CN101379389A - 基于荧光的检测方法和设备 - Google Patents

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Abstract

用于检测来自一种试样的荧光辐射的发射的设备，这种荧光辐射的发射响应于通过两个或更多的不同辐射源(145、160)的在相同时间段的激发，在这种设备中，用一种调制方式标记每个辐射源(145、160)，然后，能够在所发射的荧光辐射中单独检测这种调制方式。例如，在基于荧光谐振能量转移(“FRET”)的技术中，可根据不同的调制方式对至两个或更多不同的LED源(145、160)的驱动电流进行频率调制或脉宽调制。然后，可通过不同的调制方式单独检测这种试样的对这些源(145、160)中的每一个的响应，如含在这种试样中的不同供体/受体探针的响应，即便是在这些响应的波长或波长范围相同或重叠的情况下也是如此。

Description

基于荧光的检测方法和设备
技术领域
本发明涉及基于荧光的检测方法和设备，如可用在测定或成像中的检测方法和设备。本发明特别适合用在用于荧光显微的方法和设备中以及基于荧光谐振能量转移的方法和设备中。
背景技术
在基于发光的测定或成像方法中，由刺激物用物理、化学或机械方式将易感分子激发，随后这些易感分子发射光，这种光能够被检测到。可将发出的光用于查找这些分子的位置，并因此而能够用在成像中和/或用于检测发光分子在一种过程中的参与。
刺激物的一种方便形式是的光，该光能够被引导至包括易感分子的试样，且发光的这种形式称为荧光。发出的光具有与刺激光不同的波长或波长范围，这样就可相对容易地在这种刺激光出现时检测到所发出的光。这种刺激光或所发出的光均不必在可见光谱内，但无疑需要适当的检测所发出的光的方法。
在荧光谐振能量转换(“FRET”)测定技术中，可从所发出的光确定试样中的过程的进展。易感部分以两种类型出现，这些类型包括供体部分和受体部分。这些部分可采用各种形式，如分离的荧光分子或在相同的分子上的不同荧光团群组，或者可不具有分子形式，但可以是如微粒，如荧光珠或荧光量子点。供体在它们自身上发出荧光以响应于发送到试样的刺激光(本说明书也称为“激发辐射”)。不过，若受体在物理上靠近，则在偶极子之间有一种激发能量的传递，这会猝灭供体的荧光并反而可能会通过受体导致荧光。这有时称为“
Figure A200680052310D0006170049QIETU
”谐振能量传递。能量传递的程度取决于供体与受体之间的分离距离。FRET测定技术取决于一种过程对供体/受体对的物理邻近的影响。当这些供体/受体对足够地靠在一起时，就会有从供体至受体的能量传递，且该对的总体荧光输出受到这种能量传递的影响。当该对分开时，能量传递减少或停止，且该对的总体荧光输出不同并可检测。因此，改变一种试样中的供体/受体对的物理邻近的过程引起由这种试样所发出的光的光谱成分中的可检测变化，从而给出这种过程的进展的测度。
有时将包括供体/受体对的易感荧光团制成称为“探针”的结构。一种探针的特征在于这种探针会在一种试样中以某种方式运行以使从这种探针位置发出的荧光会提供有用信息。例如，这种探针可占据某些位置，在此情形中，荧光会显示这些位置。在FRET中，通常对这种探针进行选择，以使这种探针会由进行测定的过程构成或分割，且这种供体和受体位于该探针的不同部分上，以在构成或分割这种探针时将这种供体和受体结合在一起或分离。探针还可具有多于一个的元件，这些元件分别载有供体和受体，且由进行测定的过程结合在一起或分离。
通常将提供供体荧光团和受体荧光团的这些材料称为染料，且这些染料的公知的示例包括荧光素(蓝色激发，绿色发射:通常用作一种供体)和若丹明(rhodamine)(绿色激发，红色发射:通常用作一种受体)。
可用不同的方式检测供体/受体对的物理邻近中的变化。受体本身可在从供体接收到能量时发出荧光，但波长不同于供体发出荧光时的波长。因此，可通过测量以供体或受体的波长的荧光输出水平中的变化来检测物理邻近中的这种变化。不管对哪个进行监测以检测这种变化，均称为一种“报告分子”，无论是供体还是受体。一些受体本身并不发出荧光，而是仅“猝灭”供体的荧光。这些受体称为“暗猝灭剂”，且在此情形中，供体必须是报告分子。可在总体上将结合一种报告分子的监测或检测装置称为报告系统。
有时也将受体分子称为“受纳体”，但根据所监测的过程，可能会有与这种过程的其它元件的冲突，因此通常在本发明中采用术语“受纳体”。
可利用FRET技术监测的过程包括蛋白质间相互作用、核酸间相互作用和蛋白质-核酸相互作用。例如，在细胞膜中将表皮生长因子(“EGF”)绑定到受纳体时，一旦这些受纳体聚合成二聚物，提前将EGF的单个单元示踪，一些用供体分子且一些用受体分子示踪。这种膜中的受纳体的二聚作用使至少一些供体/受体分子对紧靠在一起，从而引起如前面所描述的那样的由试样发出的光的光谱成分中的可检测变化。可按照类似的原则构成免疫测定，例如，通过利用两个标有荧光团的抗体，通过同时绑定到抗原以形成抗体-抗原-抗体夹层复合体，或者通过在抗原通过固定在荧光珠的表面的捕捉抗体的作用出现时使一种标有荧光团的抗体邻近于这种荧光珠来形成一种FRET。就核酸相互作用而言，可将标有FRET的试剂用在“荧光现场杂交”(FISH)、核酸杂交测定(尤其是“DNA”片中的数组格式)和检测一种DNA复制酶的操作中，这种“荧光现场杂交”(FISH)用于细胞和组织的染色，在检测一种DNA复制酶的操作中，可将含有一种供体/受体对的序列专用探针加到这种试剂主混合物。由于这种酶沿着这种DNA移动，所以这种酶遇到该探针并分裂探针，从而将这种供体/受体对分离，并再次引起如前面所描述的那样的发出的光的光谱成分中的变化。
酶在其中复制DNA的公知的过程的一种非常成功的示例是聚合酶链式反应(“PCR”)，在这种聚合酶链式反应中，将试样DNA的双螺旋变性为其两个核苷酸链，然后，每个链由一种聚合酶的作用而复制以产生两个新的双螺旋。利用多个加热和冷却循环重复这种过程，以大量增加试样DNA的数量。这种复制过程由将一种“引物”绑定到每个将用作一种模板的链来触发。引物是一种特定次序的核苷酸的单链条，这种特定次序能够绑定到DNA的变性链中的核苷酸的互补序列。从这种引物开始，这种聚合酶就能够“读出”这种模板链并非常迅速地将这种模板链与互补核苷酸匹配。结果是替代先前的双螺旋的两种新的螺旋，且每个螺旋由原始的链中的一个加上新组装的互补链组成。
为了监测PCR过程，还将一个或多个探针绑定到DNA的变性链。探针遵循与引物相同的原则，但并不触发复制。相反，探针载有供体、受体或既载有供体又载有受体，并绑定到沿着该链的一个或多个位置。若在探针从该引物沿着该链前行时由这种聚合酶水解且接着供体/受体对分离，则可检测到FRET的可测变化。
使用供体/受体对并因此而可用在基于FRET的测定中的其它探针包括使用双杂交的探针、“分子信标”和“Resonsense”，在使用双杂交的探针中，在不同的结构上承载供体和受体，若目标代码出现在一种链中，则通过绑定到沿着这种链的相邻的位置使这些结构从物理上紧靠在一起，在这种“分子信标”中，在一种环形结构的各自的端部承载供体和受体，这种环形结构解环以绑定到一种链，从而将供体/受体对分离，在这种“Resonsense”中，供体/受体对是一种示踪探针和一种插入染料。
在“Real-Time PCR:An Essential Guide”(Edwards、Logan和Saunders编辑，Horizon Bioscience2004年出版，ISBN 0-9545232-7-X)一文中讨论了PCR过程和FRET测定技术。正如会从该文了解到的那样，复用一个试样上的测量值是公知的。还可有可出现在这种试样中的多于一个的过程，且可通过利用不同的探针单独检测这些过程，通过承载不同的供体/受体对组合将这些探针“示踪”。例如，供体/受体对可在使用不同的供体分子、在不同的波长范围发出荧光或在使用不同的受体分子时不同。若有多于一种类型的供体，则公知使用一种“通用受体”技术，在这种技术中，一种类型的受体分子从多于一种类型的供体接受谐振能量。通用受体技术将检测简化，因为仅必须检测该受体荧光的一个波长。根据供体的类型，可能有必要提供多于一种波长的激发辐射。类似地，若有多于一种类型的受体，则公知使用一种“通用供体”技术，在这种技术中，一个供体分子的谐振能量可由多于一个的受体接受。虽然每个探针类型可承载相同的供体，但不同的探针类型可由各自的受体的荧光波长范围进行区别。可通过利用多于一个的通用供体和/或受体以使探针组会共用相同的供体或受体来延伸通用供体方法和通用受体方法。
在公知的利用通用受体格式的装置中，并不能够通过测量受体荧光来直接将来自不同探针的响应相互区别，因为这种受体分子会以同样的方式发出荧光以响应于这些不同供体中的每一个。因此可依次进行测量，例如，以一系列不同的激发波长。这并不虑及在过程中的荧光变化的连续监测，如核酸扩增反应。即便是可将试样对不同激发波长的荧光反应直接区别，例如，因为使用不同波长的、通用“猝灭剂”格式的不同供体分子荧光以及使用不同波长的受体分子荧光，但在实践中也难以获得非常多的不同探针的复用。例如，在实时使用FRET来监测PCR的过程时，有一种约为四的实际限制。这是因为荧光发射的波长范围往往相对较广。
发明内容
根据本发明的实施例的第一方面，提供一种用于检测来自试样的荧光辐射的发射的设备，这种荧光辐射的发射响应于辐射源的激发，这种设备包括:
i)试样辐照器，这种试样辐照器用于以相同的时间段用激发辐射照射试样，这种激发辐射来自至少两个源，这两个源提供不同波长的激发辐射；
ii)调制装置，这种调制装置用于根据各自不同的调制方式调制该至少两个源中的每一个的激发辐射；以及
iii)发射检测器，这种发射检测器用于检测来自该试样的荧光辐射的发射，
其中，这种发射检测器适合于检测所发射的辐射的各自不同的调制方式中的每一个，以使能够单独检测这种试样对该至少两个源的响应。
由于根据本发明的一种实施例的设备能够以相同的时间段对来自至少两个源的激发辐射进行处理，所以这种设备的特点在于将这种试样辐照器设计成将来自至少两个源的激发辐射以相同的时间段输送到这种试样。例如，这种试样辐照器可包括至少一个辐射偏转器，该至少一个辐射偏转器用于将由这些源中的至少一个所提供的激发辐射偏转到与这些源中的至少另一个所提供的激发辐射共用的路径上，以输送到这种试样，该至少一个辐射偏转器如半反镜或二向色镜。
本发明的实施例的一种区别性特征在于来自该试样的响应于不同源的发射的波长可相同或重叠。当然，这是由于不同的发射反而可由它们的调制方式进行区别。因此，这种发射检测器可包括用于过滤来自该试样的响应于不同源的荧光辐射的发射的单滤波器或共用滤波器。这种单滤波器或共用滤波器能够帮助降低这种系统中的噪声，但无必要提供两个或更多不同的滤波器或实际上提供两个或更多不同的辐射路径，以分离这些不同的响应。
在本发明的一种实施例中，可同时使用至少两个不同的激发源来照射试样，并且仍仅通过这些源中的一个区别这种试样对激发的荧光响应，甚至在这种荧光响应的波长对于每个源来讲往往相同的情况下也是如此。这可通过在试样发射中检测与每个辐射源关联的区别性调制方式来进行。因此，可通过利用至少两个不同的探针检测相同试样中至少两个不同的过程并在要求监测相同试样中至少两个不同过程的进展时检测相同试样中至少两个不同的过程。即便是在试样发射中仅有一个波长或波长范围时也是如此，因此，已作为一种区别方式失去波长，试样响应于这种区别的激发源。将每个区别性调制方式有效地用于“示踪”或标记特定激发源，以使这种激发源能够在由试样中的报告分子所产生的荧光中被检测到，即便是在用于产生响应于这些激发源中的每一个的荧光的这种波长或波长范围相同时也是如此。
在试样发射中可能仅有一个波长或波长范围但可能有至少两个不同的激发源的情形包括使用通用受体与多于一个的不同供体。在使用两个不同的供体作为报告分子的情形中(即带有通用猝灭剂)，这些供体响应于不同的激发源但偶然以相同或重叠波长发出荧光，因此，在这种情形中，经由这些激发源的调制信号的标记可用于增加这些发射信号的分析分离。
因此，本发明的实施例在第一方面可包括用在荧光谐振能量转移测定中的设备，这种设备用于检测来自试样的荧光辐射的发射，这种试样含有至少两个不同的探针，每个探针包括供体/受体对，其中对该至少两个源中的每一个的激发辐射的波长进行选择，以激发来自这种试样中的各自不同的探针的响应，以及这种发射检测器适合于检测所发射的辐射中的这些各自不同的调制方式中的每一个，以使可单独检测该至少两个不同的探针对该至少两个源的响应。
用在本发明的实施例中的调制装置的一种方便形式是对辐射源的振幅或强度施加周期性调制，以给出区别性调制方式。在这种辐射源是发光二极管的情况下，这可通过如至该二极管的驱动电流的正弦变化进行。或者，可将这种调制应用于这种源的所发射的辐射，例如通过将光电子调制器、振荡闸或带有间隔孔径的旋转轮插在这种源与试样之间的辐射路径中。在此情形中，由这种源发射的激发辐射可包括脉冲列，且这种调制装置适合于控制这种脉冲列的一个或多个参数，以给出用于这种源的调制方式。可以用这种方式调制的脉冲列的参数包括在0.1千赫至10兆赫范围内的脉冲频率或脉冲相位，以及在0.1微秒至10毫秒范围内的脉冲宽度。
还可选地使用多于一个的激发波长，从而增加可被检测到的试样所提供的不同响应的数量。在此情形中，这种发射检测器可适合于独立地检测第一波长和第二波长(或波长范围)荧光辐射的发射，从而可单独检测这种试样的至少四个不同的响应，在每种情形中，通过调制方式和/或通过波长区别这些响应。使用不同的调制方式允许将这种原则进一步延伸到如六个或更多数量的不同响应。
通过允许同时使用多个激发波长，本发明的实施例增强了进行动力学测量的能力，在诸如实时PCR的过程中，这些测量尤为有用。实时PCR是一种非常动态的系统，这种系统具有在几十秒的时间量程中发生的非特定热循环导致的荧光变化。例如，可在pH、温度和荧光发射的波长范围之间有一种复杂关系。来自如在一种引物内或在产品链退火和熔化中运行的无论以何种方式使用的探针的荧光报告可在十分之几秒至几秒内发生。若仅可依次检测荧光报告，则可能不会有时间捕捉可得到的荧光信息的全部富度，而不必对测定进行重复，这种重复可能引入错误并花费更多的时间和更多的试样材料。不过，利用本发明的实施例，可同时检测来自多于一个实际上是几个探针的报告。
过去曾经可区别可达四个不同的荧光发射，且这在许多情况下一直有难度。利用本发明的实施例“示踪”每个激发源消除了这种障碍，以使多得多的荧光发射能够被区别，从而允许多得多的探针同时被检测。这一点在其中重要的测定示例可基于公知的“三重测定”，在这种“三重测定”中，利用第一探针使试样DNA经历PCR，利用第二探针使控制DNA同时经历PCR，且还使用控制探针以鉴别这种PCR过程。在一些测定中，可进行多个PCR过程，并且利用控制DNA和一个或多个控制探针。本发明的实施例支持在相同的试样中并在相同的时间的所有这些过程的同时监测，这些过程为五个或更多。
因此，将源调制引入PCR过程的监测中带来极大好处，即便是用在这种检测和/或监测中的公知的激发源也已由波长区别。现已发现，在制造本发明时，通过波长区别激发辐射的这些源的能力并不贯彻到探针发射的域，因为两个不同的探针可通过发射类似的或重叠的荧光波长范围完全响应于两个不同的激发源。
本发明的另一种优点在于通过信噪比的改进来改进荧光检测的灵敏度。
正如前面所描述的那样，本发明的实施例可用于检测和区别用于各种目的的发射，如进行一个或多个测量或用于以一个时间段监测发射。
根据本发明的实施例的第二方面，提供一种用于检测在核酸扩增反应过程中从试样发射以响应于通过辐射源激发的荧光辐射的设备，这种设备包括:
i)试样辐照器，这种试样辐照器用来自源的激发辐射照射这种试样；
ii)调制装置，这种调制装置用于根据可检测的调制方式调制这种激发辐射；以及
iii)发射检测器，这种发射检测器用于检测来自该试样的荧光辐射的发射，
其中，这种发射检测器适合于检测所发射的辐射中的这种调制方式，以使能够在至这种发射检测器的一个或多个其它辐射输入出现时检测这种试样对这种源的响应。
本发明的实施例在第二方面可包括设备，其中在利用荧光谐振能量转移的过程中，试样辐照器适合于用来自至少两个不同源的激发辐射照射这种试样，且这种发射检测器适合于检测这种试样的两个或更多的不同响应，每个响应由这种报告系统的不同探针生成，且每个探针包括供体/受体对。
根据本发明的第三方面，提供一种检测来自试样的荧光发射的方法，这种方法包括检测至少两个荧光发射，且该至少两个发射由各自不同的调制方式区分。
在根据本发明的实施例的第三方面的方法中，可通过检测适合于每个荧光发射的调制方式来单独进行每个荧光发射的检测。
在第三方面的本发明的实施例可通过使用根据在本发明的第一方面和第二方面的实施例的设备来应用。若适当的话，所描述的与一个方面或本发明的任何一个实施例有关的任何特征可与本发明的一个或多个其它方面或实施例有关的应用。
本发明的实施例可用在非生物方法和过程中，因为FRET技术的唯一要求是如在一种方法或过程期间供体/受体对相互关于彼此移动。不过，显然还有其中试样包括一种生物试样的许多应用。一种应用是基于核酸扩增反应的过程，如实时聚合酶链式反应。不过，本发明的实施例的应用延伸超过基于FRET的测定和PCR过程。例如，通过调制的发射的分化还可用在基于荧光的成像中，在这种基于荧光的成像中，试样中不同的组分通过对激发辐射的响应产生的荧光来展示它们的位置。仅就基于FRET的测定和PCR过程而言，通过不易由发射波长区别但可由不同的激发源激发的组分来区别发射是重要的。同样，可在对不同源的响应中检测这些不同源的区别性调制。这与成像应用特别有关，在这些成像应用中，典型的检测器如一种CCD摄影机缺乏内在波长鉴别，且要求滤波器装置以实现色彩分离，并带有随之发生的灵敏度、简单性和成本方面的损失。
附图说明
将仅通过示例的方式，并参考附图，描述作为本发明的一种实施例的用在PCR测定中的一种荧光辐射探针监测器，在这些图中:
图1示出了这种监测器的示意性平面图；
图2示出了用在图1的监测器中的一种滤波器的示意性正视图；
图3示出了可出现在图1的监测器的使用中的两种不同的正弦调制方式和一种可能的检测到的输出；
图4示出了可出现在图1的监测器的使用中的两种不同的脉冲宽度调制方式和一种可能的检测到的输出；
图5、图6和图7示意性地示出了用在一种使用图1的监测器的测定中的三对可区别探针；以及
图8示出了可通过图1的监测器的使用实现的检测限制。
具体实施方式
参看图1，以公知的方式经由一种试样输送输入端100将一种用于测定的试样输送到一种涂有导电聚合物的15mm的玻璃毛细管，以形成毛细管组件105。这种毛细管组件105设有经由这种聚合物输送热的加热电路115，以及用于至这种加热电路115的动态反馈控制的红外热电堆110。经由各自的透镜140、155、半反镜135、二向色镜130和另一透镜125，将用于监测荧光探针活动的激发辐射170从两个源145、160输送到毛细管组件105。这种毛细管本身具有珠状端部120，这种毛细管通过这种珠状端部120接收激发辐射170并输送荧光输出。这些装置是公知的类型。二向色镜130适合于反射这种激发辐射波长的辐射，并因此而经由该另一透镜125将这种激发辐射输送到毛细管组件105，但以出现在这种试样中的荧光探针的波长传递辐射。因此，从这种试样发射的荧光辐射175可由该另一透镜125收集并由二向色镜130沿着一种不同的光路输送到辐射检测器150。
短通滤波器195、197用在每个源145、160的输出端，以将激发辐射170限制到所希望的波长并阻断寄生激发。长通滤波器196用在检测器150的输入端，以降低来自除了出现在该试样中的荧光探针之外的源的噪声。
参看图2，每个滤波器195、196、197是公知的类型并可选择性地包括带有多个不同滤波孔径205的盘200。可将盘200旋转以将已选滤波孔径205展示给射束，并因此而能够用于过滤多个不同波长范围中的任何波长范围。在示于图1中的装置中，仅有长通滤波器196包括盘200，且短通滤波器195、197中的每一个仅包括一种简单滤波器。
再参看图1，这两个源145、160发射分别以360nm(紫外)和480nm(蓝色)为中心的波长的激发辐射170。每个源包括发光二极管(“LED”)，驱动这种发光二极管以通过驱动电流的输送发射激发辐射。这种驱动电流中的变化会改变所输送的激发辐射的强度，且经由一种调制装置180驱动每个源145、160，以展示出强度中的一种基于正弦的变化。这种频率专用于每个源，并产生用于每个源的特征调制方式。例如，可在5kHz调制紫外源145，并在12kHz调制蓝色源160。
前面所提及的频率5kHz和12kHz仅作为示例。通常还可在任何地方以大范围频率应用调制，例如，从65Hz至10kHz。这种范围是适当的，因为这种范围跨越了从大大高于美国电源频率(60Hz)直到这样一种频率，即荧光弛豫时间(约100纳秒)在此频率上往往会非常大。
用于可使用的光电二极管的驱动电流的适当的调制装置180是公知的，因此此处不再进行详细描述。一个调制装置180可在实际上具有多于一个的驱动电流输出，并因此而控制多于一个的光电二极管145、160的驱动电流。这种装置180可结合用于设置在每个输出端提供给光电二极管145、160的各自的驱动电流。或者，这种调制装置180可在实际上由两个或更多的分离的调制装置表示，且可对每个调制装置独立进行控制以设置各自的驱动电流。
至光电二极管的驱动电流的变化能够引起这种二极管输出中的色彩漂移，但这种色彩漂移通常轻微且不可能成为一种问题。不过，这种驱动电流的强度调制的替代是脉宽调制或重复率调制，这种脉宽调制或重复率调制可用作光电二极管145、160的或每个光电二极管145、160的驱动电流的通断开关或各自的输出射束的通断开关。同样，适当的调制装置180是公知的，因此此处不再进行详细描述。例如，调制装置180可向用于选择性地阻断这种/这些输出射束的一个或多个光电子调制器(未示出)提供一个或多个控制信号。基于脉冲的调制避免色彩漂移，但可将谐波引入这种系统，可能需要将这些谐波滤去。
毛细管组件105中的荧光探针以公知的方式发出荧光以响应于激发辐射170。根据出现在毛细管组件105中的过程的进展以及使用的特定探针，经由这种毛细管的珠状端部120从一个或多个探针发射荧光辐射、经由该另一透镜125将荧光辐射拾波并且经由长通滤波器196将荧光辐射输送到辐射检测器150。检测器150的公知的适当形式是一种带有关联的放大器的光电二极管，因此提供一种放大的电输出信号，这种输出信号表示由这种/这些探针监测的一个或多个过程的活动水平。将这种输出信号输送到一种信号分析器185且能够在监测器190上看到这种输出信号和/或将这种输出信号储存。
辐射检测器150的输出信号会反映所检测的荧光辐射中的波动。因此，将源的特征调制方式贯彻到检测器150的电输出，其又会产生荧光辐射中的调制。有多于一个的源145、160，则会有多于一个的特征调制方式。若荧光由源145、160中的每一个在相同的时间段期间刺激并由相同的检测器检测，则这些调制方式均会出现在检测器150的电输出信号中。
参看图3，一种示例可以是如这种驱动电流控制器产生至第一源145的第一驱动电流信号300和至第二源160的第二驱动电流信号305，以5kHz对第一源145进行调制，且以12kHz对第二源160进行调制。然后，这些源在试样中独立产生经过调制的荧光，这种试样接着在检测器150产生一种经过调制的电输出信号310。电输出信号310会展示出一种更加复杂的调制，这种调制含有这两种方式的叠加的频率，即5kHz和12kHz。这些调制方式中的任一种在这种检测器的电输出信号310中的存在或缺失会显示探针对这两种不同的源145、160的响应的存在或缺失，从而显示相关的过程活动在这种试样中的存在或缺失。
再参看图1，为了以相对简单的方式检测检测器150的电输出310中各自的调制方式，将检测器输出310输送到公知类型的信号分析器185并提供同步检测。信号分析器185也从该调制装置180接收以5kHz和12kHz的第一和第二驱动电流信号。这些驱动电流信号与示波器一起可用于对信号分析器185进行调谐，以在信号分析器185进行检测所需的这两种调制方式的频率对检测器输出310取样，以识别对这些源145、160中的每一个的单独荧光响应。
参看图4，正如前面所提及的那样，在一种与同步检测一起使用的调制的替代形式中，这种调制可采用另一种基于脉冲的调制形式，如脉宽调制或重复率调制。在示于图4的示例中，第一调制方式由一种具有4:5的占空比的脉冲列400表示，第二调制方式由一种具有1:5的占空比的脉冲列405表示。这样，在信号分析器185看到的试样410的荧光响应就能够展示起源于这些调制方式中的每一个的组分，同样，也能够通过公知的检测技术将这些组分分离。
正如前面所提及的那样，荧光发射的工作寿命约为100纳秒的数量级。因此，实际最大调制频率或脉冲重复率往往约为10MHz。将最小值通常设定在高于电源频率(英国为50Hz，美国为60Hz)，以减少该系统中的可能的噪声源。适当的脉冲宽度或在脉冲宽度中的调制通常在从0.1微秒至约10毫秒的范围内，这种范围产生一种调制，可在从约100Hz至10MHz范围内的频率域检测这种调制。
如图4所示，对脉冲宽度进行调制，但脉冲重复率在这些调制方式之间保持相同。作为选择或附加，可通过改变脉冲重复率来应用一种调制方式。
参看图5至图7，这些图中示出了共同在相同的试样中的各种探针500对的响应，且这些响应具有相同的波长。这些探针500的每个对响应于经过调制的激发辐射505，并因此而产生经过调制的响应510。
在某种情形中，使用两个源145、160，以5kHz调制的紫外(360nm)源和以12kHz调制的另一蓝色(480nm)源。参看图5和图6，第一对探针500均可用在520nm经过调制的荧光510进行响应，且第二对探针500均可用在660nm经过调制的荧光510进行响应。这些探针500对并不能够由波长区别，但可由它们各自的调制进行区别，因为这些调制会由至这些源即5kHz和12kHz的源的驱动电流的这两种调制方式“示踪”。
参看图7，在上述形式的一种变化形式中，探针500对均可采用一种暗猝灭剂DQ3。在此情形中，这些报告分子会是各自的供体D1、D2，这些供体D1、D2发出以如600nm和620nm的荧光。这些波长可能太接近而不能清楚地区别，但经过检测的荧光510同样载有至这些源即5kHz和12kHz的源的驱动电流的这些调制方式，因此就能够区别荧光510。
参看图8，现已发现，与公知的未经调制的设备相比，本发明的实施例的灵敏度非常高。利用以不同浓度的通常用在探针中的染料即荧光素的一系列溶液，在这种检测器输出端测得的与经过调制的荧光有关的电压开始显示出清晰的信号，该信号高于10pM浓度的荧光素处的噪声。在更高的浓度时，信号电平大大增加，并比用公知的用于检测相同的荧光的装置实现的信号电平高几倍。
在前面的描述中，可通过利用用所有的源对试样同时照射进行通过这种试样的荧光响应到多于一个的不同源的分离，通过区别性调制方式的使用将这些源和各自的对这些源的响应“示踪”。通过波长识别对不同源的响应是公知的。不同的报告分子可在不同的波长发出荧光，且在检测器150使用滤波器以将检测限制在每次一个报告分子是公知的。或者，可进行更复杂的检测，例如，利用一种光谱荧光计或带有多于一个的光学检测器的荧光计。适当的系统的例子有:AppliedBiosystems 7700；Applied Biosystems 7000；Roche LighCycler；CepheidSmartCycler和Corbett Rotor-Gene。通过在本发明的一种实施例中使用调制以及波长鉴别，可鉴别数量多得多的荧光响应。因此，在一直以来在基于FRET的测定中仅可使用波长鉴别来鉴别可达四个的响应的情形中，由于这些荧光响应的波长特征的原因，同时使用简单的调制方式允许所鉴别的响应的数量达到十六个或可能更多。这基于使用四个调制方式和四个不同波长的源。发光二极管可容易地用于提供适当的源。
另一种优点在于可同时区分这些调制方式。在公知的系统中，通常有必要进行连续的检测，以检测这些荧光响应的各种波长。因此，调制方式的使用可允许降低试样数量，并减少总体测定时间。
在本发明的实施例中，由于荧光响应没有必要处于不同的波长以相互区别，所以在检测器150前面的滤波器可以是一种简单的长通滤波器。与公知的与发射滤波器有关的装置相比，这种简化的光学装置尤其可用在其它类型的测定装置中，如毛细管105由一种多孔板形式替代的装置中。

Claims (21)

1.一种用于检测来自试样的荧光辐射的发射的设备，所述荧光辐射的发射响应于辐射源的激发，所述设备包括：
i)试样辐照器，所述试样辐照器用于在相同的时间段用来自至少两个源的激发辐射照射所述试样，所述两个源提供不同波长的激发辐射；
ii)调制装置，所述调制装置用于根据各自不同的调制方式调制所述至少两个源中的每一个的激发辐射；以及
iii)发射检测器，所述发射检测器用于检测来自所述试样的荧光辐射的发射，
其中，所述发射检测器适合于检测所发射的辐射的各自不同的调制方式中的每一个，以使能够单独检测所述试样对所述至少两个源的响应。
2.如权利要求1所述的设备，所述设备用在荧光谐振能量转移测定中，用于检测来自试样的荧光辐射的发射，所述试样含有至少两个不同的探针，每个探针包括一对供体/受体，其中，对所述至少两个源中的每一个的激发辐射的波长进行选择，以激发来自所述试样中的各自不同的探针的响应，以及所述发射检测器适合于检测所发射的辐射中的所述各自不同的调制方式中的每一个，以使可单独检测所述至少两个不同的探针对所述至少两个源的响应。
3.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，所述发射检测器适合于检测以第一波长的荧光辐射的发射和以第二波长的荧光辐射的发射，从而可单独检测所述试样的至少四个不同的响应，在每种情形中，通过调制方式和/或通过波长区别所述响应。
4.如权利要求3所述的设备，其中，所述至少四个不同的响应包括在所述试样中至少四个不同的探针的响应。
5.如权利要求2至4中的任一项所述的设备，其中，所述试样辐照器适合于在相同的时间段用来自多于两个的源的激发辐射照射所述试样，所述调制装置适合于根据各自不同的调制方式对所述源中的每一个的激发辐射进行调制，从而可单独检测所述试样的至少六个不同的响应，在每种情形中，通过调制方式和/或通过波长区别所述响应。
6.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，所述试样辐照器包括至少一个辐射偏转器，所述至少一个辐射偏转器用于将由所述源中的至少一个所提供的激发辐射偏转到与所述源中的至少另一个所提供的激发辐射共用的路径上，以输送到所述试样。
7.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，所述发射检测器包括用于过滤来自所述试样的荧光辐射的发射的滤波器，辐射显示所述各自不同的调制方式中的至少两个，在所述设备用时经由所述滤波器在相同的时间段检测所述调制方式。
8.一种用于监测在核酸扩增反应过程中试样响应于辐射源的激发而发射的荧光辐射的设备，所述设备包括：
i)试样辐照器，所述试样辐照器用来自源的激发辐射照射所述试样；
ii)调制装置，所述调制装置用于根据可检测的调制方式调制所述激发辐射；以及
iii)发射检测器，所述发射检测器用于检测来自所述试样的荧光辐射的发射，
其中，所述发射检测器适合于检测所发射的辐射中的所述调制方式，以使能够在至所述发射检测器的一个或多个其它辐射输入出现时检测所述试样对所述源的响应。
9.如权利要求8所述的设备，其中，所述发射检测器适合于在使用荧光谐振能量转移的过程中检测所述试样的一个或多个响应，所述一个或多个响应由报告系统生成，所述报告系统包括供体/受体对。
10.如权利要求9所述的设备，其中，所述试样辐照器适合于在使用荧光谐振能量转移的过程中用来自至少两个不同源的激发辐射照射所述试样，以及所述发射检测器适合于检测所述试样的两个或两个以上的不同响应，每个响应由所述报告系统的不同探针生成，每个探针包括供体/受体对。
11.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，所述调制装置适合于调制至少一个所述源的激发辐射的强度，以给出用于所述源的调制方式。
12.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，由至少一个所述源发射的激发辐射包括脉冲列，所述调制装置适合于调制所述脉冲列，以给出用于所述源的调制方式。
13.如权利要求12所述的设备，其中，所述调制装置适合于调制所述脉冲列的脉冲宽度，以给出所述调制方式。
14.如权利要求12所述的设备，其中，所述调制装置适合于调制所述脉冲列的脉冲重复率，以给出所述调制方式。
15.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，所述调制装置提供可作为频率进行检测的调制，所述频率在65Hz至10MHz的频率范围内。
16.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，所述试样包括生物试样。
17.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，引起经过检测的来自所述试样的荧光辐射的发射的过程包括核酸扩增反应。
18.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，引起经过检测的来自所述试样的荧光辐射的发射的过程包括免疫测定。
19.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，引起经过检测的来自所述试样的荧光辐射的发射的过程包括核酸杂交反应。
20.如前面的权利要求中的任一项所述的设备，其中，引起经过检测的来自所述试样的荧光辐射的发射的过程包括实时聚合酶链反应。
21.一种检测来自试样的荧光发射的方法，所述方法包括检测至少两个荧光发射，所述至少两个发射由各自不同的调制方式区分。
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