CN101361000B

CN101361000B - 用于药用产品溶出试验的方法

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Publication number: CN101361000B
Application number: CN2006800505809A
Authority: CN
Inventors: L·S·瑟伦森; A·P·施瓦茨; J·森诺高-安德森
Original assignee: ALK Abello AS
Current assignee: ALK Abello AS
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2026-12-22
Also published as: EP1966611B1; DK1966611T3; CA2634507A1; EP1966611A1; HK1120109A1; US7968351B2; CN101361000A; WO2007071257A1; WO2007071257A8; US20080305505A1

Abstract

本发明涉及溶出测量的领域，更具体地，涉及可再现的用于药用产品例如过敏原疫苗的溶出试验的方法。

Description

用于药用产品溶出试验的方法

技术领域

发明背景

固体药用产品例如片剂或胶囊通常由活性成分和赋形剂(即，药理学非活性成分)组成。口服给药之后可预测的和可再现的从固体剂型的药物吸收取决于几种因素，例如药物从药物产品的释放和药物在生理条件下的溶出或溶解。在药物例如口内崩散型的过敏原疫苗的情况中，重要的是剂型在接触口腔的唾液时瞬时分散，以便保证有尽可能多的活性成分被提供给口腔的粘膜。

由于药物从药物产物的释放和药物的溶出或溶解的关键性质，溶出试验经常涉及预测药物的体内行为。因为体内生物研究倾向于是昂贵的和费时的，并且伦理方面的考虑可能限制对人类进行这些研究的合意性，所以将体外药物溶出试验作为廉价的和低风险的替代方案是理想的。

药物批准机关例如EMEA和FDA经常需要药物公司测定任何新药用产品的药物释放特征，以便得到批准，并且还可能需要这种试验，以作为目前有效的(on-going)质量参数。

已经开发了各种方案用于进行这种体外溶出试验，并且例行地用于产品开发和质量保证。经常地，药物溶出试验使用推荐的药典方法和装置进行，例如美国药典和欧洲药典例如USP 28<711>和EP 5.0，2.9.3。溶出特征经常被批准机关例如FDA和EMEA使用，用于许可产品、放弃生物等效性要求和支持对与推荐的不同的其它生物生物等效性要求的要求。典型地用于这种试验的溶出介质为例如磷酸盐缓冲液、水和柠檬酸盐缓冲液。基于不同的搅拌方法，有四种不同类型的溶出装置通常可以商购并且得到药典承认。这些装置被称为：桨、转篮、流通池、和往复圆筒。在四种类型的装置中，桨装置是最经常使用的。已知几种标准的桨型药物溶出试验装置，例如由Varian Inc.、DistekInc.及其他生产的那些。尽管确切的方案和装置可以不同，但是所有的药物溶出试验方法都包括将药用产品置于含水的溶出介质(例如水和/或缓冲液)中，和对溶出介质施加某种形式的搅拌以促进试验产品的崩解和溶出。

Blanco-Príeto等人，Int.J.Pharm.184(2)，1999，243-250公开了用于研究生长抑素类似物从聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)微球体的释放动力学的试验介质。该试验介质是不同的pH和摩尔浓度的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且有或者没有1、5和10％的牛血清白蛋白(BSA)或1、4和10％的人血清白蛋白(HSA)。随后通过HPLC测定生长抑素类似物的浓度。

可通过口腔和口腔粘膜接近免疫系统，例如过敏原的舌下给药是已知的给药途径。对于大多数药物来说，非常重要的是将正确剂量的过敏原给予患者。溶出试验条件应该基于药物的物理化学特性和口服给药之后剂型可能接触的环境条件。开发了许多已知的溶出介质用于意在被吞咽并且通过胃肠道吸收的口服制剂，并且不适合于意在在口中例如舌下分散并且在口腔中起作用的药用产品。

此外，蛋白质在溶液中经常不稳定，特别是在它们为低浓度时，并且可由于吸附于表面例如玻璃表面而变性。

过敏原片剂中的活性成分是蛋白质的混合物，其中有一些在溶液中具有低的稳定性，因此化学以及物理、和稳定性方面的考虑对于适当选择溶出介质是极为重要的。由于在溶液中的物理不稳定性或变性，通常使用的溶出介质不适合于包含低浓度蛋白质例如过敏原的固体剂型的溶出。

因此，对药学相关的并且克服吸附于表面的问题的、实现包含蛋白质的产品的可再现溶出的溶出介质仍是非常期待的。

发明内容

本发明提供测定从药物固体剂型释放的活性成分的量的方法，其中所述活性成分为一种或多种蛋白质，所述方法包括以下步骤：

(a)允许所述固体剂型在溶出介质中释放活性成分，所述溶出介质包括0.05到2.0％酪蛋白和0.005到1.0M磷酸盐缓冲盐水，并且具有6到8.5的pH；和

(b)测定溶液中活性成分的量。

发明详述

溶出试验

已经发现通过使用本发明的方法测定从包含药用蛋白质的产品的固体剂型(特别是包含低剂量蛋白质例如过敏原和高度有效的蛋白质的固体剂型)释放的活性成分的量，有可能得到可再现的和生理学相关的药用产品的溶出试验，而没有上述的例如变性和吸附的问题。

根据本发明，提供了测定从药物固体剂型释放的活性成分的量的方法，其中所述活性成分为一种或多种蛋白质，所述方法包括以下步骤：

(b)测定溶液中活性成分的量。

在本发明的一个方面中，溶出介质具有6到8.5的pH。在本发明的另一个方面中，溶出介质具有6到8的pH。在本发明的另一个方面中，溶出介质具有6.2到7.6的pH。在本发明的另一个方面中，溶出介质具有6.4到7.4的pH。在本发明的另一个方面中，溶出介质具有6.6到7.3的pH。在本发明的另一个方面中，溶出介质具有6.7到7.2的pH。在本发明的另一个方面中，溶出介质具有6.7到6.9的pH。

在本发明的一个方面中，溶出介质包括0.1到1.0％的酪蛋白。在本发明的一个另外的方面中，溶出介质包括0.3到0.7％的酪蛋白。在本发明的另一个方面中，溶出介质包括约0.5％的酪蛋白。

在本文中提供液体培养基中物质(诸如例如酪蛋白)的百分比时，所述百分比以w/v％提供。w/v％是基于100ml液体中的克数计算。

磷酸盐缓冲盐水(在下文中也缩写为PBS)是通常使用的磷酸盐缓冲的盐溶液。该缓冲液有助于保持恒定的pH。在本发明的一个方面中，磷酸盐缓冲盐水具有低于1.0M的摩尔浓度。在本发明的另一个方面中，磷酸盐缓冲盐水具有低于0.5M的摩尔浓度。在本发明的又一个方面中，磷酸盐缓冲盐水具有低于0.1M的摩尔浓度。在本发明的另一个方面中，磷酸盐缓冲盐水具有大于0.005M的摩尔浓度。在本发明的另一个方面中，磷酸盐缓冲盐水为0.005到1.0M的磷酸盐缓冲盐水。在本发明的又一个方面中，磷酸盐缓冲盐水为0.005到0.5M的磷酸盐缓冲盐水。在本发明的另一个方面中，磷酸盐缓冲盐水为0.005到0.1M的磷酸盐缓冲盐水。在本发明的另一个方面中，磷酸盐缓冲盐水为0.005-0.05M的磷酸盐缓冲盐水。在本发明的另一个方面中，磷酸盐缓冲盐水为约0.01M的磷酸盐缓冲盐水。在本发明的另一个方面中，PBS包括氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠。

在本文中提及PBS的摩尔浓度时，是指所述PBS中的磷酸根离子的摩尔浓度。

溶出介质任选地另外包括非离子型洗涤剂，例如选自Tween-20、Tween-80、Span 20或Span 80的非离子型洗涤剂。

在本发明的一个方面中，溶出介质为0.01M的磷酸盐缓冲盐水和酪蛋白钠盐0.5％(w/v)和去离子水，磷酸盐缓冲盐水包括0.08％(w/v)氯化钠、0.02％(w/v)氯化钾、0.02％(w/v)磷酸二氢钾和0.144％(w/v)磷酸氢二钠。

本文中使用的术语“酪蛋白”是指酪蛋白或其盐，诸如例如酪蛋白钠盐。

溶出介质可以如下制备：将磷酸盐缓冲盐水(例如10x浓度)、酪蛋白钠盐和去离子水混合，并且用盐酸例如0.2M盐酸调节pH。

在本发明的一个方面中，溶出缓冲液包括约0.5％(w/v)的酪蛋白、约0.01M PBS并且具有约6.8的pH。

固体剂型例如快速分散固体剂型的体外溶出试验可以用于评价药物产品的批次间质量，指导新制剂的开发，确保改变(例如配方、生产方法、生产位置、和生产方法规模扩大方面的改变)之后继续保持产品质量和性能，和检验产品的储存期限。在本发明的一个方面中，溶出试验用于评价固体剂型的批次间质量。在本发明的另一个方面中，溶出试验用于检验固体剂型的储存期限。

溶出的持续时间

在一段时间内允许固体剂型释放活性成分，从而在取出样本之前形成固体剂型的至少部分溶液。取决于具体的固体剂型和例如选择的装置和搅拌，取出用于测定活性成分的样本之前的时间取决于检验的特定产品，并且可以由本领域技术人员决定。在本发明的一个方面中，允许固体剂型释放活性成分至少足以得到均质溶液的一段时间，使得有可能得到可重现的检验样本结果。在某一时间段之后，至少一些活性成分已经释放，并且可以将样品过滤，然后测定在给定时间段释放的活性成分的量。在本发明的一个方面中，在将固体剂型置于溶出装置中的15分钟内进行取样。在本发明另外的方面中，在将固体剂型置于溶出装置中的10分钟内进行取样。在本发明另外的方面中，在将固体剂型置于溶出装置中的5分钟内进行取样。在本发明另外的方面中，在将固体剂型置于溶出装置中的3分钟内或1分钟内进行取样。

溶出技术要求

取决于待检验的药物产品，可以如例如美国药典(USP)28<711>和欧洲药典(EP)5.0，2.9.3所述使用单点技术要求、双点技术要求或溶出特征。典型地，单点技术要求用于高度可溶性和迅速溶解的药物产品的常规的质量检验。双点技术要求典型地用于表征质量和作为控制释放剂型的常规质量管理试验。

装置

可以使用适合于药物产品溶出的任何装置。目前，最通常使用的溶出试验方法是(1)转篮方法和(2)桨方法。这两种装置体外溶出方法描述在USP 28<711>和EP 5.0，2.9.3中。在US和欧洲药典中还描述的其它溶出方法为往复圆筒方法和流通池系统方法。在许多情况中，期望得到体外释放数据的适当的体内相关性并且对任何这些当前的方法或其它备选方案/修饰的最终选择取决于待检验的具体的药物产品。上述的溶出方法和装置可以通常以手工取样或自动操作使用。在本发明的一个方面中，以手动或自动取样方式使用桨装置方法。

搅拌

在将药物产品浸渍在适合的溶出容器中之后，通常在溶出试验过程中应该保持适度的搅拌条件，以避免变性或起泡沫，并且同时得到在容器中的均匀分布。使用转篮方法，搅拌(或搅拌的速度)通常为50-100rpm，使用桨方法，通常为50-150rpm。在本发明的一个方面中，溶出装置为桨装置。溶出介质的体积通常为500、900、或1000mL。然而，可以选择任何合适的体积。

测定活性成分的量

用于测定活性成分的量的任何合适的方法都可以使用，所述方法相对于待测量的活性成分和溶出介质是适合的。

在本发明的一个方面中，固体剂型的过敏原含量可以通过常规的免疫测定法测定，例如，针对提取组分例如主要过敏原的ELISA、FIA、LIA、和RID，所述主要过敏原使用针对使用标准方法得到的提取物产生的标准化的抗体混合物(例如在小鼠或兔中产生的抗体)或过敏性患者血清的集合。

在本发明的一个方面中，测定法为ELISA检验法。

固体剂型

术语“固体剂型”在本文的情况中是指单元剂型，在将其在口腔中给药时，其不是液体或粉末，因此，“固体剂型”是指例如包含单位剂量活性成分的片剂。固体剂型可为片剂、胶囊、锭剂或囊片的形式。在本发明的一个方面中，固体剂型为片剂。

术语“快速分散剂型”在本文的情况中是指在小于约90秒、优选在小于约60秒、优选在小于约30秒、更优选在小于约20秒、更优选在小于约10秒在口腔中分散的剂型，更优选在口腔中被接受之后的小于约5秒、并且最优选在小于约2秒分散的剂型。在本发明的一个方面中，固体剂型为快速分散固体剂型。在本发明的另一个方面中，固体剂型为用于口腔粘膜给药的快速分散固体剂型。

术语“口腔粘膜给药”是指其中将剂型置于口腔中任何地方(诸如例如，置于舌下)的给药途径，以允许活性成分接触患者的口腔或咽的粘膜，以便得到活性成分的局部或全身效应。口腔粘膜给药途径的一个实例为舌下给药。

术语“舌下给药”是指其中将剂型置于舌的下面以便得到活性成分的局部或全身效应的给药途径。

本文中使用的术语“药物固体剂型”是指一种固体剂型，其包括能够治疗、减轻或部分地阻止给定病况或疾病及其并发症的临床表现的有效量的活性成分。

用于各种目的的有效量取决于疾病或病况的严重程度以及受试者的体重和一般状态。应该理解，测定合适的剂量可以使用常规实验实现，通过构造有价值的基质并且试验基质中的不同的点，其都在有经验的医生或兽医的技术范围内。

使用本发明的方法，有可能测定从药物固体剂型释放的活性成分的量，即使在活性成分以极低浓度存在于例如包括过敏原的固体剂型中时。在本发明的一个方面中，溶出样本中的活性成分(例如主要的过敏原)的量为1-50ng/ml。

术语“活性成分”在本文的情况中是指一种或多种蛋白质。

术语“蛋白质”在本文的情况中是指具有氨基酸序列的蛋白质，包括任何天然存在的蛋白质、修饰的蛋白质、重组蛋白质、重组的突变蛋白质、或者其任何蛋白质片段或蛋白质混合物。

提供有用的蛋白质的以下列表用于说明性的目的，并且不以任何方式限制可使用本发明的方法测定的医学上有用的蛋白质的范围：过敏原；哺乳动物蛋白质，诸如例如生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；高血糖素；凝血因子，例如VIIIC因子、因子、组织因子、和冯维勒布兰德因子；抗凝血因子，例如C蛋白；心钠素；肺表面活性物质；血纤维蛋白溶解酶原活化剂，例如尿激酶或组织型血纤维蛋白溶解酶原活化剂(t-PA)；bombazine；凝血酶；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(对正常T细胞表达和分泌的活化的调节)；人类巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；苗勒管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；前松弛素；小鼠促性腺激素相关肽；脱氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；激素或者生长因子的受体；整联蛋白；A蛋白或D蛋白；类风湿因子；神经营养因子，例如来源于骨的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)、或神经生长因子例如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因于(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；红细胞生成素(EPO)；促血小板生成素(TPO)；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白细胞介素(ILs)，例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-15；过氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白质；衰变加速因子(DAF)；病毒抗原；诸如例如，AIDS包膜蛋白的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；免疫粘附素；抗体；缩宫素、加压素、促肾上腺皮质激素和类似物、表皮生长因子、催乳激素、促生长素抑制素、GLP-1相关化合物、促胃液素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、脲胃泌素(urogastrin)、胰泌素、脑啡肽(enka phalins)、内啡肽、血管紧张素、促甲状腺素释放激素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、血管紧张肽原酶、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、或短杆菌肽。

在本文的情况中，术语“过敏原”是指已经报告为在它们重复接触个体时诱导过敏(即，IgE介导的)反应的任何蛋白质，例如天然存在的蛋白质、修饰的蛋白质、重组蛋白质、重组的突变蛋白质、或者其任何蛋白质片段或蛋白质混合物。

天然存在的过敏原的实例包括花粉过敏原(树、莠草、草药、和青草花粉过敏原)；螨过敏原(来自例如室内尘螨和仓储螨)；昆虫过敏原(吸入剂、唾液-和毒液来源的过敏原)；来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等的来自例如唾液、毛发和头皮屑的动物过敏原；真菌过敏原和食物过敏原。

来自树、草和莠草的重要的花粉变应原为来源于山毛榉目、松柏科、唇形目、松柏目、和悬铃木科的分类目的这种，包括例如桦树(桦属)、赤扬(桤木属)、榛树(榛属)、角树(鹅耳枥属)、橄榄树(Olea)、雪松(柳杉属和桧属)、悬铃树(悬铃木属)、禾草目，包括例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属、猫尾草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、绒毛草属(Holcus)、虉草属(Phalaris)、黑麦属(Secale)、和高粱属(Sorghum)的草和菊目和荨麻目，包括例如豚草属、艾属、和墙草属的莠草。其它重要的吸入过敏原为来自尘螨属和嗜霉螨属(Euroglyphus)的室内尘螨；仓储螨，例如嗜鳞螨属(Lepidoglyphys)、甘食螨属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus)的那些；来自蟑螂、蠓和跳蚤例如小蠊属、大蠊属、摇蚊属、和Ctenocepphalides的那些；和来自哺乳动物例如猫、狗和马的那些；毒液过敏原，包括来源于螫刺或咬人昆虫的这种，例如来自膜翅目包括蜜蜂(蜜蜂科总科superfamily Apidae)、黄蜂(胡蜂总科superfamily Vespidea)、和蚂蚁(蚂蚁科总科superfamilyFormicoidae)的分类属的那些。来自真菌的重要的吸入过敏原为例如来源于链格孢属(Alternaria)、芽枝霉(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的这种。

食物过敏原的实例为来自以下食物的过敏原：小麦(例如Tria18-19)、甲壳动物食物包括虾(例如Mete1、Pena1、PenI1、Penm 1和Pen m 2)、斑节虾、蟹和龙虾、鱼(例如Gad c 1和Sal s 1)、鸡蛋(例如Gal d 1、Gal d 2)、花生(例如Ara h 1-8)、大豆(Gly m1-4)、牛奶(Bos d 4-8)、坚果例如杏仁(Pru du 4)、巴西果(Ber e 1、Ber e 2)，贾如坚果(Ana o 1-3)，榛子(例如Cor a 1.04、Cor a 2、Cor a 8)和胡桃(例如Jug n 1-2、Jug r 1-3)、芹菜(Api g 1、Api g4、Api g 5)，芥末(Sin a 1和Bra j 1)和芝麻籽(Ses i 1-6)，例如来自小麦(例如Tri a 18-19)、鸡蛋(例如Gal d 1、Gal d 2)、花生(例如Ara h 1-8)、大豆(Gly m 1-4)、牛奶(Bos d 4-8)的过敏原。

重组过敏原的实例包括但不限于来自使用重组技术制备的植物花粉、青草花粉、树木花粉、莠草花粉、昆虫毒液、尘螨和仓储螨蛋白质、动物头皮屑、唾液、真菌孢子和食物过敏原(即，花生、牛奶、谷蛋白和蛋)的蛋白质/肽。重组过敏原可以通过例如使用可以在发酵器上生长的微生物表达系统大规模地得到、通过重组DNA技术生产、或者在化学合成时由化学前体或其它化学制品得到。在本发明的一个方面中，过敏原是rBet v 1、rAln g 1、rCor a 1、rCar b 1、rCry j1、rCry j 2、rOle e 1、rAmb a 1、rArt v 1、rCyn d 1、rDac g 1、rDac g 5、rLol p 1、rLol p 5、rPhl p 1、rPhl p 5、rPoa p 1、rPoa p 5、rSor h 1、rDer f 1、rDer f 2、rDer p 1、rDer p 2、rEur m 1、rEur m 2、rGly d 2、rLep d 2、rTyr p 2、rBla g 1、rBla g 2、rFel d 1、rCan f 1、rCan f 2、rBos d 2、rEqu c 1、rEqu c 2、rMus m 1、rRat n 1、rApis m 1、rApi m 1、rApi m 2、rVes v 1、rves v 2、rVes v 5、rDol a 5、rDol m 1、rDol m 2、rDol m 5、rPol a 1、rPol a 2、rPol a 5、rAlt a 1或rCla h 1。

修饰的过敏原的实例包括与敏感受试者的过敏性疾病状况有关的天然存在形式的过敏原，其中所述修饰的重组过敏原是与天然存在的过敏原相比发生改变的。其包括包含几个氨基酸交换的过敏原变体、过敏原突变物、低聚物、片段、缺失变体(deletion variants)、杂交分子、肉豆蔻基化的(myristylated)、糖基化的、棕榈酰化的和磷酸化的过敏原和其它变体。修饰的过敏原可以通过任何适合的方法生产，例如位置定向诱变方法、PCR方法、化学合成和这些方法的混合。

重组的突变过敏原与野生型的不同之处在于过敏原的基因已经通过基因操作方法进行修饰，使得它们编码的多肽表现出与野生型相比的单个或几个氨基酸的置换、缺失和/或加入。重组的突变过敏原的实例包括过敏原置换变体、加成变体、低聚物、片段、缺失变体、杂交分子和其它变体。

在本发明的一个方面中，本发明的方法用于测量固体剂型的溶出，所述固体剂型为过敏原组合物。在本发明另外的方面中，过敏原固体剂型为用于口服给药的快速分散剂型的形式，所述剂型被设计为在接触唾液时在口中瞬时或迅速地分散，以便保证在吞咽之前过敏原对粘膜的免疫有效的组织的最大接触。

在本发明的一个方面中，固体剂型中的活性成分为选自以下组的一种或多种过敏原：Bet v 1、Aln g 1、Cor a 1和Car b 1、Que a1、Cry j 1、Cry j 2、Cup a 1、Cup s 1、Jun a 1、Jun a 2、Juna 3、Ole e 1、Lig v 1、Syr v 1、Pla 11、Pla a 1、Pla a 2、Amb a 1、Amb a 2、Amb t 5、Art v 1、Art v 2、Art v 3、Par j 1、Par j 2、Par j 3、Sal k 1、Ave e 1、Cyn d 1、Cyn d 7、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1、Lol p 5、Pha a 1、Pas n 1、Phl p 1、Phl p 2、Phl p 3、Phl p 4、Phl p 5、Phl p 6、Poa p 1、Poa p 5、Sec c 1、Sec c 5、Sor h 1、Der f 1、Der f 2、Der f 3、Der f 7、Der p 1、Der p 2、Der p 3、Der p 7、Der m 1、Eur m 1、Eur m 2、Gly d 1、Gly d 2、Lep d 1、Lep d 2、Blo t 1、Tyr p 2、Bla g 1、Bla g 2、Per a 1、Per a 3、Per a 7、Fel d 1、Fel d 2、Fel d 3、Fel d 4、Can f 1、Can f 2、Bos d 2、Equ c 1、Equ c 2、Equ c 3、Mus m 1、Rat n 1、Api s m 1、Api m 1、Api m 2、Ves v 1、Ves v2、Ves v 5、Ves f 5、Ves g 5、Ves m 1、Ves m 2、Ves m 5、Vesp 5、Ves s 5、Ves v i 5、Dol m 1、Dol m 2、Dol m 5、Dol a 5、Pol a 1、Pol a 2、Pol a 5、Sol i 1、Sol i 2、Sol i 3和Sol i4、Alt a 1、Alt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Cla h 1、Clah 2、Cla h 6、Asp f 1、Bos d 4、Mal d 1、Mal d 3、Gly m 1、Gly m 2、Gly m 3、Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5或这些中任何的杂化物。

在本文的情况中，Der p 2和Der f 2过敏原也称为“Der gr.2”过敏原。因此，Der gr.2过敏原的定量是指对Der p 2和Der f 2过敏原的总量的定量。

在本发明的一个方面中，活性成分是一种或多种过敏原提取物。

在本文中的情况中，表达“过敏原提取物”是指通过提取生物学过敏原来源物质得到的任何提取物，通常如“Allergenic extracts”，H.Ipsen等人，chapter 20in Allergy，principle and practise(Ed.S.Manning)1993，Mos by-Year Book，St.Louis中所述的。这种提取物可以通过水溶液提取水溶性材料，随后进行纯化步骤如过滤，以得到溶液，即提取物。然后可使提取物经过进一步的纯化和/或处理如冷冻干燥，以除去实质上所有的水。通常，过敏原提取物包括蛋白质和其它分子的混合物。过敏原蛋白质经常分类为主要过敏原、中间体过敏原、次要过敏原或不经分类。过敏原提取物通常包括主要过敏原和次要过敏原。主要过敏原通常占平均过敏原提取物的约5-15％，更通常为约10％。过敏原的分类基于对特定过敏原的临床重要性的评价，并且如下所示。提取物可为例如含水的形式或冻干形式。

在提取物中发现的重要的主要过敏原的实例包括草的第1和5和6组过敏原(例如Phl p 1，5，和6)、尘螨的第1和2组过敏原(例如Der p 1，Der p 2)、树木花粉过敏原1和2(例如Bet v 1，Cry j 1，Cry j 2)、豚草花粉过敏原1和2(Amb a 1，Amb a 2)、猫过敏原1(即Fel d 1)。

本文中使用的表达“生物学过敏原来源物质”是指包括一种或多种过敏原的任何生物材料。这种材料的实例是螨的PMB(纯的螨肉体)或WMC(完整的螨培养物)、得自例如草、草药、莠草和树的脱脂或非脱脂的花粉、兽毛和皮屑、毛皮、真菌菌丝体和孢子、昆虫肉体、毒液或唾液和食物。

生物学过敏原来源物质可以包括污染物质，例如来自过敏原花粉来源物质的外来的花粉和植物和花的碎片。可接受的来自其它物质的花粉污染的最大水平为1％。还应该不含花和植物的碎片，极限值为5重量％。

在本发明的一个方面中，固体剂型的活性成分为生物学过敏原来源物质的一种或多种过敏原提取物，所述生物学过敏原来源物质选自梯牧草、粉尘螨、屋尘螨、疣皮桦、欧洲榛、桤木属糯稻、Cryptomeriajaponica，豚草、Ambrosia trifida、Artemisia vulgaris和Felisdomesticus。

在本发明的另一个方面中，活性成分是来自猫尾草-梯牧草的花粉的提取物，其包括以下蛋白质的混合物，所述蛋白质包括但不限于一种或多种过敏原Phl p 1、Phl p 2、Phl p 3、Phl p 4、Phl p 5、Phl p 6、Phl p 7、Phl p 11、Phl p 12、Phl p 13。在本发明的另一个方面中，活性成分是屋尘螨提取物和粉尘螨提取物的混合物，包括蛋白质的混合物，所述蛋白质包括但不限于一种或多种过敏原Der p2、Der f 2、Der p 1和Der f 1。

在本发明的另一个方面中，活性成分为来自桦树-疣皮桦的花粉的提取物，包括蛋白质的混合物，所述蛋白质包括但不限于一种或多种过敏原Bet v 1、Bet v 2、Bet v 3、Bet v 4、Bet v 6、Bet v 7。

在本发明的另一个方面中，活性成分为来自短的豚草-豚草-和/或三裂叶豚草-Ambrosia trifida的花粉的提取物，包括蛋白质的混合物，所述蛋白质包括但不限于一种或多种的过敏原Amb a 1、Amb a2、Amb a 3、Amb a 5、Amb a 6、Amb a 7和Amb t 5。

本文中使用的术语“过敏原疫苗”包括来源于相同过敏原来源或来源于不同过敏原来源的至少一种过敏原，例如，分别来源于不同螨类和草类的来源于草第1组和草第5组过敏原或螨第1组和第2组过敏原，莠草抗原如短豚草和三裂叶豚草过敏原，不同的真菌过敏原如链格孢属和芽枝霉属，树过敏原如桦树、榛树、角树、橡树、柳杉和赤扬过敏原，食物过敏原如花生、大豆、和牛奶过敏原。

在本发明另外的方面中，要测量的剂型为例如WO2004047794(ALK-Abell ó)、WO2004075875(ALK-Abell ó)、EP 278877(Medibrevex)、WO 200061117(Scherer)、或WO2000057856(PierreFabre Medicament)中所述的固体剂型形式的过敏原片剂。

在本发明的另一个方面中，用于本发明方法的固体剂型为快速分散固体剂型。通过本发明的方法溶出的特别适合的固体剂型是例如在WO2004047794中所述的，包括过敏原的固体网络和任何水溶性的或水可分散的基质。网络是通过从固态的组合物升华溶剂得到的，组合物包括过敏原的溶液和通过例如冻干得到的基质。形成快速分散固体剂型的基质的一部分的可药用赋形剂是基质成型剂和另外其它适合的赋形剂，例如抗酸剂、稀释剂、增强剂、粘膜黏着剂(mucoadhesiveagents)、调味剂、味道掩蔽剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、粘度增强剂、着色剂、pH调节剂、甜味剂、助剂、崩解剂、润滑剂等。这些赋形剂都根据常规的药学实践基于配制过敏原治疗剂的本领域技术人员理解的方式选择。基质成型剂的实例包括衍生自动物或植物蛋白质的赋形剂，例如明胶、糊精和大豆、小麦和车前草种子蛋白质；树胶，例如阿拉伯胶、瓜尔胶、琼脂和黄原胶；聚糖；淀粉和改性淀粉，藻酸盐；羧甲纤维素；角叉菜胶；右旋糖酐；果胶；合成聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；和多肽/蛋白质或聚糖复合物，例如明胶-阿拉伯胶复合物。明胶是水溶性胶体高分子的非均匀混合物。平均分子量分布的这种非均匀混合物可以得自对动物来源的富含胶原的材料例如骨、皮肤、腱、韧带等的水解作用。明胶可以衍生自哺乳动物例如牛、猪，或非哺乳动物例如温水或冷水鱼。明胶可以为水解的或非水解素、交联的或非交联的。它们可以另外为凝胶化或非凝胶化类型，非凝胶化类型典型地衍生自冷水鱼。在本发明的另一个特定的方面中，使用淀粉。淀粉是碳水化合物聚合物的复杂混合物。作为其它适合的基质成型剂的实例，可提及糖，例如甘露醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖和海藻糖；环状的糖，例如环糊精；无机盐，例如磷酸钠、氯化钠和硅酸铝；和具有2到12个碳原子的氨基酸，例如甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、L-异白氨酸、L-亮氨酸、和L-苯丙氨酸。

在本发明的一个方面中，固体剂型包括一种或多种选自甘露醇、纤维素、交联羧甲纤维素钠、二氧化硅和/或硬脂酸镁的成分。

在本发明的另一个方面中，固体剂型包括一种或多种选自甘露醇和鱼胶(fish gelatine)的成分。

在本发明的一个方面中，固体剂型为WO2004047794实施例1中所述的，其中活性成分是梯牧草的提取物。

在本发明的另一个方面中，固体剂型为WO2004047794中所述的，其中活性成分是屋尘螨提取物和粉尘螨提取物的混合物。

术语“约”或“大约”是指特殊值的可接受范围内，如本领域技术人员确定的，其部分地取决于该数值是如何测量或测定的，例如测量系统的限制。例如，“约”可以是指给定值的最大20％，优选最大10％，更优选最大5％，更优选最大1％的范围。

实施例

材料和方法

固体剂型

包含梯牧草提取物的剂型

如WO2004047794实施例1中所述制备包含梯牧草作为过敏原提取物的剂型1和2，各成分如以下表1中所述。

表1.包含梯牧草的不同剂型

成分	剂型1％w/w	剂型2％w/w	剂型3％w/w
				鱼胶	4.0％	6.5％	6.0％
甘露醇	3.0％	5.5％	5.08％
				青草花粉提取物(梯牧草)SQ-T	125000或25000或2500	75000或25000或2500	75000或25000
NaOH	定量到pH 7.5	定量到pH 7.5	定量到pH 7.5
				纯化水	定量到250mg	定量到250mg	定量到250mg
总％/湿式充填重量	100％	100％	100％
				干单位重(理论值)	17.5mg(不含NaOH)	30.0mg(不含NaOH)	27.7mg(不含NaOH)

SQ-T：SQ-T单位根据ALK-AbellóA/S s”SQ生物效能”-标准化方法(htt p://www.alk-abello.com)测定并且分配给片剂。标准化操作包括相对于内标准评价过敏原提取物的质量，将最重要的主要过敏原定量并且与内标准相比较，调整相对于内部参考的主要过敏原含量，相对于SQ-T单位产生主要过敏原的恒定水准，并且根据相对于内标准的I gE结合测量过敏原提取物的总的过敏原活性，即效能。

可以使用如上所述相同的成分和方法制备具有不同梯牧草量的剂型。

包含屋尘螨和粉尘螨提取物的剂型

以与WO2004047794中所述方法类似地制备包含Der gr.2、Der p1和Der f 1作为主要过敏原的剂型4。

溶出方法

在以下实施例中，使用EP 5.0，2.9.3中所述的溶出方法。将固体剂型浸渍在包含500ml 37℃溶出介质的桨式装置中。转速和取出样品的时间在每个实施例中给出。将样品过滤通过0.22μm膜式过滤器，然后通过ELISA方法分析。在实施例1-4中，实验以三或六个重复试验进行(n＝3或n＝6)，以三个或六个数值的平均值给出，并且表明每个实施例的复制数(n)。所述溶出方法经过验证。对于剂型3、75000SQ-T、和n＝6，中间精确度(差异系数)CVip为≤15.5％，重复性(差异系数)CVrep为≤3.7％。

溶出介质0.5％(w/v)酪蛋白，0.01M PBS，pH 6.8的制备

溶出介质由0.01M的磷酸盐缓冲盐水(最终缓冲液中的浓度：为0.08％(w/v)氯化钠、0.02％(w/v)氯化钾、0.02％(w/v)磷酸二氢钾和0.144％(w/v)磷酸氢二钠)、酪蛋白钠盐0.5％(w/v)和去离子水组成。溶出介质可以如下制备：将磷酸盐缓冲盐水(10x浓度，Bie &Berntsen)、酪蛋白钠盐(ICN Biomedicals)和去离子水混合，并且用0.2M盐酸调节pH到6.8。

用于梯牧草主要过敏原5(Phl p 5)的酶联免疫吸附测定(ELISA)

该试验使用基于Obispo等人，Allergy，1997，52，pg.806-813的ELISA技术进行。

ELISA方法测量梯牧草主要过敏原(Phl p 5)的活性。在4℃在黑暗下将与Phl p 5分子上不同抗原表位反应的两种单克隆抗体(ALK-Abello A/S，DK)涂在微量滴定板上。在洗涤(用洗涤缓冲液洗涤4次，0.01M PBS，0.05％Tween-20)并且用封闭缓冲液(2％酪氨酸缓冲液)将板封闭之后，施加样品/参考，其随后结合于抗体。再次洗涤(用洗涤缓冲液洗涤4次)之后，对孔施加针对梯牧草抗原的生物素化的兔多克隆抗体(ALK-Abello A/S，DK)并且使其反应。

在用洗涤缓冲液洗涤4次之后，对孔施加与HRP(辣根过氧化物酶)(DAKO，Denmark)偶联的链霉抗生物素蛋白并且使其在室温下反应1小时(振摇)。在用洗涤缓冲液洗涤4次之后，施加HRP酶的底物(TMB、KEM EN TEC)并且使其反应20分钟。其后用0.5N硫酸停止反应。在分光光度计例如Multilabel计数器Victor 2中在450nm测量形成的颜色。

在ELISA分析之前，将得自溶出实验的样品在ELISA稀释缓冲液(0.5％酪蛋白、0.01M PBS、0.05％Tween-20，pH 7.2)中稀释。使用Phl p 5ELISA可以分析范围2.4-40SQ-T/ml的样品。

用于Der gr.2，Der p 1和Der f1的酶联免疫吸附测定(ELISA)

通过如上对Phl p 5所述对Der gr.2、Der p 1和Der f 1进行ELISA来进行对溶出样品中主要过敏原(Der gr.2、Der p 1和Derf 1)的定量，不同之处在于兔多克隆抗体没有被生物素化，并且与HRP偶联的链霉抗生物素蛋白被替换为山羊抗兔HRP偶联的多克隆抗体。将测量值与参考值相比较。对于每个ELISA方案，测定相关剂量强度的片剂的主要过敏原作为100％溶出的参考。在适合的时候，还进行标示量的比较。所有的ELISA分析都是在进行溶出试验之后立即进行。

实施例1

通过如上所述的溶出方法使用50rpm进行各种溶出介质的试验。将从溶出容器取得的每个样品在ELISA稀释缓冲液中稀释到在ELISA标准曲线范围内的主要过敏原浓度，所述ELISA稀释缓冲液包含0.5％酪蛋白、0.01M PBS、0.05％Tween-20，pH 7.2。通过上述用于梯牧草的ELISA测定测量溶出。

试验了以下溶出介质：0.01M PBS，pH 6.8(H)；0.3M乙酸盐缓冲液、0.9％NaC l，pH 4.0(I)；0.063M HCl，pH 1.2(J)；和0.5％酪蛋白、0.01M PBS，pH 6.8(K)。在实验H)、I)、J)和K)中，样品在5、15、60、120分钟取出。在实验A)到C)中，酪蛋白立即沉淀。对于实验D)到G)的介质，做出梯牧草的ELISA标准曲线。

在所有实验中，试验的固体剂型为75000SQ-T剂量的包含梯牧草作为过敏原提取物的上述的“剂型1或2”。

表2.各种溶出介质的试验

从以上表2可以看出，含0.5％酪蛋白、0.01M PBS，pH 6.8的介质在5分钟内产生完全的释放并且适合作为ELISA稀释缓冲液。此外，介质D和E适合作为溶出介质和ELI SA稀释缓冲液。

实施例2

使用50r pm进行上述溶出方法，并且在5、10和15分钟取出样品。使用的溶出介质为含0.5％酪蛋白、0.01M PBS，pH 6.8的溶出介质。将从溶出容器取得的每个样品在ELISA稀释缓冲液中稀释到用于梯牧草的ELISA标准曲线范围内的主要过敏原浓度，所述ELISA稀释缓冲液包含0.5％酪蛋白、0.01M PBS、0.05％Tween-20，pH 7.2。通过上述用于梯牧草的ELISA测定测量溶出。

将如上所述制备的都包含梯牧草作为过敏原提取物的剂型1、2和3以不同的活性成分量使用。

表3.包含梯牧草的剂型1、2和3的溶出

对于所有三种剂型在5分钟可见完全释放。标示量的释放百分比的变化可以由使用的免疫化学分析方法的变化和剂型中活性成分的含量不是刚好100％来解释。

实施例3

使用50rpm进行上述溶出方法，并且在不同的时间点(从5到60分钟)取出样品。使用的溶出介质为含0.5％酪蛋白、0.01M PBS，pH6.8的溶出介质。将从溶出容器取得的每个样品在ELISA稀释缓冲液中稀释到用于梯牧草的ELISA标准曲线范围内的主要过敏原活性，所述ELISA稀释缓冲液包含0.5％酪蛋白、0.01M PBS、0.05％Tween-20，pH 7.2。通过上述用于梯牧草的ELISA测定测量溶出。

如上所述制备的包含梯牧草作为过敏原提取物的剂型1的溶出结果如表4中所示。

表4.包含不同的梯牧草浓度的剂型的溶出

对于所有三种浓度在5分钟可见完全释放。标示量的释放百分比的变化可以由使用的免疫化学分析方法的变化和剂型中活性物质的含量不是刚好100％来解释。

实施例4

使用150rpm进行上述溶出方法，并且在不同的时间点(从30秒到5分钟)取出样品。使用的溶出介质为含0.5％酪蛋白、0.01M PBS，pH 6.8的溶出介质。将从溶出容器取得的每个样品在ELISA稀释缓冲液中稀释到用于梯牧草的ELISA标准曲线范围内的主要过敏原期望浓度，所述ELISA稀释缓冲液包含0.5％酪蛋白、0.01M PBS、0.05％Tween-20，pH 7.2。通过上述用于梯牧草的ELISA测定测量溶出。

使用如上所述制备的包含梯牧草作为过敏原提取物的剂型3。

表5.包含梯牧草的剂型在150rpm的溶出

结果表明，药物物质在第一分钟内完全释放，意味着可以期望药物物质在第一分钟内完全地可用于与口腔粘膜相互作用。

实施例5

在一个容器中进行包含梯牧草作为过敏原提取物75000SQ-T的剂型2的溶出，进行不同的天数以便在如上所述用于梯牧草的相同的ELISA测定中分析所有的样品。将样品在2-8℃储存0、1、2、3、4和7天。将从溶出容器取得的每个样品在ELISA稀释缓冲液中稀释到用于梯牧草的ELISA标准曲线范围内的主要过敏原浓度，所述ELISA稀释缓冲液包含0.5％酪蛋白、0.01M PBS、0.05％Tween-20，pH 7.2。在第0天通过上述用于梯牧草的ELISA测定测量溶出。

表6.溶出样品的稳定性

没有发现溶出样品的降解。这表明溶出介质非常稳定并且样品可以在分析之前在2-8℃储存至少7天。

实施例6

使用150r pm进行上述溶出方法，并且在1到15分钟之间取出样品。每个样品以3或6个重复试验进行试验(n＝3或n＝6)。使用的溶出介质为含0.5％酪蛋白、0.01M PBS，pH 6.8的溶出介质。将从溶出容器取得的每个样品在ELISA稀释缓冲液中稀释到ELISA(Dergr.2、Der p 1和Der f 1)标准曲线范围内的主要过敏原浓度，所述ELISA稀释缓冲液包含0.5％酪蛋白、0.01M PBS、0.05％Tween-20，pH 7.2。

将如上所述制备的包含Der gr.2、Der p 1和Der f 1作为主要过敏原的剂型4与不同量的活性物质使用。

溶出样品中的主要过敏原(Der gr.2、Der p 1和Der f 1)的定量通过如上所述用于Der gr.2、Der p 1和Der f 1的ELISA进行。将测量值与参考值相比较。对于每个ELISA方案，测定相关剂量强度的片剂的主要过敏原作为100％溶出的参考。在适合的时候，还进行标示量的比较。所有的ELISA分析都是在进行溶出试验之后立即进行。

包含不同浓度Der gr.2、Der p 1和Der f 1的剂型在150rpm的溶出

Claims

1.测定从药物固体剂型释放的活性成分的量的方法，其中所述活性成分为一种或多种蛋白质，所述方法包括以下步骤：

(a)允许所述固体剂型在溶出介质中释放活性成分，所述溶出介质包括0.1到1.0％酪蛋白和0.005到0.1M磷酸盐缓冲盐水，并且具有6.6到7.3的pH，其中所述活性成分在溶出样本中的量为1-50ng/ml；和

(b)测定溶液中活性成分的量；

其中所述固体剂型为片剂、胶囊、锭剂或囊片的形式。

2.权利要求1的方法，其中溶出介质的pH范围为6.7到6.9。

3.权利要求1的方法，其中溶出介质包括0.3到0.7％的酪蛋白。

4.权利要求3的方法，其中溶出介质包括0.5％的酪蛋白。

5.权利要求1的方法，其中磷酸盐缓冲盐水为0.01M的磷酸盐缓冲盐水。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中溶出介质另外包括非离子型洗涤剂。

7.权利要求6的方法，其中所述非离子型洗涤剂为选自Tween-20、Tween-80、Span 20或Span 80的非离子型洗涤剂。

8.权利要求6的方法，其中固体剂型为在小于90秒的时间内在口腔中分散的固体剂型。

9.权利要求8的方法，其中固体剂型为用于口腔粘膜给药的分散固体剂型。

10.权利要求8的方法，其中固体剂型为在口腔中被接受之后的小于60秒的时间内在口腔中分散的剂型。

11.权利要求10的方法，其中固体剂型为在口腔中被接受之后的小于30秒的时间内在口腔中分散的剂型。

12.权利要求11的方法，其中固体剂型为在口腔中被接受之后的小于20秒的时间内在口腔中分散的剂型。

13.权利要求12的方法，其中固体剂型为在口腔中被接受之后的小于10秒的时间内在口腔中分散的剂型。

14.权利要求13的方法，其中固体剂型为在口腔中被接受之后的小于5秒的时间内在口腔中分散的剂型。

15.权利要求14的方法，其中固体剂型为在口腔中被接受之后小于2秒的时间内在口腔中分散的剂型。

16.权利要求1-5中任一项的方法，其中活性成分为一种或多种过敏原提取物。

17.权利要求16的方法，其中过敏原提取物包括选自以下组的一种或多种过敏原：草第1和5和6组过敏原；尘螨第1和2组过敏原；树木花粉过敏原1和2；豚草花粉过敏原1和2；和猫过敏原1。

18.权利要求1-5中任一项的方法，其中活性成分为梯牧草的提取物。

19.权利要求1-5中任一项的方法，其中活性成分为屋尘螨和粉尘螨的提取物。

20.权利要求1-5中任一项的方法，其中用于测定活性成分的量的方法是ELISA方法。

21.权利要求1-5中任一项的方法，其中活性成分的释放在溶出装置中进行。

22.权利要求21的方法，其中所述溶出装置是桨式装置。

23.权利要求21的方法，其中溶出装置的rpm为50-150rpm。

24.权利要求1-5中任一项的方法，其中固体剂型包括一种或多种选自甘露醇、纤维素、交联羧甲纤维素钠、二氧化硅和/或硬脂酸镁的成分。

25.权利要求1-5中任一项的方法，其中固体剂型包括一种或多种选自甘露醇和鱼胶的成分。

26.权利要求1-5中任一项的方法，其中溶出试验用于评价固体剂型的批次间质量。

27.权利要求1-5中任一项的方法，其中溶出试验用于试验固体剂型的储存期限。

28.权利要求1-5中任一项的方法，其中在将固体剂型置于溶出介质中15分钟内进行取样。

29.权利要求1-5中任一项的方法，其中在将固体剂型置于溶出介质中10分钟内进行取样。

30.权利要求1-5中任一项的方法，其中在将固体剂型置于溶出介质中5分钟内进行取样。

31.权利要求1-5中任一项任何方法，其中在将固体剂型置于溶出介质中3分钟内进行取样。

32.权利要求1-5中任一项的方法，其中在将固体剂型置于溶出介质中1分钟内进行取样。