CN101374533B - 利用选择的乳酸杆菌减少婴儿腹痛 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了所选择的特定乳酸杆菌菌株、一种选择这样的菌株的方法，以及包含这样菌株的产品，其中，该菌株能提高IL-10的产量从而使CD4+CD25+TR细胞增殖而被选择，并且用于预防和/或治疗婴儿腹痛。

Description

利用选择的乳酸杆菌减少婴儿腹痛
技术领域
本发明这里提供了特定的乳酸杆菌菌株，以及一种选择这样菌株的方法，和包含这样菌株的产品；其中这些菌株由于具有提高细胞因子IL-10水平的能力而被选择出来，用于预防和/或治疗腹痛。
背景技术
虽然婴儿腹痛既普遍又痛苦，但是其特性和原因仍然不清楚。一位母亲对这种情况的描述是在一天中本来很高兴的婴儿，开始皱眉头、脸开始变红、蹬腿、尖叫并持续哭闹2～20分钟，然后这种袭击突然停止。甚至对于用来描述这种情况的术语也有争论。这些术语包括“婴儿腹痛”、“傍晚腹痛”，因为这种疼痛主要局限于晚间，以及“三个月腹痛”籍由这种症状在婴儿出生后三个月左右消失(Illingworth RS.Difficulties in breastfeeding.In Ronald S.Illingworth，ed.The Normal Child.10th edn.Harcourt(India)Pvt.Ltd.1997；39-44)。不同的作者采用不同的定义。Wessels的定义为腹痛是在至少三个星期的每个星期中三天或者更多天中出现每天三个或更多小时的阵发性哭闹，是在文献中最为广泛接受的(Sondergaard C，Skajaa E，Henriksen TB.Fetal growth and infantile colic.Arch Dis Child Fetal-Neonatal Ed 2000；83(1)：F44-47)。目前，主要的可能诱发因素被分成三组：心理与社会的、肠胃的和神经发育的疾病。
心理与社会的因素包括：正常哭闹的变体、非典型的养育行为影响、父母与婴儿之间交流问题的表现。
肠胃的疾病在腹痛中被涉及到，因为哭闹时婴儿腿部的位置和脸部的扭曲。肠胃的因素主要有以下内容：
不正确的喂养方法例如奶瓶喂养，水平位置喂养以及喂后缺少缺少使之打嗝的拍打被认为是诱发原因。在开始的六个月内母乳喂养被认为是唯一的保护因素。在非母乳喂养的婴儿中婴儿的腹痛的风险性提高了1.86倍。(Saavedra MA，Dacosta JS，Garcias G，HortaBL，Tomasi E，Mendoca R.Infantile colic incidence and associated riskfactors：a cohort study.Pediatr(Rio J)2003；79(2)：115-122)Lothe等人认为腹痛是由于对牛奶中乳清蛋白敏感(Lothe L，Lindberg T.Cow′smilk whey protein elicits symptoms of infantile colic in colicky formula-fed infants：A double-blind cross over study.Pediatrics 1989；83：262).
在一项近期的研究中，得出的结论认为食物的过敏性仅仅只是少部分婴儿的腹痛病例的诱因(Hill DJ，Hosking CS.Infantile colicand food hypersensitivity.J Pediatr Gastrenterol Nutr 2000；30(Suppl)：S67-76)。近来Buchanan已经显示低过敏原牛奶在婴儿腹痛中的实验没有得到足够的证据支持(Buchanan P.Effectiveness of treatment forinfantile colic。Trial of hypoallergenic milk is not supported by strongenough evidence.BMJ 1998；317(7170)：1451-1452)。患有婴儿腹痛的婴儿被认为具有较高的过敏性疾病风险度。然而，在一项近期的研究中，特应性、过敏性鼻炎、哮喘、喘鸣和呼吸频率变化的标记，在患有和不患有婴儿腹痛的婴儿中是可比对的(Castro-Rodriguez JA，Stern DA，Halonen M，Wright AL，Holberg CJ et al.Relationshipbetween infantile colic and Asthma/atopy：A prospective study in anunselected population.Pediatrics 2001；108(4)：878-882)。
乳糖吸收障碍已经被作者基于呼吸氢检测报道了(Hyams J，Geerstama M，Etienne N，Treem W.Colonichy drogen production ininfants with colic.J Pediatr 1989；115：592)。在患有和不患有婴儿腹痛的婴儿中没有发现粪便中氢浓度的差异。然而，产生较高甲烷水平的婴儿被发现减少了腹痛，这说明甲烷的产生能起到缓解作用(Belson A，Shetty AK，Yorgin PD，Bujanover Y，Peled Y，Dar MH，RiafS.Colonichy drogen elimination and methane production in infants withand without infantile colic syndrome.Dig Dis Sci 2003；48(9)：1762-1766)。
肠胃的(GIT)激素例如能动素，血管活性肠肽已经显示在患有腹痛的婴儿中异常高。Lothe等人发现在日后发展腹痛的婴儿从出生第一天起就显示GIT水平增高，其说明在婴儿腹痛患者的GIT生理状况异常(Lothe L，Ivassson SA，Ekman R，Lindberg T.Motilin andinfantile colic：A prospective study.Acta Pediatr Scand 1990；79(4)：410-416)。
已提出的神经发育失调显示腹部的痉挛和腹痛有可能是蠕动过度的结果。该理论得到的证据支持是利用抗胆碱能试剂可以减少腹痛症状(Gupta SK.Is colic a gastro intestinal disorder？Curr Opin Pediatr2002；14：588-92)。
大部分婴儿在4个月左右摆脱了腹痛困扰的事实支持了神经发育因素诱发腹痛的观点(Barr RG.Colic and crying syndromes in infants.Pediatrics 1998；102(5suppl E)：1282-6)。
根据普遍接受的定义，益生菌是一种活的微生物饲料添加剂，其能通过改善宿主肠内的微生物平衡而有效影响宿主动物。虽然最初指的是用于农场动物饲料的添加剂，用于人类的情况该定义也很容易被接受。人类所摄取的主要益生菌是包含肠道乳酸杆菌和双歧杆菌菌种的乳制品形式的食品。其暗示益生菌的摄取影响肠内微生物群落的组成。
有人提出益生菌对肠内生态系统的影响有益于摄取者。已经公开的通过使用益生菌改变肠内微生物而带来的很多可能的益处包括：提高传染性疾病的抵抗力、尤其是肠的、减少腹泻的持续时间、降低血液压力、降低血液胆固醇浓度、减少过敏、刺激外周血淋巴细胞的吞噬作用、调节细胞因子的基因表达、辅助作用、肿瘤衰退、和减少致癌物或辅致癌物的产生。
Christensen等人首先报道了益生菌乳酸杆菌的免疫调节作用，其调节树突状细胞(DCs)的Th1/Th2/Th3/Tr1/Treg-增强能力。他们展示了当鼠科动物细胞DCs暴露于不同乳酸杆菌种类的共培养物时，包括路氏乳酸杆菌，它们产生细胞因子Il-6，IL-10，IL-12，和TNF-α的能力和以浓度依赖的方式上调节MHC II类和CD86表面标记的能力被不同程度地调节。所有乳酸杆菌上调节的表面MHC II类和CD86标记-显示出DC成熟。在这些研究中尤其要注意到路氏乳酸杆菌(菌株12246)是一种弱的IL-12诱导剂，但是当其与约氏乳酸杆菌或干酪乳酸杆菌共培养时，其能不同程度地抑制前炎症细胞因子信号IL-12，IL-6和TNF-a的产生，而这些物质可被后两种种类刺激。IL-10的产生在这些情况下保持不变。
这些发现推出的结论是“路氏乳酸杆菌可能对肠内的树突状细胞产生一种环境调节作用，使其产生对于没有“危险信号”的抗原有益的耐受性，而同时保持了对通过危险信号例如LPS所识别的病原体完好的应答能力”，而且“路氏乳酸杆菌可能是一种潜在的精细靶向治疗，能有效下调节IL-12和TNF-α(和IL-6)产量同时诱导抗炎症因子IL-10，这样提供了一种替代的方法抗衡肠内前炎症因子微生物群落”并且因此“可能存在Th1/Th2/Th3的肠激发作用，根据肠微生物群的组成而被调节，肠微生物群包括摄入的益生菌。”(Christensen HR，Frokiaer H，Pestka JJ(2002)Lactobacilli differentiallymodulate expression ofcytokiness and maturation surface markers inmurine dendritic cells.J Immunol 168171-178)。
Smits等人扩展了这些研究并且发现路氏乳酸杆菌能够激活DCs以刺激T调节(TR)细胞产生。他们采用三种不同的乳酸杆菌在体外与人的单核细胞-来源的DCs共培养。其中两种乳酸杆菌，一种人的路氏乳酸杆菌菌株(ATCC 53609)和干酪乳酸杆菌，而不是植物乳酸杆菌菌株，激活这些DCs以刺激TR细胞的发育。这些TR细胞被显示出能产生水平提高了的IL-10并且能够以一种IL-10-依赖的方式抑制旁路T细胞的增殖(Smits HH，Engering A，van der Kleij D，de Jong EC，Schipper K，van Capel TMM，Zaat BAJ.Yazdanbakhsh M，Wierenga EA，van Kooyk Y，Kapsenberg L(2005)Selective probiotic bacteria induceIL-10-producing regulatory T cells in votro by modulating dendritic cellfunction through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule3-grabbing nonintegrin.J Allergy Clin Immunol 115 1260-1267)。
关于口服路氏乳酸杆菌对宿主自身的效果第一方面的证据是鸡回肠中观察到CD4+/CD8+T细胞比例上升(Walter J.Dobrogosz，NUTRAfoods 2005 4(2/3)15-28)。Valeur等人近来将这项研究扩展到人的回肠。他们在人类对象中获得原位证据显示(a)人特异性的路氏乳酸杆菌ATCC 55730个体细胞分布在整个人的肠中并且(b)路氏乳酸杆菌ATCC 55730参与特异地存在于肠的回肠区域CD4+T细胞的募集和/或增殖。他们总结认为“路氏乳酸杆菌的施用诱导CD4+T-辅助细胞募集到人的上皮。这种募集作用可以作为解释这种路氏乳酸杆菌菌株在人体中益生菌效应的一个因素(Valeur N，Engel P，Carbajal N，Connolly E，Ladefoged K(2004)Colonization andimmunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the humangastrointestinal tract，Appl Environ Microbiol 701176-1181)。
Toll类受体(TLRs)识别微生物的结构基序并且激活一系列引发细胞因子产生的基因。通常，TLRs被认为是微生物感染的感受器，并且它们的角色是诱发炎症应答。然而，能够被TLRs识别的结构基序并不是病原体特有的，而是所有微生物种类所共用的通用结构基序，而且免疫系统怎样通过TLRs区分共生菌和病原菌还不完全清楚。近来，数据显示TLRs，虽然其在诱导炎症应答中起作用，但是也通过识别共生微生物群而在维持肠内菌群平衡中起作用(Rakoff-Nahoum S，Paglino J，Eslami-Varzaneh F，Edberg S，MedzhitovR.Recognition of commensal microflora by toll-like receptors isrequired for intestinal homeostasis.Cell.2004 Jul 23；118(2)：229-41)。
各种乳酸菌菌种，包括路氏乳酸杆菌已经被用于配制益生菌制剂。路氏乳酸杆菌是动物肠胃的道中天然发生的居住菌，并且通常发现于健康动物的肠中，包括人类。已知其具有抗微生物活性。例如，参见美国专利US 5,439,678、5,458,875、5,534,253、5,837,238、和5,849,289。当路氏乳酸杆菌细胞生长在存在甘油的厌氧性条件下时，它们产生已知为β-羟基-丙醛(3-HPA)的抗微生物物质。
肠内的免疫系统和共生菌群之间存在一个清楚而复杂的关系。近来，已经证明腔内生的菌群可以通过toll样受体(TLRs)和NOD-受体起始所诱导的杆菌在肠上皮细胞上的内生和适应宿主应答的关键过程(Haller D，Jobin C.Interaction between resident liminal bacteriaand the host：can a healthy relationship turn sour？J Pediatr GastroenterolNutr 2004；38：123-36.Rakoff-Naholm S，Paglino J，Eslami-Varzaneh F，Edberg S，Medzhitov R.Recognition of comm.ensal microflora by Toll-like receptors is required for intestinal homeostasis.Cell 2004；118：229-241)。在动物模型中，细胞因子能够通过神经-和肌-免疫相互作用起始肠内神经肌肉的过反射应答(Milla PJ.Inflammatory cells and theregulation of gut motility.J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004；39：S750.)。
肠内的免疫系统和共生菌群之间存在一个清楚而复杂的关系。近来，已经证明腔内生的菌群可以通过激活肠上皮细胞上的toll样受体(TLRs)和NOD-受体而启动细菌诱导的天然和获得性宿主应答的关键过程(Haller D，Jobin C.Interaction between resident liminalbacteria and the host：can a healthy relationship turn sour？J PediatrGastroenterol Nutr 2004；38：123-36.Rakoff-Naholm S，Paglino J，Eslami-Varzaneh F，Edberg S，Medzhitov R.Recognition of comm.ensalmicroflora by Toll-like receptors is required for intestinal homeostasis.Cell 2004；118：229-241)。在动物模型中，细胞因子能够通过神经-和肌-免疫相互作用启动肠内神经肌肉的过反射应答(Milla PJ.Inflammatory cells and the regulation of gut motility J PediatrGastroenterol Nutr 2004；39：S750)。
在实验和临床研究中已经证明特异的益生菌菌株抑制T细胞的增殖并降低Th1和Th2两种细胞因子的分泌，同时优先产生抑制性细胞因子例如IL-10和TGF-β(Rautava S，Kalliomaki M，Isolauri E.Probiotics during pregnancy and breast-feeding might conferimmunomodulatory protection against atopic disease in the infants.JAllergy Clin Immunol 2002；109：119-121)。而且，在人类志愿者中，路氏乳酸杆菌在人的肠胃道中群集并且能够发挥免疫调节活性，包括在人的回肠上皮募集CD4+T-辅助细胞(Valeur N，Engel P，CarbajalN，Connolly E，Ladefoged K.Colonization and immunomodulation byLactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract.Appl Environ Microbiol 2004；70：1176-81)。DCs的成熟是将不成熟的DCs转变成成熟的抗原提呈细胞并移居淋巴结的过程。这一过程导致不成熟的DCs的特征即强有力的抗原摄取能力的丧失，并且上调节各种细胞因子和共刺激分子的表达(Mellman I，Steinman RM：Dendritic cells：specialized and regulated antigen processing machines.Cell 2001，106：255-8.Banchereau J，Briere F，Caux C，Davoust J，Lebecque S，Liu YJ，Pulendran B，Palucka K：Immunobiology ofDendritic cells.Annu Rev Immunol 2000，18：767-811)。
已知成熟的条件是基于DCs在暴露于抗原期间或之后与之相遇的环境。这种情况的最好实施例是利用单核细胞-条件的培养基(MCM)。MCM是通过培养的单核细胞在体外产生的并且随后采用培养液的上层清液作为成熟因子的来源。在MCM中负责成熟的主要成分是前炎症细胞因子白细胞介素-1beta(IL-1β)，IL-6和TNF-α(Reddy A，Sapp M，Feldman M，Subklewe M，Bhardwaj N：A monocyteconditioned medium is more effective than defined cytokines inmediating the terminal maturation of human dendritic cells.Blood 1997，90：3640-6.)。成熟的DCs产生各种细胞因子，其刺激和介导T细胞应答。这些细胞因子中的两种是IL-10和IL-12。这些细胞因子在诱导的T细胞应答的方面具有相反的效应：IL-12诱导Th1型应答而IL-10则抑制这样的应答。
因此，APCs的活化状态(抗原提呈细胞)，包括DCs，决定了CD4+T细胞应答的类型和大小。静止的APCs(包括胸腺中的上皮细胞)可以促进CD4+CD25+TR细胞的发育。在病原体感染期间，通过TLRs识别微生物分子导致APCs的活化。随后APCs产生IL-6和其它能一起使TR细胞抑制效应失效的可溶性因子，以允许有效产生TE(T效应细胞)细胞对抗病原体。静止的和活化的APCs之间的动态平衡也将受TR和TE细胞两者活动的影响(图1)。
Pessi等人(2000)公开了IL-10在特应性儿童口服鼠李糖乳酸杆菌之后的产生情况。但是不像本发明，该研究没有公开能够产生高数量的IL-10的特异性菌株，其因为对抗能动性失调和腹痛的效率而被选择(Pessi T，Sutas Y，Hurme M，Isolauri E.Interleukin-10generation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus.GG.Clin Exp Allergy.2000Dec；30(12)：1804-8)。
Hermelijn等人的一项研究(2005)显示路氏乳酸杆菌和干酪乳酸杆菌，但不是植物乳酸杆菌，诱发单核细胞-来源的DCs以驱动TR细胞的发育。所产生的这些TR细胞产生水平提高了的IL-10。不象这里的本发明，该作者没有把IL-10的提高与肠能动性或腹痛联系起来。即使在提到菌株时，该作者介绍了两种能有效提高IL-10水平的不同的细菌种类。这与本发明形成了对比，本发明显示最有效地减少腹痛的益生菌必须在菌株水平上确定和选择，因为相同种类的不同菌株有效增加IL-10水平的能力不同。
目前没有腹痛的有效疗法。目前治疗腹痛的范例由药理学的和/或非-药理学的方法组成，使症状减小到最低限度。通常提供给父母的腹痛治疗性干预包括四个策略：包括饮食的、物理的、行为的和药理学。饮食操作法包括各种喂养技术的专业建议，或者采用低过敏原的牛奶，豆奶或无乳糖的配方奶，以及提早引入固体食物(Lothe，L.，et al.cow′s milk formula as a cause of infantile colic：adouble-blind study.Pediatrics 1982；70：7-10；Forsyth B W C.Colic andthe effect of changing formulas：a double-blind multiple-crossover study.J Pediatr 1989；115，521-6；Treem，W R，et al.Evaluation of the effect ofa fiber-enriched formula on infant colic.J Pediatr 1991；119695-701)。然而，不管是采用豆奶配方还是改变喂养技术并不是对各种腹痛的情况都有效。研究这些建议的统计数据表明采用低过敏原配方奶，例如部分水解的或氨基酸基的，可能对仅仅大约25％婴儿有益(Lucassen，P L B J，et al.infantile colic：crying time reduction with awhey hydrolysate：a double-blind，randomized placebo-controlled trial.Pediatrics 2000；106：1349-54；Estep，D C，et al.Treatment of infant colicwith amino acid-based infant formula：a preliminary study.Acta Paediatr2000；89：22-7)。
用于治疗腹痛的物理策略包括物理移动身体位置以减轻气体/逆流的产生、抱着婴儿走、包裹、对腹部施压、或给婴儿按摩。其它方法包括使婴儿分心以减轻其对腹痛的警觉性例如带婴儿坐车、利用坐车模拟器、利用婴儿床振荡或摇篮(Lipton E L.Swaddling andchild care practice：historical，cultural and experimental observations.Pediatrics 1965；35：521-67；Byrne J M，Horowitz F D.Rocking as asoothing intervention：the influence of direction and type of movement.Infant Behav Dev 1981；4：207-18)。
另一种方法是播放一些据说能使婴儿放松的录音。然而，在医学文献中有证据显示这些方法不起作用(Parkin P C，Schwartz C J，Manuel B A.Randomized controlled trial of three interventions in themanagement of persistent crying of infancy.Pediatrics 1993；92(2)：197-201)。这些策略，最好的情况下，只是辅助减轻腹痛的症状。
建议进行行为干预而治疗腹痛是目前矛盾最多的疗法。一些作者主张提高感官刺激，而其它则主张降低这样的刺激(Balon A J.Management of infantile colic.Amer Pham Physician 1997；55：235-242；Lucassen P L B J，Assendelft W J J，Gubbels J W，van Eijk T M，vanGeldrop W J，Effectiveness of treatments for infantile colic：systematicreview.BMJ 1998；316(5)：1563-9；and Carey W B，″Colic″--primaryexcessive crying as an infant-environmental interaction.Pediatr ClinNorth Am 1984；31：993-1005)。其它建议包括提早对哭闹作出反应，或者允许婴儿哭闹，提供橡皮奶头，执行固定的喂食时间表，采用眼神交流和互动游戏。
治疗腹痛的药理干涉导致利用处方或非处方药物。目前采用的处方药物包括颠茄碱和镇静剂(镇痛剂)，其可以减轻疼痛，但是伴随的风险包括锥体外系症状、呼吸阻抑、和便秘。例如，抗胆碱能的药物，其作用类似于阿托品，例如，莨菪碱(
Figure S2007800012187D00111
或
Figure S2007800012187D00112
)和双环胺泡腾片，会加快心跳，减少唾液的产生，解除肠胃和尿道以及支气管的痉挛。虽然抗胆碱能的药物是唯一在美国市场上用于一直显示对于婴儿腹痛有效的处方药物，不幸的是，有超过5％受治疗的婴儿产生副作用，包括呼吸困难、呼吸暂停、癫痫发作、晕厥、窒息、昏迷和肌肉张力过低(Williams J，Watkin-Jones R.Dicyclomine：worrying symptoms associated with itsuse in some small babies(BMJ 1984；288：901；Myers J H，Moro-Sutherland D，Shook J E.Anticholinergic poisoning in colicky infantstreated with hyoscyamine sulfate.Am J Emerg Med 1997；15：532-5)。此外，在服用双环胺的婴儿中还有几例死亡的报道(Garriott J C，Rodriguez R，Norton L E.Two cases of death involving dicyclomine ininfants.Clinical Toxicol 1984；22(5)：455-462)。
已报道的对于治疗婴儿腹痛有效的非处方药物包括几种镇静或催眠药物，包括超药理学剂量的(高剂量)苯海拉明
Figure S2007800012187D00113
、苯巴比妥、水合氯醛、甚至酒精。然而，在患有呼吸疾病的儿童中这些物质可能存在严重的副作用，因此限制了它们在治疗腹痛中的广泛应用(Balon A J.Management of infantile colic.Amer Pham Physician 1997；55：235-242；Gurry D.infantile colic.Australian Pham Phys 1994；23(3)：337-34632)。
比较安全的治疗腹痛的非处方药物主要包括施用西甲硅油或者聚二甲硅氧烷，一种不易吸收的非处方药，其能减小肠内气泡的大小。西甲硅油非常安全并且经常被推荐，但是仍然有几个研究显示西甲硅油对于婴儿的腹痛的效果并不比安慰剂的好(Metcalf，T J，etal.，Pediatrics 1994 July；94(1)：29-34.Sferra，T J，et al.，Pediatr ClinNorth Am 1996 April；43(2)：489-510.Danielson，B.et al.，Acta PaediatrScand 1985 May；74(3)：446-50.Colon，A R，et al.，Am Fam Physician1989 December；40(6)：122-4)。因此，当今最常用的腹痛治疗只是等待婴儿长大到不会再患腹痛。
因此，目前需要一种对于治疗婴儿和幼儿腹痛有效并安全的化合物和组合物以及技术。本发明的组合物和方法，符合这种需要，提供的产品能够安全而有效地治疗与婴儿腹痛相关的症状。专利申请EP1364483A10公开了用于治疗肠—神经肌肉紊乱例如婴儿腹痛的益生菌。申请人介绍了几种不同的细菌种类可以作为益生菌。这与本发明形成对比，本发明的最有效减少腹痛的益生菌是一种特异的乳酸杆菌，其因为有效提高IL-10的水平而被选择，而不是一个整个的细菌种类，本发明的发明者已经证明在相同种类的不同菌株之间在刺激IL-10产量上具有显著差异。
在2005年，Savino证明在7天的治疗中补充路氏乳酸杆菌ATCC55730与采用西甲硅油的标准治疗法相比能显著改善哺乳婴儿腹痛症状。采用路氏乳酸杆菌治疗的有效率为95％而只采用西甲硅油的婴儿中仅仅为7％。他在2005年8月31日至9月3日在意大利西恩那召开的会议上将结果提交给了欧洲儿科研究学会(ESPR)(Pediatr Res.2005；58(2)：411)。虽然Savino’s的结果显示出有益的效果，他不知道提高IL-10产量的特异菌株与降低肠能动性并因此减少腹痛之间的关系。这里本发明提供了选择这样的最佳菌株的方法。
Collins公开了运动功能失调产生的一系列症状，其能增加肠的各个区域和其附近器官的炎症和免疫激活状态，例如食道炎、胃炎、和自发性肠炎(IBD)。这些研究表明肠的能动性也受免疫系统的影响。在这种情况下，运动系统可能在肠抵抗存在于内腔中的有害刺激的过程中起到重要作用(Collins S.，The Immunomodulation ofEnteric Neuromuscular Function：Implications for Motility andInflammatory Disorders.Gastroentrology 1996；111：1683-1699)。这种观点被反映，例如，通过Vantrappen等人的研究，其显示细菌在小肠中过度生长伴随着小肠中消化运动正常循环模式的瓦解(Vantrappen G，Jannssens J，Hellemans J，Ghoos Y.The interdigestivemotor complex of normal subj ects and patients with bacterial overgrowthofthe small intestine.J Clin Invest 1977；9：1158-1168)。
很多年前就已知提高IL-10的水平会抑制过度活化的免疫系统。以前还证明了肠能动性受神经信号的控制，该信号与肠内的免疫系统相关联而腹痛就是肠能动性增加了的结果，例如，由于细菌的过度生长。
在工业化国家，早在分娩过程就开始采取卫生措施，其扰乱了初生儿获取母亲肠微生物菌群的能力。结果，不同的微生物菌群在婴儿体内建立起来。代替受到例如大肠杆菌和乳酸杆菌的保护，在新生儿身体更常有金黄色葡萄球菌和其它皮肤细菌的集群。
本发明的发明者出乎意料的发现当皮肤细菌过度生长时会过度活化婴儿的免疫系统，导致肠能动性的过度活化并导致腹痛的结果，较高数量的特异肠道细菌，例如路氏乳酸杆菌DSM 17938，具有提高IL-10产量的能力，导致TR系统的成熟即CD4+CD25+TR细胞的增殖。CD4+CD25+细胞的上调节导致肠能动性的降低从而对患有腹痛的婴儿产生有益的效果。
由于这些发现，非病原菌菌株因为提高IL-10的特性而被选择，并令人惊奇的发现具有这种特性的菌株与减少婴儿腹痛的关系。因而，本发明涉及采用路氏乳酸杆菌DSM 17938用于制造一种用于预防和/或治疗腹痛的医药用品，并且以相同的方法选择的其它菌株。
本发明的又一个目的是提供包含所述菌株并且施用给动物，包括人类的产品。其它的目标和优点将通过以下公开和附属的权利要求而更加清楚。
发明概述
本发明这里提供一种特定的乳酸杆菌菌株、一种选择这样的菌株的方法、以及包含这样菌株的产品。其中，该乳酸杆菌菌株由于具有提高IL-10的产量并因此促进CD4+CD25+TR细胞增殖的能力而被选择，用于预防和/或治疗腹痛。
其它的目的和特征将通过以下说明和权利要求而更加清楚。
附图说明
图1表示所选择的特定的乳酸杆菌菌株在促进CD4+CD25+TR发育过程中的作用。
图2a表示通过DC细胞产生IL-10产量的条形图；
图2b表示通过DC细胞产生IL-10产量的表格。
具体实施方式
皮肤细菌在肠中的集群和缺乏TR细胞而使新生儿免疫系统过度活化，导致肠能动性的过度活化而引起腹痛。大量的特异肠杆菌细胞，例如路氏乳酸杆菌DSM 17938，具有提高IL-10产量的能力，导致TR系统的成熟，即CD4+CD25+TR细胞增殖。以前很多研究者曾报道的其它乳酸杆菌菌株能诱导IL-10的产量例如Rautava等人(前述)。CD4+CD25+细胞的上调节导致肠能动性降低并且因而对腹痛产生有益的效果。令人惊奇的是发现引起细胞因子IL-10水平提高的菌株与能够降低平均哭闹时间的菌株是同一菌株(实施例2)。
本发明这里包括已选择的乳酸杆菌菌株，包括路氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM 17938，该乳酸杆菌菌株由于具有减轻腹痛的能力而被选择。包含取自这些菌株的整个细胞或成分的产品例如食物、营养添加剂和组合物、药物和医药设备可以通过本领域公知的方法制备，并且通常包括一种加入了乳酸杆菌-菌株、或者从其中获得的成分的可吸收支持物。
一种在体外的研究方法被用作选择乳酸杆菌菌株的方法，菌株由于具有刺激IL-10从单核细胞来源的DCs产生的能力而被选择，并且因此具有诱导CD4+CD25+TR细胞发育的能力(实施例1)。
数据显示IL-10受到特异菌株路氏乳酸杆菌ATCC 55730和路氏乳酸杆菌DSM 17938的有力刺激，并且这种调节是通过这两种特异菌株在对数/静止生长期间释放到培养基中的一种物质介导的。相反，两种其它的路氏乳酸杆菌菌株不能刺激相应的IL-10产量。
为了确认所选择菌株用于防止或治疗腹痛的临床相关性，在诊断患有婴儿腹痛的母乳喂养婴儿中进行了进一步的研究。
本发明的特征将通过参考以下的实施例而更加清楚，但这些实施例不应该被看成是对本发明的限制。
实施例1
益生菌菌株对于通过单核细胞来源的DC增加IL-10产量的能力的研究：
将自外周血单核细胞而产生的不成熟的DCs(Hilkens，C.M.U.，P.Kalinski，M.de Boer，and Kapsenberg.1997.Human dendritic cellsrequire exogenous interleukin-12-inducing factors to direct thedevelopment of naive T-helper cells toward the Th1 phenotype.Blood90：1920)培养在IMDM中(Life Technologies，Paisley，U.K.)，该培养基包含10％胎牛血清(HyClone公司，Logan，UT，USA)、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Recombinant Human rh GM-CSF)(500U/ml；荷兰于登Schering-Plough公司)、和重组人白介素-4(250U/ml；德国汉诺威Pharma Biotechnology公司)(Kalinski，P.，J.H.N.Schuitemaker，C.M.U.Hilkens，E.A.Wierenga，and M.L.Kapsenberg.1999)。最终成熟的树枝细胞与对IFN-γ和对杆菌的IL-12诱导子的响应度降低相关联：成熟树枝细胞在与Th细胞相互作用期间产生IL-12的能力降低(J.Immunol.162：3231)。
在本实施例中被检测的菌株是路氏乳酸杆菌ATCC 55730、路氏乳酸杆菌DSM 17938、路氏乳酸杆菌ATCC PTA 4660和路氏乳酸杆菌ATCC PTA 4964，它们均可以从ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)、和DSMZ(德国布朗斯威克)获得。菌株被培养在包含6.25％绵羊血的哥伦比亚琼脂中(英国，贝辛斯托克，Oxoid公司)。乳酸杆菌在37℃在5％CO2气氛中孵育。3天之后，细菌的数目通过在620nm(OD620)处测量光密度而被测定。通常，对于所有待测菌株OD620值0.35对应着1×108克隆形成单位(cfu)。
在第6天，由LPS(大肠杆菌，美国圣路易的Sigma-Aldrich公司)诱导不成熟的DCs使其成熟，在含有细胞因子IL-1β(25ng/mL)和TNF-α(50ng/mL)组合物的存在下测试乳酸杆菌，并且全部用作成熟因子(细胞因子购自美国新泽西洲洛基山的Peprotech公司)。
正如Vieira PL等人所描述，由成熟的DCs产生的IL-12、IL-10、和IL-6细胞因子通过CD40配体表达小鼠浆细胞瘤细胞刺激24小时的方式而被测定(Vieira PL，de Jong EC，Wierenga EA，Kapsenberg ML，Kalinski P.Development of Th1-inducing capacity in myeloid dendriticcells requires environmental instruction.J Immunol 2000；164：4507-12)。24小时之后，收集上清液，并通过ELISA检测IL-10的浓度。结果见图2。从结果可以看到，不同的乳酸杆菌菌株提高DCs产生IL-10的能力是具有显著差异的。
实施例2
所选择的益生菌菌株与西甲硅油在治疗婴儿腹痛的比较
儿科及青少年科学部门征募诊断患有婴儿腹痛的母乳喂养的婴儿(Drottning Silvias University Hospital，
Figure S2007800012187D00171
)。患者年龄为21-90天，足月分娩，出生重量为2500至4000g，腹痛症状符合Wessel’s标准，并且在登记之前发病差不多6±1天，被认为可以用于本研究(Wessel MA，Cobb JC，Jackson EB，Harris GS，Detwiler AC.Paroxismalfussing in infancy，sometimes called“colic”trics 1954；14：421-35)。所有登记的婴儿严格进行母乳喂养从而减少肠内的微生物菌群由于饮食变化而产生变化，这种变化可能转而影响对益生菌的反应。如果有临床证据显示婴儿患有慢性疾病或肠胃疾病或者在征募前一个星期接受过抗生素或益生菌，他们将被排除在外。
在本研究中，腹痛婴儿在以下治疗中随机接受益生菌或西甲硅油：
(P1)路氏乳酸杆菌菌株ATCC 55730也称为SD2112，
(P2)路氏乳酸杆菌菌株DSM 17938，根据布达佩斯协议于2006年02月06日保藏于德国DSMZ微生物菌种保藏中心(MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig)，
(P3)路氏乳酸杆菌菌株ATCC PTA 4660以及
(S)西甲硅油。
路氏乳酸杆菌以108克隆形成单位(CFU)的计量添加在5滴有商业出售的MCT-油(中链甘油三酸酯)中悬浮30分钟之后喂食，一天一次时间为28天。MCT油是天然发生的，最丰富的来源是椰子油。绝大多数MCT油是从椰子油中精炼而来。MCT油是清亮的、且无味的、低黏度的液体。这种油的悬浮液在2～8℃能稳定21个月(根据制造商的文献，瑞典斯德哥尔摩，BioGaia AB公司)(可替代的MCT油来源是瑞典卡尔斯哈门，BioGaia AB公司)。在研究过程中，父母被指导在不使用产品时将其放在冰箱中。西甲硅油(S)的施用剂量为60mg/天，以3mL市售溶液(Mylicon Infants Gas Relief Drops，J&J，7050Camp Hill Rd.，Fort Washington，Pennsylvania，19034-2210，USA)，在喂食后施用，一天两次共28天。在登记册的所有母亲被要求遵守如报道的无牛奶饮食：避免牛奶，酸乳酪，新鲜的和干的奶酪，奶油，黄油，饼干。在所有治疗期间对食谱的坚持通过饮食日记被监控。在第7、14、21和28天研究者会检查这个食谱的坚持情况。
研究所的道德委员会同意本研究的各项条件而只有在获得了父母的书面同意书之后婴儿才参与到这项研究中。
随访
儿科医生首次见到婴儿的时间定为第一天(Day-1)。在这个场合，婴儿进行医学检查而父母被接见以获得涉及分娩类型、出生体重和妊娠年龄、家族肠胃病历史和遗传性过敏症等的背景数据。特别是，如果婴儿的一个或更多家庭成员(母亲、父亲和/或年长的兄姐)患有过敏性湿疹、过敏性鼻炎或哮喘的话，最后一项认为是阳性的。而且，在研究期间任何遗传性过敏疾病的信号和症状都会被记录。父母还被要求在征募第0天(Day 0)之后记录每天平均哭闹次数和腹痛情节数量。医生将婴儿随机分配至任何研究小组。研究产品在第一天(Day 1)开始施用。
父母被要求采用固定的笔记本从第0天到第28天书面写下研究的信息并且被要求记录每天伤心哭闹情节的数量和持续时间、大便粘度和频率以及任何所观察到的副作用(便秘、呕吐、感染反应等)。为了确保所有的父母以相同的方式记录哭闹时间并确保婴儿被正确的给予医药制品，研究者之一总是与父母保持电话联系以帮助父母。
每个患者在第1，7，14，21和28天由同一名儿科医生再次检查。
结果
所登记的120名母乳喂养的腹痛婴儿中，30名随机的采用路氏乳酸杆菌ATCC 55730(P1)治疗，30名随机的采用路氏乳酸杆菌DSM 17938(P2)治疗，30名随机的采用路氏乳酸杆菌ATCC PTA4660(P3)治疗并且30名随机的采用西甲硅油(S)治疗。没有婴儿退出，因为没有任何与实验相关的副作用。各小组的年龄、出生体重、性别、分娩类型、过敏或肠胃疾病家族史、以及被动吸烟等方面相似。
在第0和第1天，各治疗小组的每天平均哭闹时间是相似的。接受路氏乳酸杆菌ATCC 55730(P1)和DSM 17938(P2)的婴儿在第7天的日常哭闹时间与接受ATCC PTA 4660和西甲硅油(S)的婴儿相比显著减少。在第14、21和28天这四个治疗组的哭闹时间显著不同。在28天中，(P1)和(S)之间平均每天哭闹时间的差异从开始到研究结束是82分钟，(P2)和(S)之间平均每天哭闹时间的差异从开始到研究结束是83分钟(表1)。从结果可以看到四个小组在接受治疗产品之前基本上是一致的。7天之后路氏乳酸杆菌菌株ATCC55730和DSM 17938的效果比另外两种添加剂的具有清楚的差异。28天之后差异更加巨大。
表1.路氏乳酸杆菌和西甲硅油小组的哭闹时间(平均分钟/天)
  腹痛婴儿N＝120   路氏乳酸杆菌ATCC55730N＝30   路氏乳酸杆菌DSM 17938N＝30   路氏乳酸杆菌ATCC PTA 4660N＝30   西甲硅油N＝30
  第0天   206   203   204   205
  第1天   191   190   198   194
  第7天   147   148   171   172
  第14天   98   100   156   155
  第21天   75   77   150   148
  第28天   58   59   145   141
虽然本发明已经结合具体的实施例进行了公开，要理解的是各种变化、修饰和实施例是可能的，并且因此所有这样的变化、修饰、和实施例被认为在本发明的精神和范围之内。

Claims (5)

1.一种路氏乳酸杆菌DSM 17938的生物纯培养物。
2.一种用于减少婴儿腹痛的组合物，包括一种路氏乳酸杆菌DSM 17938的生物纯培养物。
3.一种乳酸杆菌菌株在制备用于减少婴儿腹痛的含有乳酸杆菌菌株的药物中的应用，其中，所述乳酸杆菌菌株为一种能够促进人体IL-10表达的乳酸杆菌菌株，并且所述乳酸杆菌菌株是路氏乳酸杆菌DSM 17938。
4.一种减少婴儿腹痛的产品，所述产品包括一种能提高IL-10水平而被选择的乳酸杆菌菌株，所述乳酸杆菌菌株是路氏乳酸杆菌DSM 17938。
5.如权利要求4所述的产品，还包括中链甘油三酸酯-油。
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