CN101372704B - 使用量子点改进聚合酶链式反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用量子点改进聚合酶链式反应反应的方法，其步骤是：A、量子点的准备：量子点为水溶性；B、PCR体系的优化：将量子点加入PCR反应体系中进行PCR扩增；C、PCR产物的检测：对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，与对照体系进行比较；D、量子点从反应体系中的分离并回收扩增得到的PCR产物：对反应结束体系进行离心，量子点被离心到底部，取上清得到所需PCR产物。本发明方法简便，操作方便，有效地提高了聚合酶链式反应的专一性和产率，消除了非特异性的扩增和假阳性扩增，增加了聚合酶链式反应的专一性，广泛应用于分子诊断、分子标记、法医鉴定、基因克隆等分子生物学的各个领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使用量子点改进聚合酶链式反应的专一性和产率的方法，适用于各种聚合酶链式反应的反应体系。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种快速简便的体外合成核酸的方法，在医学和生物学中得到了广泛的应用。应用聚合酶链式反应的过程中，特异性和产率是人们最关心的两个因素。聚合酶链式反应在实际应用中干扰的副作用很多，这些干扰影响了聚合酶链式反应的特异性和产率，降低了工作效率。例如，引物设计问题、引物二聚体的存在、模板DNA的GC含量、退火温度、聚合酶链式反应缓冲液的成分等。更糟糕的是一些副作用可能导致扩增的失败。提高聚合酶链式反应反应的专一性可以通过一些方式来实现。例如，优化引物设计、优化反应程序和体系。其中优化聚合酶链式反应反应体系的方法可以通过加入formamide，glycerin，DMSO，BSA等到反应体系中，这在一定程度上改善了聚合酶链式反应的非特异性。但上述的添加剂的改进效果都有各自的局限，此外一些添加剂，比如DMSO可能会抑制DNA聚合酶的活性。
经过检索现有文献，发现优化效果比较显著的有：美国专利US PATENT 5,646,019公开的“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系中加入了耐热的单链结合蛋白(SSB，single-stranded nucleic acid bindingprotein)，SSB蛋白只结合单链DNA，不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR体系的优化。但SSB蛋白合成复杂，价格较贵，不适合商业化。中国专利ZL 200410099186.7公开了向PCR体系中添加单质金材料来实现对PCR扩增的优化。单质金价格也不菲。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种使用量子点改进聚合酶链式反应的方法，方法简便，操作方便，非常有效地提高了聚合酶链式反应的专一性和产率，而且很容易的从聚合酶链式反应反应体系中去除添加剂。
为了实现上述目的，本发明通过向PCR体系中添加量子点来实现对PCR扩增的优化，本发明的方法具体如下：
1、量子点的准备
量子点从市场上购买有4种类型：1，表面带正电荷的水溶性量子点(产品型号：W-1001-1)，2，表面带负电荷的水溶性量子点(产品型号：W-2001-1)，3，带有羧基功能团的水溶性量子点(产品型号：W-3001-1)，这三种均购置于武汉珈源量子点开发技术有限公司，另外还使用了Invitrogen公司的链霉亲和素偶联的量子点(产品型号：Q10141MP)量子点为水溶性，粒径大小为6-50nm，对粒径大小没有限制，但粒径大小会略微影响到最适优化浓度。
2、聚合酶链式反应(PCR)体系的优化
将适量的量子点(20-50nM)加入PCR反应体系当中进行PCR扩增。
按照已有常用PCR扩增技术程序，设定如下：
首先模板94℃变性4分钟；
接着25-35个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，25-65℃退火30秒到1分钟，72℃延伸30秒到15分钟，其中循环次数、退火温度25-65℃、退火时间30秒到1分钟、延伸时间30秒到15分钟，可以根据待扩增对象的长度和引物(P1、P2、P3、P4)而不同。(注释：循环次数是根据需要获得的产物量来决定，需要的产物多，则增加循环次数，但循环次数不易超过35个循环；退火温度是根据反应引物的Tm值来决定，Tm值减5℃为常规退火温度(45-65℃)，但这里的体系可以通过大幅降低退火温度(25-65℃)仍能得到所需目标产物来增加PCR的产率；根据扩增对象的长度来决定延伸时间，扩增片段每增加1000bp，需要增加1分钟延伸时间。)
最后72℃延伸10分钟。
1.PCR产物的检测：
对扩增后的DNA样品使用质量比为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，检查待扩增条带，与对照体系进行比较。可看到在PCR体系中加入量子点可以消除非特异性的扩增和假阳性扩增，增加聚合酶链式反应的专一性。
2.优化材料(量子点)从反应体系中的分离：
如果需要回收扩增得到的PCR产物，则可以对反应结束体系进行短暂离心，量子点被离心到底部，取上清可以得到所需PCR产物。
所述PCR体系参见各种商业聚合酶说明书，以华美公司Taq酶为例，PCR体系的组成为：
| Taq酶 | 1U |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5uL |
| dNTP底物(2mM) | 2.5uL |
| Mg2+(25mM) | 1.5uL |
| 引物1(0.4uM) | 1uL |
| 引物2(0.4uM) | 1uL |
| 模板DNA | 10ng |
| ddH2O | 补足总体积为25uL |
所述的量子点为半导体纳米微颗粒。
所述的的聚合酶链式反应(PCR)体系包括脱氧核糖核苷酸、耐热DNA聚合酶、模板DNA和缓冲液，聚合酶链式反应反应液的总体积是25uL。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
使用这里介绍的技术进行聚合酶链式反应实验，相比与传统方法，不但聚合酶链式反应的产率更高，而且产物的专一性更强。这种方法可以使用在任何形式的聚合酶链式反应反应。优化体系所引入的量子点可以很容易的从聚合酶链式反应体系中去除。除了引入的量子点外，不需要新增加任何试剂和仪器，消除了非特异性的扩增和假阳性扩增，增加了聚合酶链式反应的专一性，可以广泛应用于分子诊断、分子标记、法医鉴定、基因克隆等分子生物学的各个领域。
附图说明
图1为不同浓度的量子点对扩增5S rDNA片段的聚合酶链式反应的影响效果图；
图2是对图1的120bp的条带进行定量比较分析的结果效果图；
图3为不同浓度的量子点对扩增单拷贝玉米脂肪醛脱氢酶基因I片段的聚合酶链式反应的影响效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1量子点提高扩增重复序列的聚合酶链式反应的专一性和效率本实施例从玉米基因组DNA中通过聚合酶链式反应反应扩增出5S rDNA重复序列。
为了证明在聚合酶链式反应体系加入量子点能增加聚合酶链式反应的专一性和提高聚合酶链式反应的产率，申请人进行了如下实验。在这个实验中，聚合酶链式反应体系包括模板：2ng/ul玉米基因组DNA(按照J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)方法从玉米叶片中提取)，两对引物(由上海生工合成)：P1和P2，序列分别为：P1：5’-GTGCGATCATACCAGCRYTAATGAACCGG-3’，P2：5’-GAGGTGCAACACGAGGACTTCCCAGGAGG-3’，浓度分别为0.4uM；4种脱氧核糖核酸(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)的浓度分别为2mM。Taq聚合酶购自华美公司。共配置8管PCR体系，且从1到8编号。所加水溶性量子点(购自武汉珈源量子点技术开发有限公司，产品型号为：W-3001-1)的浓度分别为1：0nM；2：1nM；3：5nM；4：10nM；5：15nM；6：20nM；7：30nM；8：40nM。聚合酶链式反应反应在MJ Research PTC-100型聚合酶链式反应仪上进行。聚合酶链式反应的程序为：94℃预变性4min；94℃30s，50℃30s，72℃1min扩增35个循环，最后72℃延伸10min。聚合酶链式反应扩增的DNA产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察，照相。
具体扩增结果如图1所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图1中的分子量标准为DL2000(购自Takara公司)。1-8道依次加入1-8管PCR反应产物。此反应体系目标片段为120bp。第一道中可以看到除了有120bp的产物外还有480bp的副产物，而且产物以480bp为主，还有很多杂带。加入量子点后，可以看到随着量子点的加入，杂带减少，480bp的带也逐渐减弱，量子点浓度达到30nM时，只剩120bp的条带。说明加入量子点可以提高聚合酶链式反应的专一性。但是量子点浓度为40nM时，所有条带都消失，聚合酶链式反应反应被抑制。
而且使用Quantity One 1-D软件(Bio-Rad，USA)，对图1中各泳道中120bp片段产物进行定量分析，结果如图2所示。横坐标代表图一中的泳道，纵坐标代表各个泳道120bp条带的量。结果可以看到：随着量子点的加入，120bp条带逐渐增加，量子点浓度加大到30nM时，产物量达到最大。说明加入的量子点可以增加聚合酶链式反应反应的产率。但量子点浓度达到40nM的时候，聚合酶链式反应反应被抑制。
最后可以选择离心去除聚合酶链式反应体系中的量子点。
实施例2量子点提高扩增单拷贝序列的聚合酶链式反应的专一性和效率
本实施例从玉米基因组DNA中通过聚合酶链式反应反应扩增出单拷贝玉米脂肪醛脱氢酶基因I片段序列。除使用不同引物和加入量子点的浓度不同以外，其他步骤同具体实施例1，两对引物：P3和P4，序列分别为：P3：5’-GGCCTTCAGAGACGAGGTTG-3’，P4：5’-GCTGTGCATCAGGAATAATTTG-3’，浓度分别为0.4uM，共配置8管PCR体系，且从1到3编号。所加量子点购买于Invitrogen公司(产品型号：Q10141MP)，浓度分别为1：0nM；2：20nM；3：30nM，
具体扩增结果如图3所示：M为DL2000 Marker，第1至3道分别加入1-3管PCR产物。第一道中可以看到除了有480bp的产物外还有一些杂带。加入量子点后，可以看到随着量子点的加入，杂带减少，量子点浓度达到30nM时，杂带消失，只剩下主带。说明加入量子点可以提高单拷贝聚合酶链式反应的专一性。
其他步骤与实施例1相同。
Claims (2)
1.一种使用量子点改进聚合酶链式反应的方法，其步骤是：
A、量子点的准备：量子点为水溶性，粒径大小为6-50nm，所述量子点为半导体纳米微颗粒；
所述量子点为武汉珈源量子点技术开发有限公司的产品型号为W-3001-1的水溶性量子点或Invitrogen公司的产品型号为Q10141MP的水溶性量子点；
B、聚合酶链式反应体系的优化：将20-30nM的量子点加入PCR反应体系当中进行PCR扩增；
设定如下：
首先模板94℃变性4分钟；接着25-35个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，25-65℃退火30秒到1分钟，72℃延伸30秒到15分钟，循环次数、退火温度25-65℃、退火时间30秒到1分钟、延伸时间30秒到15分钟，根据待扩增对象的长度和引物P1、P2、P3、P4不同；最后72℃延伸10分钟；
C、PCR产物的检测：对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查扩增条带，与对照体系进行比较；
D、量子点从反应体系中分离并回收扩增得到的PCR产物：对反应结束体系进行离心，量子点被离心到底部，取上清得到所需PCR产物；
所述的模板为：玉米基因组DNA；
所述的引物为P1：5’-GTGCGATCATACCAGCRYTAATGAACCGG-3’；
所述的引物为P2：5’-GAGGTGCAACACGAGGACTTCCCAGGAGG-3’；
所述的引物为P3：5’-GGCCTTCAGAGACGAGGTTG-3’；
所述的引物为P4：5’-GCTGTGCATCAGGAATAATTTG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种使用量子点改进聚合酶链式反应反应的方法，其特征在于：所述的聚合酶链式反应体系包括脱氧核糖核苷酸、耐热DNA聚合酶、引物、模板DNA和缓冲液，聚合酶链式反应反应液的体系是25uL。
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| 徐海娥等.水溶性量子点的制备及应用.《化学进展》.2005,第17卷(第5期),800-808. * |
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