CN101287991B - 对变应原进行定量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种方法，用于对变应原样品中变应原的绝对量加以定量，所述方法包括下述步骤：a)提供已知量的一种或多种变应原校正标准肽，其具有与待定量的变应原中发现的序列相同的氨基酸序列，以及可选地，具有对于待定量的变应原中发现的序列来说独特的氨基酸序列，以及可选地，对所述变应原校正标准肽加以标记，b)降解变应原样品，以获得肽的混合物，以及可选地，用一种或多种标记试剂对所述肽加以标记，其中，降解的变应原样品中的肽或校正标准肽中至少有一样被标记，如果降解的变应原样品中的肽和变应原校正标准肽这两者都被标记了的话，用于标记变应原校正标准肽的标记试剂与用于标记降解的变应原样品的肽的标记试剂不同，c)通过质量分析，将变应原校正标准肽的量与降解的变应原样品中的相应的肽的量关联起来，来对变应原的绝对量加以定量。

Description

对变应原进行定量的方法
技术领域
本发明涉及对变应原进行定量的领域。
发明背景
变应原是诱导人类变态性应答和IgE抗体产生的抗原性分子。它们可用于诊断和治疗变态反应，即，变应原免疫疗法，后者是变应原疫苗形式的。人类所置身于的致变应性来源材料，例如食品、花粉或螨虫粪便颗粒天然就作为主要和次要变应原的复杂混合物存在。主要变应原是对该来源产生变态反应的大多数患者对其有所反应的变应原。但是，看起来任何蛋白都是可能的变应原，因为随着认知增加，已鉴定出了越来越多的次要变应原。
由于变应原来源的复杂性，首先从源自cDNA的核苷酸序列推断出若干变应原的氨基酸序列。对编码变应原的基因的克隆揭示，大多数变应原是异质性的，且它们作为异变应原和变体的混合物存在。对同源变应原和异变应原的氨基酸序列比对显示，可通过恒定和可变区域序列对它们进行鉴定，和/或可将它们分为恒定和可变区域序列。恒定区域氨基酸序列对于种类来说是独特的，但是可变区域氨基酸序列则对每种异变应原来说都是独特的。
目前通过使用标准化的天然变应原提取物(其被进一步配制为变应原疫苗)，来进行传统的变应原特异性免疫疗法和诊断。这些水性疫苗基于致变应性的天然来源材料，例如树和草的花粉、尘埃螨虫培养物和动物毛发以及皮屑颗粒。这些天然来源材料的组合物已知会相当大地变化，该变化取决于收集致变应性来源材料的时间和地点。此外，还可使用多个种类，将商用变应原疫苗配制为变应原的混合物。
对重要变应原内含物和提取物的组成的认知是最终产物再现性、 安全和效果的先决条件。生产变应原疫苗的一大挑战在于标准化，即，确保不同批次具有恒定效力。鉴于原材料是天然来源的，变化相当之大，因此需要通过基于科学的手段来控制。提取物的组成应当理想地反映出致变应性来源材料的水可溶组分的组成，因为其是在呼吸道(airways)粘膜表面提取的，并被呈递给人免疫系统。但是，所有提取物都含有若干变应原，它们针对各患者以不同组合导致总的IgE结合。因此，理想地，需要从质量和数量两方面对所有组分加以控制，但是对目前的技术而言，这还无法实现。
目前以很多种不同方法来进行标准化，因为每家厂商都有公司独有的标准化流程。通过SDS-PAGE、等电聚集等技术，以及多种免疫电泳(QIE)和ELISA技术(使用单克隆抗体和/或多克隆抗体)以及放射变应原吸附(RAST)或相关技术来进行标准化。一种最优的不同批次标准化，例如SQ标准化流程基本上有三个步骤的流程：1)通过半定量免疫电泳技术确保最优的组成以及所有组分之间的恒定比例，2)通过定量免疫电泳测定主要变应原组分，以及3)如在Magic Lite
Figure S2006800383055D00021
检验中测定的那样，来调节总的I gE结合效力。在欧洲，目前所有标准化都是相对公司内部特有的参考制剂进行的，而在美国，FDA颁布了所有厂商采用的标准。目前所用的这些技术的所有定量方面都依赖于作为试剂的抗体，并且因此很脆弱，会随着时间改变。
对变应原的复杂混合物中特定疫苗组分的绝对定量并不简单，其还没有被建立为灵敏的、常规的高通量技术。
在食品工业中，用于对食品变应原进行可靠探测和定量的常规高通量技术也是必要的。因为生产期间意外的交叉污染，可能导致坚果成为食品的隐藏部分。生产具有和不具有例如坚果的相似食品的公司在制造不同类型的食品之间清洁生产设备方面可能具有困难。之前生产的食品中的痕量，例如坚果可能留存于设备上。而经由同样的设备制造的第一批没有坚果的食品则将可能含有痕量的坚果。由于坚果或花生的交叉污染导致变态反应的食品是，例如，巧克力、糖果、饼干、甜点、糖、油炸圈(donuts)、谷物、奶昔、燕麦条、什锦早餐麦、 派、松糕、冰淇淋、烧烤酱。牛奶可能导致对来自乳制品、来自牛奶、基于牛奶的配方食品或含来自奶的蛋白的婴儿食品的少量奶蛋白的变应反应。为了避免生产婴儿食品或婴儿配方食品期间奶蛋白对奶变应型幼儿造成的污染，因此需要针对奶变应原的探测和定量方法。为确保符合食品标签规定以及为了提升对消费者的保护，针对食品变应原的可靠的探测和定量方法是必需的。已经描述了物理化学方法，例如，质谱，以及免疫学方法。通常的灵敏度、特异性、再现性、精度和准确性标准必须满足。但目前仍存在交叉反应性、矩阵效果(matrixeffects)和食品加工方面的问题。当蛋白变性时其生物学活性可能仍旧保留。
生物质谱(MS)首先被用来评估蛋白质和肽的分子量和特性。近些年来，质谱的发展使得可用于对来自复杂混合物(例如，血浆、细胞和组织样品)的多种生物分子进行定量的技术出现。早期的定量技术仅建立蛋白质的相对定量，而更近来的技术则能评估感兴趣的分子的绝对量。定量技术的迅速发展主要是由于蛋白质组学领域的进展，特别是对例如健康和疾病状态加以区分以及对针对若干种疾病(例如，癌症、风湿性关节炎和Alzheimers症)的标志分子加以鉴定的应用的进展。通过MS进行的这些定量技术的主要优点在于技术的高灵敏度，其在300amol至300fmol样品的范围内。
WO 2004/070352公开了一种方法，用于使用同量异位(isobaric)标记试剂或同重元素标记试剂的组，相对于内部标准对肽进行定量。
US 6,872,575公开了一种方法，用于对复杂样品混合物中的一种或多种蛋白质进行鉴定，而无须纯化该蛋白或获得其复合的肽记号(composite peptide signature)。
US 6,864,089公开了一种方法，用于通过对肽或蛋白样品进行差异同位素标记来定量。
用于使用MS技术对蛋白进行定量的其它方法是，例如，AQUA技术，其使用内部校正肽，这是用掺入的稳定同位素(13C，15N)合成的，以模拟通过使用例如胰蛋白酶进行酶促消化形成的天然肽(Stemmann O et al.Cell 2001；107(6)：715-26，Gerber SA et al.Proc Natl AcadSci USA 2003；100(12)：6940-5)。
另一方法是ICPL(同位素编码的蛋白标记)方法，如Kellermannet al，Proteomics 5，4-15所述，其中使用例如12C/13C6-烟碱酸-琥珀酰亚胺作为ICPL标记。
质谱首先被引入变态反应研究领域，以表征天然变应原，包括翻译后修饰，例如，糖基化情形。还进一步用其来表征重组异变应原和/或变体，其中很多已在多种表达系统中表达，所述表达系统例如Esherica Coli、Pichia Pastoris和Baculovirus表达系统。
Johannes et al，J Allergy Clin Immunol，Vol.110，No.1(2002)的第131-138页描述了用MS来研究通过PCR克隆鉴定出来的变应原同种型(isoform)的实际表达，在Swoboda et al.，J.Biol Chem，Vol 270，No.6(1995)的第2607-2613页中，用液相色谱、MS和cDNA克隆来分析主要的桦树花粉变应原Bet v1的同种型。
但是目前对于下述灵敏的方法仍有需求，所述方法是这样的：通过其可对例如疫苗中的活性组分加以定量，所述活性组分例如，来自同一种类或不同种类的变应原和/或异变应原。使用MS技术和种类特异性和变应原特异性的氨基酸序列的方法提供了一种非常灵敏的方法，通过该方法，可对特定变应原或变应原(异变应原或同源变应原)的组的内容加以定量。根据本发明的方法可用于，例如，释放检测中，以确保疫苗生产期间、最终产品中以及对活性成分和/或产品的储藏的多个阶段中变应原的量安全、准确。该方法还将对开发第二代变应原疫苗有好处，例如，其中使用重组变应原作为活性成分的疫苗。此类方法使得可以基于目前疫苗的组成和/或对其的认知来优化第二代变应原疫苗中的活性成分。
发明内容
根据本发明，提供了一种方法，用于对来自多种来源的变应原进行绝对定量。
根据一个方面，本发明提供了一种方法，用于对变应原样品中变应原的绝对量加以定量，所述方法包括下述步骤：
a)提供已知量的一种或多种变应原校正标准肽，其具有与待定量的变应原中发现的序列相同的氨基酸序列，以及可选地，对所述变应原校正标准肽加以标记，
b)降解变应原样品，以获得肽的混合物，以及可选地，用一种或多种标记试剂对所述肽加以标记，
其中，降解的变应原样品中的肽或校正标准肽中至少有一样被标记，如果降解的变应原样品中的肽和变应原校正标准肽这两者都被标记了的话，用于标记变应原校正标准肽的标记试剂与用于标记降解的变应原样品的肽的标记试剂不同，
c)通过质量分析，将变应原校正标准肽的量与来自降解的变应原样品中的相应的肽的量关联起来，来对变应原的绝对量加以定量。
在本发明的一种实施方式中，待定量的变应原由
多于一种异变应原，例如来自同一种类的、具有超过67％的氨基酸序列同一性的变应原组的成员构成。
在本发明的另一实施方式中，待定量的变应原由多于一种同源变应原构成。
根据另一方面，本发明提供了一种方法，用于对变应原样品中变应原的绝对量加以定量，所述方法包括如下步骤：
a)提供已知量的一种或多种变应原校正标准肽，其具有对于待定量的变应原或异变应原中发现的序列来说独特的氨基酸序列，以及，可选地，对所述变应原校正标准肽加以标记，
b)降解变应原样品，以获得肽的混合物，以及可选地，用一种或多种标记试剂对所述肽加以标记，
其中，降解样品中的肽或校正标准肽中至少有一样被标记，如果降解样品中的肽和变应原校正标准肽这两者都被标记了的话，用于标记变应原校正标准肽的标记试剂与用于标记降解样品的肽的标记试剂不同，
c)通过质量分析，将变应原校正标准肽的量与来自降解的变应原样品中的相应的肽的量关联起来，来对变应原的绝对量加以定量。
在本发明的一个方面，提供了与待定量的异变应原或同源变应原中发现的序列相同的氨基酸序列作为变应原校正标准肽的用途，用于对变应原进行绝对定量，以及可选地，对变应原进行鉴定。优选地，步骤b)中的降解导致产生肽混合物，其中，肽中的一种包含与变应原校正标准肽相同的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，提供了下述氨基酸序列作为变应原校正标准肽用于对变应原进行绝对定量以及可选地，对变应原进行鉴定的用途，其中所述氨基酸序列是对于待定量的变应原或异变应原来说独特的序列。优选地，步骤b)中的降解导致产生肽混合物，其中，肽中的一种包含与变应原校正标准相同的氨基酸序列。
在本发明的又一方面，提供了一种方法，用于获得变应原校正标准肽，以用于对异变应原或同源变应原加以定量，其中，所述变应原校正标准肽通过下述方法获得：
通过将异变应原或同源变应原的序列加以比较，鉴定出在待定量的异变应原或同源变应原中恒定的氨基酸序列，以及制备具有该恒定序列的合成性变应原校正标准肽。
在本发明的还一个方面，提供了一种方法，用于获得变应原校正标准肽，以用于对变应原或异变应原加以定量，其中，所述变应原校正标准肽通过下述方法获得：
通过将变应原或异变应原的序列与其它异变应原和/或同源变应原加以比较，鉴定出在对于待定量的变应原或异变应原来说独特的可变氨基酸序列，以及制备具有该独特序列的合成性变应原校正标准肽。
附图简述
图1.通过载体NTI软件(Invitrogen)，对螨虫组2变应原种类(图1a)和Bet v1(图1b)--主要的桦树变应原进行的氨基酸序列比对。被评估为可作为内部校正标准肽(可用于对异变应原定量)的 可能的氨基酸序列粗体强调示出。
图2.通过胰蛋白酶对房屋尘埃螨虫变应原：a)Der f2和b)Derp2、c)Phl p1、d)Phl p5a、e)Phl p5b和f)Bet V1(GPMAW，Lighthouse数据)进行的理论酶促切割。选用来进行定量检测的种类特异性肽用粗体和灰色强调示出。
图3.a)对经纯化的和经胰蛋白酶消化的天然Der f2和Der p2(1∶1)的混合物进行的MALDI-TOF MS指纹分析，以及b)对经纯化的和经胰蛋白酶消化的重组Der f2和Der p2(1∶1)的混合物进行的MALDI-TOF MS指纹分析。
图4.对通过使用疏水相互作用色谱分离的HDM(房屋尘埃螨虫)变应原提取物进行的SDS-PAGE分析。HDM蛋白的级分被分入两大蛋白库(I和II)，再进一步进行定量分析。
图5.在对变应原的定量中利用ITRAQTM(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)化学时，对样品进行标记的策略。
图6.对经iTRAQ标记的a)肽1，m/z 2353.44(Der p2，32-48)、b)肽2，m/z 2326.35(Der f2，32-48)、c)经胰蛋白酶消化并经iTRAQ标记的nDer p2肽和d)nDer f2肽进行的MS分析。
图7.对nDer f2、nDer p2、肽1和肽2的混合物进行的MS/MS片段化。样品混合物中异变应原nDer p2(114.10)和Der f2(115.10)的量被计算为：m/z 114的信号面积与m/z 116的面积之比(肽1)以及m/z 115的面积与m/z 117的面积之比(肽2)。
图8.对来自SCX色谱的nDer f2、nDer p2、肽1和肽2的混合物进行的反相分析。用MS和MS/MS分析来鉴定MALDI-TOF靶上点上的峰。
图9.对经胰蛋白酶消化的nBet v1和内部校正标准(AQUA肽)的混合物进行的MS分析。天然肽和校正标准之间6Da的质量差异显示于图的上角。
发明详述
在本文上下文中，术语“变应原”指：已被报道为在其重复暴露 给个体时能诱导出变应反应，即，IgE介导的反应的天然存在的蛋白、经修饰的蛋白、重组蛋白、重组突变体蛋白或其任何蛋白片段或蛋白混合物。
天然存在的变应原的例子包括花粉变应原(树、杂草、草本植物和草花粉变应原)、螨虫变应原(来自，例如，房屋尘埃螨虫和储藏物螨虫)、昆虫变应原(吸入的、唾液来源的和毒液来源的变应原)、动物变应原(例如来自诸如狗、猫、马、大鼠、小鼠等的唾液、毛发和皮屑，)、真菌变应原和食品变应原。
来自树、草和草本植物的重要花粉变应原是下述这些，其来自分类学上的壳斗目(Fagales)、木犀目(Oleales)、松杉目(Pinales)和悬铃木目(platanaceae)，包括桦树(Betula)、桤木(Alnus)、榛树(Corylus)、角树(Carpinus)、橄榄树(Olea)、雪松(Cryptomeria和Juniperus)、悬铃树(Platanus)，禾本目(Poales)，包括，i.a.黑麦草属(Lolium)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、绒毛草属(Holcus)、虉草属(Phalaris)、黑麦属(Secale)和高粱属(Sorghum)的草，以及菊目(Asterales)和荨麻目(Urticales)，包括i.a.豚草属(Ambrosia)、蒿属(Artemisia)和墙草属(Parietaria)的草本植物。重要的其它吸入变应原是来自尘螨属(Dermatophagoides)和嗜霉螨属(Euroglyphus)的房屋尘埃螨虫，储藏物螨虫，例如，Lepidoglyphys、甜食螨属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus)，来自蟑螂、蚊和跳蚤，例如，小蠊属(Blatella)、大蠊属(Periplaneta)、摇蚊属(Chironomus)和Ctenocepphalides的那些，来自哺乳动物，例如猫、狗和马的那些，毒液变应原，包括下述这些，其来自叮或咬的昆虫，例如，来自分类学上膜翅目(Hymenoptera)，包括蜜蜂(蜜蜂(Apidae)总科)、黄蜂(Vespidea总科)和蚂蚁(蚁(Formicoidae)总科)的那些。来自真菌的重要的吸入变应原是，i.a.来自链格孢属(Alternaria)、分子孢子菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的那些。
食品变应原的例子是来自小麦(例如，Tri a 18-19)，甲壳类食品，包括，虾(例如，Met e1、Pen a1、Pen I1、Pen m1和Penm2)，明虾，螃蟹和龙虾，鱼(例如，Gad c1和Sal s1)，母鸡蛋(例如Gal d1、Gal d2)，花生(例如Ara h 1-8)，大豆(Gly m1-4)，牛奶(Bos d 4-8)，坚果，例如，杏仁(Pru du 4)，巴西果(Ber e1、Ber e2)、腰果(Ana o 1-3)、榛子(例如，Cor a1.04、Cor a2、Cor a8)和胡桃(例如Jug n 1-2、Jug r 1-3)，芹菜(Api g1、Api g4、Api g5)，芥末(Sin a1和Bra j1)和芝麻种子(Ses i 1-6)，特别是来自小麦(例如Tri a 18-19)、母鸡蛋(例如，Gal d1、Gal d2)、花生(例如，Ara h 1-8)、大豆(Gly m 1-4)、牛奶(Bos d 4-8)的变应原。
重组变应原的例子包括但不限于，使用重组技术制备的、来自植物花粉、草花粉、树花粉、杂草花粉、昆虫毒液、尘埃和储藏物螨虫蛋白、动物皮屑、唾液、真菌孢子和食品变应原(即，花生、奶、麦麸和蛋)的蛋白/肽。重组变应原可例如以大规模获得，这通过使用可可培养于发酵罐上的微生物表达系统来实现，其中所述的微生物系统是通过重组DNA技术产生的，或者，当通过化学方法合成时，通过使用化学前体或其它化学物来获得。在本发明的一种实施方式中，变应原是rBet v1、rAln g1、rCor a1、rCar b1、rCry j1、rCry j2、rOle e1、rAmb a1、rArt v1、rCyn d1、rDac g1、rLol p1、rLol p5、rPhl p1、rPhl p5、rPoa p1、rPoa p5、rSor h1、rDer f1、rDer f2、rDer p1、rDer p2、rEur m1、rEur m2、rGly d1、rLep d2、rBla g1、rBla g2、rFel d1、rCan f1、rCan f2、rBos d2、rEqu c1、rEqu c2、rMus m1、rApis m1、rApi m2、rVes v1、rVes v2、rVes v5、rDol m1、rDol m2、rDol m5、rPol a1、rPol a2、rPol a5、rAlt a1或rCla h1(r表示重组)。
重组突变体变应原与野生型有所不同，因为已通过遗传操作方法对变应原的基因进行了修饰，使得它们编码的多肽较之野生型展示出 单独的或若干个氨基酸的取代、缺失和/或添加。重组突变体变应原的例子包括变应原取代变体、添加变体、寡聚体、片段、缺失变体、杂合分子和其它变体。
经修饰的变应原的例子包括这样的变应原，其天然存在的形式与敏感受试者中的变态反应疾病状况相关，其中，所述经修饰的重组变应原较之天然存在的变应原而言是经改变的。本发明包括含数个氨基酸交换的变应原变体，变应原突变体，寡聚体，片段，缺失变体，杂合分子，肉豆蔻基化的、糖基化的、棕榈酰化的和磷酸化的变应原和其它变体。经修饰的变应原可通过适合的任何方法来产生，例如定点诱变方法、PCR方法、化学合成和这些方法的混合。
在本发明的一种实施方式中，待定量的变应原选自下述组中的一种或多种：Bet v1、Aln g1、Cor a1和Car b1、Que a1、Cry j1、Cry j2、Cup a1、Cup s1、Jun a1、Jun a2、Jun a3、Olee1、Lig v1、Syr v1、Pla l1、Pla a1、Pla a2、Amb a1、Amb a2、Amb t5、Art v1、Art v2、Art v3、Par j1、Par j2、Par j3、Sal k1、Ave e1、Cyn d1、Cyn d7、Dac g1、Fesp1、Hol l1、Lol p1 and 5、Pha a1、Pas n1、Phl p1、Phlp2、Phl p3、Phl p4、Phl p5、Phl p6、Poa p1、Poa p5、Secc1、Sec c5、Sor h1、Der f1、Der f2、Der f3、Der f7、Der p1、Der p2、Der p3、Der p7、Der m1、Eur m1、Eur m2、Gly d1、Gly d2、Lep d1、Lep d2、Blo t1、Tyr p2、Blag1、Bla g2、Per a1、Per a3、Per a7、Fel d1、Fel d2、Fel d3、Fel d4、Can f1、Can f2、Bos d2、Equ c1、Equ c2、Equ c3、Mus m1、Rat n1、Apis m1、Api m1、Api m2、Ves v1、Ves v2、Ves v5、Ves f5、Ves g5、Ves m1、Ves m2、Ves m5、Ves p5、Ves s5、Ves vi5、Dol m1、Dol m2、Dol m5、Dol a5、Pol a1、Pol a2、Pol a5、Sol i1、Sol i2、Soli3 and Sol i4、Alt a1、Alt a3、Alt a4、Alt a5、Alt a6、Cla h1、Cla h2、Cla h6 Asp f1、Bos d4、Mal d1、Mal d3、 Gly m1、Gly m2、Gly m3、Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5或其任意的杂合体。
在本发明的另一实施方式中，待定量的变应原选自下述组中的一种或多种：草花粉变应原，例如Phl p1、Phl p5、Phl p6、Poa p1、Poa p5、Dac g1、Fes p1、Lol p1和Lol p5，尘埃螨虫变应原，例如，Der f1、Der f2、Der p1和Der p2，毒液变应原，例如Apim1、Api m2、Ves v1、Ves v2、Ves v5、Dol m1、Dol m2、Dol m5、Dol a5、Pol a1、Pol a2和Pol a5，杂草变应原，例如Amb a1、Amb a2、Par j1、Par o1和Par m1，桦树变应原，例如Bet v1，日本雪松变应原，例如Cry j1和Cry j2，蟑螂变应原，例如per a1，橄榄树花粉变应原，例如Ole e1，猫变应原，例如Feld1，狗变应原，例如Can f1和Can f2，马变应原，例如Equ c1和Equ c2，mugworth变应原，例如Art v1、Art v2、Art v3，霉菌变应原，例如Alt a1、Alt a3、Alt a4、Alt a5、Alt a6、Clah1、Cla h2和Cla h6以及火蚁变应原，例如Sol i2、Sol i3和Sol i4。
在本发明的又一实施方式中，待定量的变应原选自下述组中的一种或多种：草花粉变应原，例如Phl p1、Phl p5和Phl p6，橄榄树花粉变应原，例如Ole e1，尘埃螨虫变应原，例如Der f1、Der f2、Der p1和Der p2，毒液变应原，例如Ves v1、Ves v2和Ves v5，杂草变应原，例如Amb a1、Amb a2、Par j1、Par o1和Par m1和树变应原，例如Bet v1、Cry j1和Cry j2。
在本发明的又一实施方式中，待定量的变应原是选自Der f1、Der p1、Der f2和Der p2的异变应原中的一种或多种。
在本发明的还一实施方式中，待定量的变应原是选自Phl p1、Phl p5、Phl p6、Poa p1、Poa p5、Dac g1、Fes p1、Lol p1、Lol p5中的一种或多种。
在本发明的再一实施方式中，待定量的变应原是选自Amb a1和Amb a2的异变应原中的一种或多种。
来自单一种类的变应原可由若干种非常相似的分子的构成。这些相似的分子共享下述共同生物化学性质时，就被命名为异变应原，所述性质是：a.相似的分子大小；b.如果知道的话，相同的生物学功能，例如，酶作用；以及c.＞67％的氨基酸序列同一性。在本文上下文中，具有＞67％氨基酸序列同一性并且来自同一种类的变应原组成员被称为异变应原。每种异变应原可具有多种形式的非常相似的序列，所述序列仅有少量差异性氨基酸序列，这些被称为变体，并也落在本文上下文中术语“异变应原”的范围内。
在本文上下文中，术语“同源变应原”指被认为共享了相似的三维结构、分子大小、相同的生物学功能(如果知道的话)(例如，酶作用)的，来自不同种类的变应原，它们可共享针对IgE抗体的结构表位。在本发明的又一实施方式中，同源变应原具有＞20％的氨基酸序列同一性，共享共同的恒定氨基酸序列，优选地，至少2-20个氨基酸的序列，更优选地，4-15，最优选地，6-10。
例如，Amp m2和Ves v2和Def f2和Der p2可作为同源变应原的例子。
在本文上下文中，“变应原提取物”这种表达指通过提取生物变应原来原材料获得的任何提取物，如“Allergenic extracts”，H.Ipsen et al，chapter 20 in Allergy，principle and practice(Ed.S.Manning)1993，Mosby-Year Book，St.Louis的一般性描述所述。此类提取物可这样获得：对水溶性材料进行水性提取，接着进行纯化步骤(例如过滤)，以获得溶液，即，提取物。然后可对提取物进行进一步的纯化和/或加工，例如冷冻干燥，以基本上去除全部的水。通常，变应原提取物包含蛋白质和其它分子的混合物。变应原蛋白通常被分类为主要变应原、中间产物变应原、次要变应原或无分类。变应原提取物通常包含主要变应原和次要变应原。主要变应原通常将构成平均变应原提取物的大约5-15％，更通常为大约10％。对变应原的分类基于对特殊变应原临床重要性的评估，其在下文中给出。在提取物中发现的重要的主要变应原包括：草组1和5和6变应原(例如Phl p1、5 和6)、尘埃螨虫组1和2变应原(例如Der p1、Der p2)、树花粉变应原1(Bet v1)、雪松花粉变应原1和2(例如，Cry j1、Cry j2)、豚草属花粉1和2(Amb a1、Amb a2)、猫变应原1(即，Fel d1)。
用于本文中的“生物学变应原来源材料”这种表达指包含一种或多种变应原的任何生物学材料。此类材料的例子是螨PMB(纯粹的螨虫虫体，Pure Mite Body)或WMC(总螨虫培养物，Whole Mite Culture)，来自例如草、草本植物、杂草和树的脱脂或非脱脂花粉，动物毛发和皮屑，毛皮，真菌菌丝体和孢子，昆虫虫体，毒液或唾液以及食品。
生物学变应原来源材料可包含污染性材料，例如外来花粉和来自变应原花粉来源材料的植物和花的残骸。可接受的来自其它种类的花粉的最大污染水平是1％。其还应当不含花和植物的残骸，对其的重量限制为5％。
本文上下文中使用的术语“变应原疫苗”包含至少一种变应原，其可来自同样的变应来源或来自不同的致变应性来源，例如，分别来自不同螨虫和草种类的草组1和草组5变应原或螨虫组1和组2变应原，杂草变应原，例如短和大的豚草变应原，不同的真菌变应原，例如链格孢属和分子孢子菌属，树变应原，例如桦树、榛树、角树、橡树和桤木变应原，食品变应原，例如花生、大豆和奶变应原。
疫苗制备方法通常是本领域公知的。典型地，疫苗被制备为可注射的，例如作为液体溶液或悬浮液。此类疫苗还可被乳化或配制，以使得能够经鼻施用以及口服，包括经颊和舌下施用。目标免疫原性组分可与赋形剂适当混合，赋形剂是可药用的，并且还与活性成分相容。合适的赋形剂的例子是水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。疫苗可额外含有其它物质，例如润湿剂、乳化剂、缓冲剂或增强疫苗有效性的佐剂。
根据本发明的一个方面，提供了一种方法，用于对变应原样品中变应原的绝对量加以定量，所述方法包括下述步骤：
a)提供已知量的一种或多种变应原校正标准肽，其具有与待定量的变应原中发现的序列相同的氨基酸序列，以及可选地，对所述变 应原校正标准肽加以标记，
b)降解变应原样品，以获得肽的混合物，以及可选地，用一种或多种标记试剂对所述肽加以标记，
其中，降解的变应原样品中的肽或校正标准肽中至少有一样被标记，如果降解的变应原样品中的肽和变应原校正标准肽这两者都被标记了的话，用于标记变应原校正标准肽的标记试剂与用于标记降解的变应原样品的肽的标记试剂不同，
c)通过质量分析，将变应原校正标准肽的量与来自降解的变应原样品中的相应的肽的量关联起来，来对变应原的绝对量加以定量。
在本发明的一种特殊的实施方式中，校正标准肽和降解的样品的肽均被标记，但是用不同标记试剂来标记的。
在本发明的另一种实施方式中，校正标准肽被标记，但是降解的样品的肽没有被标记。
根据本发明的又一种实施方式，变应原校正标准肽没有被标记，但是降解的变应原样品的肽被标记了。
在上文所述的本发明的一种优选的实施方式中，在步骤a)中提供一种变应原校正标准肽。因此，优选地，针对每种变应原样品而言，仅使用一种变应原校正标准肽。
根据本发明的又一种优选的实施方式，步骤b)中的降解的样品被标记时，仅用一种标记试剂对其加以标记。
因此，优选地，在步骤a)中仅提供一种变应原校正标准肽，步骤b)中的降解的样品也仅被一种标记试剂所标记。
此外，当校正标准肽被标记时，其优选仅被一种标记试剂所标记。
质量分析，例如MS等，可在若干对变应原样品和针对该特殊变应原样品的、根据本发明提供的变应原校正标准肽的混合物上进行。
在本文上下文中，术语“变应原校正标准肽，其具有与待定量的变应原中发现的序列相同的氨基酸序列”表示这样的氨基酸序列区域，其在待定量的变应原的异变应原组中或在待定量的同源变应原组中是恒定的，即，相同的。根据本发明的一种优选的实施方式，变应原校 正标准肽被选用为，使得待定量的变应原(异变应原或同源变应原)在步骤b)中的降解导致产生肽混合物，其中，该混合物中的肽中的一种包含与变应原校正标准肽相同的氨基酸序列。
根据本发明还可对特定异变应原或变应原加以定量。
根据该方面，本发明提供了一种方法，用于对变应原样品中特定变应原或异变应原的绝对量加以定量，所述方法包括如下步骤：
a)提供已知量的一种或多种变应原校正标准肽，其具有对于在待定量的变应原或异变应原中发现的序列来说独特的氨基酸序列，以及，可选地，对所述变应原校正标准肽加以标记，
b)降解变应原样品，以获得肽的混合物，以及可选地，用一种或多种标记试剂对所述肽加以标记，
其中，降解样品中的肽或校正标准肽中至少有一样被标记，如果降解样品中的肽和变应原校正标准肽这两者都被标记了的话，用于标记变应原校正标准肽的标记试剂与用于标记降解样品的肽的标记试剂不同，
c)通过质量分析，将变应原校正标准肽的量与来自降解的变应原样品中的相应的肽的量关联起来，来对变应原的绝对量加以定量。
在本发明的一种特殊的实施方式中，校正标准肽和降解的样品的肽均被标记，但是使用不同的标记试剂来标记的。
在本发明的另一实施方式中，校正标准肽被标记，降解的样品的肽没有被标记。
根据本发明的又一实施方式，变应原校正标准肽没有被标记，而降解的变应原样品的肽被标记了。
在如上文所述的本发明的一种优选的实施方式中，在步骤a)中提供一种变应原校正标准肽。因此，优选地，针对每种变应原样品而言，仅使用一种变应原校正标准肽。
根据本发明的又一种优选的实施方式，步骤b)中的降解的样品被标记时，仅用一种标记试剂对其加以标记。
因此，优选地，在步骤a)中仅提供一种变应原校正标准肽，且 如果标记的话，步骤b)中的降解的样品也仅被一种标记试剂所标记。
此外，当校正标准肽被标记时，其优选仅被一种标记试剂所标记。
质量分析，例如MS等，可在若干对变应原样品和针对该特殊变应原样品的、根据本发明提供的变应原校正标准肽的混合物上进行。
在本文上下文中，术语“变应原校正标准肽，其具有对于在待定量的变应原或异变应原中发现的序列来说独特的氨基酸序列”表示这样的氨基酸序列区域，其对于待定量的异变应原或变应原来说是可变的，即，独特的。根据本发明的一种优选的实施方式，待定量的变应原在步骤b)中的降解导致产生肽的混合物，其中，所述肽中的一种包含与变应原校正标准肽相同的氨基酸序列。
变应原校正标准肽中的氨基酸的数量优选在2-20个氨基酸的范围内，更优选在4-15的范围内，最优选在6-15的范围内。该数量取决于被发现与样品中的氨基酸序列匹配的最优酶切位点，即，当通过酶来切割样品时，恒定或可变区域的序列。此外，将根据本发明使用的变应原校正标准取决于将使用的标记和定量方法，以在MS设备中进行分析时给出可探测到的信号和片段化。
在本文上下文中，“变应原样品”指包含一种或多种变应原的样品。
在本发明的一种实施方式中，变应原样品包含变应原提取物、天然存在的经纯化的变应原、经修饰的变应原、重组变应原、重组突变体变应原、任何变应原片段、异变应原的混合物或同源变应原的混合物或其组合以及包含人工添加的(spiking)经纯化天然或重组变应原的变应原提取物。
变应原样品可以是最终产物的形式，例如片剂或溶液形式的变应原疫苗，或者可以是在生产期间取出的产物/中间产物，例如，在对生物变应原来源材料或原材料进行提取之后的产物/中间产物。
在本发明的一种优选的实施方式中，变应原样品是变应原提取物、片剂形式的最终产物或中间产物的形式。
在本发明的一个方面，提供了变应原提取物，其中，变应原提取 物包含天然变应原和重组变应原，其是通过这样获得的：对天然提取物中变应原的量加以定量，以及向该提取物中加入重组变应原或天然经纯化变应原，以在最终的提取物(例如，已人工添加了经纯化天然或重组变应原的天然提取物)中获得需要量的变应原。
根据本发明的方法使得对变应原样品中来自一种或多种种类、作为异变应原或同源变应原存在、且具有共同的氨基酸序列的一种或多种变应原进行同时或一次性定量成为可能。
可使用根据本发明的方法，同时或在一次流程中对变应原样品中种类的多种异变应原进行定量。
取决于样品，可能必须要用到变性剂和缓冲溶液，以获得合适的溶液。
在样品含有可能干扰本发明的方法的物质的情况下，样品制备可包括多种处理，例如用丙酮沉淀，所述物质例如硫醇，例如，DTT或巯基乙醇，高浓度的去垢剂和/或变性剂，例如SDS、辛基B-D-吡喃葡糖苷和Triton
Figure S2006800383055D00171
X-100和/或活性蛋白酶或一级胺(而非感兴趣的变应原)。推荐的缓冲液和可能干扰根据本发明的方法的备选去垢剂和/或变性剂和物质列于，例如Applied Biosystems ItraqTM ReagentsAmine-Modifying Labeling Reagents for Multiplexed Relative andAbsolute Protein Quantification Protocol from AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA中。
取决于样品的复杂程度，在降解之前对样品进行预分级分离可能是有好处的，例如，如果存在干扰对样品中感兴趣的变应原进行探测的分子的情况下。还可能需要将样品与其制剂和/或任何佐剂(例如氢氧化铝或磷酸钙)分开/洗脱。为了获得更不复杂的混合物，可使用多种色谱技术来对样品进行分级分离，例如疏水相互作用色谱、离子交换色谱和/或免疫亲和色谱。
在本发明的一种实施方式中，变应原样品是从预分级分离获得的，例如，包含一种或多种异变应原的变应原提取物级分。
在本发明的一种实施方式中，变应原样品是来自预分级分离步骤 的级分，其中，已根据大小、溶解度、电荷和/或配体特异性对样品进行了分级分离。在本发明的另一实施方式中，通过色谱，例如通过疏水相互作用色谱、反相色谱、离子交换色谱、尺寸排除色谱或亲和色谱来进行预分级分离，例如，通过疏水相互作用色谱来进行。
图4示出了通过使用疏水相互作用色谱对含有HDM组1和2变应原的中间产物进行预分级分离的例子。分别含有HDM组1和2变应原的级分是通过其物理化学性质分开的，通过免疫沉淀来对其进行鉴定。然后两种级分都可用于定量研究。
在本发明的一种实施方式中，色谱之后对变应原样品脱盐。
在本发明的一种实施方式中，在降解之前，对变应原样品加以还原，以及封闭任何半胱氨酸残基，例如，通过烷基化来进行。
根据本发明，通过用一种或多种酶处理来降解样品，以获得肽的混合物。可选用具有非常可预测的降解情形的酶，使得可通过与变应原校正标准肽比较来鉴定和定量获得的肽。酶可以是一种或多种蛋白酶，例如，两种蛋白酶或一种或多种其它酶。蛋白水解酶的例子包括：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧基肽酶C。例如，蛋白水解酶--胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其在赖氨酸或精氨酸以及非特定氨基酸之间切割肽键，由此产生包含胺末端(N末端)和赖氨酸或精氨酸羧基末端氨基酸(C末端)的肽。以这种方式，来自对蛋白的切割的肽是可预测的，它们在来自胰蛋白酶消化的样品中的存在和/或含量指示它们的来源蛋白质的存在和/或含量。此外，肽的游离胺末端可以是好的亲核试剂，其协助对其的标记。因为酶活性是可预测的，从已知序列的蛋白的降解产生的肽的序列也是可预测的。采用该信息，可以产生“理论”肽信息。在例如对来自对实际样品的质谱分析的子片段离子进行的计算机辅助分析中，对“理论”肽片断的确定因此可用于鉴定一种或多种肽。
在本发明的一种实施方式中，在标记之前降解变应原样品，这通过用至少一种酶消化样品以部分或完全降解该样品来实现。在本发明的又一实施方式中，酶是蛋白水解酶，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧基肽酶C或其组合，例如选自ArgC、LysC和胰蛋白酶或其组合的组。在本发明的再一实施方式中，酶是胰蛋白酶。
如果必要的话，可在标记之前，通过若干种方法中的任何方法来制备经消化的样品。
本领域技术人员显而易见：有多种可能的途径来标记样品和变应原校正标准肽，以以给定方式引入不同的质量修饰官能(functionalities)，使得对变应原肽的定量成为可能。可例如按照WO 2004/070352、US 6,864,089、Stemmann O et a1.Ce11 2001；107(6)：715-26和Gerber SA et al.Proc Natl Acad Sci U S A2003；100(12)：6940-5所述来进行标记，这些文献通过此引用并入本文。
在本发明的一种实施方式中，标记用I TRAQTM化学来进行(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)。
根据本发明的该实施方式，对降解的变应原样品和/或校正标准肽的标记通过同分异构(isomeric)或同量异位标记试剂的组(例如，iTRAQTM试剂(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA))来进行。这些试剂中的每种都含有能与待分析物反应的反应活性基团(RG)以及独特的报道基团(RP)，其在MS/MS分析中产生独特的“记号离子”。使用X和Y键，用接头部分(LK)将这两种基团进一步联接到一起。对降解的变应原样品的标记由此产生被称为RP-X-LK-Y-样品的待分析物。通过调节质谱仪，使得X和Y都键合片段的方式来进行对待分析物的分析。键X的片段化从待分析物释放出报道基团，然后可独立于待分析物对报道基团进行测定。Y键的片段化从待分析物释放出RP-LK组合。因此，基于片段化，可以将报道基团的存在和/或含量与样品中待分析物的存在和/或含量关联起来。
用例如4iTRAQTM试剂进行标记允许对不同变应原样品同时进行绝对定量(变应原样品被降解，每种肽混合物用不同的iTRAQTM试剂标记)。对不同变应原样品进行同时分析的可能性使得能将经标记的肽、样品与已知量的校正标准肽进行比较，由此通过使用MS/MS以一步方式定量和鉴定成为可能。
当使用ITRAQTM和/或其它标记试剂时，对样品的标记可按照厂商的流程来进行，如图5所示。
与使用MS技术对蛋白质进行定量相关的另一标记方法是，例如，AQUA技术，其中使用用掺入的稳定同位素(13C，15N)合成的内部校正肽，以模拟使用例如胰蛋白酶进行酶促消化形成的天然肽(Stemmann Oet al.Cell 2001；107(6)：715-26，Gerber SA et al.Proc Natl AcadSci USA 2003；100(12)：6940-5)。
另一方法是ICPL(同位素编码的蛋白标记)方法，如Kellermannet al，Proteomics 5，4-15所述，其中使用例如12C/13C6-烟碱酸-琥珀酰亚胺作为ICPL标记。
在本发明的一种实施方式中，对经不同标记的肽和变应原校正标准肽进行分别的标记，在标记之后定量之前予以混合。
可以根据怎样进行对变应原和校正标准肽的标记，来选择合适的鉴定方式。
在本发明的一种实施方式中，通过肽鉴定分析对经标记的变应原肽和变应原校正标准肽加以比较，进一步明确(positively)鉴定出变应原。
还可用离子交换色谱与反相色谱组合，作为二维色谱来分离肽，以及如果需要的话，在MS分析之前用其来降低任何盐和有机化合物的量。
在本发明的一种实施方式中，使用质谱来进行定量。
在本发明的又一实施方式中，可使用串联质谱或能对分子离子加以选择和片段化的其它质谱，来进行对变应原和/或异变应原的鉴定。这尤其适合用于用iTRAQTM试剂来进行标记的情况下。
串联质谱(以及在更小的程度上，单阶段质谱)具有下述能力：其能根据分子离子的质量电荷(m/z)比对分子离子加以选择和片段化， 以及然后记录得到的片段(子)离子谱。更具体地，可通过对选用的离子施加离解能量水平(例如，碰撞导致离解(CID))，来产生子片段离子谱。例如，可从第一次质量分析选出对应于特定m/z比的经标记肽的离子，在第二次质量分析中对其进行片段化和再次分析。可进行此类串联质量分析的代表性设备包括但不限于，磁场四扇(magneticfour-sector)、串联飞行时间、三极、四极、离子阱和杂交四极飞行时间(Q-TOF)质谱仪。
上述类型的质谱仪可与多种电离源一起使用，所述电离源包括但不限于：电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。电离源可用于产生用于并没有固定电荷的第一次质量分析的带电荷种类。额外的质谱设备和片段化方法包括MALDI-MS设备中的源后衰变和使用MALDI-TOF(飞行时间)-TOF MS的高能CID。关于串联质谱仪的近来综述，参见，R.Aebersold and D.Goodlett，Mass Spectrometryin Proteomics.Chem.Rev.101：269-295(2001)。关于对TOF TOF质量分析技术的讨论，还见美国专利6,319,476，其通过引用并入本文。
基于是对变应原或同源变应原或特定的变应原或异变应原进行定量，对变应原校正标准肽(可变或恒定序列)加以选择。
在本发明的一种实施方式中，可以对变应原进行绝对定量(变应原的异变应原的绝对量)。
当使用iTRAQTM试剂时，用用于标记变应原肽的同分异构或同量异位标记或标记的组，例如，iTRAQ-114、iTRAQ-115、iTRAQ-116或iTRAQ-117，来标记选用的变应原校正标准肽。一旦相对于针对被不同标记的肽的报道基团的相对量测定了针对(多种)校正标准肽的报道基团的相对量，就可计算出样品混合物中所有经不同标记的肽的绝对量(通常表示为浓度和/或数量)，以及由此计算出变应原的量(例如，当样品是提取物时，来自种类的异变应原的绝对量)。从经ITRAQTM标记的样品获得MS和MS/MS可例如使用4700ExplorerTM软件来进行。此外，可使用GPS Explorer软件来进行数据库搜索，其将导致能对来自MS/MS的肽进行明确鉴定。然后可基于已知量的变应原校正标准肽，即， 样品和校正标准肽之比，用获得的数据进行定量。
根据本发明的方法可用于，例如释放检测中，以确保在疫苗生产期间，以及在最终的产品中，和对成份和/或产品和粗提取物储藏的多个阶段中变应原的量安全且可预测。根据本发明的方法可用于开发第二代变应原疫苗，例如使用重组变应原作为活性成分，这通过基于目前疫苗的组成和/或对其的认知，优化第二代变应原疫苗中的活性成分来实现。目前的疫苗通常是用来自大量变应原种类的变应原配制的，本发明的方法还将有助于从这些变应原混合物中确定种类特异性的变应原的组成。根据本发明的方法可用于清洁确认(其中对痕量变应原加以测量)、释放检测和对中间产物和最终产品的分析。
可通过使用蛋白质和/或核苷酸数据库，以及切割分析程序和/或进行体外质量指纹实验，来制造可用作为校正标准肽的肽。
在本文上下文中，术语“变应原校正标准肽”指具有与异变应原或同源变应原组中可变或恒定序列(取决于其用于对由多余一种异变应原或同源变应原构成的变应原进行定量还是对特定的变应原或异变应原进行定量)相同的氨基酸序列的变应原校正标准。优选通过肽合成来制备变应原校正肽。
在一些情况下，感兴趣的变应原的序列是已知的。变应原的官方列表可例如在网站(www.allergen.org)找到，这是由I.U.I.SAllergen Nomenclature Sub-committee维护的。可从蛋白质和核苷酸数据库，例如，Uniprot Knowlegdebase获得已知的变应原序列。可使用，例如，Sequence Retrieval System(SRS)或使用关键字，例如，提交的进入名称(ID)、描述(DE)、基因名(GN)、种类(OS)和/或细胞器(OG)来搜索蛋白质和/或核苷酸序列。通过使用VectorNTI软件(Invitrogen)和/或通过使用Swiss Institute ofBioinformatics(SIB)的ExPASy(Expert Protein Analysis System)蛋白质组学服务器，来进行对感兴趣的蛋白质/变应原的进一步分析。使用Blast搜索来进行对现存变应原异形体和变应原种类的序列比对，Blast搜索可用于比对同源蛋白和/或核苷酸序列。序列比较提供了对 例如，新序列与以前表征过的基因和/或蛋白加以比较的途径。对同源变应原或异变应原的序列比对可用于证实变应原种类内和种类间的相同(恒定)和可变序列，如图1所示。
为获得最优的校正标准肽，可使用切割(降解)分析程序，来模拟针对感兴趣的变应原的切割分析。可用GPMAW程序(Lighthouse data，Odense，Denmark)对变应原序列进行分析，该程序是制造来支持MS分析的。可针对若干种已知的蛋白酶来推断对变应原序列的切割(降解)分析，所述蛋白酶例如胰蛋白酶、Asp-N和Lys-C和/或它们中两种或多种的组合。然后用得到的理论肽(图2)来验证最优的降解酶，以及进一步设计可用作为校正标准肽的合成肽。
另一方面，可从体外质量指纹实验来推断校正标准肽，其中通过酶对肽进行切割，并将其混合起来。可通过质量指纹分析来探测种类特异性肽，并通过数据库搜索，例如，使用Mascot搜索引擎来对它们加以鉴定，如下文所述：
可将经纯化的天然(n)Der f2和nDer p2和重组(r)Der f2(A61501)和Der p2(BAA01241)溶解于25mM Tris-C1，pH 7.5，1.0M尿素中。重组分子(rDer f2和rDer p2)和天然(nDer f2和nDer p2)分子的小份试样都被混合(例如，1∶1)，或被胰蛋白酶消化为分别的各种肽，之后再混合起来。对混合的和/或分别的各种肽的消化产物可被脱盐，并通过质量指纹来评估。可通过质量指纹分析，从上述两种的混合物中鉴定出种类特异性的肽。在用胰蛋白酶消化之后，可将经消化的分别的HDM 2变应原混合起来，可证实同样的种类特异性恒定序列。可基于种类特异性恒定序列，对合成的肽加以设计。对肽序列的定量和验证可通过列入用ITRAQTM试剂对各变应原和校正标准肽加以标记来进行，并通过串联质谱(MS/MS)来分析。
天然变应原提取物，例如，两个HDM种类，粉尘螨(Dermatophagoides farinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)(ALK-Abelló，H
Figure S2006800383055D00231
rsholm，Denmark)的中间产物(1.0mg/ml干重)被溶解。为除去干扰性组分，可用丙酮来沉淀样品。然后 可将含蛋白的沉淀重新溶解进选用的缓冲液。就定量目的而言，可用，例如，ITRAQTM试剂来标记用作为校正标准肽的、选用的来自两个种类的合成肽和样品，以及使用MS/MS对其进行分析。
将最终产物，例如，房屋尘埃螨虫变应原片剂溶解于20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中。为除去干扰性组分，样品可能需要被预分级分离，和/或用丙酮沉淀。例如用ITRAQTM试剂对溶解的片剂和选用的校正标准肽加以标记，以及使用串联MS/MS来分析。
释放研究；将最终产物，例如，5草混合物，包括与氢氧化铝偶联的5种草种类溶解进选用的缓冲液，其可将结合的变应原与氢氧化铝洗脱开。未结合的变应原可被进一步分离，和/或脱盐进选用的消化缓冲液，可例如使用ITRAQTM试剂来标记选用的校正标准肽，可使用MS/MS来评估定量。
本文提到的与本发明的任何方法相关的所有方面或特征与根据本发明的任何其它方法无疑等同相关。
实施例
实施例1
鉴定出针对Der f2、Der p2、Phl p1、Phl p5和Bet v1的独特恒定区域以及合成的校正标准肽
使用独特的恒定区域序列，即，天然Der f2、Der p2、Phl p1、Phl p5和Bet v1中的记号肽对异变应原进行的绝对定量可使用两种不同手段来展示。合成两种校正标准肽，用于对iTRAQTM标记技术(Applied Biosystems)加以评估。此外，合成四种校正标准肽，以评估Protein-AQUATM(Sigma-Aldrich)等同位素标记技术。
基于氨基酸序列比对(Vector NTI)(图1)，通过GPMAW进行的切割分析(图2)以及Blast数据库搜索，来设计变应原校正标准肽，所述标准肽具有对应于Der f2和Der p2中32-48、Phl p1中149-158、Phl p5a中123-135、Phl p5b a中115-127以及Bet v1中151-164的氨基酸序列的种类特异性序列。对经胰蛋白酶消化的天然变应原Der f 2、Der p2、Phl p1、Phl p5、Bet v1和混合的Der f2和Der p2进行的体外质量指纹分析被用来展示种类特异性肽的存在。所有经体外消化的样品和混合物都是用Mascot搜索引擎(Matrix Science Inc.，Boston，MA，USA)鉴定出来的。
可从Sigma GENOSYS，Texas，US获得对应于Der f2和Der p2的32-48位氨基酸序列的合成肽。通过氨基酸分析(Sigma GENOSYS，Texas，US)来测定这些肽的浓度。从Sigma GENOSYS，Texas，US获得对应于Phl p1中149-158(Arg13C15N)、Phl p5a中123-135(Arg 13C15N)、Phl p5b中115-127(Arg13C15N)和Bet v1中151-164(Val 13C15N)的氨基酸序列的、稳定的经同位素标记的合成肽(Protein-AQUATM肽)。(表1)
实施例2
纯化天然和重组的草、桦树和螨虫组2变应原
从100mg粉尘螨和屋尘螨提取物(ALK-Abelló，Horsholm，Denmark)来纯化天然的Der f2和Der p2。从50mg Phleum prantense提取物(ALK-Abelló)纯化天然的Phl p1和5，从50mg Betulaverrucosa提取物(ALK-Abelló)来纯化天然的Bet v1。对分子的纯化按照文献所述来进行(Johannessen BR et al.FEBS Lett2005；579：1208-12，Aasmul-Olsen S.et al.New Horizons inAllergy Immunotherapy，edit by Sehon et al.Plenum Press.NewYork 1996，p.261-65，Petersen A et al.Clin Exp Allergy.1994Mar；24(3)：250-6，Ipsen H & Lowenstein H J Allergy Clin Immunol.1983；72(2)：150-59)。重组Der f2和Der p2被表达于Pichia pastoris表达系统中，按照文献所述对其进行纯化(Johannessen BR et al.FEBSLett 2005；579：1208-12)。蛋白质作为经冻干的小份试样储藏于-20℃。
使用异变应原中的一种在A280处的消光系数，以及使用Lambda 800UV/VIS分光光度计(Perkin Elmer Instruments，CA，USA)来测量 经纯化变应原的浓度。
实施例3
与HDM提取物进行预分级分离以及蛋白质消化
用疏水相互作用色谱来对粉尘螨(Der f)和屋尘螨(Der p)提取物进行预分级分离。用1.0ml的HiTrap Phenyl柱(GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)来进行对螨虫提取物的分级分离。用50mM磷酸钠缓冲液(Merck，Darmstadt，Germany)，pH 7.0，1.0M硫酸铵(Fluka，Buchs，Switzerland)来平衡该柱，用逐渐减少的线性梯度，以5倍柱体积的50mM磷酸钠缓冲液(Merck)，pH 7.0来洗脱结合的样品。针对HDM提取物(Der f和Der p)中的每种，分别进行色谱。通过SDS-PAGE(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)来分析级分，基于该分析，将HDM蛋白分入两大蛋白库(图4)。对含有HDM 2变应原的Der f和Der p库进行对10mM碳酸氢铵(BDH，Poole，England)的透析。经透析的Der f和Der p库被冷冻干燥，分为～5mg(干重)的小份试样装入小管，冷冻储藏于-20℃。含有HDM 2变应原的Der f和Der p小份试样被进一步用于绝对定量研究。
实施例4
酶促切割和iTRAQ标记
从三种样品组来使用iTRAQTM标记：
a)15μg天然Der f2和15μg天然Der p2
b)15μg重组Der f2和15μg重组Der p2，以及
c)100μg经预分级分离的Der f和Der p提取物。
将合成的标准肽，15μg肽1(Der p2)和15μg肽2(Der f2)溶解于100mM三乙基碳酸氢铵(TEAB)pH 8.5中，对其进行标记，以用作为针对下文所述的每个实验组的内部校正标准。
按照厂商方案，来进行对游离半胱氨酸残基的封闭、使用胰蛋白酶进行的酶促切割和用iTRAQTM试剂进行的肽标记：
六种蛋白质样品和两种内部校正标准每种都溶解至20μl的100mM TEAB，pH 8.5。用1.0μl的0.05％SDS对蛋白样品变性，通过2.0μl的4.8mM TCEP Tris(2-羧乙基)膦在60℃对其进行还原，接着，通过1.0μl的10mM s-甲基甲硫磺酸盐(MMTS)在室温下对半胱氨酸残基加以封闭。用10％(w/w)测序级的改性胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)在37℃对蛋白样品进行18小时的消化。
对经胰蛋白酶消化的样品和内部校正标准肽，肽1和2进行的iTRAQTM标记在室温进行。将从114至117的每种iTRAQ标记试剂溶解至70μl的70％乙醇中，其然后再应用到样品上。试剂混合物的最终体积为100μl/样品。经标记的样品被储藏于-20℃。
用iTRAQ-114标记天然Der p2、重组Der p2和Der p提取物的经胰蛋白酶消化的肽。用iTRAQ-115标记天然Der f2、重组Der f2和Derf提取物的经胰蛋白酶消化的肽。用iTRAQ-116(Der p2)和iTRAQ-117(Der f2)标记合成的肽--肽1(Der p2)和肽2(Der f2)(图5)。通过Voyager STR和/或4700 Proteomic Analyser(AppliedBiosystems)分析每种经标记的样品，以展现出对肽的标记。用4700Proteomic Analyser(Applied Biosystems)进行MS/MS片段分析。对经标记的样品进行1∶10稀释，通过C18 Micro柱(ZipTips，Millipore)和/或手工制C18微型柱(Poros R2，Applied Biosystems)对1.0μl样品脱盐。通过将1.0μl 70％乙腈(ACN)、0.1％三氟乙酸(TFA)和1.0μl的α-氰基-4-羟基-肉桂酸(CHCA)(AgilentTechnologies，B
Figure S2006800383055D00271
blingen，Germany)基质加入到样品顶部，在靶标上对样品进行洗脱。对样品进行干燥，对其进行MS分析。
对经iTRAQTM标记的内部校正标准的MS分析对应于m/z 2353.44处肽1的质量，以及m/z 2326.35处对应于肽2的质量(图6a和6b)。结果显示，在Der p2特异性肽1和Der f2特异性肽2中的修饰对应于结合到氨基末端和C末端赖氨酸的iTRAQTM试剂进行的修饰。对经iTRAQTM标记的天然和重组Der p2肽的MS分析揭示了m/z 2353.29处经iTRAQTM修饰的质量。类似地，对经标记的天然和重组Der f2肽的 MS分析揭示了m/z 2326.29处经iTRAQTM修饰的质量，分别见图6c和6d。没有观察到胰蛋白酶漏掉的切割。这些结果表明，经iTRAQ标记的肽1和2可用作为内部校正标准，用于对Der p2和Der f2异变应原的绝对定量检测。
实施例5
来自两种不同HDM种类的混合物的绝对定量
对和粉尘螨和屋尘螨种类的异变应原进行的绝对定量首先从经纯化天然变应原的直接混合开始。经iTRAQTM标记的天然的经胰蛋白酶水解的Der p2、Der f2和肽1和肽2以1∶1∶1∶1的比例混合，按照1∶5和1∶10稀释，通过手工制C18微型柱(Poros R2，AppliedBiosystems)脱盐。通过使用1.0μl 70％ACN(Sigma)中的5μg/μlCHCA(Sigma)，0.1％TFA(Fluka)在靶标上对样品进行洗脱。通过4700 Proteomic Analyser(Applied Biosystems)来进行MS/MS片段分析。
m/z 2353.29的片段分析揭示了对应于针对天然Der p2和肽1的报道基团离子的、m/z 114处和m/z 116处的信号。样品中天然Derp2异变应原的量被计算为m/z 114的信号面积与m/z 116(内部校正标准)的面积之比(图7a)。m/z 2326.29的MS/MS片段分析揭示了对应于针对天然Der f2和肽2的报道离子的、m/z 115和m/z 117的信号。
样品中天然Der f2异变应原的量被计算为m/z 115与m/z 117(内部校正标准)的信号面积之比(图7b)。除了绝对定量之外，m/z 2353.29和m/z 2326.29的片段离子峰列表被提交给Mascot搜索引擎(MatrixScience)进行数据库分析。通过数据库分析鉴定出作为粉尘螨和屋尘螨HDM变应原2的32-48的肽。
实施例6
通过二维色谱分离经标记的肽混合物
通过二维色谱来对Der g和Der p提取物的复杂混合物中的异变应原和重组Der f2和Der p2的混合物进行绝对定量。阳离子交换色谱(SCX)被用作为第一维，反相色谱作为第二维制备步骤。
将重组Der p2、Der f2和肽1和2按照1∶1∶1∶1的比例混合，最终体积为50μl。Der f和Der p提取物和肽1和2按照4∶4∶1∶1的比例混合，最终体积为50μl。
通过阳离子交换色谱来分离经标记的肽混合物 ( 重组 Der p2 和 Der f2 以及 Der p2 和 Der f2 的提取物 ) ：
按照1∶10将样品混合物稀释进5％ACN(Sigma)0.05％甲酸(Merck)，对其进行SCX。SCX在SMARTTM系统(GE-HealthCare，Uppsala，Sweden)中的0.8x50mm的Zorbax BIO-SCX(3.5μm)柱(AgilentTechnologies)中进行。用5％ACN(Sigma)0.05％甲酸(Merck)对柱进行平衡，用从0至100％的5％ACN(Sigma)0.05％甲酸(Merck)0.5M NaCl(Merck)的逐渐增加的线性梯度，在30分钟内进行色谱。流速为50μl/分钟，在214nm处对色谱加以监测。收集50μl的级分，通过Voyager-STR MS(Applied Biosystems)和/或4700 ProteomicAnalyser(Applied Biosystems)设备对每种级分(1.0μl)加以分析。在梯度末尾洗脱鉴定出m/z 2353.29和m/z 2326.29的肽，其与一些其它的HDM肽在一起。含有m/z 2353.29和m/z 2326.29的肽的Der f和Der p混合物级分(提取物)被选出来，通过反相色谱对其进行进一步分离，见下文。但是，对内部校正标准和rDer f2和rDer p2(重组)混合物的定量在SCX后直接从靶标盘进行。
对m/z 2353.29进行的MS/MS片段分析揭示了对应于针对Der p2和肽1的报道离子的、m/z 114和m/z 116处的信号。rDer p2/rDer f2混合物中Der p2克隆的量被计算为m/z 114的信号面积与m/z 116(内部校正标准)的面积之比。对m/z 2326.29进行的MS/MS片段分析揭示了对应于针对Der f2和肽2的报道基团离子的、m/z 115和m/z 117处 的信号。rDer p2/rDer f2混合物中Der f2克隆的量被计算为m/z 115的信号面积与m/z 117(内部校正标准)的面积之比。m/z 2353.29和m/z 2326.29的片段离子峰列表被提交给Mascot搜索引擎(MatrixScience)进行数据库分析。通过数据库分析鉴定出作为Dermatophagoides farinae和Dermatophagoides pteronyssinus HDM变应原2的32-48的肽。
两份样品--重组Der f2和Der p2的混合物以及Der f和Der p提取物混合物中m/z 2353.29和m/z 2326.29处的肽以相近的驻留时间从SCX柱上洗脱下来。该实验显示，SCX可在对变应原进行定量前用作为针对更简单的样品混合物的分级分离和脱盐步骤。实验还显示，SCX可用作为第一维分级分离步骤，用于分析变应原的更为复杂的混合物，例如免疫疗法中使用的传统变应原提取物。
通过 SCX 接着进行反相色谱以及接着进行绝对定量 MALDITOF-TOF MS 来分离经标记的肽 ( 来自 Der p2 和 Der f2 的提取物 ) 。
通过C18 PepMap100(3μm)柱(LC Packings Dionex，Sunny Vale，CA，USA)来分离来自前文所述的SCX分离分级的经iTRAQTM标记的HDM肽。用0.05％TFA(Fluka)、2％ACN(Sigma)来对柱进行平衡。以80分钟内0-50％的梯度，120分钟内50-100％的梯度，用0.04％TFA(Fluka)、80％ACN来洗脱肽。用Ultimate3000(LC Packings，Dionex)2.0μl/分钟来进行色谱，在210和214nm处监测。将1.0μl的SCX级分注射进柱中。通过将它们直接点样在MALDI-TOF靶标盘上来收集级分。用Probot(LC Packings，Dionex)设备来点样，该设备与Ultimate3000设备在线连接。每30秒按照1∶1的比例将HCCA基质(AgilentTechnologies)与样品混合，来进行点样。
使用4700 Proteomic Analyser(Applied Biosystems)，通过MS和MS/MS来分析点样的样品。从靶标上的点来鉴定m/z 2353.29和m/z2326.29的肽，它们显示出对应于色谱中214nm处的信号(图8)。对m/z 2353.29进行的MS/MS片段分析揭示了对应于针对Der p2和肽1的 报道基团离子的、m/z 114和m/z 116处的信号。Der p/f提取物混合物中Der p2异变应原的量被计算为m/z 114的信号面积与m/z 116(内部校正标准)的面积之比。对m/z 2326.29进行的MS/MS片段分析揭示了对应于针对Der f2和肽2的报道基团离子的、m/z 115和m/z 117处的信号。Der p/f提取物混合物中Der f2异变应原的量被计算为m/z 115的信号面积与m/z 117(内部校正标准)的面积之比。m/z 2353.29和m/z 2326.29的片段离子峰列表被提交给Mascot搜索引擎(MatrixScience)进行数据库分析。通过数据库分析鉴定出作为Dermatophagoides farinae和Dermatophagoides pteronyssinus HDM变应原2的32-48的肽。
该实验显示，反相色谱可用作为对样品和/或变应原提取物的复杂混合物进行的第二维分级分离，以对异变应原进行定量。
实施例7
使用AQUA策略对异变应原进行绝对定量
在AQUA技术(Stemmann O et al.Cell 2001；107(6)：715-26，Gerber SA et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003；100(12)：6940-5.)中，合成掺入了稳定同位素(13C，15N)的内部校正肽，以模拟通过使用例如胰蛋白酶进行酶促消化形成的天然肽。典型地，经一种同位素标记的氨基酸残基的掺入将肽的分子质量改变6-10Da。与在iTRAQ技术中不同，需要通过标记试剂对样品或内部校正标准加以修饰。在定量实验中，例如，当使用LC-MS/MS时，来自天然样品肽和合成的内部校正标准的特定片段离子的丰度可作为反相色谱驻留时间的函数被测量。通过对已知内部标准的丰度和天然样品肽的丰度进行比较，来进行绝对定量测定。
按照上文所述来设计针对天然Phl p1、Phl lp5a和b形式以及Bet v1的合成内部校正标准肽(图2)。下表1更为详细地描述了合成肽。
种类 变应原 氨基酸序列 理论质量 修饰 经修饰 的质量
[0195]
Betula verrucosa Bet v 1 AVESYLLAHSDAYN 1552.73 (Val 13C15N) 1558.64
Phleum prantense Phl p 1 SAGEVEIQFR 1135.57 (Arg 13C15N) 1145.27
Phleum prantense Phl p 5a YDAYVATLSEALR 1471.74 (Arg 13C15N) 1481.66
Phleum prantense Phl p 5b FDSFVASLTEALR 1455.74 (Arg 13C15N) 1465.66
表1：对合成的内部校正标准的标记
将天然的Phl p1、Phl p5和Bet v1以2.5pmol/μl的浓度重新溶解进25mM Tris-C1(Sigma)、1.0M尿素(Fluka)pH 7.8中。将内部校正标准以1∶1的比例混合进样品。用10％(w/w)测序级的胰蛋白酶(Promega)在37℃进行18小时的消化。样品被储藏于-20℃。
使用Voyager STR和/或4700 Proteomic Analyser(AppliedBiosystems)，通过MS和MS/MS来分析经胰蛋白酶消化的Phl p1、Phlp5和Bet v1。将所有样品按照1∶10稀释于0.1％TFA(Fluka)中，每种样品取1.0μl，通过手工制的C18微型柱(Poros R2 AppliedBiosystems)对其脱盐。
对经胰蛋白酶消化的天然Phl p1的MS分析揭示了m/z 1135.60处的天然肽，以及m/z 1145.61处的、针对Phl p1异变应原的内部校正标准肽(数据未示出)。对内部校正肽的MS/Ms分析显示出对应于天然Phl p1异变应原的独特的氨基酸序列的片段化图样。
对经胰蛋白酶消化的天然Phl p5的MS分析揭示了m/z 1471.81处的Phl p5a的天然肽，以及m/z 1455.77处的Phl P5b的天然肽(数据未示出)。在m/z 1481.83和m/z 1465.78处探测到了针对Phl p5a和Phl p5b异变应原的内部校正标准肽。对内部校正肽的MS/MS分析显示出对应于天然Phl p5a和Phl p5b异变应原的独特的氨基酸序列的片段化图样。
对经胰蛋白酶消化的天然Bet v1的MS分析揭示了m/z 1552.76处的天然肽，以及m/z 1558.77处的、针对Bet v1异变应原的内部校 正标准肽(图9)。对内部校正肽的MS/MS分析显示出对应于天然Bet v1异变应原的独特的氨基酸序列的片段化图样。
为对Betv 1、Phl p1、Phl p 5a和Phl p 5b异变应原进行绝对定量，可通过例如，通过LC偶联的MS/MS设备，例如LCQ DecaXP(ThermoFinnigan)、QSTAR
Figure S2006800383055D00331
Hybrid LC/MS/MS系统和4000 Q TRAPLC/MS/MS系统(Applied Biosystems)对样品进行分析。
用AQUA肽的实验显示，模拟天然异变应原序列的经稳定同位素标记的合成肽可用于对天然Phl p1、Phl p5和Bet v1中的异变应原进行绝对定量。此外，对胰蛋白酶消化产物进行的分析没有揭示胰蛋白酶漏过的任何切割。SCX和RP-HPLC组合起来的二维色谱(如针对iTRAQ化学所述)可用于对化学上相同的、天然的和合成性内部校正标准的更为复杂的变应原混合物进行分级分离。
序列表
<110>Alk Abello A/S
<120>对变应原进行定量的方法(A METHOD FOR QUANTIFICATION OF ALLERGENS)
<130>16239PCT00
<140>PCT/DK2006/000480
<141>2006-09-01
<160>147
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>1
Asp Gln Val Asp Val Lys
1 5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>2
Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys
1 5
<210>3
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>3
Val Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg
1 5 10 15
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>4
Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr
1 5 10 15
Lys
<210>5
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>5
Thr Glu Ile Lys
1
<210>6
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>6
Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn
1 5 10 15
Ala Cys His Phe Met Lys
20
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>7
Cys Pro Leu Val Lys
1 5
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>8
Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys
1 5
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>9
Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
1 5
<210>10
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>10
Ile Ala Pro Lys
1
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>11
Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys
1 5
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>12
Leu Val Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala
1 5 10 15
Lys
<210>13
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>13
Asp Gln Val Asp Val Lys
1 5
<210>14
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>14
Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys
1 5
<210>15
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>15
Val Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg
1 5 10 15
<210>16
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>16
Gly Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr
1 5 10 15
Lys
<210>17
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>17
Ile Glu Ile Lys
1
<210>18
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>18
Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ala Cys His Tyr Met Lys
20
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>19
Cys Pro Leu Val Lys
1 5
<210>20
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>20
Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys
1 5
<210>21
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>21
Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
1 5
<210>22
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>22
Ile Ala Pro Lys
1
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>23
Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys
1 5
<210>24
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>24
Val Met Gly Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala
1 5 10 15
Lys
<210>25
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>25
Met Ala Ser Ser Ser Ser Val Leu Leu Val Val Ala Leu Phe Ala Val
1 5 10 15
Phe Leu Gly Ser Ala His Gly Ile Pro Lys
20 25
<210>26
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>26
Val Pro Pro Gly Pro Asn Ile Thr Ala Thr Tyr Gly Asp Lys
1 5 10
<210>27
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>27
Trp Leu Asp Ala Lys
1 5
<210>28
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>28
Ser Thr Trp Tyr Gly Lys Pro Thr Ala Ala Gly Pro Lys
1 5 10
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>29
Asp Asn Gly Gly Ala Cys Gly Tyr Lys
1 5
<210>30
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>30
Asp Val Asp Lys Pro Pro Phe Ser Gly Met Thr Gly Cys Gly Asn Thr
1 5 10 15
Pro Ile Phe Lys
20
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>31
Gly Cys Gly Ser Cys Phe Glu Ile Lys
1 5
<210>32
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>32
Cys Thr Lys Pro Glu Ala Cys Ser Gly Glu Pro Val Val Val His Ile
1 5 10 15
Thr Asp Asp Asn Glu Glu Pro Ile Ala Ala Tyr His Phe Asp Leu Ser
20 25 30
Gly Ile Ala Phe Gly Ser Met Ala Lys
35 40
<210>33
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>33
Gly Asp Glu Gln Lys
1 5
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>34
Ser Ala Gly Glu Val Glu Ile Gln Phe Arg
1 5 10
<210>35
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>35
Tyr Pro Glu Gly Thr Lys
1 5
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>36
Val Thr Phe His Val Glu Lys
1 5
<210>37
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>37
Gly Ser Asn Pro Asn Tyr Leu Ala Leu Leu Val Lys
1 5 10
<210>38
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>38
Phe Val Ala Gly Asp Gly Asp Val Val Ala Val Asp Ile Lys
1 5 10
<210>39
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>39
Trp Ile Ala Leu Lys
1 5
<210>40
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>40
Glu Ser Trp Gly Ala Ile Trp Arg
1 5
<210>41
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>41
Ile Asp Thr Pro Glu Val Leu Lys
1 5
<210>42
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>42
Gly Pro Phe Thr Val Arg
1 5
<210>43
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>43
Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys
1 5
<210>44
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>44
Gly Glu Ala Lys
1
<210>45
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>45
Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys
1 5
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>46
Ala Asp Thr Ala Tyr Glu Ser Lys
1 5
<210>47
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>47
Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gly Ala Asp Ala Ala Gly
20 25 30
Lys
<210>48
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>48
Ala Thr Thr Glu Glu Gln Lys
1 5
<210>49
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>49
Leu Ile Glu Lys
1
<210>50
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>50
Ile Asn Ala Gly Phe Lys
1 5
<210>51
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>51
Ala Ala Leu Ala Gly Ala Gly Val Gln Pro Ala Asp Lys
1 5 10
<210>52
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>52
Thr Phe Val Ala Thr Phe Gly Pro Ala Ser Asn Lys
1 5 10
<210>53
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>53
Ala Phe Ala Glu Gly Leu Ser Gly Glu Pro Lys
1 5 10
<210>54
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>54
Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys
1 5
<210>55
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>55
Ala Ala Leu Thr Ser Lys
1 5
<210>56
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>56
Leu Asp Ala Ala Tyr Lys
1 5
<210>57
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>57
Leu Ala Tyr Lys
1
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>58
Thr Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys
1 5 10
<210>59
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>59
Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu Ser Glu Ala Leu Arg
1 5 10
<210>60
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>60
Ile Ile Ala Gly Thr Leu Glu Val His Ala Val Lys Pro Ala Ala Glu
1 5 10 15
Glu Val Lys
<210>61
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>61
Val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gln Val Ile Glu Lys
1 5 10
<210>62
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>62
Val Asp Ala Ala Phe Lys
1 5
<210>63
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>63
Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Ala Asn Asp Lys
1 5 10
<210>64
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>64
Phe Thr Val Phe Glu Ala Ala Phe Asn Asp Glu Ile Lys
1 5 10
<210>65
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>65
Ala Ser Thr Gly Gly Ala Tyr Glu Ser Tyr Lys
1 5 10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>66
Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys
1 5 10
<210>67
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>67
Gln Ala Tyr Ala Ala Thr Val Ala Thr Ala Pro Glu Val Lys
1 5 10
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>68
Tyr Thr Val Phe Glu Thr Ala Leu Lys
1 5
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>69
Ala Ile Thr Ala Met Ser Glu Ala Gln Lys
1 5 10
<210>70
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>70
Ala Lys Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly Gly Tyr Lys
20 25 30
<210>71
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>71
Ala Ala Ala Ala Val Pro Arg
1 5
<210>72
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>72
Gly Gly Pro Gly Arg
1 5
<210>73
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>73
Ser Tyr Thr Ala Asp Ala Gly Tyr Ala Pro Ala Thr Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Gly Ala Ala Ala Gly Lys
20
<210>74
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>74
Ala Thr Thr Glu Glu Gln Lys
1 5
<210>75
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>75
Leu Ile Glu Asp Ile Asn Val Gly Phe Lys
1 5 10
<210>76
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>76
Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ser Val Pro Ala Ala Asp Lys
1 5 10
<210>77
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>77
Thr Phe Glu Ala Ala Phe Thr Ser Ser Ser Lys
1 5 10
<210>78
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>78
Ala Ala Ala Ala Lys
1 5
<210>79
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>79
Ala Pro Gly Leu Val Pro Lys
1 5
<210>80
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>80
Leu Asp Ala Ala Tyr Ser Val Ala Tyr Lys
1 5 10
<210>81
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>81
Ala Ala Val Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys
1 5 10
<210>82
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>82
Phe Asp Ser Phe Val Ala Ser Leu Thr Glu Ala Leu Arg
1 5 10
<210>83
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>83
Val Ile Ala Gly Ala Leu Glu Val His Ala Val Lys Pro Val Thr Glu
1 5 10 15
Glu Pro Gly Met Ala Lys
20
<210>84
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>84
Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gln Ile Ile Asp Lys
1 5 10
<210>85
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>85
Ile Asp Ala Ala Phe Lys
1 5
<210>86
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>86
Val Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Pro Ala Asp Asp Lys
1 5 10
<210>87
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>87
Phe Thr Val Phe Glu Ala Ala Phe Asn Lys
1 5 10
<210>88
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>88
Glu Ser Thr Gly Gly Ala Tyr Asp Thr Tyr Lys
1 5 10
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>89
Cys Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Val Lys
1 5 10
<210>90
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>90
Gln Ala Tyr Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Pro Gln Val Lys
1 5 10
<210>91
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>91
Tyr Ala Val Phe Glu Ala Ala Leu Thr Lys
1 5 10
<210>92
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>92
Ala Ile Thr Ala Met Ser Glu Val Gln Lys
1 5 10
<210>93
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>93
Val Ser Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ala Gly Ala Ala
1 5 10 15
Thr Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ser Gly Ala Ala Thr Val Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Tyr Lys
35
<210>94
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>94
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg
<210>95
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>95
Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys
1 5 10
<210>96
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>96
Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Phe Thr Glu Gly
1 5 10 15
Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys
20
<210>97
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>97
Ile Ser Phe Pro Glu Gly Leu Pro Phe Lys
1 5 10
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>98
Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys
1 5 10
<210>99
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>99
Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu
1 5 10 15
Lys
<210>100
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>100
Ile Ser Asn Glu Ile Lys
1 5
<210>101
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>101
Phe Thr Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser Ile Leu Lys
1 5 10
<210>102
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>102
Ile Ser Asn Lys
1
<210>103
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>103
Tyr His Thr Lys
1
<210>104
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>104
Gly Asp His Glu Val Lys
1 5
<210>105
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>105
Ala Glu Gln Val Lys
1 5
<210>106
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>106
Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu Arg
1 5
<210>107
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽消化片断(peptide digest fragment)
<400>107
Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
1 5 10
<210>108
<211>129
<212>PRT
<213>屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<400>108
Ser Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly
100 105 110
Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
<210>109
<211>129
<212>PRT
<213>屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<400>109
Ser Glu Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly
100 105 110
Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
<210>110
<211>145
<212>PRT
<213>屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<400>110
Met Tyr Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Ala Arg
1 5 10 15
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val
20 25 30
Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
35 40 45
Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr Lys
50 55 60
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp
65 70 75 80
Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu
85 90 95
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
100 105 110
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly
115 120 125
Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg
130 135 140
Asp
145
<210>111
<211>146
<212>PRT
<213>屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<400>111
Met Met Tyr Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Arg Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys
20 25 30
Val Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg
35 40 45
Gly Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val
65 70 75 80
Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro
85 90 95
Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro
100 105 110
Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met
115 120 125
Gly Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile
130 135 140
Arg Asp
145
<210>112
<211>141
<212>PRT
<213>害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)
<400>112
Met Met Lys Phe Ile Ala Leu Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Gly Lys Met Thr Phe Lys Asp Cys Gly His Gly Glu Val Thr Glu Leu
20 25 30
Asp Ile Thr Gly Cys Ser Gly Asp Thr Cys Val Ile His Arg Gly Glu
35 40 45
Lys Met Thr Leu Glu Ala Lys Phe Ala Ala Asn Gln Asp Thr Ala Lys
50 55 60
Val Thr Ile Lys Val Leu Ala Lys Val Ala Gly Thr Thr Ile Gln Val
65 70 75 80
Pro Gly Leu Glu Thr Asp Gly Cys Lys Phe Ile Lys Cys Pro Val Lys
85 90 95
Lys Gly Glu Ala Leu Asp Phe Ile Tyr Ser Gly Thr Ile Pro Ala Ile
100 105 110
Thr Pro Lys Val Lys Ala Asp Val Thr Ala Glu Leu Ile Gly Asp His
115 120 125
Gly Val Met Ala Cys Gly Thr Val His Gly Val Gln Glu
130 135 140
<210>113
<211>98
<212>PRT
<213>害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)
<400>113
Ile His Arg Gly Glu Lys Met Thr Leu Glu Ala Lys Phe Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gln Asp Thr Ala Lys Val Thr Ile Lys Val Leu Ala Lys Val Ala Gly
20 25 30
Thr Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Glu Thr Asp Gly Cys Lys Phe Ile
35 40 45
Lys Cys Pro Val Lys Lys Gly Glu Ala Leu Asp Phe Ile Tyr Ser Gly
50 55 60
Thr Ile Pro Ala Ile Thr Pro Lys Val Lys Ala Asp Val Thr Ala Glu
65 70 75 80
Leu Ile Gly Asp His Gly Val Met Ala Cys Gly Thr Val His Gly Gln
85 90 95
Val Glu
<210>114
<211>141
<212>PRT
<213>害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)
<400>114
Met Met Lys Phe Ile Ala Leu Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Gly Lys Met Thr Phe Lys Asp Cys Gly His Gly Glu Val Thr Glu Leu
20 25 30
Asp Ile Thr Gly Cys Ser Gly Asp Thr Cys Val Ile His Arg Gly Glu
35 40 45
Lys Met Thr Leu Glu Ala Lys Phe Ala Ala Asn Gln Asp Thr Ala Lys
50 55 60
Val Thr Ile Lys Val Leu Ala Lys Val Ala Gly Thr Thr Ile Gln Val
65 70 75 80
Pro Gly Leu Glu Thr Asp Gly Cys Lys Phe Ile Lys Cys Pro Val Lys
85 90 95
Lys Gly Glu Ala Leu Asp Phe Ile Tyr Ser Gly Thr Ile Pro Ala Ile
100 105 110
Thr Pro Lys Val Lys Ala Asp Val Thr Ala Glu Leu Ile Gly Asp His
115 120 125
Gly Val Met Ala Cys Gly Thr Val His Gly Gln Val Glu
130 135 140
<210>115
<211>141
<212>PRT
<213>害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)
<400>115
Met Met Lys Phe Ile Ala Leu Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Gly Lys Met Thr Phe Lys Asp Cys Gly His Gly Glu Val Thr Glu Leu
20 25 30
Asp Ile Thr Gly Cys Ser Gly Asp Thr Cys Val Ile His Arg Gly Glu
35 40 45
Lys Met Thr Leu Glu Ala Lys Phe Ala Ala Asn Gln Asp Thr Ala Lys
50 55 60
Val Thr Ile Lys Val Leu Thr Lys Val Ala Gly Thr Thr Ile Gln Val
65 70 75 80
Pro Gly Leu Glu Thr Asp Gly Cys Lys Phe Ile Lys Cys Pro Val Lys
85 90 95
Lys Gly Glu Ala Leu Asp Phe Ile Tyr Ser Gly Thr Ile Pro Ala Ile
100 105 110
Thr Pro Lys Val Lys Ala Asp Val Thr Ala Glu Leu Ile Gly Asp His
115 120 125
Gly Val Met Ala Cys Gly Thr Val His Gly Gln Val Glu
130 135 140
<210>116
<211>141
<212>PRT
<213>害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)
<400>116
Met Met Lys Phe Ile Ala Leu Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Gly Lys Met Thr Phe Lys Asp Cys Gly His Gly Glu Val Thr Glu Leu
20 25 30
Asp Ile Ser Gly Cys Ser Gly Asp Thr Cys Val Ile His Arg Gly Gln
35 40 45
Lys Met Thr Leu Asp Ala Lys Phe Ala Ala Asn Gln Asp Thr Asn Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Gly Leu Glu Thr Asp Gly Cys Lys Val Leu Lys Cys Pro Ile Lys
85 90 95
Lys Gly Glu Ala Leu Asp Phe Asn Tyr Gly Met Thr Ile Pro Ala Ile
100 105 110
Thr Pro Lys Ile Lys Ala Asp Val Thr Ala Glu Leu Val Gly Asp His
115 120 125
Gly Val Met Ala Cys Gly Thr Ile His Gly Val Gln Glu
130 135 140
<210>117
<211>141
<212>PRT
<213>害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)
<400>117
Met Met Lys Phe Ile Ala Leu Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Gly Lys Met Thr Phe Lys Asp Cys Gly His Gly Glu Val Thr Glu Leu
20 25 30
Asp Ile Ser Gly Cys Ser Gly Asp Thr Cys Val Ile His Arg Gly Gln
35 40 45
Lys Met Thr Leu Asp Ala Lys Phe Ala Ala Asn Gln Asp Thr Asn Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Gly Leu Glu Thr Asp Gly Cys Lys Val Leu Lys Cys Pro Ile Lys
85 90 95
Lys Gly Glu Ala Leu Asp Phe Asn Tyr Gly Met Thr Ile Pro Ala Ile
100 105 110
Thr Pro Lys Ile Lys Ala Asp Val Thr Ala Glu Leu Val Gly Asp His
115 120 125
Gly Val Met Ala Cys Gly Thr Ile His Gly Gln Val Glu
130 135 140
<210>118
<211>141
<212>PRT
<213>害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)
<400>118
Met Met Lys Phe Ile Ala Leu Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Gly Lys Met Thr Phe Lys Asp Cys Gly His Gly Glu Val Thr Glu Leu
20 25 30
Asp Ile Ser Gly Cys Ser Gly Asp Thr Cys Val Ile His Arg Gly Gln
35 40 45
Lys Met Thr Leu Asp Ala Lys Phe Ala Ala Asn Gln Asp Thr Asn Lys
50 55 60
Val Thr Ile Lys Val Leu Ala Lys Val Ala Gly Thr Thr Ile Gln Val
65 70 75 80
Pro Gly Leu Glu Thr Asp Gly Cys Lys Val Leu Lys Cys Pro Ile Lys
85 90 95
Lys Gly Glu Ala Leu Asp Phe Asn Tyr Gly Met Thr Ile Pro Ala Ile
100 105 110
Thr Pro Lys Ile Lys Val Asp Val Thr Ala Glu Leu Val Gly Asp His
115 120 125
Gly Val Met Ala Cys Gly Thr Ile His Gly Gln Val Glu
130 135 140
<210>119
<211>125
<212>PRT
<213>家食甜螨(Glycyphagus domesticus)
<400>119
Gly Lys Met Lys Phe Lys Asp Cys Gly Lys Gly Glu Val Thr Glu Leu
1 5 10 15
Asp Ile Thr Asp Cys Ser Gly Asp Phe Cys Val Ile His Arg Gly Lys
20 25 30
Pro Leu Thr Leu Glu Ala Lys Phe Ala Ala Asn Gln Asp Thr Thr Lys
35 40 45
Ala Thr Ile Lys Val Leu Ala Lys Val Ala Gly Thr Pro Ile Gln Val
50 55 60
Pro Gly Leu Glu Thr Asp Gly Cys Lys Phe Val Lys Cys Pro Ile Lys
65 70 75 80
Lys Gly Asp Pro Ile Asp Phe Lys Tyr Thr Thr Thr Val Pro Ala Ile
85 90 95
Leu Pro Lys Val Lys Ala Glu Val Thr Ala Glu Leu Val Gly Asp His
100 105 110
Gly Val Leu Ala Cys Gly Arg Phe Gly Arg Gln Val Glu
115 120 125
<210>120
<211>128
<212>PRT
<213>家食甜螨(Glycyphagus domesticus)
<400>120
Gly Lys Met Asn Phe Thr Asp Cys Gly His Asn Glu Ile Lys Glu Leu
1 5 10 15
Ser Val Ser Asn Cys Thr Gly Asn Tyr Cys Val Ile His Arg Gly Lys
20 25 30
Pro Leu Thr Leu Asp Ala Lys Phe Asp Ala Asn Gln Asp Thr Ala Ser
35 40 45
Val Gly Leu Val Leu Thr Ala Ile Ile Asp Gly Asp Ile Ala Ile Asp
50 55 60
Ile Pro Gly Leu Glu Thr Asn Ala Cys Lys Leu Met Lys Cys Pro Ile
65 70 75 80
Arg Lys Gly Glu His Gln Glu Leu Ile Tyr Asn Ile Gly Glu Ile Pro
85 90 95
Asp Ala Thr Pro Glu Ile Lys Ala Lys Val Lys Ala Gln Leu Ile Gly
100 105 110
Glu His Gly Val Leu Ala Cys Gly Trp Val Asp Gly Glu Val Gln Glu
115 120 125
<210>121
<211>143
<212>PRT
<213>绵羊痒螨(Psoroptes ovis)
<400>121
Met Met Lys Thr Leu Val Val Leu Ala Ile Thr Leu Ala Val Val Ser
1 5 10 15
Ala Gly Lys Val Lys Phe Gln Asp Cys Gly Lys Gly Glu Val Glu Ser
20 25 30
Leu Glu Val Glu Gly Cys Ser Gly Asp Tyr Cys Val Ile His Lys Gly
35 40 45
Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ile Ser Val Thr Ser Asn Gln Asp Ser Ala
50 55 60
Asn Leu Lys Leu Asp Ile Val Ala Asp Ile Asn Gly Val Gln Ile Glu
65 70 75 80
Val Pro Gly Val Asp His Asp Gly Cys His Tyr Val Lys Cys Pro Ile
85 90 95
Lys Lys Gly Gln His Phe Asp Val Lys Tyr Thr Tyr Ser Ile Pro Ala
100 105 110
Ile Leu Pro Thr Thr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Lys Ile Ile Gly Asp
115 120 125
Lys Gly Leu Gly Gly Cys Ile Val Ile Asn Gly Glu Ile Gln Asp
130 135 140
<210>122
<211>141
<212>PRT
<213>腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)
<400>122
Met Lys Phe Leu Ile Leu Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gln Val Lys Phe Thr Asp Cys Gly Lys Lys Glu Ile Ala Ser Val Ala
20 25 30
Val Asp Gly Cys Glu Gly Asp Leu Cys Val Ile His Lys Ser Lys Pro
35 40 45
Val His Val Ile Ala Glu Phe Thr Ala Asn Gln Asp Thr Cys Lys Ile
50 55 60
Glu Val Lys Val Thr Gly Gln Leu Asn Gly Leu Glu Val Pro Ile Pro
65 70 75 80
Gly Ile Glu Thr Asp Gly Cys Lys Val Leu Lys Cys Pro Leu Lys Lys
85 90 95
Gly Thr Lys Tyr Thr Met Asn Tyr Ser Val Asn Val Pro Ser Val Val
100 105 110
Pro Asn Ile Lys Thr Val Val Lys Leu Leu Ala Thr Gly Glu His Gly
115 120 125
Val Leu Ala Cys Gly Ala Val Asn Thr Asp Val Lys Pro
130 135 140
<210>123
<211>135
<212>PRT
<213>梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)
<400>123
Val Ala Ala Val Ala Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn
1 5 10 15
His Glu Ile Lys Lys Val Met Val Pro Gly Cys Lys Gly Ser Glu Pro
20 25 30
Cys Val Ile His Arg Gly Thr Ala Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Asp
35 40 45
Ala Asn Gln Asn Ser Asn Ala Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Thr Ile
50 55 60
Asp Gly Val Glu Ile Asp Val Pro Gly Ile Asp Asn Asn Leu Cys His
65 70 75 80
Phe Met Lys Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Glu Tyr Asp Ile Lys Tyr
85 90 95
Thr Trp Asn Val Pro Arg Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val
100 105 110
Thr Val Lys Leu Leu Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala
115 120 125
Thr His Ala Lys Ile Arg Asp
130 135
<210>124
<211>146
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>124
Met Ile Ser Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val
1 5 10 15
Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys
20 25 30
Val Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg
35 40 45
Gly Lys Pro Phe Asn Leu Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Asn Ile Asp Gly Leu Glu Val
65 70 75 80
Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys Cys Pro
85 90 95
Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro
100 105 110
Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val
115 120 125
Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile
130 135 140
Arg Asp
145
<210>125
<211>146
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>125
Met Ile Ser Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val
1 5 10 15
Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys
20 25 30
Val Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg
35 40 45
Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Asn Ile Asp Gly Leu Glu Val
65 70 75 80
Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys Cys Pro
85 90 95
Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro
100 105 110
Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val
115 120 125
Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile
130 135 140
Arg Asp
145
<210>126
<211>146
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>126
Met Ile Ser Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val
1 5 10 15
Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys
20 25 30
Val Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg
35 40 45
Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Asn Ile Asn Gly Leu Glu Val
65 70 75 80
Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys Cys Pro
85 90 95
Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro
100 105 110
Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile
115 120 125
Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile
130 135 140
Arg Asp
145
<210>127
<211>129
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>127
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Val Lys Cys Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile Gly
100 105 110
Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
<210>128
<211>142
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>128
Gly Thr Met Val Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val Ala Asp Gln Val
1 5 10 15
Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val Met Val Asp
20 25 30
Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe
35 40 45
Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys
50 55 60
Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp Val Pro Gly
65 70 75 80
Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Val Lys Cys Pro Leu Val Lys Gly
85 90 95
Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro
100 105 110
Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile Gly Asp Asn Gly
115 120 125
Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg Asp
130 135 140
<210>129
<211>138
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>129
Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp
1 5 10 15
Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val Met Val Asp Gly Cys His Gly
20 25 30
Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala
35 40 45
Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys
50 55 60
Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn
65 70 75 80
Ala Cys His Phe Val Lys Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp
85 90 95
Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn
100 105 110
Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys
115 120 125
Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg Asp
130 135
<210>130
<211>129
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>130
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile Gly
100 105 110
Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
<210>131
<211>146
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>131
Met Ile Ser Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val
1 5 10 15
Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys
20 25 30
Val Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg
35 40 45
Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile
65 70 75 80
Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro
85 90 95
Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro
100 105 110
Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile
115 120 125
Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile
130 135 140
Arg Asp
145
<210>132
<211>146
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>132
Met Ile Ser Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val
1 5 10 15
Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys
20 25 30
Val Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg
35 40 45
Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile
65 70 75 80
Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro
85 90 95
Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asp Val Pro
100 105 110
Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val
115 120 125
Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile
130 135 140
Arg Asp
145
<210>133
<211>138
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>133
Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Val Ala Asp Gln Val Asp Val Lys Asp
1 5 10 15
Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val Met Val Asp Gly Cys His Gly
20 25 30
Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala
35 40 45
Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys
50 55 60
Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn
65 70 75 80
Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp
85 90 95
Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn
100 105 110
Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys
115 120 125
Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg Asp
130 135
<210>134
<211>129
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>134
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly
100 105 110
Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
<210>135
<211>129
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>135
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Thr Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly
100 105 110
Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
<210>136
<211>129
<212>PRT
<213>粉尘螨(Dermatophagoides farinae)
<400>136
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Glu Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Val Gly
100 105 110
Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
<210>137
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>137
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>138
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>138
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Ile Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Val Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Asn Phe Pro Glu Gly Phe Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Val Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Cys Val Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asn His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>139
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>139
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Ser Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Glu Gly Asp Asn Leu Ile Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Asn Phe Pro Glu Gly Phe Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Val Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Cys Val Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asn His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>140
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>140
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Ala Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Met Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Lys Leu Val Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Asn Phe Pro Glu Gly Phe Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Val Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Cys Val Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asn His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>141
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>141
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Ser Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Glu Gly Asp Thr Leu Ile Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Pro Glu Gly Ser Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Glu Arg Val Asp Glu Val Asp His Ala Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Ser Tyr Ser Met Ile Glu Gly Gly Ala Leu Gly Asp Thr Leu
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115 120 125
Met Lys Ala Glu His Met Lys Ala Ile Lys Glu Lys Gly Glu Ala Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>142
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>142
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Ser Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Glu Gly Asp Thr Leu Ile Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Pro Glu Gly Ser Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Glu Arg Val Asp Glu Val Asp His Ala Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Ser Tyr Ser Met Ile Glu Gly Gly Ala Leu Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Cys Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Met Lys Ala Glu His Met Lys Ala Ile Lys Glu Lys Gly Glu Ala Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>143
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>143
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Glu Gly Asp Thr Leu Ile Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Pro Glu Gly Ser Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Glu Arg Val Asp Glu Val Asp His Ala Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Ser Tyr Ser Met Ile Glu Gly Gly Ala Leu Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Cys Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Met Lys Ala Glu His Met Lys Ala Ile Lys Glu Lys Gly Glu Ala Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>144
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>144
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Ser Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Ile Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Pro Glu Gly Ser Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Glu Arg Val Asp Glu Val Asp His Ala Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Ser Tyr Ser Met Ile Glu Gly Gly Ala Leu Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Cys Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Met Lys Ala Glu His Met Lys Ala Ile Lys Glu Lys Gly Glu Ala Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>145
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>145
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Ala Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Ile Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Gly Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Val Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asn Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Ile Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>146
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>146
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Ile Glu Ala Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Val Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asn Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Ile Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210>147
<211>160
<212>PRT
<213>白桦(Betula pendula)
<400>147
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Ala Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Val Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asn Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Ile Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160

Claims (31)

1.一种方法，用于对变应原样品中变应原的异变应原的量或同源变应原的量加以定量，所述方法包括下述步骤：
a)以一种或多种酶消化所述变应原样品，以获得肽的混合物，以及可选地，用质量修饰官能对所述肽的混合物加以标记，
b)通过质谱，将合成的变应原校正标准肽的已知量与降解的变应原样品中的相应的肽的量关联起来，来对变应原的所述异变应原或所述同源变应原的绝对量加以定量，其中所述合成的变应原校正标准肽通过下列提供：
鉴定在所述异变应原之间或所述同源变应原之间同一的氨基酸序列；
制备由所述同一的氨基酸序列组成的所述合成的变应原校正标准肽；和
使用与步骤a)中使用的质量修饰官能不同的质量修饰官能标记所述合成的变应原校正标准肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中使用质量修饰官能标记获得的肽的混合物。
3.权利要求1的方法，其中，变应原的异变应原选自Phl p 1、Phlp 5、Phl p 6、Poa p 1、Poa p 5、Dac g 1、Fes p 1、Lol p 1、Lol p 5、Der f 1、Der f 2、Der p 1、Der p 2、Api m 1、Api m2、Ves v 1、Ves v 2、Ves v 5、Dol m 1、Dol m 2、Dol m 5、Dola 5、Pol a 1、Pol a 2、Pol a 5、Amb a 1、Amb a 2、Par j 1、Par o 1、Par m 1、Bet v 1、Cry j 1、Cry j 2、Per a 1、Ole e 1、Fel d 1、Can f 1、Can f 2、Equ c 1、Equ c 2、Art v 1、Art v2、Art v 3、Alt a 1、Alt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Clah 1、Cla h 2、Cla h 6、Sol i 2、Sol i 3和Sol i 4。
4.权利要求3的方法，其中，变应原的异变应原选自Phl p 1、Phl p 5、Phl p 6、Ole e 1、Der f 1、Der f 2、Der p 1、Der p2、Ves v 1、Ves v 2、Ves v 5、Amb a 1、Amb a 2、Par j 1、Paro 1、Par m 1、Bet v 1、Cry j 1和Cry j 2。
5.如权利要求3所述的方法，其中，变应原的异变应原选自Der f1、Der p 1、Der f 2和Der p 2。
6.如权利要求3所述的方法，其中，变应原的异变应原选自Phl p1、Phl p 5、Phl p 6、Poa p 1、Poa p 5、Dac g 1、Fes p 1、Lolp 1和Lol p 5。
7.如权利要求3所述的方法，其中，变应原的异变应原选自Amb a1和Amb a 2。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述标记是用ITRAQTM化学进行的。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述标记是用ITRAQ-114、ITRAQ 115、ITRAQ 116和/或ITRAQ 117进行的。
10.如权利要求1所述的方法，其中，(i)变应原的异变应原是Der f 2，并且所述合成的变应原校正标准肽由图2a的第32-48位氨基酸序列组成，或(ii)变应原的异变应原是Der p 2，并且所述合成的变应原校正标准肽由图2b的第32-48位氨基酸序列组成。
11.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中，通过用至少一种酶进行消化来降解所述变应原样品，以部分或全部降解所述样品。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述酶是蛋白水解酶。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述蛋白水解酶选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧基肽酶C或其组合构成的组。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述蛋白水解酶选自ArgC、LysC和胰蛋白酶或其组合构成的组。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述酶是胰蛋白酶。
16.如权利要求1所述的方法，其中，在进行质谱之前，对获自经消化的变应原样品的可选地经标记的肽混合物和所述合成的变应原校正标准肽进行分级分离，以将对应于所述合成的变应原校正标准肽的肽与所述混合物中的其它肽分开。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述分级分离通过色谱来进行。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述分级分离通过阳离子交换色谱或阳离子交换色谱之后接着进行反相色谱来进行。
19.如权利要求1所述的方法，其中，合成的变应原校正标准肽中氨基酸的数量在2-20个氨基酸的范围内。
20.一种方法，用于获得用于对变应原样品中的变应原的异变应原的量或同源变应原的量进行定量的变应原校正标准肽，其中，所述变应原校正标准肽是这样获得的：
鉴定在所述异变应原之间或所述同源变应原之间同一的氨基酸序列；和
制备由所述同一的氨基酸序列组成的合成的变应原校正标准肽。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述变应原校正标准肽用于对变应原样品中的变应原的异变应原的量进行定量。
22.下述合成的氨基酸序列作为变应原校正标准肽用于通过质谱对由变应原的多于一种异变应原或同源变应原组成的变应原进行绝对定量的用途，其中，所述氨基酸序列的序列与待定量的变应原的异变应原组或同源变应原组中发现的序列相同，其中所述变应原校正标准肽以质量修饰官能标记。
23.如权利要求22所述的用途，其中合成的氨基酸序列与变应原的异变应原组中发现的序列相同。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述合成的变应原校正标准肽中的氨基酸数目是4至15个氨基酸。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述合成的变应原校正标准肽中的氨基酸数目是6至10个氨基酸。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述变应原样品是变应原提取物。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述变应原样品是片剂或溶液形式的变应原疫苗。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述同源变应原是Amp 2和Ves v 2。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述同源变应原是Der f 2和Der p 2。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述变应原样品是牛奶。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述变应原样品是含有奶变应原的婴儿食品。
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