CN101356267A - 将水溶性活性蛋白转变为疏水性活性蛋白的方法，将该方法用于制备定向活性蛋白的单分子层的用途以及设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种将亲水性活性蛋白(HPiAP)转变为疏水性活性蛋白(HPoAP)的方法，适用于将它们的活性形式锚定在疏水性基层上。本发明也涉及规则的定向活性蛋白的单分子层的制备，这些定向活性蛋白固定在疏水性固体支持物上，可被用于机械操作和研究，包括在水溶液的原子力显微镜(AFM)，以及应用同样的设备来化验分析。

Description

将水溶性活性蛋白转变为疏水性活性蛋白的方法，将该方法用于制备定向活性蛋白的单分子层的用途以及设备
技术领域
本发明涉及一种将亲水性水溶性活性蛋白(hydrophilic active proteins，HPiAP)转变为疏水性活性蛋白(hydrophobic active proteins，HPoAP)的方法，通过在异类的相或者在同类的不同极性混合溶剂中以疏水性反应试剂对亲水性氨基酸表面残基进行共价修饰。该疏水化的蛋白自发地以统计学上的定向的单层方式自组装在多种不同的疏水性固体支持物上，适用于制造生物反应器和生物传感器，以及适用于机械操作和包括原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)在内的研究。
背景技术
大量的不同的实验性生物工程研究和/或应用需要紧密锚定在固体基底上的生物分子的单层。原子力显微镜(AFM)的例子是最有说服力的例子。原子力显微镜允许在原子尺寸的水平扫描固定在固体支持物上的样品。在足够扩增后，通过柔性悬臂所感应的信号，使得可对所检测的样品进行拓扑图分析。因此，原子力显微镜(AFM)允许在纳米尺度例如在1-200nm的尺度来检测样品。当在水溶液中进行该扫描时，也可以实现在生理环境下分析生物样品。然而，为获得相应于真实情形的图像，需要将所检测的生物样品稳定地固定在支持物上，以致当进行扫描时，该显微镜的尖端不会使样品移动。而且，该样品最好是应当组织为一个单分子层。
目前已知的制备固定在疏水性基底上的单分子层的方法，采用疏水相互作用，有利用天然疏水分子，见Dawn S.Y.Yeo等人的“组合的化学和高通量筛选(CombinatorialChemistry & High Throughput Screening)”，2004，Vol.7，No，3 pp.213-221，也有利用水溶性蛋白，通过改变温度、离子强度或者pH值而导致蛋白具有疏水性质，见Kapila Wadu-Mesthrige等人的“扫描显微镜杂志(Journal Scanning Microscopy)”，2000，Vol 22，pp.338-388，以及Hyun J.等人的“J.Am.Chem.Soc”2004，126(23)pp.7330-7335。这些方法缺乏选择性，因为这些化学-物理改变也可导致蛋白的活性位点的改变，因而会导致天然生物活性的丧失。
此外，疏水化蛋白也可通过对水溶性蛋白的遗传工程方法来制备，但是这些方法是非常复杂的，也不能保证蛋白原始活性的保留，见Hyun J.等人或C.Tranchant等人的“Rev.Neurol.(Paris)”1996，152(3)，pp.153-157。
由于这些原因，直到现在，人们只能实现对膜蛋白的研究，由于膜蛋白是天然地固定在脂质双分子层的，或者实现具有高尺寸的分子复合物的研究。没有关于水溶性蛋白的成像报道。
因此，本发明的保护范围是提供用于使亲水性的水溶性功能性蛋白疏水化的新方法，而该方法不会影响该蛋白的天然生物功能，以及提供能够扫描、成像和操作水溶性蛋白的装置。
发明内容
本发明涉及用于将亲水性水溶性活性蛋白(HPiAP)转变为疏水性活性蛋白(HPoAP)的方法，同时保持它们的原始生物活性。这些方法揭示了所述亲水性蛋白的不对称化学改变，也就是，这些方法引入了在位于远离或者相对于蛋白功能区域的部分的氨基酸表面残基上的化学改变。通过在异类的相或者在同类的不同极性混合溶剂中以“疏水化(hydrophobizing)”反应试剂进行反应而获得这样的结果。
本发明是基于这样的认识：蛋白的水溶性是由在它们表面上所发生的亲水性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基的数量的平衡所造成的。总的来说，在活性蛋白，例如酶，其表面的大量延伸区域被授权与水溶性小分子相互作用，这些水溶性小分子是不同的天然分子，即基底、抑制物、辅助因子和其他，该区域也就是活性位点，主要是亲水性的。
本发明所述的方法利用了极性的不对称分布以指引化学修饰反应的，需要改变该蛋白的远离或相对于活性位点的区域的蛋白性质。
这样所获得的“疏水化的(hydrophobized)”功能蛋白，接着通过疏水相互作用固定或者锚定在疏水固体支持物上，以便获得活性蛋白的定向的单分子层。
本发明所采用的术语“定向的(oriented)”是指：所述固定的蛋白主要地都将该分子的疏水化部分的朝向确定为附着在基底表面，而游离的活性位点是远离该附着点的。该术语并不是指：所述固定的分子都显示相同的空间取向，相反，这些分子的取向是随意的。
术语“单分子层(monomolecular layer)”是指：所获得的层都主要和最好是“单分子”，虽然所不希望形成的有限的多分子层通常是不可避免的。
因此，本发明的第一个目的是提供一种制备疏水性或部分疏水性的活性蛋白的方法，如权利要求1至8之一所述。
本发明的第二个目的是提供由天然亲水性活性蛋白制成的疏水性活性蛋白，如权利要9至10所述。
本发明的第三个目的是提供一种制备如权利要求11和13所述的设备的方法，以及所获得的设备。
本发明的更多目的是提供包含所述设备的生物反应器或者生物传感器。
本发明的进一步目的还提供了化验方法，以研究水溶性蛋白的构造，或者它与配基的复合物的构造，或者在该蛋白与配基或配基候选物之间的相互作用，如权利要求17和18所述。
本发明最后的目的是提供所述生物反应器或生物传感器的用途，作为固体反应支持物，用于制备用于诊断、遗传分析、免疫分析的微阵列，或者用于蛋白或遗传材料的机械操作，或者用于液体或气体的处理。
有许多因素可能影响诸如酶等活性蛋白的功能。例如，当构象或者电荷分布发生改变时，会产生构象效应；当所述基底与所述酶的相互作用受到空间位阻影响时，会产生空间位阻效应；当涉及所述支持材料的化学本质与涉及微环境的改变时，会产生分配效应。
因此，可以预期的是：疏水化反应可能改变所述活性蛋白的动力学和其他属性，例如，影响所述酶的特定活性。
然而，相反地，在实施例中报道的结果表明：本发明所要求的方法消除或者最小化了上述预期的活性的损失。
附图简要说明
图1。该图显示了由固定在硅片上的胆固醇-胰蛋白酶引起的BAPNA水解的从第0小时到第6小时的发展情况。
图2。该图报道了在水溶液中疏水锚定在硅片上的胆固醇-胰蛋白酶的拓扑图(150平方nm区域扫描)。组(a)显示了1μm区域的图像；组(b)显示了150nm区域的图像；组(C)代表所述单分子层的交叉区域。
图3。该图报道了在水溶液中疏水锚定在硅片上的胆固醇-胰蛋白酶的拓扑图(50平方nm区域扫描)。组(a)显示了50nm区域的图像；(b)显示了所述单分子层的交叉区域。
图4。该图报道了在水溶液中疏水锚定在硅片上的胆固醇-胰蛋白酶的拓扑图(24平方nm区域扫描)。组(a)显示了24nm区域的图像；(b)显示了所述单分子层的交叉区域。
图5。该图报道了由功能化的胰蛋白酶的tip设备通过后的蒸馏水的质谱图(上图)：该胰蛋白酶的自溶峰不存在。以及在溶液中的胰蛋白酶的质谱图(下图)：该胰蛋白酶的自溶峰是清晰可见的。
图6。该图显示了由功能化的胰蛋白酶的tip设备消化10分钟的人血清白蛋白(HSA)的质谱图(上图)：该胰蛋白酶的自溶峰不存在，而HAS各峰都是完全呈现的。以及在溶液中由胰蛋白酶过夜消化的HAS的质谱图(下图)：圆形处显示了一个自溶峰。
图7。该图显示了由阻碍根据本发明所述的策略II对胰蛋白酶分子的改变而导致的石英倾卸的动力学。该石英表面是由非常薄的金薄层所覆盖的，由thiocholesterols制成的疏水性材料。
本发明的详述
根据本发明所述的亲水性活性蛋白(HPiAP)是任何水溶性蛋白，选自：酶、激素、受体、抗原、抗体、过敏原、免疫反应蛋白、亲和伴侣和任何衍生物、片段、联合体以及它们的功能性等同物。特别地，该活性蛋白可以是任何酶，它的天然形式选自以下通常的分类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。这是指任何一种实际在使用的酶，是研究和工业应用中所采用的基础性的酶，例如，胰岛素、肌肉醛缩酶、淀粉酶、脂肪酶、胶原酶或者弹性蛋白酶。
通常，在蛋白的化学修饰实践中，蛋白和反应试剂都在水溶液中(均相反应)。然而，对于目前的发明的两个主要限制因素是：改变的蛋白(例如酶)必须保留其活性，而反应试剂必须是小分子或者完全溶于水。
因此，为了将亲水性活性蛋白转变为疏水性或部分疏水性蛋白，同时保持其功能性，已开发出两种不同策略，其目标都在于对远离或相对于活性位点的部分进行“疏水化(hydrophobizing)”，这必须保持蛋白自身的天然构象和性质。
[策略I]第一个策略是含有一个异类的固/液系统。所述的活性位点以及周围区域是通过附着在固体矩阵上来可逆地保护(通过亲和层析)。固相上负载有特定用于所述功能蛋白的活性位点的配基。接着在所固定的蛋白上进行所述“疏水化”步骤。将反应试剂溶解在缓冲液中，作为洗脱液，也就是液相。这这种方式下，所述蛋白分子中只有远离活性位点的部分才会被强制暴露给洗脱液。
任何适用于色谱层析的商业化的可用的亲和矩阵都可被用于本发明，例如，基于右旋糖苷或者基于纤维素的树脂，如磷酸纤维素。已知材料是适合于许多功能基团，这些功能基团适用于连接任何类型的配基，例如底物类似物、可逆抑制物、辅因子。因此，所述亲和固相的制备和用于负载所述亲水性蛋白的环境，以及所述疏水化蛋白的后续洗脱，都是本领域技术人员所熟知的。该洗脱通常可通过亲和洗脱来进行。
根据这个方法，在蛋白分子的活性位点上偶然改变的氨基酸残基将在洗脱步骤中分离。
[策略II]第二个策略包含液/液混溶物，通过将所述亲水性蛋白溶解在极性溶剂(通常是水)中，将疏水反应试剂溶解在至少部分易于与水混溶的低极性溶剂中。根据两种溶剂的极性差异，以及所加入的溶剂体积，可建立两种反应机制：
a)这两种溶剂是部分不混溶的：产生两个宏观相，在这两相之间的界面上发生所述亲水性蛋白和所述疏水性反应试剂之间的反应。在这种情形下，蛋白倾向于将它的活性位点指向所述极性相，因为该活性位点和它的周围是该蛋白表面的最高极性的区域。因此，参与所述疏水化反应的残基都位于远离该活性位点的部分，这样避免了反应对蛋白活性的影响。本发明所述的这个实施例不是最优的，因为该蛋白仍倾向于沉淀在所述界面处，将导致最终产量的降低。
b)在最优的机制中，所述两种溶剂是可混溶的。在本例中，不同溶解微环境在分子水平产生混合。反应试剂分子的疏水性部分是不溶于极性溶剂的，而在混合物中，这部分可被低极性溶剂分子所溶解。另一方面，极性溶剂分子围绕着该蛋白分子的大多数亲水性部分。所述疏水化反应在一个极性梯度下进行：该疏水化反应试剂的最高极性区域倾向于与该蛋白的较低极性区域(也就是，远离活性位点的区域)进行反应。即使在本例中，属于所述活性位点区域的残基参与反应的可能性是非常低的，因而该蛋白的活性得以保留。
为进一步确保活性的保留，可选的方法是能保护负责活性的氨基酸或者改善从事识别、相互作用和接触反应的氨基酸，通过共溶解在同一液相中，保护诸如底物、底物类似物和/或竞争性抑制物等分子。
在该反应后，经化学修饰的蛋白可通过疏水交互层析、透析或者其他纯化方法来纯化。
极性溶剂(或者水溶液)是指任何在水中的溶解物，对蛋白功能是中性的。
而低极性溶液是指任何所熟知的部分可溶或部分不可溶于水的溶剂，例如，烷基醇类、烷基胺类、卤代烷烃类，等等。
化学修饰
许多氨基酸残基在侧链上具有功能基团，例如-NH2、-OH、-SH，因此，这些基团是适用于与疏水化反应试剂进行反应的：这些氨基酸是Thr、Met、Trp、Lys、Arg、Asp、Cys、Glu、His、Ser、Tyr。从这个列举中，排除了那些具有侧链氨基基团的氨基酸、具有碳氢化侧链的氨基酸以及甘氨酸，因为这些氨基酸在所暴露的蛋白表面的浓度是相对较低的，更为重要的是，因为它们的疏水化侧链是不反应的。因此，需要进行大量的可能的修饰。
由能将一个或多个亲水性氨基酸残基转变为疏水性残基，或者能将大的高疏水性部分附着到合适的极性氨基酸的化学反应试剂所引起的任何化学修饰，都可用于将所述水溶性亲水性蛋白转变为疏水性蛋白。该转变可发生在同一氨基酸残基或者发生在不同的氨基酸残基上。
合适的疏水化反应试剂是能完成任何共价修饰的化合物，包括但不限于：O-，N-，S-烷化、O-，N-，S-酰化、重氮联接、肽键形成、芳基化、席夫碱形成以及其他类似反应。这些反应试剂的例子是：酰基氢化物、酰基氯化物、重氮化合物、醛类、酮类，也包括能整合大的脂性部分，例如胆固醇-氯磷化物(cholesteryl-chlorophormate)或等同物。
所导致被修饰的蛋白质是双溶性的，比天然形式的蛋白具有更高的疏水性，其特征在于：非极性/极性残基的不对称的分布，保持它的水溶性和它的原始功能，因为其活性位点在整个反应过程都得到保护。
根据这两个策略，所述的方法可包括一个可选的步骤，即将疏水化的活性蛋白从随机失活的蛋白中分离出来。任何利用蛋白对特定底物的亲和性，或者利用已修饰蛋白的更大的疏水性的蛋白纯化程序，都可被用于纯化该活性产物。这些方法包括：亲和层析和亲和洗脱程序或者直接在疏水AFM-底物上的蛋白分子的水洗脱。
有许多因素会影响诸如酶等活性蛋白的功能。例如，当构象或者电荷分布发生改变时，会产生构象效应；当所述基底与所述酶的相互作用受到空间位阻影响时，会产生空间位阻效应；当涉及所述支持材料的化学本质与涉及微环境的改变时，会产生分配效应。
因此，可以预期的是：本发明所述的疏水化反应可能改变所述活性蛋白的动力学和其他属性，例如，降低所述酶的特定活性。
然而，相反地，在之后实施例中报道的结果表明：本发明所要求的方法消除或者最小化了上述预期的活性的损失。
固定
根据本发明所述方法获得的疏水化活性蛋白是适合于通过疏水反应结合在疏水基底上。这些后续步骤导致组装为一个有序的层，优选是在基底表面上的蛋白的单分子层。而且，该疏水力变得更强，足以允许用水洗去未修饰的分子，这样有助于高效纯化手段的实现。
合适的疏水基底是任意支持物，天然疏水性的或者通过衍生制成疏水的。例如，该基底可以通过覆盖诸如巯基化脂质等的功能化脂质而致使疏水化，例如thiocholesterol或其他能与所述基底的表面反应的等同的脂类。所述基底包括但不限于：天然聚合物，例如纤维素，或者合成聚合物，例如PVC、聚丙烯酸酯、尼龙、聚乙烯、特氟纶、含碳材料、硅、玻璃、树脂、金属颗粒或金属片、纸和类似物。该支持物可以采用以下形式：晶片、厚片、薄层、薄片、管、纤维、微粒、粒状或粉末，均可在宏观大小、微观大小或者纳米大小，也可以有原子平面、光滑表面或者粗糙表面。
由所述疏水化活性蛋白固定在所述疏水或疏水化基底而制成的复合物是适用于制备生物反应器或者生物传感器的装置。这些装置可以采用以下“激活的”形式：晶片、厚片、薄层、薄片、管、纤维、微粒、粒状或粉末，均可在宏观大小、微观大小或者纳米大小。
本发明所述的装置是组装在生物反应器或者生物传感器内的。例如，粒状的激活颗粒可被用于组合的模块，装入普通实验室用的可替换的尖管嘴(laboratory tip)中，或者可被用于组合的过滤器，装入一个容器或者圆柱内。厚片、薄层、薄片可被组装进微阵列试剂盒中，这些试剂盒用于诊断、遗传分析、免疫分析，或者用于蛋白或遗传材料的机械操作。
我们的结果表明：引出的分子和锚定的分子相对于天然分子，在结构上和功能上都没有明显差别。这些实施例举例说明：这些酶保持了它们的大多数天然活性。
包覆在硅片上的酶的AFM观察结果和酶活性分析结果表明：在所述附着的分子上仍保持其活性构象，而在AFM扫描和对所述已修饰蛋白的多维计算都表明相似的结果，即：未激活或者错误修饰的分子已经被洗去(见图1、图2、图3和图4)。
更为重要的事实是：所述疏水交互作用是非常强和稳定的，以致可在水介质中重复使用蛋白包被的支持物，例如，重复进行酶分析。
因为所述锚定在所述疏水支持物上的蛋白分子，是在一个区域被化学修饰的，该区域不包含活性位点，这些分子在水介质中都将活性位点指向水相。这是有利的情形以便在原子级的分解水平来研究所述活性蛋白与几个小分子的相互作用机制，这些小分子诸如底物、底物类似物、变构效应物、抑制物、抗体等。
而且，因为每个蛋白分子都是稳定地锚定在所述支持物上，这个固定的构象避免了在分子之间的偶然接触，因此避免了所不希望的损害反应。这样，发生在水溶液中的诸如底物、抑制物、效应物等与这些分子的意外接触，使处于实验的控制下的。这些情形致使在生物反应器或生物传感器中持久地形成活性蛋白指向有序的单分子层，适合于被用于药品、工业和环境分析化学。本发明提供了一种简单方法，用于制造这样的生物传感器，这些生物传感器采用几百个目前用于应用生物学的任意领域的水溶性酶或者其他活性蛋白。
本发明也涉及评估采用所要求保护的生物反应器和生物传感器来研究水溶性活性蛋白的构象或者它与配基的复合物的构象，通过对所固定的定向蛋白和/或它的复合物的单分子层通过原子力显微镜(AFM)成像。这类评估是尤其可用于研究在水溶性蛋白和配基候选物之间的相互作用，以便世界新的配基。本发明所述的固定的蛋白也适合于作为固体的反应支持物，用于制备用于诊断、遗传分析、免疫分析的微阵列，或者用于蛋白或遗传材料的机械操作。
最后，所述衍生方案能修改为获得更多大量的“疏水化的”分子或在不同表面区域(包括活性位点)随机修饰的分子。因此可获得大量的修饰分子。在水介质中，所有这些分子将本能地以一种随机定向方式排列，以在所述疏水基底上形成一个层。同时采用该活性形式图像，并采用同一分子的多个不同方向的图像，将可对正在研究的所述定向分子的图像进行计算机精确重构。
本发明还在以下实施例中进一步进行详细描述，这些实施例都是只是描述了本发明的一些特例，而不是对本发明保护范围的限制。
实施例1和2描述了本发明所涉及的两个总策略，用于制备所要求保护的包覆蛋白的支持物，用于在水溶液中的生物工程应用。
两种水溶性天然酶，称为肌肉醛缩酶和胰岛素，它们都是在体外共价修饰的，通过烷化起始氨基基团以获得两性蛋白分子。
实施例1(策略I)：所用的HPiAP是兔肌肉醛缩酶，烷化剂是乙酸酐。衍生反应是在不同相中进行的。每次亲和层析，所述HPiAP被吸附在磷酸纤维素柱上(磷酸纤维素是底物1，6-二磷酸果糖的类似物)，与渗透的乙酸酐水溶液反应，然后用底物1，6-二磷酸果糖洗脱。赖氨酰基残基的滴定结果表明：每个分子有15个残基已被修饰。该转变的HPoAP的活性具有未改变的动力学参数。该醛缩酶活性是采用1，5-二磷酸果糖作为底物，并用甘油醛磷酸脱氢酶和三磷酸异构酶作为辅酶来进行评估(见表I)。
表I
  动力学参数   天然分子   15乙酰化赖氨酰基残基
  Vmax   2000   3200
  Km(μM)   23   22
实施例2(策略II)：所用的HPiAP是胰岛素，烷化剂是溶于丙醇溶液的胆固醇-氯磷化物(cholesteryl-chlorophormate)。胰岛素的水溶液是与胆固醇-氯磷化物的丙醇溶液相混合，高速旋转30分钟。在所述反应结束后，收集该疏水化的胰岛素。
在该反应后，所述化学修饰的蛋白是通过采用Phenyl HS树脂的疏水交互层析来纯化的，以0-30mM硫酸铵在20mM Gly-HCl缓冲液进行洗脱。构建为蛋白和活性的主峰的片断被用作固定实验。在衍生后，该胰岛素的活性以N-a-苄基-DL-精氨酸-p-硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)作为合成底物在pH8进行评估。结果表明：HPoAP具有完全活性、未改变的动力学参数，每个分子有3个赖氨酰基残基被修饰。
将硅胶浸入胆固醇-胰岛素溶液中，反复用水清洗，浸入所述合成底物BAPNA溶液中，在pH 8缓冲液中37℃温育所报道的时间。浸入同样溶液中的硅片则用作对照。出现黄色，则表明所锚定的胆固醇-胰岛素在多次水洗后仍保持蛋白水解活性(见图1)。
所固定的酶在多个月内都有活性，通过采用BAPNA(N-a-苄基-DL-精氨酸-p-硝基苯胺盐酸盐)作为基底的分光光度分析来评估，结果表明：在双性酶分子和疏水硅片之间的疏水结合是强而持久的。
包覆了胆固醇-胰岛素的硅片是通过AFM在10-8N和1000nm/sec的条件下进行扫描的。该扫描的图像报道在图2、图3和图4种。
表2
  动力学参数   天然分子   3个赖氨酰基残基被修饰
  特定活性   1.1   0.90
  Km(μM)   1.67   1.68
实施例3：腺苷脱氨酶是根据本发明所述的液/液策略II而被疏水化的。该疏水化媒介是以溶于丙醇溶液的胆固醇-氯磷化物为代表。
实施例4：Citosine脱氨酶是根据本发明所述的液/液策略II而被疏水化的。该反应的机制类似于实施例2。
实施例5：谷氨酸-草酰乙酸转氨酶是根据本发明所述的液/固策略I而被疏水化的，采用吡哆醛磷酸结合树脂作为亲和层析的固相。
实施例6：丙胺酸-丙酮酸盐转氨酶是根据本发明所述的液/固策略I而被疏水化的，采用吡哆醛磷酸结合树脂作为亲和层析的固相。
实施例7：苹果酸脱氢酶是根据本发明所述的液/固策略I而被疏水化的，采用烟碱结合树脂作为亲和层析的固相。
实施例8：乙醇脱氢酶是根据本发明所述的液/固策略I而被疏水化的，采用烟碱结合树脂作为亲和层析的固相。
实施例9：脂肪酶是根据本发明所述的液/固策略I而被疏水化的，采用丙酰乙酸乙酯结合树脂作为亲和层析的固相。
应用实施例
实施例10：一种用于消化溶液中蛋白的生物反应器，是通过将小牛胰岛素以类似于实施例2的方法衍生后而制备的，并将该蛋白支撑在PVC(聚氯乙烯)颗粒上。这些颗粒用于组装在普通实验室用的可替换的尖管嘴(laboratory tip)中的模块。该装置可以消化溶液中的蛋白，具有增强的消化反应性能。尤其是，与经典的通过直接在溶液中加入胰岛素的蛋白消化规程相比，采用本功能化的可替换的尖管嘴装置，可获得以下三点主要改善：
a)本装置不会在溶液中释放胰岛素分子；
b)本装置减少(甚至消除)了胰岛素的自溶片断；(见图5和图6)
c)对于一个好的蛋白质谱分析所需的消化时间从经典的溶液消化规程的过夜期间缩短到只需几分钟(1至10分钟，取决于所需消化的蛋白浓度)(见图6)。
实施例11。建立了一个类似于实施例10所描述的生物反应器，在该生物反应器中，几个结合了不同疏水化的水解酶的PVC粉末的模块在一管道内连接在一起。该装置是用于纯化工业活动的废水。这些用于所述模块内的特殊酶将根据所需纯化的废水的组成而改变：例如，为纯化面包店废水，采用淀粉酶和胰岛素来激活该模块。为纯化来自制革厂的废水，采用脂肪酶、胶原酶和弹性蛋白酶来激活该模块。
实施例12。建立了一种生物传感器，在石英圆盘上覆盖薄金表面。该表面已经通过覆盖一层thiocholesterols而被疏水化，本能地与金层发生反应，产生一个有序的层。该疏水化的表面可适用于支撑通过上述两种策略而获得的疏水化蛋白。可计算该蛋白阻滞程度，通过蛋白块在石英自发振荡频率的诱导而评估堆积的数量(见图7种的一个例子)。被阻滞的活性蛋白可用作用于任何特定的蛋白与蛋白的相互作用的探针。在该探针与用于识别的特定因子之间的连接可以被读作在所述石英振动中的进一步堆积。

Claims (20)

1、一种制备疏水性或部分疏水性活性蛋白的方法，包括以下步骤：用能使一个或多个亲水性氨基酸残基转变为疏水性残基的试剂与水溶性活性蛋白发生反应，其中所述蛋白活性位点是通过以下方式保护的：在异类的相或者同类的不同极性混合溶剂中进行疏水化反应。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应是在固/液体系或者液/液体系中进行的。
3、根据权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：将所述水溶性活性蛋白通过它的活性位点固定在亲和矩阵上；以所述试剂与所述固定的蛋白进行反应；从所述矩阵上洗脱所述疏水化的活性蛋白。
4、根据权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：将所述水溶性活性蛋白溶解在水溶液中；将所述试剂溶解在低极性溶剂中，至少部分地可与水混合；制备一种极性/低极性的均匀混合物；由此使所述蛋白与所述试剂发生反应；回收所述的疏水化的活性蛋白。
5、根据权利要求4所述的方法，还包括以下步骤：将特定用于所述蛋白的活性位点的可逆配体溶解在所述水溶液中。
6、根据权利要1至5之一所述的方法，其特征在于：所述的能将亲水性氨基酸残基转变为疏水性残基的试剂是选自：烷化剂、酰化剂、芳基化剂、重氮基化剂、肽键形成剂、席夫碱形成剂或者能引入疏水部分的化合物。
7、根据权利要1至6之一所述的方法，其特征在于：所述的水溶性活性蛋白是选自：酶、激素、受体、抗原、抗体、过敏原、免疫反应蛋白、亲和伴侣和衍生物、片段以及它们的功能性等同物。
8、根据权利要求7所述的疏水化的活性蛋白，其特征在于：所述的水溶性活性蛋白是选自：肌肉醛缩酶、胰岛素、淀粉酶、脂肪酶、胶原酶或者弹性蛋白酶。
9、通过如权利要求1至8之一所述的方法所获得的疏水化的活性蛋白，在该蛋白远离活性域或者位于与活性域相反的部分，有一个或多个亲水性氨基酸残基转变为疏水性残基。
10、根据权利要求9所述的疏水化的活性蛋白，其特征在于：具有一个或多个亲水性氨基酸残基转变为胆甾醇氨基酸残基。
11、一种制备一种设备的方法，该设备由固定在固体支持物上的定向活性蛋白的单分子层组成，该方法包括以下步骤：将如权利要求9或10所述的疏水化的活性蛋白与疏水性固体支持物相接触。
12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述疏水性固体支持物是选自：天然的或合成的多聚物、碳材料、硅、金属、树脂，所有可选的使其疏水化的衍生物。
13、根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述疏水性固体支持物是选自以下形式：晶片、厚片、薄层、薄片、管、纤维、微粒、粒状或粉末。
14、一种通过根据权利要求11至13之一所述的方法获得的设备。
15、根据权利要求14所述的设备，其特征在于，所述设备是选自以下形式：包装在实验室用的可替换的尖管嘴内的套筒，或者是过滤器，或者是微阵列支持物。
16、一种生物反应器或者生物传感器，包含根据权利要求14或15所述的设备，或者由根据权利要求14或15所述的设备组成。
17、一种用于研究水溶性蛋白和配体或配体候选物之间的相互作用的方法，包括以下步骤：
制备根据权利要求12或13所述的设备；
以所述配体或配体候选物接触所述已固定的蛋白；以及
通过原子力显微镜即AFM对所述蛋白和/或它的复合体成像。
18、一种用于研究水溶性蛋白材料的构造的技术，包括以下步骤：
将所述蛋白材料转变为一种任意疏水化的材料；
以一种疏水性固体支持物接触所述疏水化的材料，以获得任意定向的固定的蛋白材料的单分子层；
通过原子力显微镜即AFM对所述材料成像；
通过计算机辅助手段重构所述原始材料的图像。
19、根据权利要求14所述的设备用于制备用于诊断、遗传分析、免疫分析的微阵列以及用于蛋白或基因材料的机械操作的用途。
20、根据权利要求15所述的设备用于制备用于处理液体或气体的生物反应器的用途。
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