CN101356185A - 雄激素受体调节剂的多晶型物-N-(3H-咪唑并[4,5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-雄-1-烯-17-β-甲酰胺 - Google Patents

雄激素受体调节剂的多晶型物-N-(3H-咪唑并[4,5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-雄-1-烯-17-β-甲酰胺 Download PDF

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Abstract

结构式I的化合物是组织选择性方式的雄激素受体(AR)的调节剂。这些化合物可单独地或与其它活性剂组合用于变弱肌紧张性的增强和由雄激素缺乏引起的或可以通过雄激素给药改善的病况的治疗，所述病况包括骨质疏松症、骨质减少、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、牙周病、骨折、骨重建术后的骨损伤、肌减少症、脆弱、皮肤老化、雄性性腺机能减退症、妇女绝经后症状、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高脂血症、肥胖症、再生障碍性贫血和其它造血障碍、炎症性关节炎和关节修复、HIV－消瘦、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、腹部肥胖症、代谢综合征、II型糖尿病、癌性恶病质、阿尔茨海默氏病、肌营养不良、认知下降、性机能障碍、睡眠呼吸暂停、抑郁症、卵巢早衰和自身免疫性疾病。

Description

雄激素受体调节剂的多晶型物-N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-雄-1-烯-17-β-甲酰胺
技术领域
本发明涉及N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶和无定形形式以及溶剂合物，所述化合物是组织选择性雄激素受体调节剂(SARM)。该SARM从而可用于治疗由雄激素缺乏引起的或可通过雄激素给药改善的病况，如骨质疏松症、牙周病、骨折、脆弱(frailty)和肌减少症(sarcopenia)。另外，本发明的SARM可用于治疗与低睾酮有关的精神障碍，如抑郁症、性机能障碍和认知下降。SARM，作为特定组织中的拮抗剂，还可用于其中升高的雄激素水平或活性引发症状的病况，如良性前列腺增生和睡眠呼吸暂停。
背景技术
雄激素受体(AR)属于类固醇/甲状腺激素核受体的超家族，该超家族另外的成员包括雌激素受体、孕酮受体、糖皮质激素受体和盐皮质激素受体。AR在身体的多种组织中表达，并且是用以介导雄激素如睾酮(T)和二氢睾酮(DHT)的生理学以及病理生理学作用的受体。在结构上，AR由三个功能域组成：配体结合域(LBD)、DNA结合域和氨基末端域。结合于AR并且模拟内源性AR配体的作用的化合物被称为AR激动剂，而抑制内源性AR配体的作用的化合物被称为AR拮抗剂。
雄激素配体结合于AR产生配体/受体复合物，其在转移到细胞核中之后结合于存在于细胞核中的靶基因的启动子区或增强子区的DNA调控序列(称为雄激素反应元件)。然后募集称为辅因子的其它蛋白质，它们结合于受体引起基因转录。
雄激素治疗已被用于治疗多种雄性病，如生殖障碍和原发性或继发性雄性性腺机能减退症。此外，已经研究了许多天然或合成的AR激动剂，用于治疗肌与骨胳疾病，例如骨病、造血障碍、神经肌肉疾病、风湿病学疾病、消耗性疾病，和用于激素替代治疗(HRT)，如雌性雄激素缺乏。另外，AR拮抗剂如氟他胺和比卡鲁胺用于治疗前列腺癌。因此，可用于以组织选择性方式活化(“激动”)AR功能的化合物是有用的，其可产生所需的雄激素的骨骼和肌肉的合成代谢作用，而没有消极的雄性化特征，如雄性化和抑制高密度脂蛋白胆固醇(HDL)。
雄激素对绝经后骨质疏松中骨的有利作用在最近的使用组合的睾酮和雌激素给药的研究中有案可查[Hofbauer等人，Eur.J.Edocrinol.140：271-286(1999)]。在大型的2年、双盲对比研究中，口服结合雌激素(CEE)和甲基睾酮的组合表现出有效促进脊柱和髋部中的骨质量增加，而单独的结合雌激素治疗预防骨损失[J.Reprod.Med.，44：1012-1020(1999)]。
另外，有证据表明在用CEE和甲基睾酮治疗的妇女中热潮红减少；然而，治疗妇女中有30％受到粉刺和面部毛发显著增加(所有当前的雄激素药物疗法的并发症)的困扰[Watts等人，Obstet.Gynecol.，85：529-537(1995)]。还发现向CEE中加入甲基睾酮降低HDL水平，如其它研究中所示的。因此，当前雄激素治疗的雄性化可能性和对脂质分布的影响提供了用于开发组织选择性雄激素受体激动剂的理论基础。
雄激素在男性的骨新陈代谢中起到重要作用[Anderson等人，“Androgen supplementation in eugonadal men with osteoporosis-effects ofsix months of treatment on bone mineral density and cardiovascular riskfactors”，Bone，18：171-177(1996)]。即使在患有骨质疏松症的性腺丰富的(eugonadal)男性中，对睾酮治疗的治疗学反应显示雄激素发挥重要的骨合成代谢作用。在肌内注射睾酮酯250mg给药5到6个月之后，平均的腰部BMD从0.799gm/cm2增加到0.839g/cm2。因此SARM可用于治疗男性的骨质疏松症。
雄激素缺乏在经历雄激素剥夺治疗(ADT)的D阶段前列腺癌(转移性)的男性中发生。通过长效的GnRH激动剂实现内分泌睾丸摘除术，而用AR拮抗剂实现雄激素受体封闭。响应于激素剥夺，这些男性遭受热潮红、骨损失显著、脆弱和疲劳。在患有D阶段前列腺癌的男性参予的初步研究中，在经历ADT超过一年的男性中比没有经历ADT的患者中的骨质减少(50％对38％)和骨质疏松(38％对25％)更常见[Wei等人，Urology，54：607-611(1999)]。在经历ADT的男性中，腰部脊柱BMD显著更低。因此，在骨和肌肉中缺乏拮抗作用的前列腺中，组织选择性AR拮抗剂可以作为用于治疗前列腺癌的有用药物，其单独使用或作为常规ADT的辅助剂[还参见A.Stoch等人，J.Clin.Endocrin.Metab.，86：2787-2791(2001)]。
组织选择性AR拮抗剂也可治疗绝经后妇女中的多囊性卵巢综合征。参见C.A.Eagleson等人，“Polycystic ovarian syndrome：evidence thatflutamide restores sensitivity of the gonadotropin-releasing hormone pulsegenerator to inhibition by estradiol and progesterone”，J.Clin.Endocrinol.Metab.，85：4047-4052(2000)。
SARM也可治疗某些造血障碍，因为雄激素刺激肾肥大和促红细胞生成素(EPO)产生。在引入重组人EPO之前，雄激素用于治疗由慢性肾衰竭引起的贫血。另外，雄激素增加患有不严重的再生障碍性贫血和脊髓发育异常综合征的贫血患者中的血清EPO水平。贫血的治疗要求例如可以由SARM提供的选择性作用。
SARM也可具有作为治疗肥胖症的辅助剂的临床价值。降低人体脂肪的这种方法得到发表的雄激素给药减少肥胖患者的皮下和内脏脂肪的观察结果的支持[J.C.Lovejoy等人，“Oral anabolic steroid treatment，but not parenteral androgen treatment，decreases abdominal fat in obese，older men，″Int.J.Obesity.19：614-624(1995)]、[J.C.Lovejoy等人，″Exogenous Androgens Influence Body Composition and Regional Body FatDistribution in Obese Postmenopausal Women-A Clinical Research CenterStudy”，J.Clin.Endocrinol.Metab.，81：2198-2203(1996)]。因此，没有不希望的雄性化作用的SARM在治疗肥胖症中是有利的。
雄激素受体激动剂还可针对新陈代谢综合症(胰岛素抗性综合症、综合症X)，特别是在男性中，具有治疗价值。男性中的总的和游离的睾酮和性激素结合球蛋白(SHBG)的低水平与II形糖尿病、内脏肥胖症、胰岛素抗性(血胰岛素增多、异常脂血症)和新陈代谢综合症有关。D.Laaksonen等人，Diabetes Care，27(5)：1036-1041(2004)；还参见D.Laaksonen等人，Euro.J Endocrin.149：601-608(2003)；P.Marin等人，Int.J.Obesity，16：991-997(1992)，和P.Marin等人，Obesity Res.，1(4)：245-251(1993)。
雄激素受体激动剂也可具有对抗神经变性疾病如阿尔茨海默氏病(AD)的治疗学价值。雄激素通过雄激素受体诱导神经保护的能力由J.Hammond等人的“Testosterone-mediated neuroprotection through theandrogen receptor in human primary neurons”，J.Neurochem.，77：1319-1326(2001)报道。Gouras等人报道说睾酮减少阿尔茨海默氏β-淀粉样蛋白肽的分泌，并且因此可用于治疗AD[(Proc.Nat.Acad.Sci.，97：1202-1205(2000)]。还描述了与进行性AD有关的抑制蛋白质过磷酸化作用的机制[S.Papasozomenos，″Testosterone prevents the heatshock-induced overactivation of glycogen synthase kinase-3β but not ofcyclin-dependent kinase 5 and c-Jun NH2-terminal kinase andconcomitantly abolishes hyperphosphorylation of τ：Implications forAlzheimer′s disease”，Proc.Nat.Acad.Sci.，99：1140-1145(2002)]。
雄激素受体激动剂也可对肌紧张性和肌力产生有利的作用。最近的研究显示，“在健康的、性机能减退的男性中的生理学雄激素替代与不含脂肪的物质、肌肉大小和最大主动力(voluntary strength)的显著增加有关”[S.Bhasin等人，J.Endocrin.，170：27-38(2001)]。
雄激素受体调节剂可用于治疗男性和女性中的性欲降低。男性中的雄激素缺乏牵涉性欲降低。S.Howell等人，Br.J.Cancer，82：158-161。低的雄激素水平有助于许多妇女在她们的晚年生殖年份中的性情趣下降。S.Davis，J.Clin.Endocrinol.Metab.，84：1886-1891(1999)。在一项研究中，循环的游离睾酮与性渴望正相关。同上出处。在另一项研究中，为患有原发性或继发性肾上腺机能不全的妇女提供生理学DHEA替代(50mg/天)。与服用安慰剂的妇女相比较，给药DHEA的妇女表现出性意念的频率、性情趣和性满足的增加。W.Arlt等人，N Engl.J.Med.341：1013-1020(1999)还参见K.Miller，J.Clin.Endocrinol.Metab.，86：2395-2401(2001)。
另外，雄激素受体调节剂也可用于治疗认知损伤。在最近的研究中，对绝经后妇女给予单独的或与高剂量口服甲基睾酮组合的高剂量口服雌激素四个月的时间。在四个月的激素治疗前后进行认知测试。研究发现，接受雌激素(1.25mg)和甲基睾酮(2.50mg)的组合的妇女在建筑物记忆(the Building Memory)任务中保持稳定的表现水平，而接受单独的雌激素(1.25mg)的妇女显示出能力降低。A.Wisniewski，Horm.Res.58：150-155(2002)。
N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺具有以下结构式：
Figure A20068005040500101
该化合物先前已在于2003年9月25日公开的国际申请WO03/077919中公开。
发明内容
本发明涉及N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶多晶型、假多晶型(pseudopolymorphic)和无定形固态形式、其用途和药物组合物。本发明另外提供制备N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无定形和结晶固态形式的方法。
对活性物质的多种物理化学性质的认识对于优化该物质在化合物寿命周期的全部方面的应用，包括例如其生产和制药过程，和/或其储存、运输和治疗剂应用是重要的。有时，药理学活性化合物不能被制成适当的药物组合物，因为活性化合物具有不利的物理性质，诸如例如研磨性差或溶解性差。
本发明的一方面提供N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶多晶型和假多晶型以及无定形固态形式。本发明的无定形和结晶固体形式具有良好的生化性质；合乎需要的稳定性特征；合乎需要的医学性质；以及良好的加工性质。本发明的结晶和无定形固态形式可被引入到各种不同的制剂媒介物中，使得它们特别适于药学应用。
式I化合物的固态形式有效地作为雄激素受体激动剂，并且特别有效地作为SARM。本发明的多晶型、假多晶型和无定形固态形式因此可用于治疗由雄激素缺乏引起的或可通过雄激素给药改善的病况。
附图说明
图1是化合物I的无水结晶形式A的特征X射线衍射图形。
图2是化合物I的无水结晶形式A的碳-13交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱。
图3是化合物I的无水结晶形式A的氟-19交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱。
图4是化合物I的无水结晶形式A的典型的DSC曲线。
图5是化合物I的结晶形式B的X射线衍射图形。
图6是化合物I的结晶形式B的典型的DSC曲线。
图7是化合物I的结晶水合物形式C的X射线衍射图形。
图8是化合物I的结晶水合物形式C的DSC曲线。
图9是化合物I的无水结晶形式D的X射线衍射图形。
图10是化合物I的无水结晶形式D的碳-13交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱。
图11是化合物I的无水结晶形式D的氟-19交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱。
图12是化合物I的无水结晶形式D的DSC曲线。
图13是化合物I的结晶四水合物形式E的XRPD。
图14是化合物I的结晶四水合物形式E的碳-13交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱。
图15是化合物I的结晶四水合物形式E的氟-19交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱。
图16是化合物I的结晶四水合物形式E的DSC曲线。
图17是化合物I的倍半水合物形式F的X射线衍射图形。
图18是化合物I的倍半水合物形式F的TGA曲线。
图19是化合物I的结晶乙醇合物(ethanolate)形式G的X射线衍射图形。
图20是化合物I的结晶乙醇合物形式G的典型的DSC曲线。
图21是化合物I的无定形形式的XRPD。
发明详述
本发明提供了具有以下结构式的N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的多晶型和假多晶型形式，包括结晶、溶剂合物、水合物和脱水物以及无定形固态形式。
Figure A20068005040500121
本发明还涉及包括本发明化合物的固态形式和可药用载体的药物组合物。
多晶型物是同一化合物的两个或多个晶相，其在晶格中具有不同的分子排列和/或构象。活性药物化合物的不同的多晶型物可表现出不同的物理性质和化学性质。给出的活性药物化合物的不同的物理性质和化学性质还可根据水/溶剂含量的不同而异。假多晶型物包括化合物的水合物和溶剂合物。假多晶型物将一种或多种溶剂或水引入到化合物的晶格内。
化合物的固态物理性质可通过控制获得固体形式的化合物的条件被影响。化合物的不同的晶体结构可在物理性质和化学性质如颜色、稳定性、可加工性、溶解性和甚至生物利用率方面表现出差异。例如，影响粒子如何流动通过彼此的流动性是可影响化合物如何进行研磨的这样一种固态物理性质。为了弥补差的流动性和获得可研磨的药物片剂，通常，药物配方设计师必须添加其它试剂如作为助流剂或润滑剂的滑石或淀粉到药物合成物中。通过选择表现有利的流动性和研磨性的活性成分的固体形式使这种试剂的使用最小化将是有益的。
化合物的又一固态物理性质是在流体如水中的溶解速率。活性成分的溶解可影响药物产品的储存稳定性。另外，活性成分的溶解速率影响口服活性成分可到达受试者血流的速率。选择适当的固态形式可使活性成分的储存稳定性和/或溶解速率最大化。
另外，在临床试验或其它研究中，特定固态形式的鉴定、生产和控制对制药工业是有意义的。如果给出的药物的多晶型形式在临床研究期间不能保持恒定，则在一批与另一批之间不能比较正在研究的确切剂型，为研究引入了不受控制的误差来源。
一般，难以预测给出的化合物是否将形成多种结晶固态形式。更难以预测这些不同的结晶固态形式的结构构象和物理性质。
鉴定和利用药学活性化合物的多种多晶型物、假多晶型物和无定形形式以产生系列的具有不同物理性质的固体形式将是有利的。用这样的方式，药物剂型可被设计具有特定的合乎要求的性质，诸如例如特定的溶解速率、研磨性、热稳定性或贮存期限。
本发明的一个实施方案是N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶固体形式A游离碱，其具有的X射线粉末衍射(XRPD)图形具有对应于5.6±0.1、7.6+0.1和9.6±0.1的2θ值的特征衍射峰。无水结晶形式A进一步的特征在于在11.2±0.1、13.4±0.1和15.2±0.1的2θ值处的另外的衍射峰。无水结晶形式A另外的特征在于在16.3±0.1和17.3±0.1的2θ值处的衍射峰。
式I化合物的无水结晶固态形式A游离碱表现的固态碳-13交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱(碳-CPMAS NMR光谱)具有化学位移值为39.7、118.3、169.2和12.6±0.1p.p.m的特征信号。结晶固体形式A进一步的特征在于具有化学位移值为44.0、121.4、158.2和13.7±0.1p.p.m的信号。化合物I的无水结晶形式A另外的特征在于表现出化学位移值为49.5、145.4、126.5和25.0±0.1p.p.m的信号。图2显示式I化合物的无水结晶形式A的固态碳-13CPMAS NMR光谱。
在又一个实施方案中，化合物I的无水结晶形式A的固态氟-19交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱在图3示出。该无水结晶固态形式表现出化学位移值为-128.9±0.1p.p.m的特征信号。
在本发明的一个实施方案中，化合物I的无水结晶形式A的DSC曲线如图4所示。熔融吸热曲线显示峰值在约281.2℃。
本发明的一个实施方案涉及制备式I化合物的无水结晶形式A的方法，该方法包括：a)将化合物溶解在至少一种溶剂中形成混合物；b)将混合物回流直到结晶完全并形成固体；c)分离固体；和d)干燥固体。
在本发明的一个实施方案中，至少一种溶剂选自1，2-二甲氧基乙烷、异丙醇、乙酸异丙酯和丙酮。
在本发明的一个实施方案中，分离固体另外包括通过真空滤器过滤固体并用至少一种选自1，2-二甲氧基乙烷、异丙醇、乙酸异丙酯和丙酮的洗涤溶剂洗涤固体。
在本发明的又一实施方案中，溶剂是1，2-二甲氧基乙烷。
本发明的一个实施方案是N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的吸湿性结晶形式B，其具有的XRPD图形具有对应于7.8±0.1、8.5±0.1和10.2±0.1的2θ值的特征衍射峰。吸湿性结晶形式B进一步的特征在于在12.2±0.1、12.6±0.1和13.5±0.1的2θ值处的另外的衍射峰。吸湿性结晶形式B进一步的特征在于在13.9±0.1和16.8±0.1的2θ值处的衍射峰。图5显示吸湿性结晶形式B的XRPD。
在本发明的一个实施方案中，化合物I的吸湿性结晶形式B具有如图6所示的DSC曲线。DSC差示热分析图显示以约66.0℃为中心的宽的吸热峰，对应于TGA的初始失重，然后是在约164.0℃处的熔融吸热峰。
本发明的又一实施方案包括通过以下操作形成化合物I的吸湿性结晶形式B：将无定形N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺溶解在溶剂中；将混合物温热以确保无定形形式溶解；将混合物冷却；使混合物形成针状(结晶)，用洗涤溶剂洗涤形成的固体；并干燥固体。在一个实施方案中，溶剂是乙醇，洗涤溶剂是乙醇。在本发明的又一实施方案中，无定形形式与溶剂的比按质量计为约3∶4，例如，3g该化合物的无定形形式和4(约5ml的乙醇)。在又一个实施方案中，将溶液加热到约60℃。
在动力学吸湿实验中，吸湿性结晶形式B在25℃和约25％到约95％的相对湿度(RH)下逐渐吸收约7％的水分。重量增加基于在25％RH下的初始总样品重量。另外，当相对湿度从95％下降到5％RH时，吸湿性结晶形式B在25℃丧失其总重量的约8％。结晶形式B在水分吸附-解吸之后慢慢丧失结晶性。
本发明的又一实施方案是式I化合物的结晶水合物固态形式C，其具有的XRPD图形具有对应于10.1±0.1、11.0±0.1和12.4±0.1的2θ值的特征衍射峰。结晶水合物形式C的进一步的特征在于在13.2±0.1、14.1±0.1和18.9+0.1的2θ值处的另外的衍射峰。结晶水合物形式C还进一步的特征在于在20.3±0.1和22.7+0.1的2θ值处的衍射峰。结晶水合物形式C的XRPD如图7所示。
本发明的又一实施方案是化合物I的结晶水合物形式C的DSC曲线，如图8所示。宽的脱水吸热峰以约127.7℃为中心，随后是在约200.9℃的结晶放热活性峰和在约268.0℃的熔融/分解吸热峰。形式C在约25℃到约150℃之间的约4.5％的初始失重是由于脱水(一水化物的理论量为3.6％)，然后是高于250℃的热分解。
结晶水合物形式C可通过将结晶乙醇合物形式G悬浮在处在搅拌容器中的水中并使混合物老化一段时间制备。在本发明的一个实施方案中，结晶乙醇合物形式G与水的比按质量计为约1∶100。
本发明的一个实施方案是式I化合物的无水结晶形式D，其具有的XRPD图形具有对应于8.8±0.1、9.9±0.1和12.5±0.1的2θ值的特征衍射峰。无水结晶形式D的进一步的特征在于在14.8±0.1、16.3±0.1和17.9±0.1的2θ值处的另外的衍射峰。无水结晶形式D还进一步的特征在于在14.3±0.1、15.2±0.1和16.8±0.1的2θ值处的衍射峰。无水结晶形式D的XRPD如图9所示。
式I化合物的无水结晶固态形式D游离碱表现的固态碳-13交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱(碳-13CPMAS NMR)光谱具有化学位移值为23.8、37.9和174.1±0.1p.p.m的特征信号。结晶固态形式D的进一步的特征在于显示出化学位移值为13.8、48.8和156.9±0.1p.p.m的信号。化合物I的无水结晶形式D还进一步的特征在于显示出化学位移值为20.9、33.6和121.2±0.1p.p.m的信号。图10显示式1化合物的无水结晶形式D的固态碳-13CPMAS NMR光谱。
在又一个实施方案中，化合物I的无水结晶形式D的固态氟-19CPMAS NMR光谱如图11所示。该无水结晶固态形式显示出化学位移值为-127.7和-128.9±0.1p.p.m的特征信号。
本发明的又一实施方案是化合物I的形式D的DSC曲线，如图12所示。DSC曲线显示在约273℃处的熔融吸热峰。
无水结晶形式D通过以下操作制备：将四水合物形式E溶解在至少一种溶剂中形成溶液；将至少一种逆溶剂添加到溶液中直到溶液过饱和；使批料老化并任选地添加更多的逆溶剂或将批料冷却直到形成固体。从过饱和溶液形成固体可通过用形式D作为晶种对溶液引晶得以促进。
所述至少一种溶剂的非限制例子选自二甲基乙酰胺(DMAc)、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。至少一种逆溶剂的非限制例子选自庚烷、甲苯、环己烷、水、乙腈、乙酸异丙酯、乙酸异丁酯和甲基叔丁基醚(MTBE)。溶剂/逆溶剂体系的非限制例子包括：甲醇/水、DMSO/水和NMP/水。
图13显示本发明的又一实施方案，即结晶四水合物形式E的X射线衍射图形。四水合物形式E具有对应于6.1±0.1、12.8±0.1和13.1±0.1的2θ值的特征衍射峰。四水合物形式E的进一步的特征在于在13.9±0.1、17.6±0.1和19.0±0.1的2θ值处的另外的衍射峰。四水合物形式E还进一步的特征在于在19.8±0.1和22.6±0.1的2θ值处的衍射峰。
式I化合物的四水合物形式E游离碱显示出的固态碳-13交叉极化幻角自旋(CPMAS)核磁共振(NMR)光谱(碳-13CPMAS NMR)光谱具有化学位移值为13.1、28.9、39.3和154.2±0.1p.p.m的特征信号。四水合物形式E的进一步的特征在于具有化学位移值为14.6、49.9、173.2和120.6±0.1p.p.m的信号。化合物I的四水合物形式F还进一步的特征在于显示出化学位移值为23.4、35.1、63.6和161.1±0.1p.p.m的信号。图14显示式I化合物的四水合物形式F的固态碳-13CPMAS NMR光谱。
在又一个实施方案中，化合物I的四水合物形式E的固态氟-19CPMAS NMR光谱如图15所示。四水合物形式E显示出化学位移值为-126.5、-128.0和-129.3±0.1p.p.m的特征信号。
图16是化合物I的结晶四水合物形式E的DSC曲线。以约90℃为中心的宽吸热峰是由于样品失水，然后是重结晶得到新形式，然后是该形式在约177℃的熔融吸热。
四水合物形式E可通过在室温和环境条件下将无水结晶游离碱形式A放在pH约2或更低的溶液中制备。
本发明的又一实施方案是化合物I的倍半水合物形式F，其具有的XRPD图形具有对应于6.3±0.1、7.6±0.1和12.5±0.1的2θ值的特征衍射峰。倍半水合物形式F的进一步的特征在于在13.5±0.1、15.5±0.1和18.3±0.1的2θ值处的另外的衍射峰。倍半水合物形式F还进一步的特征在于在19.7+0.1和21.0+0.1的2θ值处的衍射峰。倍半水合物形式F的XRPD如图17所示。
图18是化合物I的倍半水合物形式F的DSC曲线。该DSC描图定性地类似于四水合物形式E的DSC描图，其中由脱水可见的吸热显著降低。使用10℃/分钟的加热速率在密封锅中从25℃到350℃进行DSC描图。基于样品的初始重量，实现了约5.1％的总的重量损失。倍半水合物的理论重量损失经计算为5.3％。
倍半水合物形式F可通过在40℃真空干燥四水合物形式E至少10小时制备。
本发明的一个实施方案是化合物I的结晶乙醇合物形式G，其具有的X射线粉末衍射(XRPD)图形具有对应于8.2±0.1、10.0±0.1和13.4±0.1的2θ值的特征衍射峰。结晶乙醇合物形式G的进一步的特征在于在14.6±0.1、15.3±0.1和16.4±0.1的2θ值的另外的衍射峰。无水结晶乙醇合物形式G还进一步的特征在于在18.1±0.1和19.8±0.1的2θ值处的衍射峰。图19显示结晶乙醇合物形式G的X射线衍射图形。
图20显示化合物I的结晶乙醇合物形式G的典型的DSC曲线。结晶乙醇合物形式G的DSC描图显示了以约97.1℃和121.6℃为中心的两个宽的脱溶剂吸热峰，然后是在约165.9℃的熔融吸热峰。
结晶乙醇合物形式G在25℃到100℃的典型的总重量损失为约5.0％。在高于约250℃发生热分解。使用与TGA熔炉排气装置连接的质谱仪分析从初始重量损失释放的气体为乙醇。
可以通过以下操作形成结晶乙醇合物形式G：将无定形N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺溶解在乙醇中，并将溶液加热到约60℃，然后将混合物冷却到室温，以形成固体。
本发明的一个实施方案，即多晶型物/假多晶型物是“基本上纯的”并且具有约至少85％的多晶型物/假多晶型物纯度。也就是说，对于特定的结晶形式而言，结晶形式包括低于约15wt％的杂质，包括其它的多晶型、无定形和/或假多晶型形式。在该实施方案的变体中，多晶型/假多晶型的纯度为至少95％。
在又一实施方案中，式I化合物的无定形形式是“基本上纯的”并具有约至少85％的纯度。也就是说，对于式I化合物的该固态形式而言，无定形形式包括低于约15wt％的杂质，包括其它的多晶型和/或假多晶型形式。在该实施方案的变体中，无定形纯度为至少95％。典型的无定形物质的XRPD图形如图21所示。
X射线粉末衍射研究广泛用于表征分子结构、结晶性和多晶型性。在具有PW3040/60控制台的Philips Analytical X′Pert PRO X射线衍射系统上生成式I化合物的结晶形式的X射线粉末衍射(XRPD)图形。使用PW3373/00陶瓷Cu LEF X射线管K-α辐射作为辐射源。
除了上面描述的X射线粉末衍射图形之外，化合物I的结晶形式进一步通过它们的固态碳-13和氟-19核磁共振(NMR)光谱表征。在使用Bruker 4mm双共振CPMAS探针的Bruker DSX 400WB NMR系统上获得固态碳-13NMR光谱。碳-13NMR光谱采用质子/碳-13交叉极化幻角自旋，具有可变振幅交叉极化和总-旁频带-抑制。样品在10.0kHz下自旋，使用10秒的再循环延迟收集总共1024次扫描。在进行FT之前将10Hz的谱线展宽施用于光谱。使用甘氨酸的羰基碳(176.03p.p.m.)作为次级对照以TMS标度报告化学位移。
在使用Bruker 4mm H/F/X探针的Bruker DSX 500WB NMR系统上获得固态氟-19NMR光谱。NMR光谱采用质子/氟-19交叉极化幻角自旋，具有可变振幅交叉极化和在62.5kHz去耦的TPPM。样品在15.0kHz下自旋，使用5秒的再循环延迟收集总共150次扫描。在进行FT之前将10Hz的谱线展宽施用于光谱。使用聚(四氟乙烯)(Teflon
Figure A20068005040500181
，其指以的化学位移为-122ppm)作为外部次级对照报告化学位移。
使用TA Instruments DSC 2910或等价仪器获得差示扫描量热计(DSC)数据。将1到6mg的样品称重到开口锅内。然后将锅卷曲并置于量热计池的样品位置。将空锅置于参考位置。关闭量热计池并使氮气流通过该池。设定加热程序以10℃/分钟的加热速率将样品加热到约300℃的温度。开始加热程序。当程序完成时，使用在系统软件内包含的DSC分析程序对数据进行分析。在高于和低于观察到吸热的温度范围的基线温度点之间对熔融吸热峰积分。数据报告为开始温度、最高温度和焓。
本发明的一个实施方案是N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无定形固体形式。图21显示化合物I的无定形形式的典型的XRPD图形。
本发明的固态形式可包括两种或多种形式的混合物。本发明的固态的混合物将具有以在混合物中存在的多种多晶型物的每一种为特征的X射线衍射峰。
鉴定为SARM的本发明的化合物的固态形式可用于治疗由可通过雄激素给药改善的、由雄激素缺乏引起的疾病或病况。这种无定形、溶剂合物和结晶形式可理想地作为单独的治疗药或作为与骨吸收抑制剂如双膦酸盐类、雌激素、SERM、组织蛋白酶K抑制剂、αvβ3整联蛋白受体拮抗剂、降钙素和质子泵抑制剂的组合，用于治疗女性和男性中的骨质疏松症。它们也可与刺激骨形成的药物如甲状旁腺激素或其类似物一起使用。本发明的SARM化合物的多种固体形式也可用于治疗前列腺疾病，如前列腺癌和良性前列腺增生(BPH)。此外，本发明的化合物的固态形式表现出对皮肤(粉刺和面部毛发生长)的最小影响，并且可用于治疗多毛症。另外，结构式I的化合物可以刺激肌肉生长，并且可用于治疗肌减少症和脆弱。它们可在肥胖症的治疗中用于减少内脏脂肪。此外，本发明的化合物可以在中枢神经系统中表现出雄激素激动作用，并且可用于治疗血管舒缩症状(热潮红)和用于增加能量和性欲。它们可用于阿尔茨海默氏病的治疗。
式I化合物的固体形式也可由于它们修复骨的能力而单独地或作为GnRH激动剂/拮抗剂治疗的辅助剂用于治疗前列腺癌；或者因为它们在前列腺中拮抗雄激素的能力而用于抗雄激素治疗的替代治疗；和使骨消耗最小化。另外，本发明的化合物可由于它们在胰腺癌的治疗中修复骨的能力而作为使用抗雄激素治疗的辅助剂，或者由于它们的抗雄激素性质作为单独治疗剂，提供优于骨保留(bone-sparing)的常规抗雄激素治疗的优点。另外本发明的化合物可以增加血细胞如红细胞和血小板的数目，并且可用于治疗造血障碍如再生障碍性贫血。因此，考虑到上述的组织选择性雄激素受体激动作用，式I化合物的结晶和无定形形式对于性机能减退(雄激素缺乏的)男性中的激素替代治疗是理想的。
本发明还涉及安全地和特异性地治疗患有腹部肥胖、新陈代谢综合症(亦称‘胰岛素抗性综合症’和‘综合症X’)的新陈代谢综合症和II型糖尿病。
已经发现式I的化合物为雄激素受体的组织选择性调节剂(SARM)。在一个方面中，本发明的化合物的固态形式可用于活化哺乳动物中的雄激素受体的功能，特别是用于活化骨和/或肌肉组织中雄激素受体的功能和阻断或抑制(“拮抗”)雄性个体前列腺中或雌性个体子宫中的雄激素受体的功能。
本发明的另一个方面是使用式I的化合物的无定形和结晶形式减弱或阻断在雄性个体前列腺中或雌性个体子宫中由AR激动剂诱导的雄激素受体功能而不减弱或阻断在毛发生长性皮肤或声带中的雄激素受体功能；和活化骨和/或肌肉组织中的雄激素受体功能而不活化控制血脂水平的器官(如肝脏)中的雄激素受体功能。
结构式I的化合物表现出对雄激素受体为亚微摩尔的结合亲合力，并可用于治疗患有与雄激素受体功能有关的病症的哺乳动物。将治疗有效量的化合物(包括多晶型、假多晶型、和无定形形式，及其混合物)对哺乳动物给药，用于治疗与雄激素受体功能有关的病症，如雄激素缺乏；可通过雄激素替代疗法改善的病症或可通过雄激素替代疗法改进的病症，包括：变弱肌紧张性的增强、骨质疏松症、骨质减少、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、牙周病、骨折(例如，脊椎骨折和非脊椎骨折)、骨重建术后的骨损伤、肌减少症、脆弱、皮肤老化、雄性性腺机能减退症、妇女绝经后症状、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高脂血症、肥胖症、再生障碍性贫血和其它造血障碍、胰腺癌、炎症性关节炎和关节修复、HIV-消瘦(HIV-wasting)、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、癌性恶病质、阿尔茨海默氏病、肌营养不良、认知下降、性机能障碍、睡眠呼吸暂停、抑郁症、卵巢早衰和自身免疫性疾病。治疗通过对需要这种治疗的哺乳动物给药治疗有效量的结构式I的化合物进行。另外，式I化合物的固态形式可单独或与其它活性剂组合用作药物组合物中的成分。
在一个实施方案中，本发明的化合物的无定形和结晶固体形式可单独或与其它活性剂组合用于治疗雄性个体中的由雄激素缺乏引起的或可通过雄激素替代改善的病况，其包括但不限于骨质疏松症、骨质减少、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、牙周病、HIV-消瘦、前列腺癌、癌性恶病质、肥胖症、关节炎病况、贫血症诸如例如再生障碍性贫血、肌营养不良和阿尔茨海默氏病、认知下降、性机能障碍、睡眠呼吸暂停、抑郁症、良性前列腺增生(BPH)、腹部肥胖、代谢综合征、II型糖尿病、和动脉粥样硬化。治疗通过对需要这种治疗的雄性个体给药治疗有效量的结构式I的化合物进行。
“关节炎病况”是指其中炎性损害限于关节的疾病或关节的任何炎性病况，最值得注意的是骨关节炎和类风湿性关节炎(Academic PressDictionary of Science Technology；Academic Press；第一版，1992年1月15日)。本发明的式I化合物可单独或以组合形式用于治疗或预防关节炎病况，如贝切特氏病；粘液囊炎和腱炎；CPPD沉积疾病；腕管综合征；埃-当综合征；纤维肌痛；痛风；感染性关节炎；炎症性肠病；幼年型关节炎；红斑狼疮；莱姆病；马方综合症；肌炎；骨关节炎；成骨不全；骨坏死；多动脉炎；风湿性多肌痛；牛皮癣性关节炎；雷诺氏现象；反射性交感神经营养不良综合征；瑞特氏综合征；类风湿性关节炎；硬皮病；和舍格伦综合征。本发明的实施方案涵盖了关节炎病况的治疗或预防，其包括给药治疗有效量的单独的或作为混合物形式的式I的化合物的无定形和结晶形式。子方案为骨关节炎的治疗或预防，其包括给药治疗有效量的式I的化合物。参见Cutolo M，Seriolo B，Villaggio B，Pizzorni C，Craviotto C，Sulli A.，Ann.N.Y.Acad.Sci.2002 Jun；966：131-42；Cutolo，M.Rheum Dis Clin North Am，2000Nov，26(4)：881-95；Bijlsma JW，Van den Brink HR.Am J Reprod Immunol 1992Oct-Dec，28(3-4)：231-4；Jansson L，Holmdahl R.，Arthritis Rheum，2001Sep，44(9)：2168-75；Purdie DW.Br，Med Bull，2000，56(3)：809-23。还参见Merck Manual，17版，pp.449-451。
当以组合形式使用来治疗关节炎病况时，式I的化合物可与本文中公开的可用于联合治疗的任何药物使用，或可与已知用于治疗或预防关节炎病况的药物一起使用，例如皮质甾类、细胞毒药物(或其它疾病改善药物或缓解诱导药物)、金治疗剂(gold treatment)、甲氨蝶呤、NSAID和COX-2抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明的化合物可单独或与其它活性剂组合用于治疗雌性个体中的由雄激素缺乏引起的或可通过雄激素替代改善的病况，其包括但不限于骨质疏松症、骨质减少、皮肤老化、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、绝经后症状、牙周病、HIV-消瘦、癌性恶病质、肥胖症、贫血症诸如例如再生障碍性贫血、肌营养不良、阿尔茨海默氏病、卵巢早衰、认知下降、性机能障碍、抑郁症、炎症性关节炎和关节修复、动脉粥样硬化和自身免疫性疾病。治疗通过对需要这种治疗的雌性个体给药治疗有效量的结构式I的化合物进行。
式I的化合物还可用于增强哺乳动物如人的肌紧张性。结构式I的化合物的无定形和结晶形式也可在前列腺癌的治疗中用作常规的雄激素消耗治疗的辅助剂，用于修复骨、使骨损失最小化和保持骨的矿物质密度。这样，它们可以与常规的雄激素剥夺治疗一起使用，包括GnRH激动剂/拮抗剂，如在P.Limonta等人，Exp.Opin.Invest.Drugs，10：709-720(2001)；H.J.Stricker，Urology 58(Suppl.2A)：24-27(2001)；R.P.Millar等人，British Medical Bulletin，56：761-772(2000)；和A.V.Schally等人，Advanced Drug Delivery Reviews，28：157-169(1997)中公开的那些。式I的化合物的固态形式可在前列腺癌的治疗中与抗雄激素物质如氟他胺、2-羟基氟他胺(氟他胺的活性代谢物)、尼鲁米特和比卡鲁胺(CasodexTM)组合。
另外，本发明也可由于其雄激素拮抗剂性质用于治疗胰腺癌，或作为抗雄激素物质如氟他胺、2-羟基氟他胺(氟他胺的活性代谢物)、尼鲁米特和比卡鲁胺(CasodexTM)的辅助剂。
术语“治疗癌症”或“癌症的治疗”是指对患有癌性病况的哺乳动物给药，和是指通过杀死癌细胞缓解癌性病况的作用，而且还指产生抑制癌症的生长和/或转移的作用。
结构式I的化合物可以使对脂类代谢的消极作用最小化，其可以表现出优于用于性腺机能减退(雄激素缺乏)的雄性个体的激素替代治疗的现有方法的优点。
另外，结构式I的化合物可以增加血细胞如红细胞和血小板的数目，并且可用于治疗造血障碍如再生障碍性贫血。
在本发明的一个实施方案中，将治疗有效量的单独的或组合的式I的化合物的无定形、多晶型和假多晶型形式对哺乳动物给药，用于治疗或改善选自以下的病症：变弱肌紧张性的增强、骨质疏松症、骨质减少、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、牙周病、骨折、骨重建术后的骨损伤、肌减少症、脆弱、皮肤老化、雄性性腺机能减退症、妇女绝经后症状、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高脂血症、肥胖症、再生障碍性贫血和其它造血障碍、胰腺癌、炎症性关节炎和关节修复、HIV-消瘦、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、癌性恶病质、阿尔茨海默氏病、肌营养不良、认知下降、性机能障碍、睡眠呼吸暂停、抑郁症、卵巢早衰和自身免疫性疾病。
在另一个实施方案中，治疗有效量的单独的或组合的式I化合物的无定形或结晶形式可用于治疗或改善选自以下的病症：变弱肌紧张性、骨质疏松症、骨质减少、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、牙周病、骨折、骨重建术后的骨损伤、肌减少症、阿尔茨海默氏病和脆弱。
在另一个实施方案中，本发明的化合物的无定形和结晶形式可用于治疗或改善以下病症，如雄性性腺机能减退症、妇女绝经后症状、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高脂血症、肥胖症、再生障碍性贫血和其它造血障碍、胰腺癌、炎症性关节炎和关节修复、HIV-消瘦、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、癌性恶病质、肌营养不良、认知下降、性机能障碍、睡眠呼吸暂停、抑郁症、卵巢早衰和自身免疫性疾病。
本发明的化合物的固态形式可以作为它们的对映体纯形式给药。可通过多种常规方法中的任一种将外消旋混合物分离为它们单独的对映体。这些方法包括手性色谱法，用手性助剂衍生化随后通过色谱法或结晶分离，和非对映体盐的分步结晶。
如本文中使用的，起雄激素受体的“激动剂”作用的本发明的式I的化合物可结合于雄激素受体和引起该受体特有的生理学或药理学响应。术语“组织选择性雄激素受体调节剂”是指模拟一些组织中而非其它组织中的天然配体的作用的雄激素受体配体。“部分激动剂”是无论使用的化合物的量如何都不能诱导受体群达最大活化的激动剂。“完全激动剂”在给定浓度下诱导雄激素受体群的完全活化。起雄激素受体的“拮抗剂”作用的式I的化合物可结合于雄激素受体并且阻断或抑制通常由天然的雄激素受体配体诱导的雄激素相关的反应。
术语“治疗有效量”是指引起由研究人员、兽医、医生或其它临床人员探求的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的结构式I的化合物的量。
本文中使用的术语“组合物”意在包括含特定量的特定成分的产物，以及直接或间接地从特定量的特定成分的组合得到的任何产物。
“可药用的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容，并且对其接受者是无害的。
术语“化合物的给药”和“给药化合物”应该理解为是指对需要治疗的个体提供本发明的化合物或本发明化合物的前药。
术语“以组织选择性方式调节由雄激素受体介导的功能”是指在合成代谢(骨和/或肌肉)组织(骨和肌肉)中选择性地(或有差别地)调节由雄激素受体介导的功能，而在生雄性征的(生殖)组织如前列腺、睾丸、精囊、卵巢、子宫和其它性附属组织中没有这种调节。在一个实施方案中，合成代谢组织中的雄激素受体的功能被活化，而在生雄性征的组织中的雄激素受体功能被阻断或抑制。在另一个实施方案中，合成代谢组织中的雄激素受体的功能被阻断或抑制，而在生雄性征的组织中的雄激素受体功能被活化。
用于实践本发明治疗方法的结构式I的化合物的无定形或结晶形式的给药通过对需要这种治疗或预防的患者给药有效量的所述化合物而进行。对于根据本发明方法的预防性给药的需要通过使用公知的危险因素测定。归根到底，单独化合物的有效量由主管该病例的医生根据各因素如治疗的确切疾病、患者患有的该疾病的严重程度和其它疾病或病况、选择的给药途径、患者相伴需要的其它药物和治疗和医生判断中的其它因素决定。
如果以固定剂量配制，这种组合产品使用处在如下所述剂量范围内的式I的化合物的无定形和结晶形式和处在其批准剂量范围内的其它药学活性剂。当组合制剂不适合时，化合物的无定形和结晶形式可以替代性地与已知的一种或多种可药用药剂顺序地使用。
通常，结构式I的化合物的无定形或结晶形式的日剂量可以在每名成年人每天约0.01到约1000mg的宽范围内变化。例如，从约0.1到约200mg/天的剂量范围。对于经口给药，组合物可以包含约0.01到约1000mg的片剂形式被提供，诸如例如，包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、3.0、5.0、6.0、10.0、15.0、25.0、50.0、75、100、125、150、175、180、200、225和500毫克活性成分，用于根据治疗的哺乳动物的症状调节剂量。
剂量可作为单次日剂量给药或者将所述总的日剂量以每天两次、三次、四次的分开的剂量给药。此外，根据选择用于给药的单独的化合物的性质，剂量能以更少频率如每周、每两周、每月等给药。当然，对于较少频率的给药，单位剂量相对更大。
当通过鼻内途径、透皮途径、通过直肠或阴道栓剂或通过静脉内溶液给药时，当然，在整个剂量给药过程中剂量给药最好是连续的而不是间歇性的。
举例说明本发明的是包括任一种上述的单独的或组合的化合物的无定形和结晶形式以及可药用载体的药物组合物。本发明的例子是生产药物组合物的方法，包括将一种或多种式I化合物的无定形或结晶形式和可药用载体组合。
用于医学应用的组织选择性雄激素受体调节剂的制剂包括式I的化合物的无定形或结晶固体形式及其可接受的载体和任选的其它治疗活性成分。载体必须在与制剂的其它成分相容的意义上为可药用的并且对制剂的接受者对象是无害的。
因此，本发明另外提供包括结构式I的化合物的无定形或结晶形式及其可药用载体的药物制剂。该制剂包括适合于经口、直肠、阴道内、鼻内、局部和非肠道(包括皮下、肌肉内和静脉内)给药的那些。在一个实施方案中，制剂为适合于经口给药的那些。
式I的化合物的适当的局部制剂包括透皮装置、气雾剂、霜剂、溶液、膏剂、凝胶剂、洗液、扑粉(dusting powders)等。包含本发明的化合物的局部药物组合物通常包括与可药用介质混合的约0.005重量％到约5重量％的活性化合物。用于给药本发明的化合物的透皮皮肤贴片包括本领域技术人员公知的那些。
制剂可作为单位剂型存在或者可通过药学领域中已知的任何方法制备。所有的方法都包括使活性化合物与构成一种或多种成分的载体结合的步骤。通常，制剂通过将活性化合物与液体载体、蜡质固体载体或细碎固体载体均匀地和紧密地结合而制备，然后，如果需要，将产物成形为所需的剂型。
适合于经口给药的本发明的制剂可作为离散的单元形式存在，如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂，其各自包含预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒形式存在；或作为在含水液体或非水液体中的悬浮液或溶液形式存在，如糖浆剂、酏剂或乳剂。
可通过，任选与一种或多种辅助成分一起，压缩或模制而生产片剂。压制片可通过在适当的机器中压缩任选与辅助成分如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、崩解剂或着色剂混合的自由流动形式的活性化合物如粉末或颗粒而制备。模制片可通过在适当的机器中模制活性化合物(优选为粉末形式)与适当的载体的混合物而制备。适当的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖类如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成的树胶类如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。用于这些剂型的非限制性的典型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
口服液体形式，如在经适当调味的悬浮剂或分散剂如合成和天然的树胶类如黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等中的糖浆或悬浮液，可通过将活性化合物加入到溶液或悬浮液中制得。可使用的另外的分散剂包括甘油等。
用于阴道或直肠给药的制剂可作为栓剂形式存在，使用常规的载体即无毒且对粘膜无刺激性的、与结构式I的化合物相容的、并且具有储存稳定性和不与式I的化合物的无定形或结晶形式结合或妨碍其释放的基质。适当的基质包括：可可脂(可可豆油)、聚乙二醇(例如碳蜡和polyglycols)二醇-表面活性剂组合、聚氧化烯-40-硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如Tween、Myrj和Arlacel)、甘油明胶和氢化植物油。当使用甘油明胶栓剂时，可使用防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
包含活性药物成分的局部制剂可与本领域中公知的多种载体物质混合，诸如例如，醇、芦荟胶(aloe vera gel)、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2十四烷基丙酸酯等，以形成例如醇溶液、局部清洁剂、清洁霜、皮肤凝胶剂、皮肤洗液、和霜剂或凝胶剂形式的洗发剂。
本发明的N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无定形和结晶形式也可作为脂质体递送系统的形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可由多种磷脂如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成。
本发明的SARM也可通过利用单克隆抗体作为与化合物分子结合的单独载体递送。本发明的化合物也可结合于作为可靶向药物载体的可溶性聚合物。这种聚合物可以包括聚乙烯-吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基异丁烯酰胺-苯酚、聚羟基-乙基天冬氨酰胺苯酚或被棕榈酰基残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可以结合于一类可生物降解的聚合物，用于实现药物的受控释放，如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或两性的水凝胶嵌段共聚物。
适合于非肠道给药的制剂包括含活性化合物的无菌含水制品的制剂，该制品可与接受者的血液等渗。这种制剂适当地包括与接受者对象的血液为等渗的化合物的溶液或悬浮液。这种制剂可以包含蒸馏水、含5％葡萄糖的蒸馏水或盐水和活性化合物。有用的制剂还包括含式I的化合物的固态形式的浓溶液或固体，其在用适当的溶剂稀释时得到适合于非肠道给药的溶液。
本发明的药物组合物和方法可以另外包括通常用于治疗上述病况的其它治疗活性化合物，所述病况包括骨质疏松症、牙周病、骨折、骨重建术后的骨损伤、肌减少症、脆弱、皮肤老化、雄性性腺机能减退症、妇女绝经后症状、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高脂血症、造血障碍诸如例如再生障碍性贫血、胰腺癌、阿尔茨海默氏病、炎症性关节炎和关节修复。
对于骨质疏松症的治疗和预防，本发明的N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的固态形式可以与至少一种骨增强剂组合，骨增强剂选自抗再吸收剂、骨合成代谢剂和通过没有精确定义的机制对骨骼有益的其它药物，如钙补充剂、类黄酮和维生素D类似物。牙周病、骨折和骨重建术后的骨损伤的病况也可受益于这些组合治疗。例如，本发明的化合物的无定形和结晶形式可以有效地与有效量的其它药物给药，所述其它药物如雌激素、双膦酸盐类、SERM、组织蛋白酶K抑制剂、αvβ3整联蛋白受体拮抗剂、液泡ATP酶抑制剂、多肽骨保护素、VEGF的拮抗剂、噻唑烷二酮类、降钙素、蛋白激酶抑制剂、甲状旁腺激素(PTH)和类似物、钙受体拮抗剂、生长激素促泌剂、生长激素释放激素、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白(BMP)、BMP拮抗作用的抑制剂、前列腺素衍生物、成纤维细胞生长因子、维生素D及其衍生物、维生素K及其衍生物、大豆异黄酮、钙盐和氟化物盐。牙周病、骨折和骨重建术后的骨损伤的病况也可受益于这些组合治疗。
在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物的无定形和结晶形式可以有效地与有效量的至少一种骨增强剂组合给药，骨增强剂选自单独的或与孕激素或孕激素衍生物组合的雌激素和雌激素衍生物；双膦酸盐类；抗雌激素药或选择性的雌激素受体调节剂；αvβ3整联蛋白受体拮抗剂；组织蛋白酶K抑制剂；破骨细胞液泡ATP酶抑制剂；降钙素；和骨保护素。
在治疗骨质疏松症时，本发明的化合物的多种固态形式的活性不同于抗再吸收剂的活性，所述抗再吸收剂为：雌激素、双膦酸盐类、SERM、降钙素、组织蛋白酶K抑制剂、液泡ATP酶抑制剂、妨碍RANK/RANKL/骨保护素路径的药物、破骨细胞产生或破骨细胞活化的p38抑制剂或任何其它抑制剂。与抑制骨吸收不同，本发明的SARM有助于刺激骨形成、作用于例如负责显著部分的骨强度的皮层骨。皮层骨的增厚显著地有助于减少骨折危险，特别是髋部骨折。由于骨合成代谢和抗再吸收作用的互补作用，结构式I的组织-SARM与抗再吸收剂诸如例如雌激素或雌激素衍生物、双膦酸盐类、抗雌激素药、SERM、降钙素、αvβ3整联蛋白受体拮抗剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、液泡ATP酶抑制剂和组织蛋白酶K抑制剂的组合特别有用。
非限制性的雌激素和雌激素衍生物的代表例包括具有雌激素活性的甾族化合物，诸如例如17β-雌二醇、雌酮、结合雌激素(PREMARIN
Figure A20068005040500281
)、马雌激素(equine estrogen)、17β-乙炔基雌二醇等。雌激素或雌激素衍生物可单独使用或与孕激素或孕激素衍生物组合使用。孕激素衍生物的非限制性例子为炔诺酮和醋酸甲羟孕酮。
可用于与本发明的化合物组合的双膦酸盐类化合物的非限制性例子包括：
(a)阿仑膦酸盐(又名阿仑磷酸、4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-双膦酸盐、阿仑膦酸钠、阿仑膦酸单钠三水合物或4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-双磷酸单钠三水合物。阿仑膦酸盐在1990年5月1日授权给Kieczykowski等人的美国专利4,922,007；1991年5月28日授权给Kieczykowski的美国专利5,019,651；1996年4月23日授权给Dauer等人的美国专利5,510,517；1997年7月15日授权给Dauer等人的美国专利5,648,491中有所描述；
(b)在1990年11月13日授权给Isomura等人的美国专利4,970,335中描述的[(环庚基氨基)-亚甲基]-双-磷酸盐(因卡膦酸盐(incadronate))；
(c)在比利时专利672,205(1966)和J.Org.Chem 32，4111(1967)中描述的(二氯亚甲基)-双-膦酸(氯膦酸)和二钠盐(氯膦酸盐)；
(d)[1-羟基-3-(1-吡咯烷基)-亚丙基]-双-膦酸盐(EB-1053)；
(e)(1-羟基亚乙基)-双-膦酸盐(依替膦酸盐)；
(f)在1990年5月22日授权的美国专利4,927,814中描述的[1-羟基-3-(甲基戊基氨基)亚丙基]-双-膦酸盐(伊班膦酸盐)；
(g)(6-氨基-1-羟基亚己基)-双-膦酸盐(奈立膦酸盐)；
(h)[3-(二甲基氨基)-1-羟基亚丙基]-双-膦酸盐(奥帕膦酸盐)；
(i)(3-氨基-1-羟基亚丙基)-双-膦酸盐(帕米膦酸盐)；
(j)在美国专利4,761,406中描述的[2-(2-吡啶基)亚乙基]-双-膦酸盐(吡膦酸盐)；
(k)[1-羟基-2-(3-吡啶基)-亚乙基]-双-膦酸盐(利塞膦酸盐)；
(1)在1989年10月24日授权给Breliere等人的美国专利4,876,248中描述的{[(4-氯苯基)硫基]亚甲基}-双-膦酸盐(替鲁膦酸盐)；
(m)[1-羟基-2-(1H-咪唑-1-基)亚乙基]-双-膦酸盐(唑来膦酸盐)；和
(n)[1-羟基-2-咪唑并吡啶-(1，2-a)-3-基亚乙基]-双-膦酸盐(米诺膦酸盐)。
在本发明的方法和组合物的一个实施方案中，双膦酸盐类选自阿仑膦酸盐、氯膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、因卡膦酸盐、米诺膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、帕米膦酸盐、吡膦酸盐、利塞膦酸盐、替鲁膦酸盐、唑来膦酸盐、以及这些双膦酸盐类的可药用盐，及其混合物。在一个变体中，双膦酸盐类选自阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、伊班膦酸盐、替鲁膦酸盐和氯膦酸盐。在这类的子类中，双膦酸盐类为阿仑膦酸盐及其可药用盐和水合物，及其混合物。具体的阿仑膦酸盐的可药用盐为阿仑膦酸单钠。阿仑膦酸单钠的可药用水合物包括一水合物和三水合物。利塞膦酸盐的具体的可药用盐为利塞膦酸单钠。利塞膦酸单钠的可药用水合物包括半-五水合物。
另外，抗雌激素化合物例如雷洛昔芬(参见例如，美国专利5,393,763)、氯米芬、珠氯米芬、恩氯米芬、萘福昔定(nafoxidene)、CI-680、CI-628、CN-55,945-27、Mer-25、U-11,555A、U-100A、及其盐等(参见例如，美国专利4,729,999和4,894,373)可用于在本发明的方法和组合物中与结构式I的化合物组合。这些药物又称为SERM，或选择性雌激素受体调节剂、本领域中已知通过与雌激素类似的途径抑制骨吸收而预防骨损失的药物。
非限制性的SERM的代表包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、托瑞米芬、azorxifene、EM-800、EM-652、TSE 424、氯米芬、屈洛昔芬、艾多昔芬和左美洛昔芬[Goldstein等人，“A pharmacological review ofselective estrogen receptor modulators”，Human Reproduction Update，6：212-224(2000)；Lufkin等人，Rheumatic Disease Clinics of North America，27：163-185(2001)和″Targeting the Estrogen Receptor with SERMs，″Ann.Rep.Med.Chem.36：149-158(2001)]。
αvβ3整联蛋白受体拮抗剂抑制骨吸收，并且可用于与结构式I的SARM组合，用于治疗包括骨质疏松症的骨病。例如，参考W.J.Hoekstra和B.L.Poulter，Curr.Med.Chem.，5：195-204(1998)及其中的参考文献。其它的αvβ3拮抗剂在R.M.Keenan等人，J.Med.Chem.40：2289-2292(1997)；R.M.Keenan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.8：3165-3170(1998)；和R.M.Keenan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.8：3171-3176(1998)中描述。
原称为组织蛋白酶O2的组织蛋白酶K为半胱氨酸蛋白酶，其在PCT国际申请公开WO 96/13523；美国专利5,501,969和5,736,357中有所描述。半胱氨酸蛋白酶类，具体地为组织蛋白酶，牵涉多种疾病病况，如肿瘤转移、炎症、关节炎和骨重新塑造。在酸性pH条件下，组织蛋白酶可以降解I型胶原蛋白。组织蛋白酶抑制剂可以通过抑制胶原纤维的降解而抑制破坏骨的骨吸收，因此可用于治疗骨吸收疾病，如骨质疏松症。组织蛋白酶K抑制剂的非限制性例子可以在PCT国际公开WO01/49288和WO 01/77073中找到。
已经发现称为″他汀类″的HMG-CoA还原酶抑制剂类的成员引起新骨的生长、代替骨质疏松症引起的骨质量损失(参见The Wall StreetJournal，Friday，December 3，1999，B1页)。因此，他汀类有希望用于治疗骨吸收。HMG-CoA还原酶抑制剂的例子包括他汀类及其可药用盐和酯，包括但不限于洛伐他汀(参见美国专利4,342,767)；辛伐他汀(参见美国专利4,444,784)；二羟基开环酸形式的辛伐他汀，特别是其铵盐或钙盐；普伐他汀，特别是其钠盐(参见美国专利4,346,227)；氟伐他汀，特别是其钠盐(参见美国专利5,354,772)；阿托伐他汀，特别是其钙盐(参见美国专利5,273,995)；西立伐他汀，特别是其钠盐(参见美国专利5,177,080)；罗苏伐他汀，又称为ZD-4522(参见美国专利5,260,440)和匹伐他汀，又称为NK-104；伊伐他汀；或尼伐他汀(参见PCT国际申请公开WO97/23200)。
可将破骨细胞液泡ATP酶抑制剂，也称为质子泵抑制剂，与本发明的结构式I的SARM的固体形式一起使用。已经报告说在破骨细胞的顶膜发现的质子ATP酶在骨吸收过程中起到重要的作用。因此，这种质子泵代表了用于设计潜在地可用于治疗和预防骨质疏松症和相关的新陈代谢病的骨吸收抑制剂的有吸引力的靶标[参见C.Farina等人，DDT，4：163-172(1999)]。
生血管因子VEGF已经表现出通过结合于破骨细胞上的它的受体而刺激分离的成熟兔破骨细胞的骨再吸收活性[参见M.Nakagawa等人，FEBS Letters，473：161-164(2000)]。因此，开发与破骨细胞受体如KDR/Flk-1和Flt-1结合的VEGF的拮抗剂可以提供治疗或预防骨吸收的另一种方法。
过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)的活化剂如噻唑烷二酮(TZD)在体外抑制破骨细胞样细胞形成和骨吸收。由R.Okazaki等人在Endocrinology，140：5060-5065(1999)中报告的结果指出骨髓细胞上的局部机制以及葡萄糖代谢作用的系统机制。PPARγ活化剂的非限制性例子包括格列酮类，例如曲格列酮、吡格列酮、罗格列酮和BRL 49653。
也可将降钙素与结构式I的SARM一起使用。优选将降钙素用作鲑鼻喷剂(Azra等人，Calcitonin，1996，在J.P.Bilezikian等人编辑的Principles of Bone Biology，San Diego：Academic Press中；和Silverman，″Calcitonin”，Rheumatic Disease Clinics of North America，27：187-196，2001)。
也可将蛋白激酶抑制剂与结构式I的SARM一起使用。激酶抑制剂包括在WO 01/17562中公开的那些，在一个实施方案中，激酶抑制剂选自p38的抑制剂。可用于本发明中的p38抑制剂的非限制性例子包括SB 203580[Badger等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，279：1453-1461(1996)]。
骨合成代谢剂为已知通过增加骨蛋白质基质的产生而建造骨的那些药物。这种骨合成代谢剂包括例如甲状旁腺激素(PTH)及其片段，如天然存在的PTH(1-84)，PTH(1-34)，其类似物，其为未加修饰的或具有取代基的，特别是甲状旁腺激素皮下注射剂。已经发现PTH增加成骨细胞(形成骨的细胞)的活性，从而促进新骨的合成(Modern Drug Discovery，Vol.3，No.8，2000)。可注射的重组形式的人PTH，Forteo(特立帕肽)，已经在美国得到管理当局批准用于骨质疏松症的治疗。
还可用于与本发明的SARM组合的是如Gowen等人在J.Clin.Invest.，105：1595-604(2000)所述的诱导PTH分泌的钙受体拮抗剂。
包括生长激素促泌剂、生长激素、生长激素释放激素等在内的另外的骨合成代谢剂可用于与结构式I的化合物一起使用，用于治疗骨质疏松症。典型的生长激素促泌剂的非限制性例子在美国专利3,239,345、4,036,979、4,411,890、5,206,235、5,283,241、5,284,841、5,310,737、5,317,017、5,374,721、5,430,144、5,434,261、5,438,136、5,494,919、5,494,920、5,492,916和5,536,716；欧洲专利公开0,144,230和0,513,974；文章，Science.2601640-1643(June 11，1993)；Ann.Rep.Med.Chem.，28：177-186(1993)；Bioorg.Med.Chem.Lett.，4：2709-2714(1994)；和Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7001-7005(1995)中公开。
胰岛素样生长因子(IGF)也可与结构式I的SARM一起使用。胰岛素样生长因子可选自胰岛素样生长因子I，单独的或组合有IGF结合蛋白3，和IGF II[参见Johannson和Rosen，″The IGFs as potential therapy formetabolic bone diseases”，1996，在Bilezikian等人编辑的Principles ofBone Biology.San Diego：Academic Press中；和Ghiron等人，J.BoneMiner.Res.10：1844-1852(1995)]。
骨形态发生蛋白(BMP)也可与结构式I的SARM一起使用。骨形态发生蛋白包括BMP 2、3、5、6、7，以及相关的分子TGFβ和GDF 5[Rosen等人，“Bone morphogenetic proteins”，1996，在J.P.Bilezikian等人编辑的Principles of Bone Biology，San Diego：Academic Press中；和WangEA，Trends Biotechnol.，11：379-383(1993)]。
也可将BMP拮抗作用的抑制剂与结构式I的SARM一起使用。在一个实施方案中，BMP拮抗剂抑制剂选自BMP拮抗剂SOST、noggin、chordin、gremlin和dan的抑制剂[参见Massague和Chen，″ControllingTGF-beta signaling”，Genes Dev.，14：627-644，2000；Aspenberg等人，J.Bone Miner.Res.16：497-500，2001；和Brunkow等人，Am.J.Hum.Genet.68：577-89(2001)]。
本发明的组织选择性雄激素受体调节剂也可与多肽骨保护素组合，用于治疗与骨损失有关的病况，如骨质疏松症。骨保护素可以选自哺乳动物骨保护素和人骨保护素。作为肿瘤坏死因子受体超家族的成员的多肽骨保护素可用于治疗以骨损失增加为特征的骨疾病，例如骨质疏松症。参考美国专利6,288,032。
也可将前列腺素衍生物与结构式I的SARM一起使用。前列腺素衍生物的非限制性代表例选自前列腺素受体EP1、EP2、EP4、FP、IP的激动剂及其衍生物[Pilbeam等人，“Prostaglandins and bone metabolism”，1996，在Bilezikian等人编辑的Principles of Bone Biology，San Diego：Academic Press；Weinreb等人，Bone，28：275-281(2001)中]。
也可将成纤维细胞生长因子与结构式I的SARM一起使用。成纤维细胞生长因子包括aFGF、bFGF和具有FGF活性的相关肽[HurleyFlorkiewicz，″Fibroblast growth factor and vascular endothelial growthfactor families”，1996，在J.P.Bilezikian等人编辑的Principles of BoneBiology，San Diego：Academic Press中]。
除骨吸收抑制剂和骨合成代谢剂之外，还已知有其它药物通过没有精确定义的机制有益于骨骼。这些药物可有利地与结构式I的SARM组合。
也可将维生素D、维生素D衍生物和类似物与结构式I的SARM一起使用。维生素D和维生素D衍生物包括例如D3(胆骨化醇)、D2(麦角骨化醇)、25-OH-维生素D3、1α，25(OH)2维生素D3、1α-OH-维生素D3、1α-OH-维生素D2、二氢速甾醇、26，27-F6-1α，25(OH)2维生素D3、19-去甲-1α，25(OH)2维生素D3、22-氧杂钙三醇、卡泊三醇、1α，25(OH)2-16-烯-23-炔-维生素D3(Ro 23-7553)、EB1089、20-表-1α，25(OH)2维生素D3、KH1060、ED71、1α，24(S)-(OH)2维生素D3、1α，24(R)-(OH)2维生素D3[参见，Jones G.，″Pharmacologicalmechanisms of therapeutics：vitamin D and analogs”，1996，在J.P.Bilezikian等人编辑的Principles of Bone Biology，San Diego：AcademicPress中]。
也可将维生素K和维生素K衍生物与本发明的SARM的各种固体形式一起使用。维生素K和维生素K衍生物包括四烯甲萘醌(维生素K2)[参见Shiraki等人，J.Bone Miner.Res.，15：515-521(2000)]。
可将大豆异黄酮包括异丙氧黄酮与本发明的SARM一起使用。
氟化物盐类，包括氟化钠(NaF)和氟磷酸单钠(MFP)也可与结构式I的SARM一起使用。也可将膳食用钙补充剂与结构式I的SARM一起使用。膳食用钙补充剂包括碳酸钙、柠檬酸钙和天然钙盐(Heaney.Calcium.1996，在J.P.Bilezikian等人编辑的Principles of Bone Biology，San Diego：Academic Press中)。
与结构式I的化合物组合使用时有利于骨骼的骨吸收抑制剂、骨合成代谢剂和其它药物的日剂量范围为本领域中已知的那些。在这种组合中，通常，结构式I的SARM的日剂量范围为每名成年人每天约0.01到约1000mg，诸如例如，约0.1到约200mg/天。然而，由于组合使用的药物的增加的效力，可进行降低各种药物剂量的调整。
具体地，当使用双膦酸盐类时，约2.5到约100mg/天的剂量(根据游离的双膦酸测量)适合于治疗，诸如例如5到20mg/天，或约10mg/天。预防性地，应该使用约2.5到约10mg/天的剂量，特别是约5mg/天的剂量。为了减少副作用，期望将结构式I的化合物和双膦酸盐类的组合每周给药一次。对于每周一次的给药，可以分别使用或以组合制剂形式使用每周约15mg到约700mg的双膦酸盐类和约0.07到约7000mg的结构式I的化合物。结构式I的化合物可以有利地在控释递送装置中给药，特别是用于每周一次给药。
对于动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症的治疗，结构式I的化合物可以有效地与一种或多种另外的活性剂组合给药。另外的一种或多种活性剂可以选自改变脂质的化合物如HMG-CoA还原酶抑制剂、具有其它药学活性的药物和同时具有改变脂质的作用和其它药学活性的药物。HMG-CoA还原酶抑制剂的非限制性例子包括内酯化的或二羟基开放酸形式的他汀类及其可药用盐和酯，其包括但不限于洛伐他汀(参见美国专利4,342,767)；辛伐他汀(参见美国专利4,444,784)；二羟基开放酸形式的辛伐他汀，特别是其铵盐或钙盐；普伐他汀，特别是其钠盐(参见美国专利4,346,227)；氟伐他汀，特别是其钠盐(参见美国专利5,354,772)；阿托伐他汀，特别是其钙盐(参见美国专利5,273,995)；西立伐他汀，特别是其钠盐(参见美国专利5,177,080)；和尼伐他汀，也称为NK-104(参见PCT国际申请公开WO 97/23200)。
可用于与结构式I的化合物组合的另外的活性剂包括但不限于HMG-CoA合酶抑制剂；角鲨烯环氧酶抑制剂；角鲨烯合酶抑制剂(也称为角鲨烯合成酶抑制剂)；酰基-辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂，包括ACAT-1或ACAT-2的选择性抑制剂以及ACAT-1和-2的双重抑制剂；微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂；普罗布考；烟酸；胆固醇吸收抑制剂，如SCH-58235，也称为依泽替米贝和1-(4-氟苯基)-3(R)-[3(S)-(4-氟苯基)-3-羟基丙基)]-4(S)-(4-羟基苯基)-2-氮杂环丁酮，其在美国专利5,767,115和5,846,966中有所描述；胆汁酸多价螯合剂；LDL(低密度脂蛋白)受体诱导剂；血小板聚集抑制剂，例如糖蛋白IIb/IIIa纤维蛋白原受体拮抗剂和阿司匹林；人过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂，包括通常称为格列酮类的化合物，例如曲格列酮、吡格列酮和罗格列酮，和包括称为噻唑烷二酮的结构类别内的那些化合物以及噻唑烷二酮结构类别以外的那些PPARγ激动剂；PPARα激动剂，例如氯贝丁酯、非诺贝特(包括微粒化的非诺贝特)和吉非贝齐；双重PPARα/γ激动剂；维生素B6(也称为吡哆醇)及其可药用盐如HCl盐；维生素B12(也称为氰基钴胺素)；叶酸或其可药用盐或酯，如钠盐和甲基葡糖胺盐；抗氧化维生素，如维生素C和E和β胡萝卜素；β阻滞剂；血管紧张素II拮抗剂如氯沙坦；血管紧张素转化酶抑制剂，例如依那普利和卡托普利；钙通道阻滞剂，例如硝苯地平和地尔硫
Figure A20068005040500351
；内皮素拮抗剂；增强ABC1基因表达的药物如LXR配体；双膦酸盐类化合物，如阿仑膦酸钠；和环氧化酶-2抑制剂，如罗非昔布和塞来昔布，以及可用于治疗这些病况的其它药物。
当与结构式I的化合物组合使用时，HMG-CoA还原酶抑制剂的日剂量范围相应于本领域中已知的那些。类似地，HMG-CoA合酶抑制剂；角鲨烯环氧酶抑制剂；角鲨烯合酶抑制剂(也称为角鲨烯合成酶抑制剂)、酰基-辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂，包括ACAT-1或ACAT-2的选择性抑制剂以及ACAT-1和-2的双重抑制剂；微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂；普罗布考；烟酸；胆固醇吸收抑制剂，包括依泽替米贝；胆汁酸多价螯合剂；LDL(低密度脂蛋白)受体诱导剂；血小板聚集抑制剂，包括糖蛋白IIb/IIIa纤维蛋白原受体拮抗剂和阿司匹林；人过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂；PPARα激动剂；双重PPARα/γ激动剂；维生素B6；维生素B12；叶酸；抗氧化维生素；β-阻滞剂；血管紧张素II拮抗剂；血管紧张素转化酶抑制剂；钙通道阻滞剂；内皮素拮抗剂；增强ABC1基因表达的药物例如LXR配体；双膦酸盐类化合物；和环氧化酶-2抑制剂的日剂量范围也相应于本领域中已知的那些，虽然由于与结构式I的化合物的组合作用，在组合给药时其剂量可以略微降低。
本发明的一个实施方案为用于影响哺乳动物中骨周转标识的方法，其包括给药治疗有效量的式I的化合物。骨周转标识的非限制性例子选自I型胶原蛋白的尿C-端肽降解产物(CTX)、I型胶原蛋白的尿N-端肽交联物(NTX)、骨钙蛋白(骨Gla蛋白质)、双能X射线吸收测量法(DXA)、骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)、定量的超声(QUS)和脱氧吡啶诺林(DPD)交联。
根据本发明的方法，组合中的单独组分可以分别地在治疗过程中的不同时间给药或以分开的形式或单一组合的形式同时给药。因此，本发明应该理解为包括同时或交替治疗的所有这些方案，并且术语“给药”应该作以相应的解释。本发明的化合物与可用于治疗由雄激素缺乏引起的或可以通过附加雄激素得以改善的疾病的其它药物的组合范围是可理解的。
在描述本发明的化合物的制备中使用的缩写：
AcOH    乙酸
CBZ-    甘氨酸甘氨酸的保护形式(C10H11NO4)
DHT     二氢睾酮
DMEM    Dulbecceo改进的Eagle培养基
DMSO    二甲基亚砜
DMF     N，N-二甲基甲酰胺
EDC     1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺·HCl
EDTA    乙二胺四乙酸
EtOAc   乙酸乙酯
EtOH    乙醇
FBS     胎牛血清
FCS     胎牛血清
HAP     羟基磷灰石
HEPES   (2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HOAt    1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt    N-羟基苯并三唑
HPLC    高效液相色谱法
LCMS    液相色谱法/质谱法
LDA     二异丙基氨基锂
MeOH    甲醇
NMM     N-甲基吗啉
n-Bu4NI    四丁基碘化铵
Pd/C       钯/炭
Rt或rt     室温
TEGM       结合缓冲剂
THF        氢呋喃
除了其它的在文献中已知的或在实验过程中示例的标准操作法之外，本发明的化合物可采用以下路线中所示的反应路线制备。
实施例1
Figure A20068005040500381
I.2-(铵基甲基)-3H-咪唑并[4.5-b]吡啶-4-鎓二氯化物(2-5)的形成
Figure A20068005040500391
步骤I.A：N-(2-氨基吡啶-3-基)-N′-羧基苄基甘氨酰胺(2-3)
将2，3-二氨基吡啶(2-1，20.866g，191.2mmol)、Cbz-甘氨酸(2-2，40g，191.2mmol)、EDC(43.93g，229.44mmol)、HOAT(26.02g，191.2mmol)和NMM(82.12mL，764.81mmol)在DMF(300mL)中的混合物搅拌20小时。混合物用H2O(500mL)稀释，用EtOAc提取(3×500mL)。合并的有机部分用饱和NaHCO3、盐水洗涤，用MgSO4干燥，然后浓缩，得到产物2-3，为棕色固体。
1H NMR(500MHz，CD3OD)7.82(d，1H，J＝5Hz)，7.49(d，1H，J＝8Hz)，7.31(m，5H)，6.65(m，1H)，5.12(s，2H)。HRMS(ES，M+l)计算值301.1295，实测值301.1296。
步骤I.B：3H-咪唑并[4.5-b]吡啶-2-基甲基氨基甲酸苄基酯(2-4)
将氨基吡啶2-3(46g，153mmol)溶于300mL的AcOH中，加热到120℃持续20小时。将反应混合物冷却到室温并浓缩，得到所需产物2-4，为乙酸盐。
1H NMR(500MHz，CD3OD)8.32(m，1H)，7.95(m，1H)，7.34(m，6H)，7.08(m，1H)，5.14(s，2H)，4.87(s，2H)。HRMS(ES，M+l)计算值283.1190，实测值283.1192。
步骤I.C：2-(铵基甲基)-3H-咪唑并[4.5-b]吡啶-4-鎓二氯化物(2-5)
向2-4(52g，151.88mmol)在1000mL的1∶1AcOH/MeOH中的混合物中添加20g的10％的Pd/C，反应混合物在1atm的H2下搅拌20小时。使混合物过滤通过硅藻土衬垫，浓缩，然后与二氧杂环己烷共沸，得到黄褐色油状物。将半固体或粘稠油悬浮在200mL的二氧杂环己烷中，并添加200mL的4.0M的HCl/二氧杂环己烷，得到黄褐色悬浮液。收集固体，用二氧杂环己烷(200mL)洗涤，并真空干燥，得到2-5，为黄褐色固体。
1H NMR(500MHz，CD3OD)8.75(d，1H，J＝8Hz)，8367(d，1H，J＝6Hz)，7.85(m，1H)，4.88(s，2H)。HRMS(ES，M+l)计算值149.0822，实测值149.0812。
II.N-(3H-咪唑并[4.5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺(1-7)的无定形形式
步骤II.A：4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酸甲酯(1-2)
将1-1(J.Med.Chem.292298-2315(1986))(120g，362.04mmol)、60％NaH(18.7g，mmol)、硫酸二甲酯(68.50g，543.05mmol)和THF(1200mL)的混合物在环境温度搅拌14小时。温热到60℃持续2小时，然后通过慢慢添加40mL的浓盐酸猝灭反应，同时用氮气吹扫顶部空间。蒸发至1/5体积，然后用1500mL水稀释。收集固体，用水、己烷洗涤，真空干燥，得到1-2，为浅黄色固体。
步骤II.B：4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾烷-17β-甲酸甲酯(1-3)
向1-2(20g，57.9mmol)的EtOH(100mL)溶液中添加10％的Pd/C(5.0g)，混合物在1atm的H2下搅拌14小时。然后使混合物过滤通过硅藻土垫，浓缩，然后真空干燥，得到1-3，为白色固体。
步骤II.C：2α-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾烷-17β-甲酸甲酯(1-4)
在20分钟内，向-78℃的1-3(12g，34.53mmol)在THF(100mL)中的溶液中滴加1.5M的LDA在THF(27.6mL，41.44mmol)中的溶液，然后搅拌1小时。然后在20分钟内添加FN(SO2Ph)2(13.07g，41.44mmol)的THF(40mL)溶液。30分钟后，除去冷却浴，反应搅拌14小时。添加Et2O，混合物用水、饱和碳酸氢钠水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，然后浓缩。在硅胶上色谱分离(己烷到EtOAc，作为洗脱液)，得到1-4，为无色固体。
MS M+H计算值：366，实测值366.1。
步骤II.D：2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酸甲酯(1-5)
在30分钟内，向-78℃的1-4(30g，82.1mmol)的THF(400mL)溶液中滴加1.5M的LDA的THF(71.1mL，107mmol)溶液，然后搅拌1小时。然后在15分钟内添加苯亚磺酸甲酯(19.23g，123mmol)。30分钟后，除去冷却浴，反应搅拌1小时。添加Et2O，混合物用水、饱和碳酸氢钠水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，然后浓缩。将残余物溶于甲苯(200mL)，加热回流2小时。蒸发溶剂，残余物在硅胶上色谱分离(己烷到50％的EtOAc/己烷作为洗脱液)，得到1-5，为浅黄色固体。
MS M+H计算值：364，实测值364.1。
步骤II.E：2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酸(1-6)
向1-5(6.2g，17.1mmol)的1，4-二氧杂环己烷(50mL)溶液中添加氢氧化锂(1.07g，25.6mmol)的水(30mL)溶液，混合物在100℃加热3小时。冷却后，混合物用乙酸乙酯稀释，分离，有机物用1N的HCl、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，然后浓缩，得到1-6，为浅黄色固体。
MS M+H计算值：350，实测值350。
步骤II.F：N-(3H-咪唑并[4.5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺(1-7)
将1-6(15g，42.9mmol)、EDC(9.88g，51.5mmol)、HOBt(6.96g，51.510mmol)、NMM(18.9mL，171.70mmol)和2-5(10.43g，47.217mmol)在DMF(200mL)中的混合物加热到40℃持续4小时，然后在环境温度搅拌14小时。混合物用水稀释，过滤，固体用水洗涤，然后真空干燥。在硅胶上色谱分离(己烷到70∶25∶5的CHCl3/EtOAc/MeOH作为洗脱液)，得到1-7，为无色的无定形固体。
1H NMR(500MHz，CDCl3)8.45(m，1H)，7.95(m，1H)，7.23(m，1H)，6.14(d，1H，J＝8Hz)，4.72(m，2H)，3.40(dd，1H，J＝4Hz，13Hz)，2.94(s，3H)，2.23(m，2H)，1.96(m，2H)，1.53-1.86(m，7H)，1.25-1.39(m，3H)，1.12(m，1H)，1.04(m，2H)，0.95(s，3H)，0.68(s，3H)。MS M+H计算值：480.2770实测值480.2740。
实施例2
N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的无水结晶形式A
将无定形N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺(1-7)溶于1，2-二甲氧基乙烷。将溶液加热到回流。在约2分钟后，发生结晶。淤浆回流2小时，冷却到室温，过滤。固体用1，2-二甲氧基乙烷洗涤，并干燥，得到N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的无水结晶形式A。
实施例3
N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的吸湿性结晶形式B
在加温下将无定形N-(3H-咪唑并[4.5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺(3.0g)(1-7)溶于5mL乙醇中。混合物冷却到室温。6小时后，开始形成针状结晶。将混合物放置过夜。收集沉淀的固体，用乙醇洗涤。经洗涤的固体干燥24小时。
实施例4
N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的结晶水合物形式C
将结晶乙醇合物形式G(约10mg)悬浮在处在搅拌容器中的1mL的水中。将悬浮液搅拌3小时。使固体沉降析出。干燥固体的XRPD分析显示为结晶水合物形式C。
实施例5
N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的结晶无水形式D
将结晶四水合物形式E(1.5gm)和甲醇(15gm，19mL)加入到装备有香蕉刀片搅拌机的125mL夹套烧瓶中。夹套温度设为20℃。固体在20℃溶解。用形式A(30mg)作为晶种对混合物引晶，并老化1小时。在8小时内将去离子水(DIW)(19mL)添加到夹套烧瓶中。加入约1mL的DIW后，形式A晶种溶解。在加入约9mL的DIW后，将批料用约5mg的形式A晶种再引晶。在最初加入水后将批料老化过夜。将夹套烧瓶中的混合物的约三分之一(13mL)除去并置于带盖的量筒中。使固体沉降析出。用吸量管吸出量筒内的样品的液体部分并通过WhatmanTM过滤器过滤。将量筒内的样品的剩余部分在装备有真空装置的过滤罐上过滤。然后样品用DIW洗涤三次。经过滤的湿滤饼在35℃的真空烘箱中干燥。干燥固体的XRPD分析显示为结晶形式A。
在4小时内，向在夹套烧瓶内的剩余的混合物中添加4.81mL的DIW。然后使批料老化过夜。然后，将夹套烧瓶内剩余的混合物的约一半(15.4mL)置于带盖的量筒内。使固体沉降析出。用吸量管吸出量筒内的样品的液体部分，并通过WhatmanTM过滤器过滤。将样品的湿固体部分在装备有真空装置的过滤罐上过滤。然后样品用DIW洗涤三次。经过滤的湿滤饼在35℃的真空烘箱中干燥。干燥固体的XRPD分析显示为结晶形式A。
随后，在4小时内向在夹套烧瓶内的剩余的混合物中添加3.95mL的DIW。使批料老化4小时。关闭搅拌并使固体沉降析出。用吸量管吸出量筒内的样品的液体部分，并通过Whatman过滤器过滤。将湿固体在装备有真空装置的过滤罐上过滤。然后样品用DIW洗涤三次。经过滤的湿滤饼在35℃的真空烘箱中干燥。干燥固体的XRPD分析显示为结晶无水形式D。
实施例6
N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的结晶四水合物形式E
将N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的无水结晶形式A(52.46mg)称重，并溶于搅拌下的50mL的0.1N盐酸中形成透明的溶液。24小时后，用几滴50％的NaOH将样品调节到pH1.5以促进沉淀。溶液仍然没有沉淀析出，向溶液中添加另外的100.25mg的无水结晶形式A以促进沉淀。溶液大部分变得澄清，然后开始析出沉淀。将样品平衡4天多，此时将固体离心析出，过滤，用冷水漂洗。干燥样品的XRPD分析显示为结晶四水合物形式E。
实施例7
N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的结晶倍半水合物形式F
将实施例2中所述的N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的无水结晶形式A的一部分在40℃烘箱中真空干燥2小时，取出小份用于分析，余下的样品继续干燥过夜。然后取出样品也用于分析。2小时样品和过夜真空干燥样品都用XRPD进行表征，并确定为是相同的：结晶倍半水合物形式F。
实施例8
N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的乙醇合物形式G(2-1)
将无定形N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺(9.5g)(1-7)溶于60℃的75mL的乙醇中。将混合物冷却到室温。2小时后，收集固体，用25mL的乙醇洗涤。经洗涤的固体空气干燥24小时，得到无色的固体。干燥固体通过XRPD分析并确定为是无定形形式。
实施例9
药物组合物
作为本发明的特定的实施方案，将100mg的N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺无水结晶形式D与足够细分散的乳糖配制，提供580到590mg的总量，用于填充0号硬胶囊。
尽管上述说明书教导了本发明的原则，提供实施例用于举例说明目的，但应理解本发明的实践涵盖所有的处在权利要求及其等价物范围内的通常的变体、选择或改进。
试验
用于化合物的SARM活性鉴定的体外和体内试验
本申请中的示例性化合物在以下的一个或多个试验中表现出活性。测定化合物对内源性表达的AR的亲合力的羟磷灰石基放射配体替代试验
材料：
结合缓冲液：TEGM(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10％甘油，1mMβ-巯基乙醇，10mM钼酸钠，pH 7.2)
50％HAP浆：Calbiochem羟磷灰石，Fast Flow，在10mM Tris，pH 8.0和1mM EDTA中。
洗涤缓冲液：40mM Tris，pH7.5，100mM KCl，1mM EDTA和1mMEGTA。
95％EtOH
甲雌三烯醇酮，[17α-甲基-3H]，(R1881*)；NEN NET590
甲雌三烯醇酮(R1881)，NEN NLP005(溶解于95％EtOH中)
二氢睾酮(DHT)[1，2，4，5，6，7-3H(N)]NEN NET453
羟磷灰石Fast Flow；Calbiochem Cat#391947
钼酸盐＝钼酸(Sigma，M1651)
MDA-MB-453细胞培养基：
RPMI 1640(Gibco 11835-055)w/23.8mM
NaHCO3，2mM L-谷氨酰胺，在500mL
的完全培养基中                         最终浓度
10mL(1M Hepes)                         20mM
5mL(200mM L-glu)                       4mM
0.5mL(10mg/mL人胰岛素)                 10μg/mL
在0.01N HCl中
Calbiochem#407694-S)
50mL FBS(Sigma F2442)                  10％
1mL(10mg/mL庆大霉素Gibco#15710-072)    20μg/mL
细胞传代
将细胞(Hall R.E.等人，European Journal of Cancer，30A：484-490(1994))在PBS中漂洗两次，将不含酚红的胰蛋白酶-EDTA在相同的PBS中稀释1∶10。将细胞层用1X胰蛋白酶漂洗，将额外的胰蛋白酶倾掉，并将细胞层在37℃培养～2分钟。将烧瓶塞住并检查细胞脱附的迹象。一旦细胞开始滑下烧瓶，加入完全培养基以杀灭胰蛋白酶。这时对细胞计数，然后稀释到适当的浓度并分离到烧瓶或实验皿中用于进一步培养(通常1∶3到1∶6稀释)。
MDA-MB-453细胞裂解产物的制备
当MDA细胞达到70到85％铺满时，如上所述将它们脱附，并通过在4℃下在1000g离心10分钟进行收集。将细胞团粒用TEGM(10mMTris-HCl、1mM EDTA、10％甘油、1mMβ-巯基乙醇、10mM钼酸钠，pH 7.2)洗涤两次。在最后的洗涤之后，将细胞以107个细胞/毫升的浓度再悬浮在TEGM中。将细胞悬浮液在液氮或乙醇/干冰浴中快速冷冻并转移到位于干冰上的-80℃冷冻器中。在建立结合试验以前，将冷冻的样品置于冰-水上至恰好解冻(～1小时)。然后将样品在4℃下在12,500g到20,000g离心30分钟。立即将上清液用于建立试验。如果使用50μL的上清液，则试验化合物可以在50μL的TEGM缓冲液中制备。
多化合物筛选方法
制备1x TEGM缓冲液，并且按以下顺序制备包含同位素的试验混合物：EtOH(在反应中为2％的最终浓度)、3H-R1881或3H-DHT(在反应中为0.5nM的最终浓度)和1x TEGM。[例如，对于100个样品，为200μL(100x2)的EtOH+4.25μL的1∶103H-R1881原液+2300μL(100x23)1x TEGM]。将化合物顺序地稀释，例如，如果开始的最终浓度为1μM，和化合物在25μL溶液中，则对于双份样品，制备75μL的4x1μM溶液，并将3μL的100μM溶液加入到72μL的缓冲液中，并且进行1∶5系列稀释。
首先将25μL的3H-R1881痕量和25μL的化合物溶液混合在一起，随后加入50μL的受体溶液。将反应温和地混合，在约200rpm短暂地旋转并在4℃培养过夜。制备100μL的50％HAP浆液并将其加入到培养的反应物中，然后将其涡流并在冰上培养5到10分钟。将反应混合物再涡旋两次，用于在培养反应物时再悬浮HAP。然后使用FilterMateTMUniversal Harvester洗板器(Packard)将96孔板中的样品在洗涤缓冲液中洗涤。洗涤过程将包含与配体结合的表达受体的HAP团粒转移到Unifilter-96GF/B滤板(Packard)上。将滤板上的HAP团粒与50μL的MICROSCINT(Packard)闪烁剂培养30分钟，然后在TopCount微量闪烁计数器(Packard)上计数。使用R1881作为参考计算IC50值。
式I的化合物在上述试验中进行试验，发现具有1微摩尔或更低的IC50值。
用于雄激素受体N-末端域和C-末端域的由配体诱导的相互作用的哺乳动物双杂种试验(激动剂模式，VIRCON)
该试验评价AR激动剂诱导rhAR的N-末端域(NTD)和C-末端域(CTD)之间的相互作用(其反映体内由激活的雄激素受体介导的雄性化可能性)的能力。rhAR的NTD和CTD的相互作用定量表示为配体诱导的作为CV-1猴肾细胞中哺乳动物双杂种试验的Gal4DBD-rhARCTD融合蛋白和VP16-rhARNTD融合蛋白之间的缔合。
在转染的前一天，将CV-1细胞胰蛋白酶化并计数，然后以20,000个细胞/孔在96孔板或更大的板(相应地按比例增大)中铺板在DMEM+10％FCS中。次日早晨，根据供应商推荐的方法，使用LIPOFECTAMINE PLUS试剂(GIBCO-BRL)，将CV-1细胞与pCBB1(在SV40早期启动子下表达的Gal4DBD-rhARLBD融合构建体)、pCBB2(在SV40早期启动子下表达的VP16-rhAR NTD融合构建体)和pFR(Gal4响应性荧光素酶报道基因，Promega)转染。简而言之，将0.05μg pCBB1、0.05μg pCBB2和0.1μg的pFR的DNA混合物在与“PLUS试剂”(1.6μL，GIBCO-BRL)混合的3.4μL的OPTI-MEM(GIBCO-BRL)中混合并在室温(RT)培养15分钟，以形成预复合的DNA。
对于每个孔，将0.4μL的LIPOFECTAMINE试剂(GIBCO-BRL)稀释到第二个试管中的4.6μL的OPTI-MEM中并混合以形成稀释的LIPOFECTAMINE试剂。将预复合的DNA(上述)和稀释的LIPOFECTAMINE试剂(上述)合并、混合并在室温下培养15分钟。将细胞上的培养基用40μL/孔的OPTI-MEM替换，并向每个孔中加入10μLDNA-脂质复合物。将复合物温和地混合到培养基中并在37℃在5％CO2中培养5小时。在培养之后，加入200μL/孔的D-MEM和13％的活性炭处理胎牛血清(charcoal-stripped FCS)，随后在37℃下在5％CO2中培养。在24小时后，加入期望浓度的试验化合物(1nM-10μM)。四十八小时后，根据生产商的规程，使用LUC-Screen系统(TROPIX)测量荧光素酶活性。通过连续加入50μL的试验溶液1、随后加入50μL的试验溶液2直接在孔中进行试验。在室温下培养40分钟之后，使用2-5秒积分测量发光度。
计算试验化合物的活性，为相对于使用3nM R1881获得的活性的Emax。本发明的组织选择性雄激素受体调节剂在这种试验中表现出弱激动活性或无激动活性，在10微摩尔时具有低于50％的激动剂活性。
参见He B，Kemppainen JA，Voegel JJ，Gronemeyer H，Wilson EM，″Activation function in the human androgen receptor ligand binding domainmediates inter-domain communication with the NH(2)-terminal domain”，J.Biol.Chem.274：37219-37225(1999)。
雄激素受体的反式激活调节(TAMAR)
该试验评价试验化合物控制从MMTV-LUC报道基因转录进入MDA-MB-453细胞(其是一种天然表达人AR的人乳腺癌细胞系)的能力。该试验测量了连接到LUC报道基因的修饰MMTV LTR/启动子的诱导。
以20,000到30,000个细胞/孔在白色的透明底的96孔板中的“Exponential生长培养基”中铺板，该生长培养基组成如下：含10％FBS、4mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES、10μg/mL人胰岛素和20μg/mL庆大霉素的无酚红的RPMI 1640。培养条件是37℃和5％CO2。转染以批处理方式进行。将细胞胰蛋白酶化并在适当量的新鲜培养基中计数到正确的细胞数，然后温和地与Fugene/DNA混合液混合并在96孔板上铺板。所有的孔接受200Tl的培养基+脂质/DNA复合物，然后在37℃下培养过夜。转染混合液组成如下：不含血清的Optimem、Fugene6试剂和DNA。遵守用于混合液构建的生产商(Roche Biochemical)的规程。脂质(Tl)与DNA(Tg)的比为约3∶2，培养时间为在室温下20分钟。在转染后16到24小时，将细胞用试验化合物处理，使得最终DMSO(介质)浓度＜3％。使细胞暴露在试验化合物下48小时。在48小时后，用Promega细胞培养裂解缓冲液将细胞裂解30-60分钟，然后在96孔板光度计中测定提取物中的荧光素酶活性。
计算试验化合物的活性，为相对于使用100nM R1881所得活性的Emax。参见R.E.Hall等人，“MDA-MB-453，an androgen-responsive humanbreast carcinoma cell line with high androgen receptor expression”，Eur.J.Cancer，30A：484-490(1994)和R.E.Hall等人，“Regulation of androgenreceptor gene expression by steroids and retinoic acid in humanbreast-cancer cells”，Int.J.Cancer.，52：778-784(1992)。本发明的组织选择性雄激素受体调节剂在这种试验中表现出高于10％的部分激动剂活性。
体内前列腺试验
将9-10周龄(性成熟最早年龄)的雄性Sprague-Dawley大鼠以预防模型使用。目标是测量雄激素样化合物延迟在睾丸去除(睾丸切除术[ORX])之后七天内发生的腹侧前列腺和精囊迅速退化(～-85％)的程度。
将大鼠切除睾丸(ORX)。将每只大鼠称重，然后通过维持有效的异氟烷气体进行麻醉。在阴囊上作1.5cm的前后切口。将右侧睾丸取出。用4.0丝在最接近睾丸的0.5cm处将精索动脉和输精管结扎。在结扎位置的远端用小手术剪一次剪掉睾丸。将组织残余部分送返到阴囊中。对左侧睾丸重复同样的操作。在将两侧的残余部分送返到阴囊后，用4.0丝将阴囊和覆盖皮肤缝合。对于假ORX，完成除了结扎和剪刀剪切之外的全部程序。大鼠在10-15分钟内完全恢复意识和完全的活动能力。
在将手术切口缝合之后立即对大鼠皮下或经口给药一定剂量的试验化合物。持续处理另外的六个连续日。
尸体解剖和终点
首先将大鼠称重，然后在CO2室中麻醉，直到接近死亡。通过心脏穿刺得到约5ml全血。然后检查大鼠的某些死亡征象和ORX的完全性。然后，将前列腺的腹侧部分定位并以高度程式化方式钝器剖解下来。将腹侧前列腺吸干3-5秒，然后称重(VPW)。最后，将精囊定位并剖解下来。将腹侧精囊吸干3-5秒，然后称重(SVWT)。
这个试验的原始数据为腹侧前列腺和精囊的重量。二级数据包括血清LH(促黄体生成激素)和FSH(促卵泡激素)和可能的骨形成和雄性化的血清标记物。数据通过ANOVA加Fisher PLSD post-hoc检验分析，以确定组与组之间的差异。评价试验化合物抑制ORX-诱导的VPW和SVWT损失的程度。
体内骨形成试验：
将7-10月龄的雌性Sprague-Dawley大鼠以治疗模型使用，以模拟成年女性。大鼠已经在75-180天前切除卵巢(OVX)，以引起骨损失和模拟雌激素缺乏、骨质减少的成年女性。用小剂量的强效抗再吸收剂阿仑膦酸盐(0.0028mpk SC，2X/周)的预处理从第0天开始。在第15天，开始用试验化合物处理。在第15-31天进行试验化合物治疗，在第32天进行尸体解剖。目标是测量雄激素样化合物增加骨形成量的程度，其通过骨膜表面上增加的荧光染料标记表示。
在典型的试验中，研究每组为七只大鼠的9个组。在第19和29天(治疗的第五和第十五天)，对每只大鼠单次皮下注射钙黄绿素(8mg/kg)。
尸体解剖和终点
首先将大鼠称重，然后在CO2室中麻醉，直到接近死亡。通过心脏穿刺得到约5ml全血。然后检查大鼠的某些死亡征象和OVX的完全性。首先，将子宫定位，以高度程式化方式钝器剖解掉，吸干3-5秒，然后称重(UW)。将子宫置于10％的中性缓冲的福尔马林中。然后，在髋部将右腿脱节。在膝处将股骨和胫骨分离，基本上除去肉，然后置于70％乙醇中。
将股骨的近端-远端中点作为中心的中右股骨的1厘米段置于闪烁管中并在梯度醇和丙酮中脱水和脱脂，然后通过增加异丁烯酸甲酯的浓度将其引入到溶液中。将其包埋于90％异丁烯酸甲酯∶10％邻苯二甲酸二丁酯的混合物，使之进行聚合48-72小时。将瓶子敲碎并将塑料块修整为方便地适合于Leica 1600Saw Microtome的钳状样品座的形状，将骨的长轴准备用于横切。制备三个85μm厚的横切片并安装在载玻片上。选择每只大鼠的接近骨中点的一个切片并且进行盲式编码(blind-coded)。对各个切片的骨膜表面评价总的骨膜表面、单独荧光染料标记、双重荧光染料标记和标记间的距离。
这个试验的一级数据是带有双重标记的骨膜表面的百分比和矿物沉积率(标记间的距离(μm)/10d)、骨形成的半独立性标记物。二级数据包括子宫重量和组织学特征。三级终点可以包括骨形成和雄性化的血清标记物。将数据通过ANOVA加Fisher PLSD post-hoc检验分析，以确定组与组之间的差异。评价试验化合物增加骨形成终点的程度。

Claims (34)

1.结晶N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺。
2.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无定形结晶形式A，其具有的X射线粉末衍射图形具有在5.6±0.1、7.6±0.1和9.6±0.1的2θ值处的衍射峰。
3.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无水结晶形式A，其具有的碳-13CPMASNMR光谱信号具有约39.7±0.1、118.3±0.1、169.2±0.1和12.6±0.1p.p.m的化学位移值。
4.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无水结晶形式A，其具有的氟-19MAS NMR光谱信号具有约-128.9±0.1p.p.m的化学位移值。
5.权利要求2的无水结晶形式A，其具有的熔点在约281.2℃。
6.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的吸湿性结晶形式B，其具有的XRPD图形具有在约7.8±0.1、8.5±0.1和10.2±0.1的2θ值处的衍射峰。
7.权利要求6的吸湿性结晶形式B，其具有的熔点在约164.0℃。
8.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶水合物形式C，其具有的XRPD图形具有在约10.1±0.1、11.0±0.1和12.4±0.1的2θ值处的衍射峰。
9.权利要求8的结晶水合物形式C，另外具有在约268.0℃处的熔融/分解吸热峰。
10.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无水结晶形式D，其具有的XRPD图形具有在约8.9±0.1、9.9±0.1和12.5±0.1的2θ值处的衍射峰。
11.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无水结晶形式D，其具有的碳-13CPMASNMR光谱信号具有约174.2±0.1、12.2±0.1、56.0±0.1和23.9±0.1p.p.m的化学位移值。
12.权利要求10的结晶水合物形式D，另外具有在约263.6℃处的熔融吸热峰。
13.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶四水合物形式E，其具有的XRPD图形具有在约6.1±0.1、12.8±0.1和13.1±0.1的2θ值处的衍射峰。
14.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶四水合物形式E，其具有的碳-13CPMASNMR光谱信号具有约13.1±0.1、28.9±0.1、39.3.0±0.1和154.2±0.1p.p.m的化学位移值。
15.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶四水合物形式E，其具有的氟-19MASNMR光谱信号具有约-126.5±0.1、-128.0±0.1和-129.3±0.1p.p.m的化学位移值。
16.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶倍半水合物形式F，其具有的XRPD图形具有在约6.3±0.1、7.6±0.1和12.5±0.1的2θ值处的衍射峰。
17.N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶乙醇合物形式G，其具有的XRPD图形具有在约8.2±0.1、10.0±0.1和13.4±0.1的2θ值处的衍射峰。
18.权利要求17的结晶乙醇合物形式G，另外具有在约165.9℃处的熔融吸热峰。
19.制备化合物N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的无水结晶形式A的方法，该方法包括：
a)将化合物溶解在至少一种溶剂中形成混合物；
b)使混合物回流直到结晶完全并形成固体；
c)分离固体；和
d)干燥固体。
20.权利要求19的方法，其中至少一种溶剂选自1，2-二甲氧基乙烷、异丙醇、乙酸异丙酯和丙酮。
21.权利要求20的方法，其中分离固体另外包括通过真空滤器过滤固体并用至少一种选自1，2-二甲氧基乙烷、异丙醇、乙酸异丙酯和丙酮的洗涤溶剂洗涤固体。
22.制备N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的四水合物形式E的方法，该方法包括：将无水结晶游离碱形式A添加到pH约2或更低的水溶液中形成溶液；使溶液老化以沉淀固体；分离固体；并干燥固体。
23.权利要求22的方法，其中无水结晶游离碱形式A的添加在室温下进行。
24.形成N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶无水形式D的方法，该方法包括：将四水合物形式E溶解在至少一种溶剂中形成溶液；向溶液添加至少一种逆溶剂直到溶液过饱和；使过饱和溶液老化以形成固体；分离固体；并干燥固体。
25.权利要求24的方法，其中至少一种溶剂选自二甲基乙酰胺、甲醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮。
26.权利要求25的方法，其中至少一种逆溶剂选自庚烷、甲苯、环己烷、水、乙腈、乙酸异丙酯、乙酸异丁酯和甲基叔丁基醚。
27.权利要求26的方法，其中至少一种溶剂选自甲醇、二甲基亚砜和N-甲基-2-吡咯烷酮；并且至少一种逆溶剂选自水和乙腈。
28.权利要求27的方法，其中老化步骤任选地包括添加更多的逆溶剂或将批料冷却直到形成固体。
29.形成N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶倍半水合物形式F的方法，该方法包括在40℃真空干燥四水合物形式E至少10小时。
30.形成N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶乙醇合物形式G的方法，该方法包括将无水N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺溶解在乙醇中形成溶液；加热溶液到约60℃，通过将溶液冷却到室温使溶液老化以沉淀固体；从溶液分离固体；并干燥固体。
31.形成N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的吸湿性结晶形式B的方法，该方法包括将N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄-1-烯-17β-甲酰胺的无定形形式溶解在乙醇中形成溶液，其中无定形形式与乙醇的比以质量计为约3∶4；加热溶液到约60℃；通过将溶液冷却到室温使溶液老化以沉淀固体；从溶液分离固体；并干燥固体。
32.形成N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶水合物形式C的方法，该方法包括将N-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的结晶乙醇合物形式G溶解在搅拌容器中的水中形成溶液，其中结晶乙醇合物形式G与水的比以质量计为约1∶100；使溶液老化以沉淀固体；从溶液分离固体；并干燥固体。
33.一种药物组合物，包括治疗有效量的N-(3H-咪唑并[4，5-B]吡啶-2-基甲基)-2-氟-4-甲基-3-氧代-4-氮杂-5-α-雄-1-烯-17-β-甲酰胺的至少一种结晶形式和至少一种可药用载体。
34.权利要求33的药物组合物，其中至少一种结晶形式选自：无水结晶形式A、吸湿性结晶形式B、水合物结晶形式C、无水结晶形式D、四水合物结晶形式E、倍半水合物结晶形式F和乙醇合物形式G。
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