iii)SEQ ID NO:3序列和其变异形式或其活性衍生物(结构相似衍生物)；或
(vi)SEQ ID NO：3序列中任意半胱氨酸残基变成丝氨酸残基。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽选自重组多肽、天然多肽或合成多肽。
4.一种核酸序列，其编码权利要求1所述的多肽。
5.权利要求1所述的多肽在制备用于预防和治疗人或动物组织纤维化的药物中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述组织包括人或动物的肝脏、肾脏或肺。
7.一种用于预防和治疗人或动物组织纤维化以及肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还包括其它用于预防和/或治疗人或动物组织纤维化的药物。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的形式为口服试剂、皮下试剂、皮内试剂、肌肉注射或静脉注射试剂。
10.权利要求1所述的多肽在制备用于预防和治疗人或动物肝癌以及预防和治疗肿瘤尤其是肝癌肿瘤转移的药物中的用途。
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