ES2347277T3 - Procedimiento de cuantificacion de alergenos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la cuantificación de la cantidad absoluta de alérgeno en una muestra de alérgeno, en el que el alérgeno consiste en más de un isoalérgeno o isoalérgenos de alérgeno o alérgenos homólogos que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una cantidad conocida de uno o más péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia a encontrar dentro del alérgeno a cuantificar mediante la identificación de una secuencia constante de aminoácidos dentro del alérgeno a cuantificar mediante la comparación de secuencias de aminoácidos de isoalérgenos o alérgenos homólogos y la preparación de un péptido patrón de calibración de alérgenos sintético que tiene esta secuencia constante y el marcaje de dicho péptido o péptidos patrones de calibración de alérgenos mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa, b) la degradación de la muestra de alérgeno para obtener una mezcla de péptidos y opcionalmente el marcaje de dichos péptidos con uno o más agente o agentes marcadores mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa, en la que si ambos péptidos en la muestra de alérgeno degradada y el péptido o los péptidos patrón de calibración de alérgenos se marcan, el agente o agentes marcadores usados para el marcaje del péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos son diferentes del agente o agentes marcadores usados para marcar los péptidos de la muestra de alérgeno degradada, c) la cuantificación de la cantidad absoluta de alérgeno mediante la correlación de la cantidad de péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno con la cantidad del péptido o péptidos correspondientes de la muestra de alérgeno degradado mediante espectrometría de masas.
Description
Procedimiento de cuantificación de
alérgenos.
La presente invención se refiere al campo de la
cuantificación de alérgenos.
Los alérgenos son moléculas antigénicas que
inducen respuestas alérgicas y la producción de anticuerpos IgE en
seres humanos. Se usan tanto para diagnóstico como para tratamiento
de alergias, es decir, inmunoterapia alérgena, esto último en forma
de vacunas alérgenas. Los materiales básicos alergénicos a los que
se exponen los seres humanos, tales como alimentos, pólenes o
partículas fecales de ácaros aparecen de forma natural como mezcla
o mezclas complejas de alérgenos mayores y menores. Los alérgenos
mayores son alérgenos a los que una mayoría de pacientes, que son
alérgicos a la fuente, reaccionan. Parece, sin embargo, que
cualquier proteína es un alérgeno potencial, puesto que todavía se
identifican más y más alérgenos menores a medida que aumenta el
conocimiento.
Debido a la complejidad de las fuentes
alérgenas, las secuencias de aminoácidos de varios alérgenos se
dedujeron primero a partir de secuencias de nucleótidos derivadas
de ADNc. La clonación de genes que codifican alérgenos reveló que
la mayoría de los alérgenos son heterogéneos y que aparecen como
mezclas de isoalérgenos y variantes. El alineamiento de secuencias
de aminoácidos de isoalérgenos y alérgenos homólogos demostró que
pueden identificarse mediante y/o dividirse en secuencias de región
constante y variable. Las secuencias de aminoácidos de región
constante son específicas de la especie, sin embargo las secuencias
de aminoácidos de región variable son específicas de cada uno de
los isoalérgenos.
La inmunoterapia y el diagnóstico específicos de
alérgenos convencionales se realizan actualmente mediante el uso de
extractos de alérgenos naturales normalizados que se formulan
adicionalmente en vacunas alérgenas. Estas vacunas acuosas se basan
en materiales básicos naturales alérgenos, tales como polen de
árboles y hierba, cultivos de ácaros del polvo y partículas de pelo
y escamas de piel animales. La composición de estos materiales
básicos naturales se sabe que varía considerablemente dependiendo
del tiempo y lugar de recogida de los materiales básicos alérgenos.
Las vacunas alérgenas comerciales pueden adicionalmente formularse
en mezclas de alérgenos usando diversas especies.
El conocimiento de la composición de los
extractos y el contenido de los alérgenos esenciales es un
prerrequisito para la reproducibilidad, seguridad y eficacia del
producto final. Un reto principal en la fabricación de vacunas
alérgenas es la normalización, es decir, asegurar una potencia
constante de un lote a otro. Puesto que la materia prima que se
produce de manera natural, la variación es considerable y necesita
controlarse mediante medidas de base científica. La composición del
extracto idealmente debería reflejar la composición de los
componentes solubles en agua del material básico alérgeno ya que se
extrae de la superficie de la mucosa de las vías respiratorias y se
presenta al sistema inmune humano. Todos los extractos, sin embargo,
contienen varios alérgenos que contribuyen a la unión de IgE total
en diferentes combinaciones para pacientes individuales.
Idealmente, por lo tanto, todos los componentes deben controlarse
tanto cualitativamente como cuantitativamente, pero con lo
tecnología actual esto no es prácticamente posible.
La normalización se realiza actualmente de
muchas formas diferentes, puesto que cada fabricante tiene
procedimientos de normalización específicos de la compañía. La
normalización se realiza mediante técnicas tales como
SDS-PAGE, isoelectroenfoque además de una
diversidad de técnicas inmunoelectroforéticas (QIE) y ELISA usando
anticuerpos mono- y/o policlonales y radio alergosorbentes (RAST) o
técnicas relacionadas. Una normalización de lote a lote óptima, tal
como el procedimiento de estandarización SQ, es esencialmente un
procedimiento de tres etapas: 1) asegurar una composición óptima y
relaciones constantes entre todos los componentes mediante técnicas
semicuantitativas inmunoelectroforéticas, 2) determinar los
componentes alérgenos principales mediante inmunoelectroforesis
cuantitativa, y 3) ajustar la potencia de unión a IgE global como se
determinó en ensayos con Magic Lite®. En Europa, toda la
normalización se realiza actualmente en relación con una preparación
de referencia específica de compañía de uso interno, mientras que
en Estados Unidos, la FDA emite patrones que deben usarse por todos
los fabricantes. Todos los aspectos cuantitativos de estas técnicas
usadas en la actualidad dependen de los anticuerpos como reactivos
y como tales son vulnerables al cambio a lo largo del tiempo.
La cuantificación absoluta de los componentes de
vacuna específicos en mezclas complejas de alérgenos no es sencilla
y no se ha establecido todavía como una técnica sensible, rutinaria
de alto rendimiento.
También en la industria alimentaria las técnicas
rutinarias de alto rendimiento para la cuantificación y detección
fiable de alérgenos alimentarios es necesaria. Pueden encontrarse
frutos secos como una parte oculta de un alimento debido a
contaminación cruzada accidental durante la fabricación. Las
compañías que producen alimentos similares con y sin por ejemplo
frutos secos pueden tener dificultades en la limpieza del
equipamiento de producción entre las fabricaciones de los
diferentes tipos de alimentos. Pueden permanecer trazas de alimentos
previamente producidos tales como frutos secos en el equipamiento.
Los primeros lotes de alimentos fabricados sin frutos secos que
pasan a través del mismo equipo contendrán probablemente trazas de
frutos secos. Los alimentos que pueden causar reacción alérgica
debido a contaminación cruzada de frutos secos o cacahuetes son por
ejemplo chocolate, caramelos, galletas, postres, dulces, rosquillas,
cereales, batidos, barras de granola, muesli, tartas, magdalenas,
helado, salsa barbacoa. La leche de vaca puede causar una reacción
alérgica a pequeñas cantidades de proteína láctea de productos
lácteos, a partir de leche de vaca, fórmula basada en leche de vaca
o alimentos infantiles que contienen proteína láctea. Para evitar la
contaminación de proteína láctea durante la producción de alimentos
infantiles o fórmula infantil a niños alérgicos a la leche se
necesita por lo tanto un procedimiento de detección y
cuantificación de alérgenos lácteos. Son necesarios procedimientos
de detección y cuantificación fiables para alérgenos alimentarios
con el fin de asegurar el cumplimiento del etiquetado alimentario y
mejorar la protección del consumidor. Se han descrito procedimientos
fisicoquímicos por ejemplo espectrometría de masas, así como
procedimientos inmunológicos. Los criterios usuales de sensibilidad,
especificidad, reproducibilidad, precisión y exactitud deben
cumplirse. Aun así, los problemas de reactividad cruzada persisten,
de efectos matriz y de procesamiento de alimentos. La actividad
biológica puede permanecer cuando la proteína se ha
desnaturalizado.
La espectrometría de masas biológica (EM) se
empleó por primera vez para evaluar el peso molecular y la identidad
de proteínas y péptidos. En los últimos años, los avances en la
espectrometría de masas han dado como resultado técnicas que pueden
usarse para la cuantificación de una diversidad de biomoléculas a
partir de mezclas complejas tales como muestras plasmáticas,
celulares y tisulares. Las técnicas de cuantificación anteriores han
establecido solamente la cuantificación relativa de proteínas
mientras que las técnicas más recientes evalúan las cantidades
absolutas de moléculas de interés. El rápido desarrollo de las
técnicas de cuantificación se debe principalmente al progreso en el
campo de la proteómica, particularmente en aplicaciones que
distinguen, por ejemplo, estados sanos y enfermos y la
identificación de moléculas marcadoras para diversas enfermedades
tales como cáncer, artritis reumatoide y enfermedad de Alzheimer.
La principal ventaja de estas técnicas de cuantificación mediante
EM es la alta sensibilidad de las técnicas que varía desde 300 amol
a 300 fmol de las muestras.
El documento WO 2004/070352 desvela un
procedimiento para la cuantificación de péptidos en relación con un
patrón interno que usa reactivos de marcaje isobárico o conjuntos de
reactivos de marcaje isobárico.
El documento US 6.872.575 desvela un
procedimiento para la identificación de una o más proteínas en
mezclas de muestras complejas sin purificar la proteína y obtener
su identificación peptídica compuesta.
El documento US 6.864.089 desvela un
procedimiento para la cuantificación que usa marcaje isotópico
diferencial de muestras peptídicas o proteínicas.
Otros procedimientos para la cuantificación de
las proteínas que usan técnicas de EM son por ejemplo la técnica
AQUA que usa péptidos de calibración interna sintetizados con
isótopos estables incorporados (^{13}C, ^{15}N) para imitar
péptidos nativos formados mediante digestión enzimática usando por
ejemplo, tripsina (Stemmann O y col. Cell 2001;
107(6):715-26, GerberSA y col. Proc Natl Acad
Sci U S A 2003;100(12):6940-5).
Otro procedimiento es el procedimiento de ICPL
(Marcaje de Proteínas Codificado por Isótopos) descrito por
Kellermann y col., Proteomics 5, 4-15, que usa por
ejemplo ^{12}C/^{13}C_{6} -ácido
Nicotínico-succinimida como marcador ICPL.
La espectrometría de masas se introdujo por
primera vez en el campo de la investigación de la alergia para
caracterizar alérgenos naturales que incluyen modificaciones después
de la traducción tales como patrones de glucosilación. Se empleó
adicionalmente para caracterizar isoalérgenos recombinantes y/o
variantes muchas de las cuales se han expresado en diversos
sistemas de expresión tales como los sistemas de expresión de
Escherichia coli, Pichia pastoris y Baculovirus.
Helsper y col., J Allergy Clin Immunol, Vol.
110, Nº 1 (2002), páginas 131-138 describe el uso de
EM para estudiar la expresión real de isoformas alergénicas
identificadas mediante clonación por PCR y en Swoboda y col., J.
Biol Chem, Vol 270, Nº 6 (1995), páginas 2607-2613,
se usa cromatografía líquida, EM y clonación de ADNc para analizar
isoformas del alérgeno principal de polen de abedul, Bet v 1.
En Kristiansson y col., RAPID COMMUNICATIONS IN
MASS SPECTROMETRY, Vol. 18, Nº 14 (2004), páginas
1592-1598, se usa la espectrometría de masas para
medir la cantidad de péptidos trípticos aducidos a HHPA de albúmina
de suero humano en un lavado nasal.
Ninguna de estas referencias describe la
espectrometría de masas para cuantificar un grupo de isoformas de
alérgenos o alérgenos homólogos en una muestra y ninguna de estas
referencias describe el uso de péptidos patrón de calibración que
tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia
constante de aminoácidos que se encuentra en el grupo de alérgenos
a cuantificar.
En consecuencia, existe la necesidad de un
procedimiento sensible mediante el que los componentes activos
tales como alérgenos de la misma especie o diferentes especies y/o
isoalérgenos por ejemplo en una vacuna puedan cuantificarse. Un
procedimiento que usa técnicas de EM y las secuencias de aminoácidos
específicas de alérgeno y específicas de especie proporciona un
procedimiento muy sensible mediante el cual el contenido de los
grupos de alérgenos (isoalérgenos o alérgenos homólogos) puede
cuantificarse. El procedimiento de acuerdo con la invención es útil
por ejemplo en un ensayo de liberación para asegurar una cantidad
segura y precisa de alérgeno durante la producción de una vacuna,
en el producto final y también durante las diferentes etapas de
almacenamiento de principios activos y/o productos. El procedimiento
también sería beneficioso en el desarrollo de vacunas alérgenas de
segunda generación por ejemplo usando alérgenos recombinantes como
principios activos. Dicho procedimiento haría posible la
optimización de los principios activos en vacunas alérgenas de
segunda generación basándose en el conocimiento y/o composición de
las vacunas actuales.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un procedimiento para la cuantificación absoluta de
alérgenos a partir de una pluralidad de fuentes.
De acuerdo con un aspecto la invención
proporciona un procedimiento para la cuantificación de la cantidad
absoluta de alérgeno de una muestra de alérgeno en la que el
alérgeno está constituido por más de un isoalérgeno o isoalérgenos
o alérgeno o alérgenos homólogos que comprenden las siguientes
etapas:
- a)
- proporcionar una cantidad conocida de uno o más péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos que tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia que se encontrará dentro del alérgeno y que se cuantificará mediante la identificación de una secuencia constante de aminoácidos dentro del alérgeno a cuantificar mediante comparación de secuencias de aminoácidos de isoalérgenos o alérgenos homólogos y preparar un péptido patrón de calibración de alérgeno sintético que tiene esta secuencia constante y el marcaje de dicho péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno mediante la introducción de funcionalidades modificadoras de masa,
- b)
- la degradación de la muestra de alérgeno para obtener una mezcla de péptidos y opcionalmente el marcaje de dichos péptidos con uno o más agente o agentes marcadores mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa en la que si tanto los péptidos de la muestra de alérgeno degradada como el péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos están marcados, el agente o agentes marcadores usados para el marcaje del péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos son diferentes del agente o agentes marcadores usados para el marcaje de los péptidos de muestra del alérgeno degradado simple,
- c)
- la cuantificación de la cantidad absoluta de alérgeno mediante la correlación de la cantidad de péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos con la cantidad del péptido o péptidos correspondientes de la muestra de alérgeno degradado mediante espectrometría de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización de la invención el alérgeno a
cuantificar consiste de más de un isoalérgeno, por ejemplo,
miembros de un grupo de alérgenos de la misma especie con más del
\rangle 67% de identidad de secuencia de aminoácidos.
En otra realización de la invención el alérgeno
a cuantificar consiste en más de un alérgeno homologo.
De acuerdo con la invención, el uso de una
secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia que va a
encontrarse en los isoalérgenos o alérgeno o alérgenos homólogos a
cuantificar se proporciona como un péptido patrón de calibración de
alérgenos para cuantificación absoluta del alérgeno o alérgenos y
opcionalmente su identificación. Preferentemente, la degradación de
la etapa b) da como resultado una mezcla de péptidos en la que uno
de los péptidos comprende la misma secuencia de aminoácidos que el
péptido patrón de calibración de alérgeno.
De acuerdo con la invención, se proporciona un
procedimiento para obtener un péptido patrón de calibración de
alérgeno para su uso en la cuantificación de isoalérgenos o
alérgenos homólogos en el que el péptido patrón de calibración de
alérgeno se obtiene mediante:
La identificación de una secuencia de
aminoácidos que es constante en los isoalérgenos o alérgenos
homólogos que se van a cuantificar, mediante la comparación de las
secuencias de los isoalérgenos o alérgenos homólogos y la
preparación de un péptido patrón de calibración de alérgeno
sintético que tiene esta secuencia constante.
Fig. 1. Alineamiento de secuencia de aminoácidos
de especie de alérgenos del grupo 2 de ácaros (fig 1a) y Bet v 1
(fig 1b), el principal alérgeno de abedul mediante el software
Vector NTI (Invitrogen). Las secuencias de aminoácidos putativas
que pueden evaluarse como péptidos patrón de calibración interna
(útiles para cuantificación de isoalérgenos) se destacan en
negrita.
Fig. 2. Escisión enzimática teórica mediante
tripsina de alérgenos de los ácaros del polvo domésticos, a) Der f
2 y b) Der p 2; c) Phl p 1, d) Phlp 5a e) Phl p 5b y f) Bet v 1
(GPMAW, Lighthouse data). Los péptidos específicos de especies
seleccionados para los ensayos de cuantificación se destacan con
negrita y color gris.
Fig. 3. a) Análisis de identificación por EM
MALDI-TOF de una mezcla de Der f 2 y Der p 2 (1:1)
naturales purificados y digeridos con tripsina y b) análisis de
identificación por EM MALDI-TOF de una mezcla de
Derf 2 y Derp 2 (1:1) recombinantes purificados y digeridos con
tripsina.
Fig. 4. Análisis SDS-PAGE del
extracto de alérgeno del APD (Ácaro del Polvo Doméstico) separado
mediante el uso de cromatografía de interacción hidrófoba. Las
fracciones de proteínas de APD se dividieron en dos conjuntos de
proteínas principales (I y II) y se sometieron adicionalmente a
análisis de cuantificación.
Fig. 5. Una estrategia para el marcaje de
muestras cuando se emplea la química ITRAQ^{TM} (Applied
Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) en la cuantificación
de alérgenos.
Fig. 6. Los análisis EM de a) Péptido 1, m/z
2353,44 (Der p 2, 32-48) b) Péptido 2, m/z 2326,35
(Der f 2, 32-48) c) Péptidos nDer p 2 marcados con
iTRAQ y digeridos con tripsina y d) péptidos nDer f 2 marcados con
iTRAQ.
Fig. 7. Fragmentación por EM/EM de la mezcla de
nDerf 2, nDer p 2, Péptido 1 y Péptido 2. La cantidad de
isoalérgenos nDer p 2 (114,10) y Der f 2 (115,10), en la mezcla de
muestra se calculó como la relación del área de señal de m/z 114 al
área de m/z 116 (Péptido 1) y como la relación del área de m/z 115
al área de m/z 117 (Péptido 2).
Fig. 8. El análisis de fase invertida de la
mezcla de nDer f 2, nDer p 2, Péptido 1 y Péptido 2 de la
cromatografía SCX. Se usaron análisis EM y EM/EM para identificar
los picos localizados en la Diana MALDI-TOF.
Fig. 9. Análisis EM de la mezcla de nBet v 1
digerida con tripsina y el patrón de calibración interno (péptido
AQUA). La diferencia de masa de 6 Da entre el péptido nativo y el
patrón de calibración se demuestra en la esquina superior de la
figura.
En el presente contexto, el término
"alérgeno" se refiere a cualquier proteína que se produce de
manera natural, una proteína modificada, una proteína recombinante,
una proteína mutante recombinante o cualquier fragmento proteico de
las mismas o mezclas de proteínas que se ha notificado que inducen
reacciones alérgicas, es decir, mediadas por IgE tras su exposición
repetida a un individuo.
Los ejemplos de alérgenos que se producen de
manera natural incluyen alérgenos de polen (alérgenos del polen de
árboles, malas hierbas, hierbas y céspedes), alérgenos de ácaros (de
por ejemplo, ácaros del polvo domésticos y ácaros de almacén),
alérgenos de insectos (alérgenos originarios de veneno, saliva e
inhalantes), alérgenos animales de por ejemplo saliva, pelo y
escamas de la piel de por ejemplo perro, gato, caballo, rata, ratón,
etc., alérgenos fúngicos y alérgenos alimentarios.
Los alérgenos de polen de árboles, céspedes e
hierbas importantes son tales que se originan de los ordenes
taxonómicos de Fagales, Oleales, Pinales y platanáceas incluyendo
entre otros abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano
(Corylus), carpe (Carpinus), olivo (Olea),
cedro (Cryptomeria y Juniperus), plátano
(Platanus), el orden de Poales que incluye entre otros
las hierbas de los géneros Lolium, Phleum,
Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus,
Phalaris, Secale y Sorghum y los ordenes de
Asterales y Urticales incluyendo entre otros las
hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y
Parletaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son
los de los ácaros del polvo domésticos del género
Dermatophagoides y Euroglyphus, el ácaro de almacén
por ejemplo Lepidoglyphys, Glycyphagus y
Tyrophagus, los de cucarachas, mosquitos y pulgas por
ejemplo Blatella, Periplaneta, Chironomus y
Ctenocepphalides y de aquellos de mamíferos tales como gato,
perro y caballo, alérgenos de venenos incluyendo los que se originan
de insectos que pican o muerden tales como los del orden taxonómico
de los himenópteros incluyendo abejas (superfamilia Apidae),
avispas (superfamilia Vespidea) y hormigas (superfamilia
Formicoidae). Son alérgenas de inhalación importantes de los
hongos entre otros los que se originan de los géneros
Alternaria, Cladosporium, Aspergillus y
Penicillium.
Los ejemplos de alérgenos alimentarios son
alérgenos de trigo (por ejemplo Tri a 18-19),
crustáceos comestibles incluyendo camarón (por ejemplo Met e 1, Pen
a 1, Pen l 1, Pen m 1 y Pen m 2), gamba, cangrejo y langosta,
pescado (por ejemplo Gad c 1 y Sal s 1), huevos de gallina (por
ejemplo Gal d 1, Gal d 2), cacahuetes (por ejemplo Ara h
1-8), soja (Gly m 1-4), leche de
vaca (Bos d 4-8), frutos secos tales como almendra
(Pru du 4), nuez de Brasil (Ber e 1, Ber e 2), anacardo (Ana o
1-3), avellana (por ejemplo Cor a 1.04, Cor a 2, Cor
a 8) y nuez (por ejemplo Jug n 1-2, Jug r
1-3), apio (Api g 1, Api g 4, Api g 5), mostaza (Sin
a 1 y Bra j 1) y semilla de sésamo (conjuntos i
1-6), y en particular alérgenos de trigo (por
ejemplo Tri a 18-19), huevos de gallina (por
ejemplo Gal d 1, Gal d 2), cacahuete (por ejemplo Ara h
1-8), soja (Gly m 1-4) y leche de
vaca (Bos d 4-8).
Los ejemplos de alérgenos recombinantes incluyen
pero no se limitan a proteínas/péptidos de polen de planta, polen
de césped, polen de árbol, polen de malas hierbas, veneno de
insecto, proteínas de ácaro del polvo y de almacén, escama de la
piel de animales, saliva, esporas fúngicas y alérgenos alimentarios
(por ejemplo, cacahuete, leche, gluten y huevo) preparados usando
técnicas recombinantes. Los alérgenos recombinantes pueden
obtenerse por ejemplo a gran escala mediante el uso de sistemas de
expresión microbianos que pueden cultivarse en fermentadores,
producirse por técnicas de ADN recombinante o precursores químicos u
otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. En una
realización de la invención, el alérgeno es rBet v 1, rAin g 1,
rCor a 1, rCar b 1, rCry j 1, rCry j 2, rOle e 1, rAmb a 1, rArt v
1, rCyn d 1, rDac g 1, rLol p 1, rLol p 5, rPhl p 1, rPhl p 5, rPoa
p 1, rPoa p 5, rSor h 1, rDer f 1, rDer f 2, rDer p 1, rDer p 2,
rEur m 1, rEur m 2, rGly d 1, rLep d 2, rBIa g 1, rBIa g 2, rFel d
1, rCan f 1, rCan f 2, rBos d 2, rEqu c 1, rEqu c 2, rMus m 1,
rApis m 1, rApi m 2, rVes v 1, rVes v 2, rVes v 5, rDol m 1, rDol m
2, rDol m 5, rPol a 1, rPol a 2, rPol a 5, rAlt a 1 o rCIa h 1 (r
se refiere a recombinante).
Un alérgeno mutante recombinante difiere del
tipo silvestre en que los genes para los alérgenos se han modificado
mediante procedimientos de manipulación genética tales que los
polipéptidos que codifican muestran sustituciones, deleciones y/o
adiciones de varios aminoácidos o aminoácidos individuales en
comparación con el tipo silvestre. Los ejemplos de un alérgeno
mutante recombinante incluyen variantes de sustitución, variantes de
adición, oligómeros, fragmentos, variantes de deleción, moléculas
híbridas y otras variantes de alérgenos.
Los ejemplos de un alérgeno modificado incluyen
alérgenos, que en la forma que se produce de manera natural se
asocian con condiciones de enfermedad alérgica en sujetos sensibles,
en los que dicho alérgeno recombinante modificado se altera en
comparación con el alérgeno que se produce de manera natural. Se
incluyen variantes alérgenas que contienen unos pocos intercambios
de aminoácidos, mutantes alérgenos, oligómeros, fragmentos,
variantes de deleción, moléculas híbridas, alérgenos miristilados,
glucosilados, palmitoilados y fosforilados y otras variantes. El
alérgeno modificado puede producirse mediante cualquier
procedimiento adecuado tal como un procedimiento de mutagénesis
dirigida, un procedimiento de PCR, síntesis química y una mezcla de
estos procedimientos.
En una realización de la invención, el alérgeno
a cuantificar se selecciona de uno o más del grupo de Bet v 1, Aln
g 1, Cor a 1 y Car b 1, Que a 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1,
Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Ole e 1, Lig v 1, Syr v 1, Pla I 1, Pla
a 1, Pla a 2, Amb a 1, Amb a 2, Amb t 5, Art v 1, Art v 2, Art v 3,
Par j 1, Par j 2, Par j 3, Sal k 1, Ave e 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Dac g
1, Fes p 1, Hoi I 1, Lol p 1 y 5, Pha a 1, Pas n 1, Phl p 1, Phl p
2, Phl p 3, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1,
Sec c 5, Sor h 1, Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7, Der p 1, Der
p 2, Der p 3, Der p 7, Der m 1, Eur m 1, Eur m 2, Gly d 1, Gly d 2,
Lep d 1, Lep d 2, Bio t 1, Tyr p 2, Bla g 1, Bla g 2, Per a 1, Per a
3, Per a 7, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Can f 1, Can f 2,
Bos d 2, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Mus m 1, Rat n 1, Apis m 1, Apl
m 1, Apl m 2, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Ves f 5, Ves g 5, Ves m 1,
Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 5, Ves vi 5, Dol m 1, Dol m 2, Dol
m 5, Dol a 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Sol I 1, Sol i 2, Sol f 3 y
Sol i 4, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Cla h 1, Cla
h 2, Cla h 6 Asp f 1, Bos d 4, Mal d 1, Mal d 3, Gly m 1, Gly m 2,
Gly m 3, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5 o híbridos de
cualquiera de estos.
En otra realización de la invención, el alérgeno
a cuantificar es uno o más isoalérgenos seleccionados del grupo de
alérgenos del polen de césped tales como Phl p 1, Phl p 5, Phl p 6,
Poa p 1, Poa p 5, Dac g 1, Fes p 1, Lol p 1 y Lol p 5, alérgenos de
ácaros del polvo tales como Der f 1, Der f 2, Der p 1 y Der p 2,
alérgenos de venenos tales como Api m 1, Apl m 2, Ves v 1, Ves v 2,
Ves v 5, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Dol a 5, Pol a 1, Pol a 2 y Pol
a 5, alérgenos de malas hierbas tales como Amb a 1, Amb a 2, Par j
1, Par o 1 y Par m 1, alérgenos de abedul tal como Betv 1,
alérgenos de cedro japonés tales como Cry j 1 y Cry j i 2, alérgenos
de cucarachas tales como Per a 1, alérgenos de polen de olivos
tales como Ole e 1, alérgenos de gato tal como Fel d 1, alérgenos
de perro tal como Can f 1 y Can f 2, alérgenos de caballos tales
como Equ c 1 y Equ c 2, alérgenos de artemisa tales como Art v 1,
Art v 2, Art v 3, alérgenos de moho tales como Alt a 1, Alt a 3,
Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Cla h 1, Cla h 2 y Cla h 6 y alérgenos de
hormiga roja tales como Sol 2, Sol I 3 y Sol i 4.
En todavía otra realización de la invención, el
alérgeno a cuantificar es uno o más isoalérgenos seleccionados del
grupo de alérgenos del polen de hierba tales como Phl p 1, Phl p 5 y
Phl p 6, alérgenos del polen de olivo tal como Ole e 1, alérgenos
del ácaro del polvo tal como Der f 1, Der f 2, Der p 1 y Der p 2,
alérgenos de venenos tales como Ves v 1, Ves v 2 y Ves v 5,
alérgenos de malas hierbas tales como Amb a 1, Amb a 2, Par j 1,
Par o 1 y Par m 1 y alérgenos de árbol tales como Bet v 1, Cry j 1 y
Cry j 2.
En todavía otra realización el alérgeno a
cuantificar es uno o más isoalérgenos seleccionados del grupo
constituido por Der f 1, Der p 1, Der f 2 y Der p 2.
En todavía otra realización el alérgeno a
cuantificar es uno o más isoalérgenos seleccionados del grupo
constituido por Phl p 1, Phl p 5, Phl p 6, Poa p 1, Poa p 5, Dac g
1, Fes p 1, Lol p 1, Lol p 5.
En todavía otra realización el alérgeno a
cuantificar es uno o más isoalérgenos seleccionados del grupo
constituido por Amb a 1 y Amb a 2.
Un alérgeno de una especie única puede consistir
en varias moléculas muy similares. Esas moléculas similares se
denominan isoalérgenos cuando comparten las siguientes propiedades
bioquímicas comunes: a. tamaño molecular similar; b. función
biológica idéntica, si se conoce, por ejemplo acción enzimática; y
c. identidad > 67% de secuencias de aminoácidos. En el presente
contexto, los miembros de un grupo alérgeno que tienen una identidad
de secuencia de aminoácidos > 67% y son de la misma especie se
denominan isoalérgenos. Cada isoalérgeno puede tener múltiples
formas de secuencias muy similares con solamente unos pocos
aminoácidos de diferencia; éstas se denominan variantes y se
incluyen en el término "isoalérgeno" en el presente
contexto.
En el presente contexto la expresión
"alérgenos homólogos" se refiere a alérgenos de diferentes
especies, que se cree que comparten estructuras tridimensionales,
tamaño molecular similar, función biológica idéntica, si se conoce,
por ejemplo acción enzimática y pueden compartir epítopos
estructurales para anticuerpos de IgE. En una realización adicional
de acuerdo con la invención los alérgenos homólogos tienen una
identidad de secuencias de aminoácidos \rangle, 20% y comparten
una secuencia constante común de aminoácidos, preferentemente una
secuencia de al menos 2-20 aminoácidos, más
preferentemente de 4-15 y aún más preferentemente de
6-10.
\newpage
Como un ejemplo de alérgenos homólogos pueden
mencionarse por ejemplo Amp m 2 y Ves v 2, y Der f 2 y Der p 2.
En el presente contexto, la expresión
"extracto de alérgeno" se refiere a cualquier extracto obtenido
mediante extracción de un material básico de alérgeno biológico
como se describe generalmente en "Allergenic extracts", H.
Ipsen y col., capítulo 20 en Allergy, principle and practice (Ed. S.
Manning) 1993; Mosby-Year Book, S. Luis. Dicho
extracto puede obtenerse mediante extracción acuosa de material
soluble en agua seguida de etapas de purificación como filtración
para obtener la solución es decir el extracto. El extracto puede
entonces someterse a procesado y/o purificación adicional como
liofilización que retira sustancialmente todo el agua.
Generalmente, un extracto de alérgeno comprende una mezcla de
proteínas y otras moléculas. Las proteínas alérgenas se clasifican
con frecuencia como un alérgeno mayor o, un alérgeno intermedio, un
alérgeno menor o sin clasificación. Un extracto de alérgeno
generalmente comprende alérgenos tanto mayores como menores. Los
alérgenos mayores generalmente constituirán aproximadamente el
5-15% de un extracto de alérgeno corriente, con más
frecuencia aproximadamente el 10%. La clasificación de un alérgeno
se basa en una evaluación de la importancia clínica del alérgeno
particular y se da posteriormente. Los ejemplos de alérgenos mayores
importantes en un extracto incluyen los alérgenos de los grupos 1 y
5 y 6 de césped (por ejemplo Phl p 1, 5 y 6), los alérgenos de grupo
1 y 2 de ácaros del polvo (por ejemplo Der p 1, Der p 2), alérgeno
de polen de árbol 1 (Bet v 1), alérgeno de polen de cedro 1 y 2
(por ejemplo Cry j 1, Cry j 2), polen 1 y 2 de ambrosia (Amb a 1,
Amb a 2), alérgeno de gato 1 (es decir Fel d1).
La expresión "material básico de alérgeno
biológico" como se usa en el presente documento se refiere a
cualquier material biológico que comprende uno o más alérgenos. Son
ejemplos de dichos materiales los PMB (Cuerpo de Acaro Puro) o WMC
(Cultivo de Ácaro Completo) acáridos, pólenes desgrasados o no
desgrasados de por ejemplo céspedes, hierbas, malas hierbas y
árboles, pelo y escamas de piel animal, piel, micelios y esporas
fúngicos, cuerpos de insectos, veneno o saliva y alimentos.
Los materiales básicos de alérgenos biológicos
pueden comprender materiales contaminantes, tales como polen ajeno
y residuos de plantas y flores de un material básico de polen de
alérgenos. El máximo nivel de contaminación aceptado con polen de
otras especies es del 1%. También debería estar desprovisto de
residuos de flores y plantas, con un límite del 5% en peso.
La expresión "vacuna de alérgeno" como se
usa en el presente contexto comprende al menos un alérgeno que se
origina de la misma fuente alérgica o se origina de diferentes
fuentes alérgicas por ejemplo alérgenos del grupo 1 de césped y el
grupo 5 de césped o alérgenos del grupo 1 y grupo 2 de ácaros de
diferentes especies de ácaros y césped respectivamente, antígenos
de malas hierbas tales como alérgenos de ambrosía corta y gigante,
diferentes alérgenos de hongos tales como alternaria y
cladosporium, alérgenos de árboles tales como abedul,
avellano, carpe, roble y aliso, alérgenos alimentarios tales como
alérgenos de cacahuete, soja y leche.
La preparación de vacunas se conoce generalmente
bien en la técnica. Las vacunas se preparan típicamente como
inyectables bien como soluciones líquidas o suspensiones. Dicha
vacuna también puede emulsionarse o formularse de modo que permita
administración nasal así como oral, incluyendo administración bucal
y sublingual. El componente inmunógeno en cuestión puede mezclarse
adecuadamente con excipientes que son farmacéuticamente aceptables
y adicionalmente compatibles con el principio activo. Son ejemplos
de excipientes adecuados el agua, solución salina, dextrosa,
glicerol y similares así como combinaciones de los mismos. La vacuna
puede contener adicionalmente otras sustancias tales como agentes
humectantes, agentes emulsionantes, agentes tamponantes o adyuvantes
que mejoran la eficacia de la vacuna.
De acuerdo con un aspecto de la invención, un
procedimiento para la cuantificación de la cantidad absoluta de
alérgeno en una muestra de alérgeno en la que el alérgeno consiste
en más de un isoalérgeno o isoalérgenos o alérgeno o alérgenos
homólogos comprende las siguiente etapas:
- a)
- proporcionar una cantidad conocida de uno o más péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos que tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia que se encuentra dentro del alérgeno a cuantificar mediante la identificación de una secuencia constante de aminoácidos dentro del alérgeno a cuantificar mediante la comparación de las secuencias de aminoácidos de isoalérgenos o alérgenos homólogos y la preparación de un péptido patrón de calibración de alérgeno sintético que tiene esta secuencia constante y el marcaje de dicho péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa.
- b)
- la degradación de la muestra de alérgeno para obtener una mezcla de péptidos, y opcionalmente el marcaje de dichos péptidos con uno o más agente o agentes marcadores mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa, en el que si ambos péptidos de la muestra de alérgeno degradada y el péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos están marcados, el agente o agentes marcadores usados para el marcaje de péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos son diferentes del agente o agentes marcadores usados para el marcaje de los péptidos de la muestra de alérgeno degradada,
- c)
- la cuantificación de la cantidad absoluta de alérgeno mediante la correlación de la cantidad de péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno con la cantidad del péptido o péptidos correspondientes de la muestra de alérgeno degradada mediante espectrometría de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular de la invención
tanto el péptido o péptidos patrón de calibración como los péptidos
de la muestra degradada se marcan pero con diferentes agentes
marcadores.
En otra realización de la invención, el péptido
o péptidos patrón de calibración se marcan y los péptidos de la
muestra degradada no se marcan.
En una realización preferida de la invención
como se ha descrito anteriormente, un péptido patrón de calibración
de alérgeno se proporciona en la etapa a). Así pues,
preferentemente, sólo se usa un péptido patrón de calibración de
alérgeno para cada muestra de alérgeno.
De acuerdo con una realización preferida
adicional de la invención la muestra degradada en la etapa b) está,
cuando se marca, marcada solamente con un agente marcador.
Así pues, preferentemente, solamente se
proporciona un péptido patrón de calibración de alérgeno en la etapa
a) y si se marca, la muestra degradada en la etapa b) solamente se
marcada con un agente marcador.
Además, el péptido patrón de calibración está
preferentemente marcado con solamente un agente marcador.
El análisis de masas, por ejemplo la EM como
tal, puede llevarse a cabo en mezclas de varios pares de una
muestra de alérgeno y se proporciona un péptido patrón de
calibración de alérgeno de acuerdo con la invención, para esa
muestra de alérgeno particular.
En el presente contexto, la expresión "péptido
o péptidos patrón de calibración de alérgenos que tienen una
secuencia de aminoácidos siendo dicha secuencia idéntica a una
secuencia que se encontrará en el alérgeno o alérgenos a
cuantificar" se refiere a una región de una secuencia de
aminoácidos que es constante es decir idéntica en el grupo de
isoalérgenos del alérgeno o en los alérgenos homólogos a
cuantificar. De acuerdo con una realización preferida de la
invención, el péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno
se selecciona de modo que la degradación de la etapa b) del
alérgeno (isoalérgenos o alérgenos homólogos) a cuantificar da como
resultado una mezcla de péptidos en la que uno de los péptidos de la
mezcla comprende la misma secuencia de aminoácidos que el péptido
patrón de calibración de alérgenos.
El análisis de masas, por ejemplo la EM como
tal, puede llevarse a cabo en mezclas de varios pares de una
muestra de alérgeno y un péptido patrón de calibración de alérgenos
proporcionado de acuerdo con la invención, para esa muestra de
alérgeno particular.
El número de aminoácidos en el péptido patrón de
calibración de alérgenos está preferentemente en el intervalo de 2
a 20 aminoácidos, más preferentemente en el intervalo de 4 a 15 y
más preferentemente en el intervalo de 6 a 15. El número depende
del sitio de escisión enzimática óptimo que se ha hallado que
corresponde a la secuencia de aminoácidos dentro de la muestra es
decir la secuencia de región variable o constante cuando la muestra
se escinde mediante una enzima. Además, el patrón de calibración de
alérgenos a usar de acuerdo con la invención depende de la marca y
del procedimiento de cuantificación a usar con el fin de dar una
señal detectable y fragmentación cuando se analiza en un
instrumento de EM.
En el presente contexto la expresión "muestra
de alérgeno" se refiere a una muestra que comprende uno o más
alérgeno o alérgenos.
En una realización de la invención, la muestra
de alérgeno comprende un extracto de alérgeno, un alérgeno
purificado que se produce de manera natural, un alérgeno modificado,
un alérgeno recombinante, un alérgeno mutante recombinante,
cualquier fragmento de alérgeno, una mezcla de isoalérgenos o
mezclas de alérgenos homólogos o una combinación de los mismos y un
extracto de alérgeno que comprende adición artificial de alérgenos
naturales purificados o recombinantes.
La muestra de alérgeno puede estar en la forma
de un producto final tal como una vacuna de alérgeno en forma de un
comprimido o una solución o un producto/intermedio extraído durante
la producción tal como después de una extracción de un material
básico de alérgeno biológico o materia prima.
En una realización preferida de la invención, la
muestra de alérgeno está en forma de un extracto de alérgeno, un
producto final en forma de un comprimido o un producto
intermedio.
En un aspecto de la invención se proporciona un
extracto de alérgeno comprendiendo dicho extracto de alérgeno,
alérgeno natural y alérgeno recombinante y obteniéndose mediante la
cuantificación de la cantidad de alérgeno en un extracto natural y
la adición de alérgeno recombinante o alérgeno natural purificado al
extracto con el fin de obtener la cantidad necesaria de alérgeno en
el extracto final tal como un extracto natural al que se ha añadido
artificialmente alérgenos recombinantes o naturales purificados.
El procedimiento de acuerdo con la invención
hace posible cuantificar un alérgeno o alérgenos presentes como
isoalérgenos o alérgenos homólogos y que tienen una secuencia
constante de aminoácidos en común de una o más especies en una
muestra de alérgenos simultáneamente o en una operación.
Es posible cuantificar los isoalérgenos de una
especie en una muestra de alérgenos simultáneamente o en un
procedimiento que usa el procedimiento de acuerdo con la invención.
Dependiendo de la muestra, puede ser necesario usar
desnaturalizantes y soluciones tampón para obtener una solución
apropiada.
En caso de que la muestra contenga sustancias
como tioles por ejemplo DTT o mercaptoetanol, altas concentraciones
de detergente y/o desnaturalizantes tales como SDS, octil
B-D-glucopiranósido y Triton®
X-100 y/o proteasas activas o aminas primarias
(además del alérgeno de interés), que pueden interferir con el
procedimiento de acuerdo con la invención la preparación de la
muestra puede implicar diversos tratamientos por ejemplo
precipitación con acetona. Los tampones recomendados y detergentes
alternativos y/o desnaturalizantes y sustancias que pueden
interferir con el procedimiento de acuerdo con la invención se
enumeran en por ejemplo los Reactivos Marcadores Modificadores de
Amina iTRAQ^{TM} de Applied Biosystems para Protocolo Relativo
Múltiple y de Cuantificación de Proteína Absoluta de Applied
Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos.
Dependiendo de la complejidad de la muestra,
puede ser beneficioso prefraccionar la muestra antes de la
degradación por ejemplo si existen moléculas que interfieren con la
detección del alérgeno o alérgenos de interés en la muestra. La
muestra también puede necesitar separarse/eluirse de su formulación
y/o cualquier adyuvante por ejemplo hidróxido de aluminio o fosfato
de calcio. Para obtener una mezcla menos compleja, la muestra puede
fraccionarse mediante el uso de diversas técnicas de cromatografía
tales como cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio
iónico y/o de inmunoafinidad.
En una realización de la invención, la muestra
de alérgeno es una fracción que resulta del prefraccionamiento, por
ejemplo una fracción de extracto de alérgeno que comprende uno o más
isoalérgenos.
En una realización de la invención, la muestra
de alérgeno es una fracción de una etapa de prefraccionamiento en
la que la muestra se ha fraccionado de acuerdo con la especificidad
de tamaño, solubilidad, carga eléctrica y/o ligando. En una
realización adicional de la invención, el prefraccionamiento se
realiza mediante cromatografía, tal como cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía de fase reversa, cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño o
cromatografía de afinidad por ejemplo mediante cromatografía de
interacción hidrófoba.
Un ejemplo de prefraccionamiento de un producto
intermedio que contiene alérgenos de grupo 1 y 2 de APD mediante el
uso de cromatografía de interacción hidrófoba se muestra en la Fig
4. Las fracciones que contienen respectivamente alérgenos del grupo
1 y grupo 2 de APD se separan según sus propiedades fisicoquímicas y
se identifican mediante inmunoprecipitación. Ambas fracciones
pueden someterse después a estudios de cuantificación.
En una realización de la invención, la muestra
de alérgeno se desala después de la cromatografía.
En una realización de la invención, la muestra
de alérgeno se reduce y se bloquea cualquier resto de cisteína
antes de la degradación tal como por ejemplo mediante
alquilación.
De acuerdo con la invención, la muestra se
degrada mediante el tratamiento con una o más enzimas para obtener
una mezcla de péptidos. La enzima puede seleccionarse para que tenga
un patrón de degradación muy predecible lo que permite que se
obtengan péptidos que pueden identificarse y cuantificarse mediante
su comparación con el péptido patrón de calibración de alérgeno. La
enzima puede ser una o más proteasas, tal como por ejemplo dos
proteasas o una o más de otra enzima o enzimas. Los ejemplos de
enzimas proteolíticas incluyen tripsina, papaína, pepsina, ArgC,
LysC, proteasa V8, AspN, pronasa, quimotripsina y carboxipeptidasa
C. Por ejemplo, la enzima proteolítica tripsina es una serina
proteasa que escinde enlaces peptídicos entre lisina o arginina y
un aminoácido no específico para de este modo producir péptidos que
comprenden un extremo amino terminal (N-terminal) y
un aminoácido carboxiterminal lisina o arginina (C terminal). De
esta manera, los péptidos de la escisión de la proteína son
predecibles y su presencia y/o cantidad, en una muestra de un
digerido de tripsina, es indicativa de la presencia y/o cantidad de
la proteína de su origen. Además, los extremos de amino terminal
libres de un péptido pueden ser unos buenos nucleófilos que
facilitan su marcaje. Debido a que la actividad de las enzimas es
predecible, la secuencia de péptidos que se produce de la
degradación de una proteína de una secuencia conocida puede
predecirse. Con esta información, puede generarse información
peptídico "teórica". Puede por lo tanto usarse una
determinación de los fragmentos peptídicos "teóricos" en por
ejemplo análisis asistido por ordenador de iones de fragmentos hijos
de análisis de espectrometría de masas de una muestra real para
identificar uno o más péptidos.
En una realización de la invención la muestra de
alérgenos se degrada antes del marcaje mediante digestión de la
muestra con al menos una enzima proteolítica hasta degradar parcial
o completamente la muestra. En una realización adicional de la
invención, la enzima proteolítica se selecciona del grupo
constituido por tripsina, papaína, pepsina, ArgC, LysC, proteasa
V8, AspN, pronasa, quimotripsina o carboxipeptidasa C o una
combinación de las mismas, tales como seleccionadas del grupo de
ArgC, LysC y tripsina o una combinación de las mismas. En otra
realización adicional de la invención la enzima es tripsina.
La muestra digerida puede prepararse antes de su
marcaje mediante cualquiera de varios procedimientos si fuera
necesario.
\newpage
Para los expertos en la materia, será obvio que
existen numerosas posibilidades para marcar la muestra y los
péptidos patrón de calibración de alérgenos con el fin de
introducir, de una manera predeterminada, funcionalidades de
modificación de masa diferentes que hacen posible la cuantificación
de los péptidos de alérgeno. El marcaje puede por ejemplo
realizarse como se describe en el documento WO 2004/070352, el
documento US 6.864.089, Stemmann O y col. Cell 2001;
107(6):715-26 y Gerber SA y col. Proc Natl
Acad Sci U S A 2003;100(12):6940-5.
En una realización de la invención el marcaje es
con química ITRAQ^{TM} (Applied Biosystems, Foster City, CA,
Estados Unidos).
De acuerdo con esta realización de la invención,
el marcaje de la muestra de alérgeno degradada y/o los péptidos
patrón de calibración se realiza mediante un conjunto de reactivos
de marcaje isomérico o isobárico tales como Reactivos iTRAQ^{TM}
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Cada uno de estos
reactivos contiene un grupo reactivo (GR) que reacciona con el
analito y un grupo informador (GI) único que produce un "ión de
identificación" único en el análisis EM/EM. Estos dos grupos se
unen adicionalmente con un resto enlazador (EL) usando enlaces X e
Y. El marcaje de la muestra de alérgeno degradada produce por lo
tanto un analito denominado muestra
GI-X-EL-Y. El
análisis del analito se realiza mediante el ajuste de un
espectómetro de masas de modo que tanto X como Y se unan al
fragmento. La fragmentación del enlace X libera el informador del
analito y el informador puede entonces determinarse
independientemente a partir del analito. La fragmentación del
enlace Y libera la combinación GI-EL del analito.
Por lo tanto, basándose en la fragmentación la presencia y/o la
cantidad del informador puede correlacionarse con la presencia y/o
la cantidad del analito en la muestra.
El marcaje con por ejemplo reactivos 4
iTRAQ^{TM}, permite una cuantificación absoluta de diferentes
muestras de alérgenos simultáneamente (las muestras de alérgenos se
degradan y cada mezcla de péptidos se marca con diferentes
reactivos iTRAQ^{TM}. La posibilidad de análisis simultáneos de
diferentes muestras de alérgeno permite la comparación de los
péptidos marcados, la muestra o muestras, con la cantidad conocida
de péptido o péptidos patrón de calibración y de este modo hace
posible la cuantificación e identificación mediante el uso de EM/EM
en una etapa.
El marcaje de las muestras cuando se usan los
reactivos ITRAQ^{TM} y/o otros marcajes puede realizarse de
acuerdo con el procedimiento del fabricante como se muestra en la
figura Fig. 5.
Otro procedimiento para el marcaje en conexión
con la cuantificación de proteínas usando técnicas de EM son por
ejemplo la técnica AQUA que usa péptidos de calibración interna
sintetizados con isótopos estables incorporados (^{13}C,
^{15}N) para imitar péptidos nativos formados mediante digestión
enzimática usando, por ejemplo, tripsina (Stemmann O y col. Cell
2001; 107(6):715-26, Gerber SA y col. Proc
Natl Acad Sci U S A 2003;100(12):6940-5).
Otro procedimiento es el procedimiento ICPL
(Marcaje de Proteínas Codificadas por Isótopos) descrito por
Kellermann y col., Proteomics 5, 4-15, que usa por
ejemplo ^{12}C/^{13}C_{6}-ácido
nicotínico-succinimida como marcador ICPL.
En una realización de la invención el péptido o
péptidos marcados de forma diferente y el péptido o péptidos patrón
de calibración de alérgenos se marcan separadamente y se mezclan
después del marcaje antes de la cuantificación.
Dependiendo de cómo se realice el marcaje del
alérgeno y los péptidos patrón de calibración, puede seleccionarse
una manera apropiada de identificación.
En una realización de la invención, el alérgeno
se identifica adicionalmente de forma concluyente mediante la
comparación del péptido o péptidos alérgenos marcados y el péptido o
péptidos patrón de calibración de alérgeno mediante análisis de
identificación de péptidos. La cromatografía de intercambio de
cationes también puede usarse para la separación de los péptidos,
en combinación con cromatografía de fase reversa como cromatografía
bidimensional y para la reducción de la cantidad, si fuera
necesario, de cualesquiera sales y compuestos orgánicos antes del
análisis EM.
En una realización de la invención, la
cuantificación se realiza usando espectrometría de masas.
En una realización adicional de la invención, la
identificación del alérgeno y/o isoalérgenos puede realizarse
usando espectómetros de masas en tándem y otros espectómetros de
masas que son capaces de seleccionar y fragmentar iones
moleculares. Esto es especialmente adecuado cuando se usan reactivos
iTRAQ^{TM} para el marcaje.
Los espectómetros de masas en tándem (y en menor
grado espectómetros de masas de fase única) tienen la capacidad de
seleccionar y fragmentar iones moleculares de acuerdo con su
relación masa-carga (m/z) y después registrar los
espectros iónicos del fragmento resultante (hijo). Más
específicamente, los espectros iónicos del fragmento hijo pueden
generarse sometiendo los iones seleccionados a niveles de energía
disociativos (por ejemplo disociación inducida por colisión (CID)).
Por ejemplo, los iones que corresponden a péptidos marcados de una
relación particular m/z pueden seleccionarse de un primer análisis
de masas, fragmentarse y reanalizarse en un segundo análisis de
masas. Los instrumentos representativos que pueden realizar dicho
análisis de masas en tándem incluyen, pero no se limitan a,
espectómetros de masas magnéticos de cuatro sectores, de tiempo de
paso en tándem, triples, cuadripolo, de trampa de iones, y de
tiempo de paso cuádruple híbrido (Q-TOF).
\newpage
Estos tipos de espectómetros de masas pueden
usarse junto con una diversidad de fuentes de ionización,
incluyendo, pero sin limitarse a, ionización de
electropulverización (IEN) y desorción/ionización de láser asistida
por matriz (MALDI). Las fuentes de ionización pueden usarse para
generar especies cargadas para el primer análisis de masas en el
que los análisis no poseen ya una carga fija. Los procedimientos de
fragmentación y los instrumentos de espectrometría de masas
adicionales incluyen desintegración posterior a la fuente en
instrumentos MALDI-EM y CID de alta energía que usa
MALDI-TOF (tiempo de vuelo)-TOF EM.
Para una reciente revisión de los espectómetros de masas en tándem
por favor véase: R. Aebersold y D. Goodlett, Mass Spectrometry in
Proteomics. Chem. Rev. 101: 269-295 (2001). Véase
también la patente de Estados Unidos Nº 6.319.476 para un análisis
de técnicas de análisis de masas TOF TOF.
El péptido o péptidos patrón de calibración de
alérgenos (secuencia o secuencias variables o constantes) se eligen
dependiendo de si la cuantificación a realizar es de un alérgeno o
alérgenos homólogos o alérgenos o isoalérgenos específicos.
En una realización de la invención, puede
realizarse la cuantificación absoluta de un alérgeno (cantidad
absoluta de isoalérgenos de alérgenos).
Cuando se usan los reactivos iTRAQ^{TM} el
péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos elegidos se
marca con un marcador isomérico o isobárico del conjunto de
marcadores, por ejemplo iTRAQ-114,
iTRAQ-115, iTRAQ-116 o
iTRAQ-117, usados para marcar los péptidos de
alérgenos.
Así pues en una realización de la invención el
marcaje es con ITRAQ-114, ITRAQ-115,
ITRAQ-116 y/o ITRAQ-117.
Una vez que la cantidad relativa del informador
para el péptido patrón de calibración, o péptidos patrones, se
determina en relación con las cantidades relativas del informador
para los péptidos marcados diferencialmente, es posible calcular la
cantidad absoluta (con frecuencia expresada en concentración y/o
cantidad) de todos los péptidos marcados diferencialmente en la
mezcla de muestras y de este modo calcular la cantidad de alérgeno
(por ejemplo cantidad absoluta de isoalérgeno o isoalérgenos de una
especie cuando la muestra es un extracto). La adquisición de EM y
EM/EM de las muestras marcadas con ITRAQ^{TM} puede realizarse
usando por ejemplo software 4700 Explorer^{TM}. Además, el
software Explorer GPS puede usarse para realizar las búsquedas de
base de datos que darían como resultado la identificación definitiva
de los péptidos de EM/EM. Los datos obtenidos pueden usarse después
para la cuantificación basándose en la cantidad conocida de péptido
patrón de calibración de alérgenos es decir la relación entre la
muestra y el péptido patrón de calibración.
En una realización de la invención (i) el
alérgeno a cuantificar es Der f 2 y el péptido de calibración patrón
de alérgeno comprende los aminoácidos 32-48 de Der
f 2 o (ii) el alérgeno a cuantificar es Der p 2 y el péptido de
calibración patrón del alérgeno comprende los aminoácidos
32-48 de Der p 2.
El procedimiento de acuerdo con la invención es
útil por ejemplo en un ensayo de liberación para asegurar una
cantidad segura y predecible de alérgeno durante la producción de
una vacuna y en el producto final y también durante las diversas
fases de almacenamiento de ingredientes y/o productos y extractos
sin procesar. El procedimiento de acuerdo con la invención es útil
en el desarrollo de vacunas alérgenas de segunda generación por
ejemplo que usan alérgenos recombinantes como principios activos
mediante la optimización de los principios activos en las vacunas
alérgenas de segunda generación basándose en el conocimiento y/o
composición de las vacunas actuales. Las vacunas actuales se
formulan con frecuencia usando alérgenos de varias especies de
alérgenos y el procedimiento también sería beneficioso en la
determinación de la composición de alérgenos específicos de especie
a partir de estas mezclas de alérgenos. El procedimiento de acuerdo
con la invención puede usarse en la validación de la limpieza, en
la que se miden las cantidades traza de alérgeno o alérgenos,
ensayos de liberación y análisis de productos intermedios y
finales.
Los péptidos que pueden usarse como péptidos
patrones de calibración pueden realizarse mediante el uso de bases
de datos de proteínas y/o nucleótidos y un programa o programas de
análisis de escisión y/o realizar experimentos de identificación
genética de masas in vitro.
En el presente contexto, la expresión "péptido
patrón de calibración de alérgeno" se refiere a un patrón de
calibración de alérgenos con una secuencia de aminoácidos idéntica a
una secuencia constante de un grupo de isoalérgenos o alérgenos
homólogos. El péptido de calibración de alérgeno se prepara
preferentemente mediante síntesis peptídica.
En algunos casos, la secuencia del alérgeno de
interés ya se conoce. Puede encontrarse una lista oficial de los
alérgenos por ejemplo en el sitio web (www.allergen.org) que
mantiene el Subcomité de Nomenclatura de Alérgenos I.U.I.S. Las
secuencias de alérgeno conocidas pueden obtenerse de bases de datos
de proteínas y nucleótidos por ejemplo la Base de Conocimiento
Uniprot. Las secuencias de proteínas y/o nucleótidos pueden
explorarse usando por ejemplo el Sistema de Recuperación de
Secuencias (SRS) o mediante el uso de palabras clave por ejemplo
introducción del nombre de entrada (ID), descripción (DE), nombre
del gen (GN), especie (OS) y/o orgánulo (OG). El análisis adicional
de la proteína/alérgeno de interés se realiza mediante el uso de
por ejemplo software Vector NTI (Invitrogen) y/o mediante el uso del
servidor de proteómica ExPASy (Sistema de Análisis de Proteínas
Experto) del Instituto Suizo de Bioinformática (SIB). El
alineamiento de secuencias de isoformas alérgenas existentes y
especies alérgenas se realiza usando por ejemplo la búsqueda Blast
que puede usarse para alinear secuencias de nucleótidos y/o de
proteínas homólogas. Los alineamientos de secuencias proporcionan
una manera de comparar por ejemplo secuencias nuevas con genes y/o
proteínas previamente caracterizados. Los alineamientos de las
secuencias de alérgenos homólogos o isoalérgenos pueden usarse para
demostrar las secuencias idénticas (constantes) y variables dentro
de y entre especies alérgenas como se muestra en la Fig. 1.
Para obtener péptidos patrón de calibración
óptimos, el análisis de escisión del alérgeno de interés puede
simularse usando un programa o programas de análisis de escisión
(degradación). Las secuencias de alérgenos pueden someterse a por
ejemplo un programa GPMAW (Lighthouse data, Odense, Dinamarca) que
se crea para soportar análisis EM. El análisis de escisión
(degradación) de una secuencia de alérgeno puede deducirse para
varias proteasas conocidas tales como tripsina,
Asp-N y Lys-C y/o una combinación de
dos o más de ellas. Los péptidos teóricos resultantes (Fig. 2) se
usan después para verificar la enzima o enzimas de degradación
óptimas y diseñar adicionalmente los péptidos sintéticos que pueden
usarse como péptidos patrones de calibración.
Por otro lado, los péptidos patrones de
calibración pueden deducirse del experimento o experimentos de
identificación genética de masas in vitro en los que los
alérgenos se escinden mediante una enzima y se mezclan. Los
péptidos específicos de especie pueden detectarse mediante análisis
de identificación genética de masas e identificarse mediante
búsquedas de base de datos por ejemplo usando el motor de búsqueda
Mascot, como se describe posteriormente.
Los Der f 2 y nDer p 2 naturales purificados (n)
y los Der f 2 (A61501) y Der p 2 (BAA01241) recombinantes (r)
pueden disolverse en Tris-CI 25 mM a pH 7,5, Urea
1,0 M. Una alícuota de moléculas recombinantes (rDer f 2 y rDer p
2) y moléculas naturales (nDer f 2 y nDer p 2) pueden mezclarse (por
ejemplo 1:1) o digerirse como alérgenos individuales mediante
tripsina y mezclarse después. Las digestiones de alérgenos mezclados
y/o individuales se desalan y evalúan mediante identificación
genética de masas. Los péptidos que son específicos de especie
pueden identificarse mediante análisis de identificación genética de
masas a partir de la mezcla de estas dos especies. Los alérgenos
APD 2 individuales pueden mezclarse después de la ingestión con
tripsina y las mismas secuencias constantes específicas de especie
pueden demostrarse. Basándose en las secuencias constantes
específicas de especie pueden diseñarse péptidos sintéticos. La
cuantificación y verificación de las secuencias de péptidos puede
realizarse mediante el marcaje de alérgenos individuales y los
péptidos patrón de calibración por ejemplo con reactivos
ITRAQ^{TM} y analizarse mediante espectrometría de masas en tándem
(EM/EM).
Se disuelven los extractos alérgenos naturales
por ejemplo, productos intermedios de dos especies de APD
Dermatophagoides farinae y Dermatophagoides
pteronyssinus (ALK-Abelló, Hørsholm, Dinamarca)
(1,0 mg/ml en peso seco). Para retirar el componente de
interferencia las muestras pueden precipitarse con acetona. El
precipitado que contiene proteínas puede después resolverse en el
tampón seleccionado. Con el propósito de cuantificar, la muestra o
muestras y los péptidos sintéticos seleccionados de las dos especies
usados como péptido patrón de calibración pueden marcarse con, por
ejemplo, reactivos ITRAQ^{TM} y analizarse mediante EM/EM.
El producto final, por ejemplo el comprimido de
alérgeno de ácaro del polvo doméstico se disuelve en tampón
Na-Fosfato 20 mM pH 7,0. Para retirar los
componentes de interferencia, la muestra puede necesitar
prefraccionarse y/o precipitarse con acetona. El comprimido
disuelto y los péptidos patrones de calibración seleccionados se
marcan, por ejemplo, con reactivos iTRAQ^{TM} y se analizan usando
EM/EM en tándem.
Estudio de liberación; el producto final, por
ejemplo 5 mezclas de césped incluyendo cinco especies de césped
unidas con hidróxido de aluminio se disuelve en un tampón
seleccionado que puede eluir alérgenos unidos del hidróxido de
aluminio. Los alérgenos separados pueden separarse adicionalmente
y/o desalarse en un tampón de digestión seleccionado y pueden
marcarse los péptidos patrón de calibración seleccionados con, por
ejemplo, reactivos de iTRAQ^{TM} y puede evaluarse la
cuantificación usando EM/EM.
\vskip1.000000\baselineskip
La calificación absoluta de los isoalérgenos
usando las secuencias de región constante únicas, es decir péptidos
de identificación de Der f 2, Der p 2, Phl p 1, Phl p 5 y Bet v 1
naturales se demostró mediante el empleo de dos enfoques
diferentes. Se sintetizaron dos péptidos patrones de calibración
para evaluar la técnica de marcaje con iTRAQ^{TM} (Applied
Biosystems). Además, se sintetizaron cuatro péptidos patrones de
calibración para evaluar la técnica del marcaje con isótopo estable
tal como proteína-AQUA^{TM} (Sigma Aldrich).
Los péptidos patrones de calibración de
alérgenos que tienen secuencias específicas de especie que
corresponden a la secuencia de aminoácidos de 32-48
en Der f 2 y en Der p 2, 149-158 en Phl p 1,
123-135 en Phl p 5a, 115-127 en Phl
p 5b a y 151-164 en Bet v 1 se diseñaron basándose
en los alineamientos de secuencia de aminoácidos (Vector NTI)
(Figura 1), análisis de escisión mediante GPMAW (Figura 2) y
búsquedas en base de datos Blast. Los análisis de identificación
genética de masas in vitro de alérgenos naturales digeridos
con tripsina Der f 2, Der p 2, Phl p 1, Phl p 5, Bet v 1 y Der f 2
y Der p 2 mezclados se realizaron para demostrar la aparición de
los péptidos específicos de especie. Todas las muestras y su mezcla
o mezclas digeridas in vitro se identificaron mediante el
uso del motor de búsqueda Mascot (Matrix Science Inc., Boston, MA,
Estados Unidos).
Los péptidos sintéticos que corresponden a la
secuencia de aminoácidos 32-48 en Der f 2 y Der p 2
se obtuvieron de Sigma GENOSYS Texas, Estados Unidos. La
concentración de los péptidos se determinó mediante el análisis de
aminoácidos (Sigma GENOSYS, Texas, Estados Unidos). Los péptidos
sintéticos marcados con isótopo estable (los péptidos
Protein-AQUA^{TM}) que corresponden a la secuencia
de aminoácidos 149-158 en in Phl p 1 (Arg ^{13}C
^{15}N), 123-135 in Phl p 5a (Arg ^{13}C
^{15}N), 115-127 in Phl p 5b a (Arg ^{13}C
^{15}N) y 151-164 in Bet v 1 (Val ^{13}C
^{15}N) se obtuvieron de Sigma GENOSYS, Texas, Estados Unidos
(Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Der f 2 y Der p 2 naturales se purificaron de
100 mg de extractos de Dermatophagoides farinae y
Dermatophagoides pteronyssinus (ALK-Abelló,
Horsholm, Dinamarca). Los Phl p 1 y 5 naturales se purificaron de 50
mg de extracto de Phleum prantense
(ALK-Abelló) y Bet v 1 natural de 50 mg de extracto
de Betula verrucosa (ALK-Abelló). La
purificación de las moléculas se realizó como se describe en la
bibliografía (Johannessen BR y col. FEBS Lett
2005;579:1208-12, Aasmul-Olsen S. y
col. New Horizons in Allergy Immunotherapy, editado por Sehon y col.
Plenum Press. Nueva York 1996, pág. 261-65,
Petersen A y col. Clin Exp Allergy. 1994
Mar;24(3):250-6, Ipsen H & Lowenstein H
J Allergy Clin Immunol. 1983; 72(2):150-59).
Los Der f 2 y Der p 2 recombinantes se expresaron en un sistema de
expresión de Pichia pastoris y se purificaron como se
describe en la bibliografía (Johannessen BR y col. FEBS Lett
2005;579:1208-12). Las proteínas se almacenaron como
alícuotas liofilizadas a -20ºC.
La concentración de los alérgenos purificados se
midió usando el coeficiente de extinción de uno de los isoalérgenos
a A_{280} y mediante el uso de espectrómetro Lambda 800 UV/VIS
(Perkin Elmer Instruments, CA, Estados Unidos).
\vskip1.000000\baselineskip
La cromatografía de interacción hidrófoba se usó
para prefraccionar los extractos de Dermatophagoides farinae
(Der f) y Dermatophagoides pteronyssinus (Der p). El
fraccionamiento de los extractos de ácaros se realizó con una
columna de Fenilo HITrap de 1,0 ml (GE-Healthcare,
Uppsala. Suecia). La columna se equilibró con tampón
Na-fosfato 50 mM (Merck, Darmstadt, Alemania), pH
7,0, sulfato de amonio 1,0 M (Fluka, Buchs, Suiza) y la muestra
unida se eluyó con tampón Na-fosfato 50 mM (Merck),
pH 7,0 en 5 volúmenes de columna usando un gradiente lineal
decreciente. La cromatografía se realizó separadamente para cada uno
de los extractos de APD, Der f y Der p. Las fracciones se
analizaron mediante SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad,
CA, Estados Unidos) y basándose en estos análisis se dividieron las
proteínas APD en 2 conjuntos principales de proteínas (Figura 4).
Los conjuntos de Der f y Der p que contienen alérgenos APD 2 se
sometieron a una etapa de diálisis contra bicarbonato de amonio 10
mM (BDH, Poole, Inglaterra). Los conjuntos Der f y Der p dializados
se liofilizaron, se distribuyeron en alícuotas en viales de
aproximadamente 5 mg (peso seco) y se almacenaron en congelación a
-20ºC. Las alícuotas Der f y Der p que contenían los alérgenos APD2
se sometieron adicionalmente a estudios de cuantificación
absolutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se empleó marcaje con iTRAQ ^{TM} de tres
conjuntos de muestras:
a) 15 \mug de Der f 2 natural y 15 \mug de
Der p 2 natural
b) 15 \mug de Der f 2 recombinante y 15 \mug
de Der p 2 recombinante y
c) 100 \mug de extractos de Der f y Der p
prefraccionados.
Los péptidos patrones sintéticos, 15 \mug de
péptido 1 (Der p 2) y 15 \mug de péptido 2 (Der f 2) se
disolvieron en un bicarbonato de trietilamonio 100 mM (TEAB) pH 8,5
y se marcaron para usarse como patrones de calibración internos
para cada uno de los conjuntos experimentales como se describe
posteriormente.
El bloqueo de restos de cisteína libres, la
escisión enzimática usando tripsina y el marcaje peptídico con
reactivos de iTRAQ^{TM} se realizó de acuerdo con el protocolo del
fabricante:
Cada una de las seis muestras de proteínas y los
dos patrones de calibración internos se disolvieron en 20 \mul de
TEAB 100 mM, pH 8,5. Las muestras de proteínas se desnaturalizaron
con 1,0 \mul de SDS al 0,05% y se redujeron mediante 2,0 \mul
de TCEP tris(2-carboxietil)fosfina 4,8
mM a 60ºC después de bloquear los restos de cisteína mediante 1,0
\mul de S-metil metanotiosulfonato (MMTS) 10 mM a
temperatura ambiente. Las muestras de proteínas se digirieron con
tripsina modificada apta para secuenciación al 10% (p/p) (Promega,
Madison, Wl, Estados Unidos) durante 18 horas a 37ºC.
El marcaje con iTRAQ^{TM} de las muestras
digeridas con tripsina y los péptidos patrón de calibración interna,
Péptidos 1 y 2 se realizó a temperatura ambiente. Cada reactivo de
marcaje iTRAQ desde 114 a 117 se disolvió en 70 \mul de etanol al
70% que se aplicó después a la muestra o muestras. Los volúmenes
finales de las mezclas de reactivo fueron de 100 \mul/ muestra.
Las muestras marcadas se almacenaron a -20ºC.
Los péptidos digeridos con tripsina de Der p 2
natural, Der p 2 recombinante y extracto de Der p se marcaron con
iTRAQ-114. Los péptidos digeridos con tripsina de
Der f 2 natural, Derf 2 recombinante y extracto de Der f se
marcaron con iTRAQ-115. Los péptidos sintéticos
péptido 1 (Der p 2) y péptido 2 (Der f 2) se marcaron con
iTRAQ-116 (Der p 2) e iTRAQ-117 (Der
f 2) (Figura 5). Cada una de las muestras marcadas se analizó
mediante Voyager STR y/o Analizador Proteómico 4700 (Applied
Biosystems) para demostrar el marcaje de los péptidos. Los análisis
de fragmentos mediante EM/EM se realizaron con un Analizador
Proteómico 4700 (Applied Biosystens). Las muestras marcadas se
diluyeron a 1:10 y se desaló 1,0 \mul de la muestra o muestras
mediante microcolumnas C18 (ZipTips, Millipore) y/o micro columnas
C18 artesanales (Poros R2, Applied Biosystems). La muestra se eluyó
en el objetivo mediante 1,0 \mul de acetonitrilo al 70% (ACN),
ácido Trfluoroacético al 0,1% (TFA) y una matriz de 1,0 \mul de
ácido
alfa-ciano-4-hidroxi-cinámico
(CHCA) (Agilent Technologies, Böblingen, Alemania) se añadió sobre
la muestra. La muestra se secó y se sometió a análisis EM.
Los análisis EM de los patrones de calibración
internos marcados con iTRAQ^{TM} revelaron masas que correspondían
al péptido 1 en m/z 2353,44 y péptido 2 en m/z 2326,35 (Figuras 6a
y 6b). Los resultados mostraron que la modificación del péptido 1
específico de Der p 2 y el péptido 2 especifico de Der f 2
correspondían a la modificación mediante el reactivo iTRAQ^{TM}
cuando se unía al extremo amino terminal y la lisina C terminal. Los
análisis EM de los péptidos Der p 2 naturales y recombinantes
marcados con iTRAQ^{TM} revelaron que iTRAQ ^{TM} modificaba
las masas a m/z 2353,29. De manera similar, los análisis EM de los
péptidos Der f 2 naturales y recombinantes marcados revelaron que
iTRAQ^{TM} modificaba el péptido a m/z 2326,29, respectivamente
(Figura 6c y 6d). No se observaron escisiones fallidas por
tripsina. Estos resultados muestran que los péptidos 1 y 2 marcados
con iTRAQ^{TM} pueden usarse como patrones de calibración internos
para ensayos de cuantificación absoluta de isoalérgenos Der p 2 y
Der f 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación absoluta de los isoalérgenos
de las especies Dermatophagoides farinae y
Dermatophagoides pteronyssinus se empleó primero de la
mezcla directa de los alérgenos naturales purificados. Los Der p 2,
Der f 2 y péptidos 1 y 2 trípticos naturales marcados con
iTRAQ^{TM} se mezclaron en una relación de 1:1:1:1, se diluyeron
a 1:5 y a 1:10 y se desalaron mediante microcolumnas C18 artesanales
(Poros R2, Applied Biosystems). La muestra se eluyó en el objetivo
mediante el uso de 1,0 \mul de CHCA 5 \mug/\mul (Sigma) en
ACN al 70% (Sigma), TFA al 0,1% (Fluka). Los análisis de fragmentos
por EM/EM se realizaron mediante un analizador proteómico 4700
(Applied Biosystems).
Los análisis de fragmentos de m/z 2353,29
revelaron señales a m/z 114 y m/z 116 correspondientes a los iones
informadores para Der p 2 y péptido 1 naturales. La cantidad de
isoalérgenos de Der p 2 naturales en la muestra se calculó como la
relación del área de señal de m/z 114 con el área de m/z 116, el
patrón de calibración interno (figura 7a). Los análisis de
fragmentos por EM/EM de m/z 2326,29 revelaron las señales a m/z 115
y m/z 117 correspondientes a los iones informadores para Der f 2 y
péptido 2 naturales.
La cantidad de isoalérgenos de Der f 2 naturales
en la muestra se calculó como la relación del área de señal de m/z
115 y m/z 117, el patrón de calibración interno (figura 7b). Además
de la cuantificación absoluta las listas de picos iónicos de
fragmentos de m/z 2353,29 y m/z 2326,29 se introdujeron para su
análisis por bases de datos mediante el motor de búsqueda Mascot
(Matrix Science). Los análisis de la base de datos dieron como
resultado la identificación de los péptidos como
32-48 de los alérgenos 2 de APD Dermatophagoides
farinae y Dermatophagoides pteronyssinus APD.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación absoluta de la mezcla Der f 2
y Der p 2 recombinantes y los isoalérgenos en la mezcla compleja de
los extractos de Der f y Der p se evaluó mediante cromatografía
bidimensional. La cromatografía de intercambio catiónico (SCX) se
evaluó como la primera dimensión y la cromatografía de fase reversa
como la etapa de separación de segunda dimensión.
\newpage
Der p 2, Der f 2 y los péptidos 1 y 2
recombinantes se mezclaron en una relación de 1:1:1:1, en un volumen
final de 50 \mul. Los extractos de Der f y Der p y los péptidos 1
y 2 se mezclaron en una relación 4:4:1:1, en un volumen final de 50
\mul.
Separación de las mezclas peptídicas marcadas
mediante cromatografía de intercambio catiónico (tanto Der p 2 y
Der f 2 recombinantes como extractos de Der p 2 y Der f 2);
Las mezclas de muestras se diluyeron a 1:10 en
ACN al 5% (Sigma) ácido Fórmico al 0,05% (Merck) y se sometieron a
SCX. El SCX se realizó en una columna BIO-SCX Zorbax
de 0,8x50 mm (3,5 \mum) (Agilent Technologies) en un sistema
SMART^{TM} (GE-HealthCare, Uppsala, Suecia). La
columna se equilibró con ACN al 5% (Sigma) ácido Fórmico al 0,05%
(Merk) y se realizó la cromatografía con un gradiente lineal
creciente desde 0 a 100% de ACN al 5% (Sigma) ácido Fórmico al
0,05% (Merck) NaCl 0,5 M (Merck) en 30 minutos. El caudal fue de 50
\mul/minuto y la cromatografía se controló a 214 nm. Las
fracciones de 50 \mul se recogieron y se analizó 1,0 \mul de
cada fracción mediante los instrumentos EM
Voyager-STR (Applied Biosystems) y/o Analizador
Proteómico 4700(Applied Biosystems). Los péptidos a m/z
2353,29 y m/z 2326,29 se identificaron eluyendo al final del
gradiente junto con algunos otros péptidos APD. Las fracciones de
mezcla de Der f y Der p (los extractos) que contenían los péptidos
a m/z 2353,29 y m/z 2326,29 se seleccionaron para separarse
adicionalmente mediante cromatografía de fase reversa, véase
posteriormente. Sin embargo, la cuantificación de la mezcla de rDer
f 2 y rDer p 2 (recombinante) y los patrones de calibración
internos se realizó directamente después de SCX de la placa
diana.
Los análisis de fragmento por EM/EM de m/z
2353,29 revelaron señales a m/z 114 y m/z 116 correspondientes a
los iones informadores para Der p 2 y péptido 1. La cantidad de clon
Der p 2 en la mezcla rDer p 2/ rDer f 2 se calculó como la relación
del área de señal de m/z 114 al área de m/z 116, el patrón de
calibración interno. Los análisis de fragmentos por EM/EM de m/z
2326,29 revelaron las señales a m/z 115 y m/z 117 correspondientes
a los iones informadores para Der f 2 y péptido 2. La cantidad del
clon Der f 2 en la mezcla rDer p 2/ rDer f 2 se calculó como la
relación del área de señal de m/z 115 a m/z 117, el patrón de
calibración interno. Las listas de picos iónicos de fragmento de
m/z 2353,29 y m/z 2326,29 se introdujeron para análisis en bases de
datos mediante el motor de búsqueda Mascot (Matrix Science). Los
análisis de bases de datos dieron como resultado la identificación
de los péptidos como 32-48 de los alérgenos 2 de APD
de Dermatophagoides farinae y Dermatophagoides
pteronyssinus.
Los péptidos a m/z 2353,29 y m/z 2326,29 en
ambas muestras; la mezcla Der f 2 y Der p 2 recombinantes y las
mezclas de extractos Der f y Der p, eluyeron de la columna SCX con
tiempos de retención similares. Este experimento mostró que SCX
puede usarse como una etapa de fraccionamiento y desalación para las
mezclas de muestras más simples antes que la cuantificación de los
alérgenos. Los experimentos también mostraron que SCX puede
emplearse como la etapa de fraccionamiento de primera dimensión
para los análisis de mezclas más complejas de alérgenos tales como
los extractos de alérgenos convencionales usados en la
inmunoterapia.
La separación de los péptidos APD marcados con
iTRAQ^{TM} a partir de fraccionamiento con SCX como se ha
descrito anteriormente se realizó mediante una columna C18 PepMap100
(3 \mum) (CL Packings Pionex, Sunny Vale, CA, Estados Unidos). La
columna se equilibró con TFA al 0,05% (Fluka), ACN al 2% (Sigma).
Los péptidos se eluyeron con TFA al 0,04% (Fluka), ACN al 80% en un
gradiente de 0-50%, en 80 minutos,
50-100% en 120 minutos. La cromatografía se realizó
con Ultimate3000 (CL Packings, Dionex) 2,0 \mul/min y se controló
a 210 y 214 nm. Se inyectó 1,0 \mul de la fracción de SCX a la
columna. Las fracciones se recogieron mediante su aplicación
puntual directamente en una placa diana de
MALDI-TOF. La aplicación puntual se realizó con el
instrumento Probot (CL Packings, Dionex) que se conectó en línea
con el instrumento Ultimate3000. La aplicación puntual se realizó
cada 30 segundos mezclando la matriz HCCA (Agilent Technologies) a
la muestra en una relación de 1:1
Las muestras aplicadas puntualmente se
analizaron mediante EM y EM/EM usando un Analizador Proteómico 4700
(Applied Biosystems). Los péptidos a m/z 2353,29 y m/z 2326, 29 se
identificaron a partir de los puntos en la diana y se mostró que
correspondían a las señales a 214 nm en la cromatografía (Figura 8).
Los análisis de fragmentos por EM/EM de m/z 2353,29 rebelaron
señales a m/z 114 y m/z 116 correspondientes a los iones
informadores para Der p 2 y péptido 1. La cantidad de isoalérgenos
de Der p 2 en la mezcla de extracto de Der p/f se calculó como la
relación del área de señal de m/z 114 al área de m/z 116, el patrón
de calibración interno. Los análisis de fragmentos por EM/EM de m/z
2326,29 revelaron las señales a m/z 115 y m/z 117 correspondientes
a los iones informadores para Der f 2 y Péptido 2- La cantidad de
isoalérgenos Der f 2 en la mezcla de extracto de Der p/f se calculó
como la relación del área de señal de m/z 115 a m/z 117, el patrón
de calibración interno. Las listas de picos iónicos de fragmento de
m/z 2353,29 y mz 2326,29 se introdujeron para análisis de bases de
datos mediante el motor de búsqueda Mascot (Matrix Science). Los
análisis de bases de datos dieron como resultado una identificación
de los péptidos como 32-48 de los alérgenos APD 2 de
Dermatophagoides farinae y Dermatophagoides
pteronyssinus.
Este experimentó muestra que la cromatografía de
fase reversa puede usarse como la segunda dimensión en el
fraccionamiento de las mezclas simples y/o complejas de extractos de
alérgenos para la cuantificación de isoalérgenos.
\vskip1.000000\baselineskip
En la técnica AQUA (Stemmann O y col. Cell
2001;107(6):715-26, Gerber SA y col. Proc
Natl Acad Sci U S A 2003;100(12):6940-5.)
los péptidos de calibración interna se sintetizan con isótopos
estables incorporados (^{13}C, ^{15}N) para imitar péptidos
nativos formados mediante digestión enzimática usando, por ejemplo,
tripsina. La incorporación de un residuo de aminoácido marcado con
isótopo cambia las masas moleculares de los péptidos típicamente de
6 a 10 Da. A diferencia de la técnica iTRAQ o bien las muestras o
bien el patrón o los patrones de calibración interna necesitan
modificarse mediante los reactivos marcadores. En los experimentos
de cuantificación por ejemplo cuando se usa un
CL-EM/EM la abundancia de un ión de fragmento
específico de tanto el péptido muestra nativo como el patrón de
calibración interno sintetizado pueden medirse como una función del
tiempo de retención de cromatografía de fase reversa. La
cuantificación absoluta se determina mediante la comparación de la
abundancia del patrón interno conocido con el péptido muestra
nativo.
Los péptidos patrones de calibración interna
sintéticos para Phl p 1, Phl p 5 forma a y b y Bet v 1 naturales se
diseñaron como se ha descrito anteriormente (Figura 2). Los péptidos
sintéticos se describen en más detalle en la
tabla 1.
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Phl p 1, Phl p 5 y Bet v 1 naturales se
redisolvieron en un Tris-Cl 25 mM (Sigma), Urea 1,0
M (Fluka) pH 7,8 a una concentración de 2,5 pmol/\mul. Los
patrones de calibración interna se mezclaron con las muestras a una
relación de 1:1. La digestión se realizó mediante Tripsina apta para
secuenciación al 10% (p/p) (Promega) a 37ºC durante 18 h. Las
muestras se almacenaron a -20ºC.
Los Phl p 1, Phl p 5 y Bet v 1 digeridos con
Tripsina se analizaron mediante EM y EM/EM usando el Voyager STR
y/o el Analizador Proteómico 4700 (Applied Biosystems). Todas las
muestras se diluyeron a 1:10 en TFA al 0,1% (Fluka) y se desaló 1,0
\mul de cada muestra mediante micro columnas C18 artesanales
(Poros R2 Applied Biosystems).
Los análisis por EM de Phl p 1 natural digerido
con tripsina revelaron el péptido nativo a m/z 1135,60 y el péptido
patrón de calibración interna para los isoalérgenos de Phl p 1 a m/z
1145,61 (datos no mostrados). Los análisis por EM/EM de los
péptidos de calibración interna mostraron un patrón de fragmentación
que se correspondía con la secuencia de aminoácidos única de los
isoalérgenos de Phl p 1 naturales.
Los análisis por EM del Phl p 5 natural digerido
con tripsina revelaron el péptido nativo de Phl p 5b a m/z 1471,81
y el péptido nativo de Phl p 5b a m/z 1455,77 (datos no mostrados).
Los péptidos patrones de calibración interna para los isoalérgenos
de Phl p 5a y Phl p 5b se detectaron a m/z 1481,83 y a m/z 1465.78.
Los análisis por EM/EM de los péptidos de calibración interna
mostraron patrones de fragmentación que se correspondían con las
secuencias de aminoácidos únicos de los isoalérgenos de Phl p 5 a y
Phl p 5b naturales.
Los análisis por EM de Bet v 1 natural digerido
con tripsina revelaron el péptido nativo a m/z 1552,76 y el péptido
patrón de calibración interna para los isoalérgenos Bet v 1 a m/z
1558, 77 (Figura 9). Los análisis por EM/EM del péptido de
calibración interna mostraron un patrón de fragmentación que se
correspondía con la secuencia de aminoácidos única de los
isoalérgenos de Bet v 1 naturales.
Para la cuantificación absoluta de los
isoalérgenos de Bet v 1, Phl p 1, Phl p 5a y Phl p 5b las muestras
pueden someterse a análisis mediante, por ejemplo, instrumentos
EM/EM anclados a CL tal como CLQ DecaXP (ThermoFinnigan), sistema
híbrido CL/EM/EM QSTAR® y sistema CL/EM/EM Q TRAP 4000 (Applied
Biosystems).
Los experimentos con los péptidos AQUA mostraron
que los péptidos sintéticos marcados con isótopos estables que
imitan las secuencias isoalérgenas nativas pueden usarse para la
cuantificación absoluta de los isoalérgenos en Phl p 1, Phl p 5 y
Bet v 1 naturales. Además, los análisis de bases de datos de las
digestiones trípticas no revelaron ninguna escisión fallida
mediante tripsina. La cromatografía bidimensional la combinación de
SCX y RP-HPCL como se describe para la química iTRAQ
puede usarse en el fraccionamiento de las mezclas de alérgenos más
complejas de patrones de calibración nativos idénticos e internos
sintéticos.
Claims (18)
1. Un procedimiento para la cuantificación de la
cantidad absoluta de alérgeno en una muestra de alérgeno, en el que
el alérgeno consiste en más de un isoalérgeno o isoalérgenos de
alérgeno o alérgenos homólogos que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- proporcionar una cantidad conocida de uno o más péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia a encontrar dentro del alérgeno a cuantificar mediante la identificación de una secuencia constante de aminoácidos dentro del alérgeno a cuantificar mediante la comparación de secuencias de aminoácidos de isoalérgenos o alérgenos homólogos y la preparación de un péptido patrón de calibración de alérgenos sintético que tiene esta secuencia constante y el marcaje de dicho péptido o péptidos patrones de calibración de alérgenos mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa,
- b)
- la degradación de la muestra de alérgeno para obtener una mezcla de péptidos y opcionalmente el marcaje de dichos péptidos con uno o más agente o agentes marcadores mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa, en la que si ambos péptidos en la muestra de alérgeno degradada y el péptido o los péptidos patrón de calibración de alérgenos se marcan, el agente o agentes marcadores usados para el marcaje del péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos son diferentes del agente o agentes marcadores usados para marcar los péptidos de la muestra de alérgeno degradada,
- c)
- la cuantificación de la cantidad absoluta de alérgeno mediante la correlación de la cantidad de péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno con la cantidad del péptido o péptidos correspondientes de la muestra de alérgeno degradado mediante espectrometría de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que la muestra de alérgeno se degrada para
obtener una mezcla de péptidos y el marcaje de los péptidos
obtenidos con uno o más agente o agentes marcadores mediante la
introducción de funcionalidades de modificación de masa y la
cantidad absoluta de alérgeno se cuantifica mediante la correlación
de la cantidad de péptido o péptidos patrón de calibración de
alérgenos marcados con la cantidad de péptido o péptidos marcados
correspondientes de la muestra de alérgeno degradado mediante
espectrometría de masas.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que la muestra de alérgeno se degrada para
obtener una mezcla de péptidos y la cantidad absoluta de alérgeno
se cuantifica mediante la correlación de la cantidad del péptido o
péptidos patrón de calibración de alérgenos marcados con la cantidad
de péptido o péptidos correspondientes de la muestra de alérgeno
degradado mediante espectrometría de masas.
4. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que el
péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno tiene una
secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de
aminoácidos de un péptido obtenido por degradación de acuerdo con
la etapa b.
5. El procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4, en que el alérgeno a
cuantificar consiste en más de un isoalérgeno.
6. El procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4 en el que el alérgeno a
cuantificar consiste en más de un alérgeno homólogo.
7. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el que el
alérgeno a cuantificar es uno o más isoalérgenos del grupo
constituido por Phl p 1, Phl p 5, Phl p 6, Poa p 1, Poa p 5, Dac g
1, Fes p 1, Lol p 1, Lol p 5, Der f 1, Der f 2, Der p 1, Der p 2,
Api m 1, Api m 2, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Dol m 1, Dol m 2, Dol
m 5, Dol a 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Amb a 1, Amb a 2, Par j 1,
Par o 1, Par m 1, Bet v 1, Cry j 1, Cry j 2, Per a 1, Ole e 1, Fel
d 1, Can f 1, Can f 2, Equ c 1, Equ c 2, Art v 1, Art v 2, Art v 3,
Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Cla h 1, Cla h 2, Cla h
6, Sol i 2, Sol i 3 y Sol i 4.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el alérgeno a cuantificar es uno o más
isoalérgenos seleccionados del grupo constituido por Phl p 1, Phl p
5, Phl p 6, Ole e 1, Der f 1, Der f 2, Der p 1, Der p 2, Ves v 1,
Ves v 2, Ves v 5, Amb a 1, Amb a 2, Par j 1, Par o 1, Par m 1, Bet v
1, Cry j 1 y Cry j 2.
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que alérgeno a cuantificar es uno o más
isoalérgenos seleccionados del grupo constituido por Der f 1, Der p
1, Der f 2 y Der p 2.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el alérgeno a cuantificar es uno o más
isoalérgenos seleccionados del grupo constituido por Phl p 1, Phl p
5, Phl p 6, Poa p 1, Poa p 5, Dac g 1, Fes p 1, Lol p 1 y Lol p
5.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el alérgeno a cuantificar es uno o más
isoalérgenos seleccionados del grupo constituido por Amb a 1 y Amb a
2.
12. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcaje
es con química ITRAQ^{TM}.
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el marcaje es con
ITRAQ-114, ITRAQ 115, ITRAQ 116 y/o ITRAQ 117.
14. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que (i) el
alérgeno a cuantificar es Der f 2 y el péptido de calibración
patrón de alérgeno comprende los aminoácidos 32-48
de Der f 2 o (ii) el alérgeno a cuantificar es Der p 2 y el péptido
de calibración estándar de alérgeno comprende los aminoácidos
32-48 de Der p 2.
15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que el alérgeno se
identifica de forma concluyente mediante la comparación de la mezcla
del péptido del alérgeno y el péptido o péptidos patrón de
calibración del alérgeno mediante el análisis de identificación
peptídica.
16. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de
alérgeno se degrada mediante la digestión con al menos una enzima
proteolítica hasta degradar parcial o completamente la muestra.
17. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que la enzima proteolítica se selecciona
del grupo constituido por tripsina, papaína, pepsina ArgC, LysC,
proteasa V8, AspN, pronasa, quimotripsina y carboxipeptidasa C o
una combinación de las mismas.
18. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que la enzima es una tripsina.
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