CN101374506B - 包含气芯和壳体的颗粒的制备方法及这样获得的颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含气芯和壳体的颗粒的制备方法，所述颗粒适合于用作造影剂和用作治疗组合物的一部分，尤其用于药物递送。在提供超声能量时这些颗粒显示惊人高的活化水平。
Description
技术领域
本发明涉及包含气芯(gas core)和壳体的颗粒的制备方法，所述颗粒适合于用作造影剂和用作治疗组合物的一部分，尤其用于药物递送。
背景技术
用于诊断目的的超声造影剂是可以获得的。其中第一代造影剂由自由气泡组成，目前的试剂通常由气芯(gaseous core)和壳体组成；所述壳体可以由脂质单层、诸如人血清白蛋白的蛋白质或者可生物降解聚合物组成。具有聚合物壳体的试剂常常被称为硬壳试剂，并且它们的行为与例如脂质壳试剂不同。它们通过从它们的内部释放气体而给出超声造影，这仅仅在超声照射(例如机械指数和/或脉冲长度)值的某个阈值以上发生。其它试剂在它们变得有声学活性之前并不表现出这样的阈值。认为具有这样的阈值对于其中首先产生无造影剂活性的图像的某些成像技术来说是有利的。它对于药物递送目的也是高度期望的，其中每个观察到的声猝发对应于单一药物递送事件。这使得能够对所递送的药物的量进行定量。
常常观察到在聚合物壳气泡的样品中并非所有充气聚合物囊都在超声辐照时变得有声学活性。文献参见Bloch等人，Applied Physics Letters，84，631，2004，图1。Bouakaz等人(Bouakaz，Versluis，De Jong，Ultrasound inMedicine and Biology，31，391，2005)未能在诊断频率和压力下检测特别小(2μm)的囊的活化。
从造影剂中的不完全气体释放可能导致成像灵敏度和治疗效能的损失。结果可能是不必要的高剂量。对于药物递送来说，不完全释放可能意味着只有一部分药物会被释放，而极有可能过量药物会在肝或脾中而不是在感兴趣的区域处积聚。
USA-6,896,659涉及使用超声引发试剂从具有一组指定机械性能的中空微泡中释放，将治疗剂递送到个体内局部区域的方法。在US-A-6,896,659中公开的试剂具有受控的脆性，其特征为具有一致的壁厚与直径比率，所 述比率限定离散阈值功率强度。US-A-6,896,659具体公开了微泡的制备方法，其中在微泡生成中将环辛烷用作溶剂。该环辛烷在随后的步骤中通过冻干法被去除。Bouakaz等人，Ultrasound in Medicine and Biology，31，391，2005发现，这样的气泡实际上难以用超声力击破。他们发现大囊与小囊相比在较低的声压下破裂并且推断大小对这些气泡的脆性的影响仍然存在。在一般诊断条件下，由该方法制备的颗粒的至少一部分不破裂。
WO-A-98/48783公开了可以用作超声造影剂和用于将药物递送到血流中的微粒。微粒具有包含内层和外层的壳体。在包括以下步骤的方法中制备所述颗粒：形成生物相容材料的第一水分散体并将其与可生物降解聚合物的第二溶液混合，其中所述第二溶液包含对于所述聚合物而言相对挥发性的不与水混溶的溶剂和相对非挥发性的不与水混溶的非溶剂。所述相对非挥发性的不与水混溶的非溶剂典型地为C6-C20烃。在实施例中使用环辛烷。与US-A-6,896,659中所述的颗粒一样，这些颗粒可能在一般超声条件下仅部分破裂。
期望合成这样的试剂，其能够在诊断成像中可接受的压力和频率下被声学活化，并且这种活化优选是完全的，释放最优选从所有受声波作用的囊中发生。本发明的另一目的是使活化百分比与囊的粒度无关，从而使试剂释放与囊的粒度无关。
发明内容
我们已惊奇地发现，包含气芯的有壳颗粒的稳定性至少部分由壳体厚度和水不能穿透所述壳体进入所述芯来决定。我们已发现，在这些颗粒的制备方法中使用溶剂的特定组合是非常期望的。
因此，本发明在第一方面涉及包含气芯和壳体的颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含壳体成分、第一溶剂(1)和第二非溶剂(2)的混合物；
b)将步骤(a)的混合物与含水成分混合，由此在水相中形成步骤(a)的混合物的乳状液；
c)施加挥发溶剂(1)的条件；
d)施加去除水的条件；
e)施加去除非溶剂(2)的条件；
其中非溶剂(2)选自在步骤(d)的条件下蒸气压显著比水低的有机成分。
在另一方面，本发明涉及由该方法获得的颗粒，它们在造影剂和治疗剂中的包裹体，并且涉及造影剂或治疗组合物，其中大部分颗粒能够由强度在对于超声诊断成像而言通常的范围内的超声力活化。
附图说明
图1：用于事件计数和回波强度测量的装置的示意图；
图2：如实施例1中所述制备和测量的pla-pfo囊的事件计数；
图3：如实施例1中所述制备和测量的囊的平均回波强度；
图4：如实施例2中所述测量的混合有pla-peo的pla-pfo的事件计数；
图5：实施例5测定的肿瘤大小。
具体实施方式
在本发明的语境中使用以下定义。
将参考具体实施方案并参照某些附图描述本发明，但是本发明并不局限于此，而是仅仅由权利要求书限定。权利要求书中的附图标记不应理解成限制该范围。所描述的附图仅仅是示意性的而非限制性的。在附图中，为了说明目的，一些元件的尺寸可能被放大而不是按比例绘制的。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括”或“包含”时，其并不排除其它元件或步骤。当提及单数名词时使用不定冠词或定冠词例如“a”或“an”、“the”时，除非另有明确规定，否则这包括该名词的复数。
本发明涉及颗粒的制备方法，所述颗粒适合于用作造影剂或者用作药物组合物中的药物递送载体。
在本发明的方法中，步骤(a)包括提供包含壳体成分、第一溶剂(1)和第二非溶剂(2)的混合物。
该混合物优选大约在室温，更优选在4至30℃的温度下制得。
在本发明的语境中，溶剂(1)优选是壳体成分的良好溶剂。优选溶剂1是形成壳体的聚合物的良好溶剂，而非溶剂2是形成壳体的聚合物的不良溶剂。溶剂(1)优选至少在一定程度上溶解在水中。溶剂(1)优选是相对挥发性的成分。
溶剂(1)优选是在步骤(c)的条件下蒸气压比水高的溶剂，更优选选自二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸异丙酯或它们的组合。
据信非溶剂(2)的存在是为了制备包含气芯和壳体的颗粒(囊)而不是固体颗粒。因此，溶剂(2)的适当成分期望地是相对非挥发性的成分，其中所选则的壳体成分不溶解或者仅仅很小程度地溶解。与溶剂1相反，对于非溶剂(2)而言，高度优选在水中的溶解度很低，接近于零。
非溶剂(2)选自在步骤(d)的条件下蒸气压显著比水低的有机成分。更优选在步骤(d)的条件下非溶剂(2)的蒸气压比水的蒸气压低至少5倍。应当理解，选择非溶剂(5)以使其蒸气压仍然足够高以使得能够在冷冻干燥条件下(任选地与优选使用公知标准设备容易达到的合适减压组合)去除。
这一低蒸气压会确保溶剂(2)确实保留在形成的囊内，最后导致形成具有含气空腔的囊。优选所述囊包含至少一个空腔。最优选所述囊包含一个主空腔和任选的其它小空腔。在步骤(c)中，如果在完全去除溶剂1之前非溶剂(2)从囊中消失，则囊会表现出过大的收缩，由此增加它们的壁厚。
在优选实施方案中，非溶剂(2)选自碳链长度为10至20个碳原子的烃。发现有利的是从环癸烷、癸烷或它们的组合中选择非溶剂(2)。在最优选的实施方案中，非溶剂(2)包括环癸烷，更加优选非溶剂(2)基本上由环癸烷组成。在本发明的语境中，基本上由……组成意为非溶剂(2)的至少80重量％，优选90-100重量％是环癸烷。
在步骤(a)中任选地使用溶剂(1)和(2)的预混物以及壳体成分和溶剂(1)的预混物。
下一步骤(b)包括将步骤(a)的混合物与含水成分混合，由此在水相中形成步骤(a)的混合物的乳状液。
优选将含有步骤(a)的混合物的壳体成分加入含水成分中。为了生成乳状液，优选施加搅拌或另一种形式的搅动/剪切力。
任选地包括进一步的乳化处理以形成具有期望的、优选单分散的粒度分布的乳状液。
获得这种乳化处理的合适设备例如选自胶体磨、均化器、超声发生器。
任选在这样的处理之前或之后将乳状液挤压通过玻璃滤器。当期望时 可以多次重复这样的处理。
产生期望的具有窄分布的粒度的另一实施方案使用制备单分散乳状液的方法例如喷墨技术和使用微通道或微孔的乳化。对于微孔膜，可以施加横向流以改善粒度分布。使用喷墨技术制备颗粒的方法例如公开在共同在审申请IB2005/052098中。在下一个步骤(c)中，施加条件以去除溶剂(1)。在本申请的语境中，这也被称为挥发溶剂(1)。可以应用任何合适的技术以去除溶剂(1)。
高度优选控制条件以使水和尤其是非溶剂(2)尚不被去除。步骤(c)中的条件优选使得大多数非溶剂(2)尚不被去除，更优选基本上没有非溶剂(2)被去除。因此，优选在该步骤中不采取措施(例如通过施加真空)以降低混合物周围的压力。
去除溶剂(1)的适合方式是将温度升高至例如25℃至35℃，或者简单地通过将混合物搅拌给定量的时间来进行。
不希望受到任何理论的束缚，据信在溶剂(1)蒸发时，乳状液内相中的壳体成分浓度升高到溶解度阈值以上并且在这时壳体成分会开始沉淀。
该沉淀然后导致在乳状液内相(乳状液液滴)的表面形成聚合物壳体。据信一旦大多数或所有溶剂(1)蒸发，就产生覆盖芯的壳体成分，其包含非溶剂(2)、水和任选的可能已在该方法较早阶段加入的其它成份。
在下一步骤(d)中施加条件以从芯中去除水。这之后立即在步骤(e)中去除非溶剂(2)。
高度优选在两个不同步骤中分别去除水和非溶剂(2)。实际上在这些步骤之间有一些重叠可能是不可避免的，但是优选应当避免重叠。通常水的去除是通过例如冷冻干燥技术获得的。非溶剂(2)的去除可能还需要减压。
在步骤(e)之后产生包含经干燥颗粒的组合物。在再悬浮之后，给药适当剂量的试剂如包含这些颗粒的造影剂或治疗剂。
任选在步骤(a)或(b)中包括稳定成分。这样的稳定成分优选选自表面活性剂和聚合物(例如聚乙烯醇)或者至少两种表面活性剂和/或聚合物的组合。如果在该方法中包括这样的稳定剂，则该方法优选在去除溶剂(1)之后包括冲洗步骤以去除稳定剂。
对于壳体材料而言，可生物降解聚合物及其组合是高度优选的。如果使用一种以上聚合物的组合，则聚合物之一优选具有至少一种疏水性基团如脂族嵌段或者一个或多个侧基，或者更优选具有氟化基团。不希望受到任何理论的束缚，据信在制备方法中，这些基团会朝着囊的芯侧定向，提供疏水内部。这会把水排斥在囊之外。聚合物的其它部分为囊提供足够的机械稳定性以允许进行包括再分散在内的合成操作并给出足够的体内稳定性。可生物降解聚合物如聚乳酸很适合于此，其它可生物降解聚合物包括聚乙醇酸、聚己内酯和它们的共聚物。
在优选实施方案中，聚合物成分是用至少一种疏水性基团改性的聚合物，所述疏水性基团优选选自氟化物、包含6至24个碳原子的烷基链或它们的组合。
最优选的聚合物选自具有全氟化部分的聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(polylactic-polyglycolacid copolymer)、聚己内酯或它们的组合。
低分子量聚合物通常在壳体中较少缠结，所以当施加超声时会较易导致壳体破裂。在机械稳定性足够的条件下，小于10000的分子量是优选的。最优选分子量为2000至10000。
任选地，包含疏水性基团的聚合物可以与其它聚合物混合以建立期望的性质，例如聚乙二醇化(pegylated)聚合物，或靶向选择，例如使用生物素化聚合物以允许靶向。用配基修饰囊的后改性是有吸引力的，原因是它确保靶向部分位于囊的外表面。
在优选实施方案中，颗粒具有靶向部分如抗体或抗体片段以使得能够靶向于人或动物体的特定部位。
任选将治疗组合物引入芯中、壳体中或壳体上。最优选将疏水性治疗成分包含在芯中。十六烷或石蜡油可以用于溶解芯中的治疗组合物。可以包含在颗粒芯中的可能药物包括抗癌药如非常疏水的多柔比星(deoxyrubicin)和紫杉醇。我们已惊奇地发现，十六烷是疏水性治疗成分或疏水性造影剂的非常合适的载液。我们已发现，这样的成分容易保持溶解或微细分散在十六烷中，所以这些成分会在剩余油相中进入囊芯内部。所以只有在用超声活化之后，溶解的成分才从颗粒中被释放。所以在优选实施方案中，本发明涉及请求保护的颗粒，其还包含治疗成分和/或造影剂的至少一种载液。最优选的载液是十六烷。在另一方面，本发明涉及根据本 发明的方法，其中在步骤(c)之前，用包含治疗剂和/或造影剂的成分补充所述成分，所述治疗剂和造影剂溶解在优选包含十六烷的至少一种载液中。
在另一方面，本发明的方法优选在步骤(a)或(b)中包括治疗成分的包裹体。
更加优选将治疗成分与油相，优选十六烷或石蜡组合加入。
颗粒的芯可以包含任何气体。优选所述气体是生物相容的气体如空气或氮气。或者可以使用低溶解度的气体，例如全氟化碳。如果较高溶解度的气体是期望的，则包含二氧化碳可能是合适的。
为了确保通过超声力容易地破坏颗粒，颗粒优选具有对1至5微米的平均半径而言平均厚度为1至50nm的壳体。最优选最薄的壳体厚度至多是颗粒平均直径的3％。
在另一方面，本发明涉及包含气芯和壳体的颗粒，其由本发明和如上面更详细描述的方法获得。
在另一方面，本发明涉及超声造影剂，其包含至少一种本发明的颗粒。通常这样的造影剂会包含许多这样的颗粒。高度优选大多数所述颗粒，更加优选80-100％的所述颗粒是由上述方法获得的颗粒。
在优选的方面，本发明涉及包含气芯和聚合物壳体的颗粒组合物，其中所述颗粒具有0.1至5微米的直径和1至80nm的壳体厚度。可以通过以至多3，更优选至多1.6，更优选至多1.2，更加优选至多1.0，更加优选至多0.8的机械指数施加超声来声学活化这样的颗粒。
优选活化在0.2以上，更优选0.2至0.8，更加优选下限在0.2至0.6之间的机械指数下触发。
对于大多数超声成像和超声介导的药物释放应用，期望(造影)剂包含颗粒组合物，所述颗粒组合物包含颗粒，所述颗粒包含气芯和聚合物壳体，其中所述颗粒具有0.1至5微米的直径和是颗粒直径的至多5％，更优选至多4％的平均壳体厚度(优选1至80nm的壳体厚度)，所述颗粒可以通过施加阈值范围以上的超声来声学活化，其中所述阈值范围始于0.2的机械指数使得所述颗粒在1.2的机械指数以下表现出显著的气体释放。
优选超声造影剂包含本发明的聚合物壳颗粒，其中当在至多0.8的机械指数下施加超声时，至少80％，优选80-100％的所述颗粒被声学活化。
在另一方面，本发明涉及治疗组合物，其包含至少一种本发明的颗粒。优选这些颗粒包含至少一种药物成分。最优选所述治疗成分包含如上所述的颗粒，其中当在至多3，更优选至多1.6，更优选至多1.2，更加优选至多1.0，更加优选至多0.8的机械指数下施加超声时，至少80％，优选80-100％的所述颗粒被声学活化。
通常这意味着在施加超声时至少80％的颗粒从芯释放气体并任选地释放其它成份。高度期望该释放在短时帧内并在小机械指数范围内发生。
该声学活化可以由实施例中描述的事件计数装置监测。在该装置中，当接收的散射信号(来自活化的微粒)的振幅大于检测系统的噪声水平的两倍时，活化事件被检定并计数。
在示例性实施方案中，本发明涉及包含颗粒的造影剂或治疗组合物，所述颗粒包含气芯和聚合物壳体，其中在0.01至3，更优选0.1至2，更优选0.4至1.6的机械指数范围内，在0.5个单位，优选0.4个单位，更优选0.3个单位的机械指数窗中，至少80％的所述颗粒被超声能量活化。
优选该活化由在实施例所述的条件下事件计数增加到至少50来证明。
该事件计数的增加优选对应于在如上所述的机械指数窗和范围内回波强度增加到初始值的至少1000倍。
可以进行光学观察以查看颗粒的活化和从它们的芯释放气体。可以使用由Bouakaz等人描述的和在本申请实施例中描述的光学装置。当例如在大约0.9的MI下颗粒被活化时气体的显著释放由于气泡的形成而清楚可见。因此可以通过首先在0至1.2的MI下施加超声获得所有颗粒的完全活化的证据。在所述活化之后，然后在例如大约1.6的更高MI下给予进一步的脉冲系列。如果所有颗粒先前已经被活化，则该第二脉冲系列不引起可见的气体形成。
在步骤(e)之后产生的颗粒通常在使用前被再悬浮在合适的液体中。如果该试剂要被用作动物或人的造影剂或治疗剂，则优选颗粒被再悬浮在生理盐水溶液中。
标准超声换能器可以用于提供超声能量。该声能可以是脉冲式的，但是为了药物释放的最大引发，优选以连续波提供超声能量。使用对于患者安全性而言临床可接受的诊断功率水平下的几个声脉冲，可以成像含气体 的颗粒。
现在通过以下非限制性实施例举例说明本发明。
实施例
声学活性
如图1中所示，用于声学测量的装置由三个部分组成：发射部件、接收部件和时间调制部件。所有三个部件均由个人电脑通过 
(TexasInstrument)控制。使用在32个周期的脉冲长度下使用的1.0MHz气穴换能器(Panametrices V392)建立聚焦声场。使用被动声学检测器检查活化微囊的行为。所述被动检测器由中心频率为5MHz的宽频带聚焦换能器(直径为3.8cm且焦距为5.1cm)(Panametrics V307)和宽频带低噪声信号放大器(20dB)组成。3.0MHz的高通滤波器(TTE-HB5-3M-65B)和10.7MHz的低通滤波器(MiniCircuits BLP-10.7)用于从气穴换能器去除直接发射的、衍射引起的1.0MHz声信号。数字示波器(Model LT374L，LeCroy，Chestnut Ridge，NY)用于以20MHz的采样频率将放大的散射信号数字化。
时间调制器(Four Channel Digital Delay/Pulse Generator；StanfordResearch Systems DG535)用于在2.0Hz的PRF(脉冲重复频率)下同步声学检测器与活化超声脉冲。活化换能器水平地安装在矩形试验箱(20.2×20.2×9.6cm3)的侧壁上，而声学检测器垂直地放置并且与气穴换能器成直角共焦地对准。由于发射和接收换能器都是聚焦换能器，因此检测器仅仅对两个换能器的小共焦区域中的微囊非常敏感。使用被动技术，可以通过表征接收的声信号的波形，和通过由信号的波谱分析谐波和噪声发生来研究微囊的活化阈值和活化后振荡(或活化引起的破坏)。对于1.0MHz猝发音的每100次声波作用，通过使用LabView自动计数接收的散射信号测量微囊的活化事件计数(或相对活化率)。
来自LeCroy数字示波器的数字化散射信号被传递到PC供进一步处理。使用路径频带为2.5至6.5MHz的10阶数字Butterworth带通滤波器进一步增加实验系统的检测灵敏度(信噪比)。所以，第一谐波(在1.0MHz的发射频率下)和第二谐波在散射信号中被完全去除。长度为50微秒(即1000个数据平特(pints))的每个滤过信号(含有3阶、4阶、5阶和6阶谐波)被求 和并平均以用于进一步增强检测灵敏度(信噪比)。当接收的散射信号(来自活化的微粒)的振幅高于检测系统的噪声水平(即0.0015mV或1.5微伏)的两倍时，活化事件被检定并计数。
用一定量的去离子水将各样品瓶复原并稀释，这取决于瓶内部颗粒的总数。然后使用精密移液管(Eppendorf200)将预先确定的少量再悬浮微囊样品注射到矩形试验箱中。4升去离子水用作矩形试验箱中的运载和传播介质并且在室温下用磁力搅拌器保持循环。
以此方式，试验箱中颗粒的数目得到测定。
体内成像
将试剂在4ml磷酸盐缓冲盐水中复原并注射到大鼠尾静脉中。在30秒的时间给予0.2ml。在谐波模式下在0.15的机械指数下使用带宽为7MHz的15MHz换能器成像试剂。观察到左心室的清楚造影增强并检测到心肌的灌注。试剂循环至少5分钟。
实施例1
聚合物合成
根据受让人为纽约州立大学的文献US-A-6329470中给出的操作，使用1H，1H-全氟辛烷-1-醇作为引发剂，合成在末端具有全氟化部分的聚乳酸(pla)。我们将使用缩写pla-pfo表示该聚合物。使用已知的聚苯乙烯尺寸标准作为比较通过凝胶渗透色谱法获得大约6000的分子量。
pla-pfo囊
将pla-pfo溶解在二氯甲烷中以获得5％(w/w)的溶液(溶液A)。将环癸烷与二氯甲烷混合以获得10％(w/w)的混合物(溶液B)。将0.25g溶液A与1g溶液B混合(步骤a)。将该混合物加入10g 0.3％的pva溶液中并且通过将混合物挤压通过玻璃滤器进行乳化。将其重复10次(步骤b)，之后将乳状液搅拌一小时以蒸发二氯甲烷并完成囊形成(步骤c)。将乳状液冲洗4次以去除过量的pva。使用离心以分离囊和液体。在所有冲洗步骤中，囊均形成泡沫层，表明囊的密度低于水。加入3％的聚乙二醇并且在1mbar的压力下(步骤d)和随后在0.03mbar的压力下(步骤e)冻干样品以去除环癸烷并 且在使用前再分散。
基于初始浓度，估计壳体厚度为半径的5％，对于直径为2μm的囊，所述壳体厚度为50nm。
声学测量
将含有约20000个囊(使用库尔特粒度仪，在1至30微米之间定量测量而确定)的试剂的样品在4升水中稀释。声学事件的数目用上面所述的图1中的装置计数，并且在图2中作为机械指数的函数被绘制。在声学事件发生之前观察到清楚的阈值。该阈值对应于约0.7的机械指数，并且在1.1的机械指数之前事件的数目已上升到50。参见图3，也观察到声强度的陡增。
使用Bouakaz等人所述的装置(UMB2005)进行光学观察。将薄壁样品再分散并且注射到200微米的纤维中。将该纤维定位在于2.25MHz下工作的单元件换能器的焦点。对于从0至1.4的一系列机械指数，在每个设置使用10次循环进行高速照相机观察。约10个颗粒在视场中。在0.9的MI下所有颗粒均表现出显著的气体释放，在随后的超声猝发中，在1.2的MI下未检测到活性，表明所有颗粒均已完全失去了包封的气体。
实施例2
具有pla-pfo和pla-peo的囊
将pla-pfo溶解在二氯甲烷中以获得5％(w/w)的溶液(溶液A)。将pla-peo溶解在二氯甲烷中以获得5％的溶液(溶液B)。将环癸烷与二氯甲烷混合以获得10％(w/w)的混合物(溶液B)。将0.25g溶液A和0.25g溶液B与1g溶液B混合(步骤a)。将该混合物加入10g 0.3％的pva溶液中并且通过将混合物挤压通过玻璃滤器进行乳化。将其重复10次(步骤b)，之后将乳状液搅拌一小时以蒸发二氯甲烷并完成囊形成(步骤c)。将乳状液冲洗4次以去除过量的pva。使用离心以分离囊和液体。在所有冲洗步骤中，囊均形成泡沫层，表明囊的密度低于水。加入3％的聚乙二醇并且在1mbar的压力下(步骤d)和随后在0.03mbar的压力下(步骤e)冻干样品以去除环癸烷并且在使用前再分散。
将含有约20000个囊(使用库尔特粒度仪，在1至30微米之间定量测量而确定)的试剂的样品在4升水中稀释。声学事件的数目用所描述的装置 计数，并且在图4中作为机械指数的函数被绘制。在声学事件发生之前观察到清楚的阈值。该阈值对应于约0.7的机械指数，并且在1.2的机械指数之前事件的数目已上升到45。
实施例3
靶向造影剂
从聚交酯的混合物制备生物素化的试剂，所述混合物是：具有氟化端基的聚交酯(pla-pfo)、聚乙二醇化的聚交酯(pla-peo)和生物素化的、聚乙二醇化的聚交酯(pla-peo-生物素)，其中生物素共价键合于聚乙二醇化的基团，所有聚交酯的平均分子量均在7000以下。以pla-pfo∶pla-peo∶pla-peo-生物素为5∶4∶1的比率使用聚合物。将0.25g在二氯甲烷中5％的聚合物溶液与1g在二氯甲烷中的10％环癸烷混合。将该混合物加入10g 0.3％的pva溶液中并且通过将混合物挤压通过1μm玻璃滤器进行乳化。将其重复10次，之后将乳状液搅拌一小时以蒸发二氯甲烷并制得环癸烷填充的囊。将乳状液冲洗4次以去除过量的pva。使用离心分离囊和液体。在所有冲洗步骤中，囊均形成泡沫层，表明囊的密度低于水。加入3％的聚乙二醇并且冻干样品以去除环癸烷并且在使用前再分散。
在流动池中发现囊附着到经抗生蛋白链菌素预处理的聚苯乙烯表面。使用Panametrix V302换能器输送超声脉冲，10个周期猝发，脉冲重复频率为10kHz(占空因数为1％)。在典型视场中积累200-400个充气囊。在暴露于超声之后在400mV的峰峰设置下未看到剩余的囊，表明所有附着的囊均有声学活性。
实施例4
部分油填充的囊
从0.25g在二氯甲烷中的5％pla-pfo溶液、0.5g在二氯甲烷中的10％环癸烷和0.5g在二氯甲烷中的10％十六烷制备囊。将乳状液冲洗4次以去除过量的pva。使用离心以分离囊和液体。在所有冲洗步骤中，囊均形成泡沫层，表明囊的密度低于水。加入3％的聚乙二醇并且冻干样品以去除环癸烷并且在使用前再分散。
事件计数测量显示阈值比不用十六烷制备的囊稍高，但是活化率与不用十六烷制备的囊不能区分。
实施例5-载药造影剂
将pla-pfo溶解在二氯甲烷中以获得5％(w/w)的溶液(溶液A)。
将紫杉醇溶解在二氯甲烷中以获得10mg/ml。混合0.5g聚合物溶液、1g紫杉醇溶液、100mg十六烷和100mg环癸烷和0.5g二氯甲烷。将该混合物加入10g 0.3％的pva溶液中并且通过将混合物挤压通过玻璃滤器进行乳化。将其重复10次，之后将乳状液搅拌一小时以蒸发二氯甲烷并完成囊形成。将乳状液冲洗4次以去除过量的pva。使用离心以分离囊和液体。在所有冲洗步骤中，囊均形成泡沫层，表明囊的密度低于水。加入3％的聚乙二醇并且冻干样品以去除环癸烷并且在使用前再分散。
将试剂再分散在磷酸盐缓冲盐水(0.5ml)中，提供10mg紫杉醇/ml的试剂。对在左和右后腿区域中对称地带有两个小MC38(鼠克隆腺癌)肿瘤的每只小鼠进行两次25μl试剂的注射。
使用单元件聚焦换能器输送治疗超声(1MHz，脉冲长度300μs和PRF50Hz)。利用其尖端指向肿瘤的定制胶锥作为换能器和肿瘤之间的声学偶联材料。
利用连接到超声扫描仪(Philips HDI5000)的高频探头CL15-7上的低MI谐波模式(opt：具有组织特异性预置的HGen：脉管手术/肿瘤)监测注射和1MHz超声辐照。对于成像，为了最小化气泡破坏，使用0.15的低MI。成像深度为1.9cm并且焦距为～1.5cm。
在第一次注射之后，可以在低MI谐波成像模式中观察到试剂到达肿瘤脉管系统中，然后输送10秒治疗超声，结果不再能检测到破坏的试剂。在约10秒之后再次观察到新试剂流入肿瘤内部，然后破坏脉冲持续大概10秒。这样间歇地施加治疗超声辐照5分钟。在第二次注射发生之后重复以上操作。
如图5中所示，经超声治疗的肿瘤的肿瘤生长明显比未治疗的肿瘤延迟，在图5中显示了施加和不施加治疗超声的肿瘤大小变化。
Claims (12)
1.包含气芯和壳体的颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含壳体成分、溶剂(1)和非溶剂(2)的混合物；
b)将步骤(a)的混合物与含水成分混合，由此在水相中形成步骤(a)的混合物的乳状液；
c)施加挥发溶剂(1)的条件；
d)施加去除水的条件；
e)施加去除非溶剂(2)的条件；
其中所述壳体成分是用氟化物改性的可生物降解聚合物；所述溶剂(1)是所述壳体成分的良好溶剂，其在步骤(c)的条件下蒸气压比水高，
其特征在于非溶剂(2)基本上由环癸烷组成。
2.权利要求1的方法，其中所述聚合物是疏水性聚合物。
3.权利要求1的方法，其中所述聚合物选自聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚已内酯、ε-己内酯、具有全氟化部分的聚乳酸或它们的组合。
4.权利要求1的方法，其中在步骤(a)或(b)中包括稳定成分，所述稳定成分选自表面活性剂和聚合物，或者是至少两种表面活性剂和/或聚合物的组合。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤(c)之前，用包含治疗剂和/或造影剂的成分补充所述乳状液，所述治疗剂和造影剂溶解在至少一种载液中。
6.权利要求5的方法，其中所述载液包含十六烷。
7.权利要求1的方法，其中所述颗粒具有对1至5微米的平均半径而言平均厚度为1至50nm的壳体。
8.包含气芯和壳体的颗粒，其由权利要求1-7中任一项的方法获得，其中所述颗粒具有0.1至5微米的直径和1至80nm的壳体厚度，并且在0.01至3的机械指数范围内，在0.5个单位的机械指数窗中，80-100%的所述颗粒被超声能量活化，其中所述颗粒用作造影剂或用作治疗组合物的一部分。
9.超声诊断成像造影剂，其包含至少一种权利要求8的颗粒。
10.权利要求9的超声造影剂，其包含许多颗粒，其中80-100%的所述颗粒是由权利要求1的方法获得的颗粒。
11.治疗组合物，其包含至少一种权利要求8的颗粒，所述颗粒还包含至少一种药物成分。
12.权利要求11的治疗组合物，其包含许多颗粒，其中80-100%的所述颗粒是由权利要求1的方法获得的颗粒。
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