CN101381709B

CN101381709B - 一种植酸酶及其制备方法

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Publication number: CN101381709B
Application number: CN2008102304699A
Authority: CN
Inventors: 吴红云; 袁宏辉; 李小平; 张曲波
Original assignee: HENAN LIANHE INVE FEED CO Ltd
Current assignee: HENAN LIANHE INVE FEED CO Ltd
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2028-10-17
Also published as: CN101381709A

Abstract

本发明属于植酸酶的制备领域，具体公开了一种植酸酶及其制备方法。本发明的植酸酶是由下述重量百分比的各原料制成：麸皮40～45％、葡萄糖1.0～1.5％、环糊精1.5～2.5％、玉米蛋白粉0.8～1.2％、(NH₄)₂SO₄1.5～1.8％，余量为营养盐水。配制好的培养基随后经灭菌、接种微生物菌种、发酵、抽提即可得植酸酶。本发明原料易得，成本低；本发明方法可用酶系较全，所得植酸酶酶活高，对植酸降解彻底，饲喂效果好；本发明方法是固体发酵法生产，因此可较快地实现产业化生产。

Description

一种植酸酶及其制备方法

技术领域

本发明属于植酸酶的制备领域，具体涉及一种植酸酶及其固体发酵的制备方法。

背景技术

磷是动物不可缺少的营养元素。玉米、大豆等饲料原料中磷的含量非常丰富，其中65％以上以植酸磷的形式存在，但许多动物如猪、鸡、鸭、鱼、虾等因为消化道内缺乏植酸酶，无法利用这些植酸磷，只能随粪便排出，由此造成环境污染。植酸酶是一种性质优良的饲料添加剂，可将植酸磷分解成无机磷，显著降低猪、禽粪便排泄物中磷的含量，减少磷对环境的污染。其次，植酸酶还可以解除植酸的抗营养作用，使无机磷的用量大幅度降低，降低饲料成本；提高饲料中微量元素如Zn、Mn、Cu、Mg等生物学利用率；增加饲料中蛋白质、氨基酸、淀粉和脂质等营养物质的利用率；提高动物采食量和日增重，改善动物生产性能。

20世纪初，就已有报道磷能从有机含磷底物中被释放出来，20世纪80年代国外配合饲料中已普遍使用酶制剂，90年代开始引入我国。迄今为止，国内在这方面也做了大量的工作，可分为二条技术路线，一条路线是采用基因工程技术，构建植酸酶高效表达菌株，已有报道我国开发出用酵母表达植酸酶的基因工程菌；另一条路线是采用对野生菌株传统诱变选育。基因工程菌，产酶活力高，但生产成本相对较高，酶系单一，对植酸的降解率有限，饲养效果不是特别理想。而通过传统诱变方法，选育出的高产菌株，采用固体方法生产，成本相对较低，特别是酶系较全，对植酸降解彻底，饲喂效果好，并且通过固体发酵法生产，可较快地实现产业化生产，但是目前此路线所得植酸酶的酶活普遍不高，在45U/g干曲左右。

发明内容

为克服现有技术的不足之处，本发明的目的就是在于提供一种生产成本低、酶活高的植酸酶及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明的植酸酶是由下述重量百分比的各原料制成：麸皮40～45％、葡萄糖1.0～1.5％、环糊精1.5～2.5％、玉米蛋白粉0.8～1.2％、(NH₄)₂SO₄1.5～1.8％，余量为营养盐水。

所述营养盐水是重量配比为2：3：1：1：200的CuSO₄：ZnSO₄：MgCl₂：FeSO₄：_H2O的水溶液。

一种植酸酶的制备方法，其具体制备过程如下：

(1)配制培养基：按下述重量百分比分别取各原料：麸皮40～45％、葡萄糖1.0～1.5％、环糊精1.5～2.5％、玉米蛋白粉0.8～1.2％、(NH₄)₂SO₄1.5～1.8％，余量为营养盐水，其中营养盐水是重量配比为2：3：1：1：200的CuSO₄：ZnSO₄：MgCl₂：FeSO₄：H₂O的水溶液；

(2)灭菌：在121～124℃下灭菌30～40min；

(3)接种微生物菌种：在灭菌后的培养基中接种微生物菌种，其用量为麸皮重量的0.4～0.6％；

(4)发酵：发酵时间为5～8天，发酵温度为28～30℃；

(5)抽提酶：在发酵后的培养基中加入CaCl₂，加入量为培养基总重量的0.3～0.4％，抽提即得产品。

所述步骤(1)中的(NH₄)₂SO₄水溶液的质量浓度为1.5～2.0％。

所述步骤(1)中配制的培养基的PH值为5.3～5.5。

所述步骤(3)中所述的微生物菌种为黑曲霉Aspergullus niger FZ41、米曲霉Aspergillus oryzae之任意一种。

所述步骤(5)的抽提过程为：培养基中加入CaCl₂后，在150～200r/min的摇床上振荡抽提1～1.5h；数层纱布过滤、离心5～8min获得滤液1；在滤渣中加入重量/体积比为1：10的醋酸—醋酸钠缓冲液，调节pH值为5.0，然后在150～200r/min的摇床上振荡抽提1～1.5h得到滤液2；合并滤液1与滤液2，离心分离取上清液即得产品。

所述加入CaCl₂时，优选质量浓度为1.0～2.0％的CaCl₂溶液。

作为优化，所述离心分离时的离心机转速为5000～6000r/min，时间15～20min。

所述的植酸酶的制备方法制得的植酸酶酶活为410～480U/g干曲。

本发明通过优化固体发酵生产植酸酶最佳工艺条件，确立了以麸皮为主，葡萄糖、玉米蛋白粉、环糊精、(NH₄)₂SO₄等为辅的培养基成分，使菌体迅速生长，利于菌株产酶，从而大幅度提高植酸酶的产量，所产酶由40～50U/g干曲提高到410～440U/g干曲，并发现所得的成品具有明显地促进菌体生长和产酶的作用，培养5～8天后，酶活达到最大值410～480U/g干曲，曲有浓郁的香味。采用浅盘扩大规模发酵生产，酶活可达300～445U/g干曲。

为了验证用本发明方法制备的植酸酶的使用效果，曾用自制植酸酶进行初步应用试验，试验对象为60只蛋鸡和100只肉鸡，植酸酶在饲料中的添加量为0.2％，结果表明：对蛋鸡，添加植酸酶可完全代替磷酸氢钙，日产蛋量比对照组提高4.6％，死淘率降低4％，饲料成本可降低5％以上；对肉鸡，在生长中后期也可以等量替代磷酸氢钙，成本有较大程度的降低。

对800只肉鸡，1500只蛋鸡的饲养试验(添加量0.2～0.5％)证明：在蛋鸡饲料中，可完全等量替代磷酸氢钙，饲料成本下降3～4％；在肉鸡饲料中，可大部分替代磷酸氢钙，饲料成本略有下降，但料肉比下降2～3％，日增重提高3～5％，经济效益明显。

本发明原料易得，成本低；本发明方法通过优化传统诱变选育条件，选育出高产菌株，可用酶系较全，且所得植酸酶酶活高，对植酸降解彻底，饲喂效果好；本发明方法是固体发酵法生产，因此可较快地实现产业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以便更好的了解本发明：

本实施例中的黑曲霉Aspergullus niger FZ41，从中国科学院微生物所引进，菌种编号为RDD-001CGMCC No.1423；米曲霉Aspergillus oryzae从中国科学院微生物所引进，菌种编号为AS3·800。

实施例1

在500ml的三角瓶中加入麸皮100g、葡萄糖3.75g、环糊精5g、玉米蛋白粉2.5g、(NH₄)₂SO₄4g、营养盐水135g，制成固体培养基，其PH值为5.3；在124℃下灭菌30min；然后加入0.5g的黑曲霉，置30℃恒温培养5天；加入87.5g的质量浓度为1.0％的CaCl₂溶液，在150r/min的摇床上振荡、抽提2h，两层纱布过滤、离心5min，获得滤液1；在滤渣中加入重量/体积比为1：10的醋酸-醋酸钠缓冲液，调节pH值为5.0，然后在150r/min摇床上振荡抽提1.5h，得到滤液2，合并两次滤液置离心机上以6000r/min离心15min，分离取上清液即得产品，其酶活为410U/g干曲。

实施例2

在500ml的三角瓶中加入麸皮43g、葡萄糖1.3g、环糊精2.5g、玉米蛋白粉1.2g、(NH₄)₂SO₄1.5g、营养盐水50.5g，制成固体培养基，其PH值为5.4；在121℃下灭菌35min；然后加入0.25g的米曲霉，置28℃恒温培养7天；加入26.7g质量浓度为1.5％的CaCl₂溶液，在200r/min的摇床上振荡、抽提1.5h，两层纱布过滤、离心5min，获得滤液1；在滤渣中加入重量/体积比为1：10的醋酸-醋酸钠缓冲液，调节pH值为5.0，然后在200r/min摇床上振荡抽提1h，得到滤液2，合并两次滤液置离心机上以5000r/min离心分离20min，取上清液即得产品，其酶活为480U/g干曲。

实施例3

在500ml的三角瓶中加入麸皮45g、葡萄糖1.0g、环糊精1.5g、玉米蛋白粉0.8g、(NH₄)₂SO₄1.8g、营养盐水49.9g，制成固体培养基，其PH值为5.5；在123℃下灭菌40min；然后加入0.18g的黑曲霉，置29℃恒温培养8天；加入15g质量浓度为2.0％的CaCl₂溶液，在190r/min的摇床上振荡、抽提1.8h，两层纱布过滤、离心5min，获得滤液1；在滤渣中加入重量/体积比为1：10的醋酸-醋酸钠缓冲液，调节pH值为5.0，然后在170r/min摇床上振荡抽提1.2h，得到滤液2，合并两次滤液置离心机上以5500r/min离心分离18min，取上清液即得产品，其酶活为450U/g干曲。

本发明在上述实施例中的黑曲霉、米曲霉菌种的选择，是在能够生产植酸酶的微生物中选择的两种，对于本领域技术人员显然可以选择其它可以生产植酸酶的微生物替代黑曲霉或米曲霉，例如：无花果曲霉、甲醇酵母、枯草芽胞杆菌、克鲁斯假丝酵母等，这些应均在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种植酸酶的制备方法，其特征在于所述植酸酶的具体制备过程如下：

(1)配制培养基：按下述重量百分比分别取各原料：麸皮40～45％、葡萄糖1.0～1.5％、环糊精1.5～2.5％、玉米蛋白粉0.8～1.2％、(NH₄)₂SO₄水溶液1.5～1.8％，余量为营养盐水，其中营养盐水是重量配比为2∶3∶1∶1∶200的CuSO₄∶ZnSO₄∶MgCl₂∶FeSO₄∶H₂O的水溶液；

(2)灭菌：在121～124℃下灭菌30～40min；

(3)接种微生物菌种：在灭菌后的培养基中接种产植酸酶的微生物菌种，其用量为麸皮重量的0.4～0.6％；

(4)发酵：发酵时间为5～8天，发酵温度为28～30℃；

(5)抽提酶：在发酵后的培养基中加入CaCl₂，抽提即得产品，其中CaCl₂加入量为培养基总重量的0.3～0.4％。

2.如权利要求1所述的植酸酶的制备方法，其特征在于步骤(1)中配制的培养基的PH值为5.3～5.5。

3.如权利要求2所述的植酸酶的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的微生物菌种为黑曲霉Aspergullus niger FZ41、米曲霉Aspergillus oryzae之任意一种。

4.如权利要求1～3之任一项所述的植酸酶的制备方法，其特征在于步骤(5)的抽提过程为：培养基中加入CaCl₂后，在150～200r/min的摇床上振荡抽提1～1.5h；纱布过滤、离心5～8min获得滤液1；在滤渣中加入重量/体积比为1∶10的醋酸-醋酸钠缓冲液，调节pH值为5.0，然后在150～200r/min的摇床上振荡抽提1～1.5h得到滤液2；合并滤液1与滤液2，离心分离取上清液即得产品。

5.如权利要求4所述的植酸酶的制备方法，其特征在于加入的CaCl₂为质量浓度为1.0～2.0％的CaCl₂溶液。

6.如权利要求5所述的植酸酶的制备方法，其特征在于离心分离时的离心机转速为5000～6000r/min，时间15～20min。

7.如权利要求6所述的植酸酶的制备方法，其特征在于所制得的植酸酶酶活为410～480U/g干曲。