CN101355948A - 用于治疗增殖性疾病的Roscovitine和HDAC抑制剂的组合 - Google Patents

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Abstract

本发明的第一方面涉及组合，其包含roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N－辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。本发明的第二方面涉及药物制品，其包含roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N－辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，作为在治疗中同时、依次或分别使用的组合制剂。本发明的第三方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包含同时、依次或分别向患者给药roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N－辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。

Description

用于治疗增殖性疾病的Roscovitine和HDAC抑制剂的组合
本发明涉及适合用于治疗增殖性疾病的药物组合。特别是本发明涉及用于治疗癌症的组合，优选非小细胞肺癌(NSCLC)。
发明背景
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞周期中发挥重要的调节作用。CDKs通过对DNA复制和细胞分裂有关的各种蛋白的磷酸化调节细胞周期进程，所述蛋白包括转录因子和肿瘤抑制蛋白(Senderowicz，AM.Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators，Oncogene，2003；22：6609-6620)。通过参与RNA多聚酶II(polII)最大亚基的羧基末端结构域(CTD)的磷酸化，某些CDKs也在RNA合成的调节中发挥作用。因此，CDKs已成为受关注的治疗靶点并不令人感到意外。因此，许多通过竞争ATP结合位点而干扰CDKs活性的新药物正在进行临床试验测试(Fischer PM and Gianella-Borradori A，CDK inhibitors in clinical developmentfor the treatment of cancer，Expert Opin Investig Drugs.2003；12：955-970)。
现有技术描述了几种化合物，其可通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶而调节细胞周期。这些化合物包括丁内酯、夫拉平度(flavopiridol)和2-(2-羟基乙基氨基)-6-苄基氨基-9-甲基嘌呤(奥罗莫星)。已表明奥罗莫星和相关化合物是cdc2的抑制剂。Cdc2(也称为cdk1)是细胞周期蛋白依赖性激酶家族的催化亚基，其与细胞周期调节相关。
这些激酶包括至少两个亚基，亦即催化亚基(其中cdc2为原型)和调节亚基(细胞周期蛋白)。Cdks通过与细胞周期蛋白家族成员的短暂缔合调节，该细胞周期蛋白家族成员为：细胞周期蛋白A(cdc2、CDK2)、细胞周期蛋白B1-B3(cdc2)、细胞周期蛋白C(CDK8)、细胞周期蛋白D1-D3(CDK2-CDK4-CDK5-CDK6)、细胞周期蛋白E(CDK2)、细胞周期蛋白H(CDK7)。
这些复合物中的每一种均涉及于细胞周期的特定期。CDK活性通过翻译后修饰、与其他蛋白的短暂缔合和它们的细胞内定位的修饰来调节。CDK调节子包括激活蛋白(细胞周期蛋白、CDK7/细胞周期蛋白H、cdc25磷酸酶)、p9.sup.CKS和p15.sup.CDK-BP亚基，和抑制蛋白(p16.sup.INK4A、p15.sup.INK4B、p21.sup.Cipl、p18.p27.sup.Kipl)。
现在，文献中大量支持CDKs和它们的调节蛋白在人类肿瘤的发展中发挥重要作用的假说。因此，在许多肿瘤中，已经观察到细胞周期蛋白依赖性激酶的暂时异常表达和蛋白抑制剂的主要异常(突变、缺失)。
已经表明Roscovitine是细胞周期蛋白依赖性激酶尤其是对CDK2的强效抑制剂。CDK抑制剂被认为阻断了细胞周期G1/S和G2/M期的细胞途径。最近出现了单纯的roscovitine的R-对映异构体，seliciclib(R-Roscovitine；CYC202)，其为多种肿瘤细胞中有效的凋亡诱导剂(McClue SJ，Blake D，Clarke R，等人，In vitro and in vivo antitumor properties of the cyclin dependentkinase inhibitor CYC202(R-Roscovitine)，Int J Cancer.2002；102：463-468)，并且已经在进行治疗乳腺癌和非小细胞肺癌的临床试验(Fischer PM andGianella-Borradori A，CDK inhibitors in clinical development for the treatmentof cancer，Expert Opin Investig Drugs，2003；12：955-970)。Roscovitine也表现为成视网膜细胞瘤磷酸化的抑制剂，因此提示对Rb阳性肿瘤作用更强。
众所周知，本领域中经常组合给药活性药剂以使治疗方案最佳。例如，CDK抑制剂与第二种化疗剂组合的用途在WO 03/077999、WO 03/082337、WO 2004/041262、WO 2004/041267、WO 2004/041268、WO 2004/041308、WO 2004/110455和WO 2005/053699(均属于Cyclacel Limited)中描述。
本发明寻求提供已知药物试剂的新组合，所述组合尤其适用于治疗增殖性疾病，特别是癌症。更具体地说，本发明优选的方面重点是在非小细胞肺癌(NSCLC)治疗中有用的组合。
发明内容
本发明的第一方面涉及组合，其包含roscovitine或其可药用盐，和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，其中该抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(trichostatin A，TSA)。
虽然roscovitine和上述HDAC抑制剂在本领域中已经用作单个治疗试剂，但并没有建议本发明中所要求的具体组合会在癌症治疗中有效。而且，本领域中并没有建议具体要求的组合在治疗NSCLC中有用，已知所述NSCLC是特别难治疗的。
第二方面涉及药物组合物，其包含本发明的组合和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
第三方面涉及本发明的组合在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。
第四方面涉及药物制品(pharmaceutical product)，其包含roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，作为在治疗中同时、依次或分别使用的组合制剂。
第五方面涉及一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包含同时、依次或分别给药roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
第六方面涉及roscovitine或其可药用盐在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述治疗包含同时、依次或分别给药HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
第七方面涉及HDAC抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，其中所述治疗包含同时、依次或分别给药roscovitine或其可药用盐。
第八方面涉及(i)roscovitine或其可药用盐，和(ii)HDAC抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
第九方面涉及HDAC抑制剂，在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，其中所述药物用于与roscovitine或其可药用盐的组合治疗。
第十方面涉及HDAC抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，其中所述药物用于以roscovitine或其可药用盐的预处理治疗中。
第十一方面涉及roscovitine或其可药用盐在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于与HDAC抑制剂的组合治疗，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
第十二方面涉及roscovitine或其可药用盐在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于以HDAC抑制剂的预处理治疗中，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
第十三方面涉及roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂在制备用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的药物中的用途。
发明详述
下面阐述的优选实施方案适用于本发明的所有上述方面。
Roscovitine或2-[(1-乙基-2-羟基乙基)氨基]-6-苄基氨基-9-异丙基嘌呤，也称为2-(1-D，L-羟基甲基丙基氨基)-6-苄基氨基-9-异丙基-嘌呤。本文所用的术语“roscovitine”包括拆分的R和S对映异构体，其混合物，和其外消旋体。
本文所用的术语“seliciclib”指roscovitine的R对映异构体，即：2-(1-R-羟基甲基丙基氨基)-6-苄基氨基-9-异丙基嘌呤，该结构如下所示。
Figure A20068005090500091
对于本发明的所有实施方案，roscovitine优选为R-对映异构体，即：2-(1-R-羟基甲基丙基氨基)-6-苄基氨基-9-异丙基-嘌呤，下文中称为“seliciclib”或“CYC202”或“R-roscovitine”。
Roscovitine的体外活性如下：
  激酶   IC50(μM)
  Cdk1/细胞周期蛋白B   2.7
  Cdk2/细胞周期蛋白A   0.7
  Cdk2/细胞周期蛋白E   0.1
  Cdk7/细胞周期蛋白H   0.5
  Cdk9/细胞周期蛋白T1   0.8
  Cdk4/细胞周期蛋白D1   14.2
  PKA   ＞50
  PKC   ＞50
如上所述，本发明要求的组合包含roscovitine和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
组蛋白是小的带正电的蛋白，其富含碱性氨基酸(在生理pH下带正电)。有五种主要的组蛋白，即：H1、H2A、H2B、H3和H4，它们具有高度的结构相似性。在真细菌(例如，E.coli)没有发现组蛋白，虽然这些细菌的DNA与其它推测具有组蛋白具有相似功能(在细菌细胞中包裹DNA)的蛋白相关。然而，古细菌含有包裹它们DNA的组蛋白，其结构与真核生物染色体相似(G.M.Cooper，“The Cell-A Molecular Approach”，2nd Edition，Chapter II)。
大多数组蛋白在细胞周期的S期合成，且新合成的组蛋白快速进入核中以与DNA结合。在合成的几分钟内，新DNA与核小体结构中的组蛋白结合。
组蛋白的氨基-末端区域可以通过翻译后加入甲基(在赖氨酸和精氨酸基团上)、乙酰基(在赖氨酸基团上)，或磷酸基团(在丝氨酸基团上)而被酶修饰(Spencer等人，Gene，1999，240(1)，1)。这导致组蛋白网状正电结构减少，随后弱化了组蛋白与DNA的结合。
组蛋白脱乙酰基化剂(HDACs)以及抑制HDACs的化合物的研究已经阐明了一些疾病状态作用的机理。例如，在寻求新的抗疟疾化合物中，天然存在的apicidin通过过乙酰化组蛋白表现出体外抑制恶性疟原虫(P.falciparum)的生长(K.T.Andrews et al，Int.J.Parasitol.，2000，30(6)，761)。
因此，认为HDACs与许多不同的疾病相关，所述疾病包括增殖性疾病，如白血病(Lin等人，Nature，1998，391，811)，黑素瘤/鳞状细胞癌(Gillenwater等人，Int.J.Cancer，1998，75217；Saunders等人，Cancer Res.，1999，59，399)，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌(Gelmetti等人，Mol.Cell Biol.，1998，18，7185；Wang等人，PNAS，1998，951，10860)和结肠癌(C.A.Hassig，等人，1997，Chem.Biol.，4，783；S.Y.Archer等人，PNAS，1998，95(12)，6791)。
US 2005/0004007公开了一种促进癌细胞调亡的方法，其包括给药细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和诱导细胞分化的试剂。给出了几种类型的诱导细胞分化的试剂，即组蛋白脱乙酰酶抑制剂、蛋白激酶C、类视黄醇和维生素D3。然而，包含roscovitine和HDAC抑制剂的组合没有具体公开，且没有公开该组合在治疗实体瘤如NSCLC中的用途。相反，US 2005/0004007的实例限制于夫拉平度与所选的HDAC抑制剂的组合对白血病细胞株的测试。
因此，至今，没有公开本发明申请中要求的具体组合，更不用说这些组合能够用于治疗肺癌如NSCLC的任何建议。
本发明的一个优选实施方案中，所述HDAC抑制剂为丁酸钠。
丁酸钠通过发酵大肠腔中的膳食纤维形成(G.J.Kelloff等人，CancerChemoprevention：Volume 1，page 665)。已经发现在脊髓性肌萎缩淋巴细胞株中，丁酸钠增加含外显子7的SMN蛋白从SMN2基因的高表达。提出了丁酸钠通过乙酰化核小体DNA，和控制SMN2基因的外显子7的其它剪接的其它因素(J.-G.Chang等人，PNAS，2001，98(17)，9809)起作用。
在培养的红白血病细胞(A.Leder等人，Cell，1975，5(3)，319)和PC12嗜铬细胞瘤细胞(J.C.Byrd et al，Brain Res.，1987，428(1)，151)中，丁酸钠已经表现出诱导分化，同时增加人和其它动物中胎儿血红蛋白基因的表达(S.P.Perrine等人，Adv.Exp.Med.Biol.，1989，271，177和S.P.Perrine等人，PNAS，1988，85(22)，8540)。
在另一个优选实施方案中，所述HDAC抑制剂为丁酸钠的前药。
在另一个尤其优选实施方案中，所述前药为丁酸(新戊酰基氧基甲基)酯。丁酸(新戊酰基氧基甲基)酯
Figure A20068005090500111
为丁酸的酰基氧基烷基酯前药，且表现出诱导在白血病和神经母细胞瘤细胞调亡的固有(instrinsic)途径(S.Mei等人，International Journal of Oncology，2004，25，1509)。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述HDAC抑制剂为制毛癣素A(TSA)。
抗真菌抗生素制毛癣素首先从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)菌株的代谢产物中分离(N.Tsuji等人，J.Antibiot.，1976，29，1)。制毛癣素A(TSA)为HDAC的特异性的和可逆的抑制剂。在纳摩尔级浓度下，TSA引起体内高度乙酰化的组蛋白的聚集，并在体外强烈抑制部分纯化的组蛋白脱乙酰酶的活性(M.Yoshida等人，J.Biol.Chem.，1990，265(28)，17174)。在人Jerkat T细胞中，TSA在G1阻止细胞周期的进展，并以70nM的IC50抑制HD1脱乙酰酶的活性(Y.Hoshikawa等人，Exp.Cell Res.，1994，214，189)。
TSA也可同时改变基因的表达。Mishra等人证明TSA明显负调节CD154和IL-10，并正调节IFN-γ基因在系统性红斑狼疮(SLE)T细胞中的表达。SLE为自身免疫性疾病，其特征为抗体产生失调，导致不可逆的免疫复合物介导的终末器官的衰竭(N.Mishra等人，PNAS，2001，98(5)，2628)。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述HDAC抑制剂为N-辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hyroxamic acid，SAHA)。
N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)为TSA的合成衍生物，其在微摩尔级浓度抑制HDAC的活性。在美国，SAHA正在进行II期临床实验，所述实验针对其在治疗复发性或耐药性晚期何杰金氏淋巴瘤中的用途。
SAHA的抗增殖性作用已有记载。WO 2005/097747(Aton Pharma)公开了基于异羟肟的前药的HDAC抑制剂如SAHA在治疗肿瘤、硫氧还蛋白(TRX)-介导的疾病，和预防和/或治疗CNS疾病中的用途。
US 2004/4127525(Bacopoulos等人)公开了SAHA在治疗淋巴瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤中的用途。WO 2005/039498和WO 2005/018578(均属于Aton Pharma)进一步公开了治疗肿瘤的方法，其中WO2005/039498涉及白血病，且WO 2005/018578涉及间皮瘤或淋巴瘤。
本发明的一个优选实施方案中，所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠(或也称为2-丙基戊酸纳)。丙戊酸钠为丙戊酸的钠盐，且为NICE-批准的用于治疗癫痫的抗惊厥药。最近，研究表明丙戊酸钠用于治疗晚期实体瘤恶性肿瘤和癌症相关的神经痛的用途。已经开始进行涉及丙戊酸和UCN-01的组合研究。在这点上，虽然丙戊酸本身仅具有弱抗癌作用，但是研究表明当用于组合时其具有很高的对抗癌细胞的作用。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
另一方面涉及包含本发明组合的药物制品，其用于治疗增殖性疾病，其中所述疾病优选为癌症，且更优选为NSCLC。
本发明的另一方面涉及药物制品，其包含roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，作为在治疗中同时、依次或分别使用的组合制剂。
另一方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包含同时、依次或分别给药本发明的组合。
本文所用的“同时”是指两种药物同时给药，而所用的术语“组合”指如果它们不是同时给药，则在时限内“依次”给药，从而使得它们均适合于在同一时限内起治疗作用。因此，“依次”给药可允许在给药一种药物后5分钟内、10分钟内或大约几小时后给药另一种药物，条件是它们均同时以治疗量存在。给药成分间的延时依成分的确切性质、它们之间的相互作用和它们各自的半衰期而改变。
与“组合”或“依次”相比，本文所用的“分别”是指在给药一种药物和另一种药物之间的间隔是明显的，即当给药第二种药物时，第一次给药的药物可以不再以治疗有效量存在于血流中。
在一个优选实施方案中，在给药roscovitine或其可药用盐之前，依次或分别给药HDAC抑制剂。
在另一个优选实施方案中，在给药HDAC抑制剂之前，依次或分别给药roscovitine或其可药用盐。
在另一个优选实施方案中，HDAC抑制剂，和roscovitine或其可药用盐为同时给药。
当HDAC抑制剂为丁酸钠或其前药或TSA时，可同时或分别或依次给药HDAC抑制剂和roscovitine，而不考虑给药顺序。
当HDAC抑制剂为SAHA时，优选在给药roscovitine之前，给药SAHA，即优选患者用SAHA预治疗。
当HDAC抑制剂为丙戊酸钠时，优选分别或依次给药roscovitine和丙戊酸钠，而不考虑给药顺序。
在一个优选实施方案中，roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，对于单个成分各自以治疗有效量给药。
在另一个优选实施方案中，roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，对于单个成分各自以亚治疗量给药。
术语“亚治疗量(sub-therapeutic amount)”指低于单独用roscovitine或单独用HDAC抑制剂治疗产生治疗效果一般所需的量。
另一方面涉及本发明的组合在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。
本文所用的术语“药物制备”包括一种或多种上述成分直接作为药物或这类药物制备的任意阶段中的用途。
另一方面涉及roscovitine或其可药用盐在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述治疗包含向患者同时、依次或分别给药HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
另一方面涉及HDAC抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，其中所述药物用于与roscovitine或其可药用盐的组合治疗。或者，所述治疗可以为预处理治疗。
另一方面涉及roscovitine或其可药用盐在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于与HDAC抑制剂的组合治疗，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。或者，所述治疗可以为预处理治疗。
本文所用的术语“组合治疗(combination therapy)”是指如果不同时给药HDAC抑制剂和roscovitine，则在时限内依次给药，以便在同一时限内它们均可起到治疗作用。
本文所用的术语“预处理治疗(pretreatment therapy)”或“预治疗”指下述给药方案，其中给药一种药物后分别或依次给药第二种药物。优选地，给药第一种药物后至少2小时给药第二种药物。更优选地，在给药第一种药物后至少4小时后给药第二种药物，或更优选地至少6或8小时后给药第二种药物。甚至更优选地，在给药第一种药物后，至少12小时后给药第二种药物，或更优选地至少18或24小时后给药第二种药物。
优选地，roscovitine和HDAC抑制剂以协同方式相互作用。本文所用的术语“协同”是指roscovitine和HDAC抑制剂在组合使用时产生比由两种组分的单独效应相加预料到的效应更大的效应。有利地，协同相互作用可允许每种组分以较低剂量给药于患者，从而降低化疗的毒性，同时产生和/或保持相同的疗效。因此，在尤其优选的实施方案中，可以亚治疗量给药每种组分。
在另一个优选实施方案中，roscovitine和HDAC抑制剂以一种减轻或消除在单独治疗中使用单个成分相关的或在已知组合中使用它们时相关的不良副作用的方式相互作用。
对于所用上述实施方案，优选HDAC抑制剂选自丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)和制毛癣素A(TSA)。
增殖性疾病
本文所用的术语“增殖性疾病”广义上包括任何需要控制细胞周期的疾病，例如心血管疾病如再狭窄和心脏病、自身免疫性疾病如肾小球肾炎和类风湿性关节炎、皮肤病如牛皮癣、抗炎性、抗真菌、抗寄生虫疾病如疟疾、肺气肿和脱发病。在这些疾病中，本发明的化合物可按照需要在所需的细胞内诱导凋亡或保持停滞。
对于上述所有方面和实施方案，优选所述增殖性疾病位癌症。
非小细胞癌症
在本发明的一个尤其优选的实施方案中，所述增殖性疾病为肺癌，更优选为非小细胞肺癌(NSCLC)。
肺癌(支气管癌)可分为两种较宽的类别，即小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。两种类型的癌症之间是根据在显微镜下所观察到的肿瘤细胞的形态来区别的。
SCLC占诊断为肺癌的20％，且其特征为大部分被核填充的的小细胞(因此而得名)。有时，也称为“燕麦细胞(oat cell)”癌。SCLC为最具攻击性的癌症，其迅速转移至身体的其它部分。诊断为SCLC通常发生在癌症已经遍布全身后。通常，SCLC通常为吸烟产生的。
NSCLC可以细分为肺癌相关的组，其包括表皮样或磷状细胞癌、腺癌和大细胞癌。
磷状细胞肺癌占大约全部肺癌病例的30％，且从肺和支气管的内层中的储备细胞(其替代受损的上皮细胞)发展而来。其结果是，癌症通常源发于胸的中部。磷状细胞肺癌通常生长较慢，且从受限肿瘤(confined tumour)发展成侵入性癌症(invasive cancer)可能要几年时间。在10-20％的病例中，癌在肺中形成空腔。转移时，其通常蔓延至骨、肝、肾上腺、小肠和脑。
腺癌为最常见的肺癌，其构成总肺癌病例的30-40％。肺癌在肺的外部发展，且从产生粘液的细胞发展而来。这种癌症的病程变化较大，但通常进行缓慢，且病人几乎不出现症状或没有症状。然而，在一些病例中，腺癌扩张极快且迅速致死。在50％的病例中，当腺癌转移时，其仅蔓延至脑。腺癌蔓延的其它位置包括肝、肾上腺和骨。
大细胞癌的发病率小于腺癌或磷状细胞癌，且数量为肺癌病例的10-20％。这种癌症由大号细胞组成，该细胞自然退行发育且通常在支气管中出现。大细胞癌在肺的外周发育，且可蔓延至多处(plura)。
现在，可以通过手术、放疗或化疗治疗肺癌。化疗可以单独给药或与其它治疗选择组合。常用的NSCLC药物和方案包括：盐酸伊立替康和山梨醇注射剂(camptosar)(伊立替康；CPT-11)、喜树碱、卡铂(铂尔定)、顺铂(platinol)、表柔比星、吉西他滨、诺维本(长春瑞滨)、奥沙利铂、泰素(紫杉醇)和泰索帝(多西他赛)(NSCLC Treatment-Chemotherapy，Lung Cancer Online)。
然而，化疗并不能治愈。这种治疗的其它缺点包括毒性、对正常组织的旁路损伤(bystander damage)和抗药性(W.Wang等人，Cancer Sci.，2005，96(10)，706)。而且，研究表明使用一些已知的治疗，例如长春瑞滨，几乎没有存有的益处(M.A.Socinski等人，Clin.Adv.Hematol.Oncol.，2003，1(1)，33)。甚至新颖的活性药物，如曲沙他滨以10mg/m2剂量静脉给药(每3周一次，30分钟)几乎对NSCLC没有活性(S.F.Dent等人，Lung，2005，183(4)，265)。
在欧洲广泛使用吉西他滨/顺铂的组合治疗NSCLC。然而，顺铂被认为具有一定的缺点，即在病人中出现的明显的非血液毒性(耳毒性和肾毒性)，伴随由呕吐(P.Zatloukal等人，Lung Cancer，2002，38，S33)。
对于诊断为肺癌的患者的结果是较差的-对于所有被治疗的病例中存活10年的比例仅为大约8％-因此需要继续开发有效的治疗。
药物组合物
在一个尤其优选的实施方案中，本发明的药物制品为药物组合物的形式，其包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。
尽管本发明的化合物(包括它们的可药用盐、酯和可药用溶剂合物)可以单独给药，但它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合给药，尤其是用于人类治疗时。药物组合物可用于人类或动物，在人用药和兽用药中使用。
这些本文中描述的用于各种不同形式的药物组合物的适合赋形剂的实例可见于“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第2版，(1994)，A Wade和PJ Weller编。
治疗用的可接受的载体或稀释剂是药学领域公知的，且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编，1985)。
适合的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。适合的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
药学载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据计划的给药途径和标准的药学应用。所述药物组合物可包含(除载体、赋形剂或稀释剂外)任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、助溶剂。
适合的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖)、玉米增甜剂、天然和合成的胶(如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。
药物组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至芳香剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和助悬剂。
盐/酯
本发明的试剂可以为盐或酯，尤其是可药用盐或酯。
本发明的试剂的可药用盐包括其适合的酸加成盐或碱加成盐。适合的药学盐的综述可见于Berge等人，J Pharm Sci，66，1-19(1977)。盐为与例如以下酸形成的盐：强无机酸，如矿物酸，如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至4个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸(tetraphthalic)；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
取决于被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包括羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷醇。
对映异构体/互变异构体
本发明还适当地包括试剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技术人员能认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的化合物。可通过本领域中已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。
立体和几何异构体
本发明的一些药剂可以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，例如它们可具有一个或多个不对称和/或几何中心，并因此可以两种或多种立体异构和/或几何形式存在。本发明包括这些抑制剂试剂所有的单独立体异构体和几何异构体及它们的混合物的使用。权利要求中使用的术语包括这些形式，只要所述形式保留适当的功能活性(但不必到相同程度)。
本发明还包括所述试剂或其可药用盐的所有合适的同位素变体。本发明的试剂或其可药用盐的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量与自然界中通常发现的原子质量不同的原子取代的物质。可被掺入到所述试剂和其可药用盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。试剂和其可药用盐的一些同位素变体，例如结合放射性同位素如3H或14C的那些化合物，在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制备和可检测性而特别优选。此外，用同位素如氘即2H的取代可因较大的代谢稳定性而提供特定的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并因此可优选用于一些情况中。通常可使用合适试剂的适当同位素变体通过常规方法制备本发明药剂和其可药用盐的同位素变体。
溶剂合物
本发明也包括本发明试剂的溶剂合物形式。权利要求书中所用的术语包括这些形式。
多晶型
本发明还涉及各种晶型、多晶型和无水/水合形式的本发明的药剂。众所周知，在药物工业中可通过稍微改变这种化合物合成制备中所用溶剂的纯化方法和或分离形式来分离得到化合物的任意这类形式。
前药
本发明还包括前体药物形式的本发明的药剂。这种前体药物通常为一个或多个适当基团已被修饰以使在对人或哺乳动物对象给药后所述的修饰可被逆转的化合物。虽然为了实现体内逆转可与这种前体药物一起给药第二种药剂，但通常通过在这类对象中天然存在的酶实现这种逆转。这类修饰的例子包括酯(例如上述那些中的任一种)，其中可通过酯酶等进行逆转。其它这类系统为本领域中那些技术人员所熟知。
给药
本发明的药物组合物可适合于口服、直肠、阴道、胃肠外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、真皮内、静脉内、鼻、含服或舌下的途径给药。
对于口服给药，尤其可用的是压缩片剂、丸剂、片剂、凝胶剂(gellules)、滴剂和胶囊。优选地，每剂量的这些组合物含有1至2000mg，且更优选50-1000mg的活性成分。
其它给药形式包括溶液或乳液，它们可经静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌内注射给药，并由无菌或可灭菌溶液制备。本发明的药物组合物还可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳液、洗液、软膏、乳膏剂、凝胶、喷雾剂、溶液或扑粉(dusting poeder)的形式。
经皮给药的替代方式是利用皮肤贴片。例如，可将有效成分掺入到由聚乙二醇含水乳液或液体石蜡组成的乳膏剂内。还可以1-10重量％的浓度将有效成分掺入到由白蜡或白色软石蜡基质与所需要的稳定剂和防腐剂共同组成的软膏内。
可注射形式每剂可包含10-1000mg，优选10-500mg的活性成分。
组合物可被配制成单元剂型，即包含单元剂量或单元剂量的多重单位或亚单位的形式的离散部分。
在一尤其优选的实施方案中，静脉内给药所述本发明的组合或药物组合物。
剂量
本领域的普通技术人员不用额外试验就可容易地确定对患者给药的本发明的组合物的适宜剂量。通常，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，并且根据各种因素进行调整，包括使用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速度、药物组合、特定病症的严重程度和个体正接受的治疗。本文公开的剂量为一般情况的示例。当然也可有有益的较高或较低剂量范围个别情况，这都在本发明的范围内。
根据需要，给药的试剂的剂量可为0.1-30mg/kg体重，如2-20mg/kg，更优选0.1-1mg/kg体重。
指导性地，按照医师指导，HDAC抑制剂通常以描述于上述相关文献中的剂量给药。Pivanex通常以每天约2.34g/m2给药。Pivanex优选静脉内给药。N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)通常以每天约100-600mg给药。N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)优选口服给药。HDAC抑制剂的总日剂量可以作为单个剂量给药，或以分散剂量优选每天给药2、3或4次给药。
Roscovitine通常以约0.05至约5g/天给药，优选为约0.4至约3g/天。Roscovitine优选以片剂或胶囊口服给药。roscovitine的总日剂量可以作为单个剂量给药，或以分散剂量优选每天给药2、3或4次给药。
在一个优选实施方案中，roscovitine口服或静脉内给药，剂量为0.4至3g/天，且HDAC抑制剂以最合适的方式以上述适宜剂量给药。优选地，在给药roscovitine之前至少2小时，给药HDAC抑制剂。更优选地，给药roscovitine之前至少4小时，或更优选至少6或8小时，给药HDAC抑制剂。甚至更优选，在给药roscovitine之前至少12小时，或更优选至少18或24小时，给药HDAC抑制剂。
在另一个优选实施方案中，在给药roscovitine之后至少2小时，给药HDAC抑制剂。更优选地，在给药roscovitine之后至少4小时，或更优选至少6或8小时，给药HDAC抑制剂。甚至更优选，在给药roscovitine之后至少12小时，或更优选至少18或24小时，给药HDAC抑制剂。
试剂盒(kit of parts)
本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含：
(i)Roscovitine或其可药用盐，任选与可药用稀释剂、赋形剂或载体混合；和
(ii)HDAC抑制剂，其选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，任选与可药用稀释剂、赋形剂或载体混合。
优选地，roscovitine和HDAC抑制剂各自为单位剂量形式。优选地，试剂盒包含许多单位剂量形式的每种成分，即上述成分(i)和(ii)。
任选地，试剂盒还可包含适应特定给药方案的工具，例如说明书，指导何时、如何和以多少频率使用单位剂型的每种成分。
通过实施例并结合以下附图进一步描述本发明，其中：
图1表示seliciclib和丁酸钠的同时处理导致在A549中细胞凋亡的协同增加，其通过处理72小时后亚-G1期细胞碎片的增加来测定。
图2表示seliciclib和丁酸钠对H460细胞的同时处理导致处理72小时后凋亡的协同增加，其通过锚定蛋白染色来测定。
图3表示对于seliciclib/丁酸钠组合，在IC50浓度下凋亡的增加，其通过细胞角蛋白18(M30 ELISA)胱冬酶(caspases)酶切和PARP酶切来测定。而且，图3也表示在Mcl1水平下协同的下降，这可能与抗凋亡蛋白的损失有关，从而加速细胞凋亡。
图4更详细地表示对于seliciclib/丁酸钠组合的凋亡的分子途径。Mcl1和Bcl2(均为抗凋亡蛋白质)的损失加速细胞的凋亡。XIAP和存活蛋白均为凋亡过程的抑制剂，因此这些蛋白的损失又加速了细胞凋亡。由于XIAP和Mcl1中的下降是协同的，因此这种作用可以解释如PARP的出现表现出来的凋亡的协同诱导。组蛋白蛋白质印迹表明HDAC抑制剂增加乙酰化组蛋白的量(因为脱乙酰化作用被抑制)。
图5表示对于seliciclib/丁酸钠组合，在IC50下，细胞事件的时程。在后面的时间点，可以看到胱冬酶3和9的协同作用(表明凋亡被诱导)。
图6表示用DMSO(对照)、丙戊酸钠、seliciclib和丙戊酸钠/seliciclib组合处理后细胞周期的分布。用所示药物处理H460细胞一段时间后，在流式细胞仪上进行PI分析。结果为两次重复实验样品的平均值。
实施例
方法
R-Roscovitine
根据EP0874847B(CNRS)公开的方法制备R-Roscovitine。
HDAC抑制剂
丁酸钠和丙戊酸钠来自Sigma；TSA来自AG Scientific，Inc.；SAHA来自Toronto Research Chemicals，Inc.。
细胞培养
实验在96-孔板中进行，对于A549细胞株以2000/孔的密度接种，对于H460以3000/孔的密度接种。使用Alamar blue实验，测定处理24小时和72小时后的IC50值，其中对于丁酸钠在每个细胞株中检测，对于SAHA、丙戊酸钠和TSA在H460细胞中检测。然后使用三种不同的处理方案对每种HDAC抑制剂与seliciclib的组合进行检测，所述三种方案为：同时处理，seliciclib预处理然后HDAC抑制剂处理，和HDAC抑制剂预处理然后seliciclib处理。
Calcusyn药物组合方案
对于同时处理，在铺完细胞24小时后，加入1.5-倍连续稀释的seliciclib、HDAC抑制剂，或同时加入两种药物，然后在37℃放置72小时。对所选定的药物的浓度进行选择使得其覆盖(span)所检测的药物的IC50值。在预处理方案中，在铺好细胞2小时后加入第一种药物，然后放置24小时。抽吸培养基，用含有第二种药物的新鲜培养基替换，然后培养72小时。对于两个单个依次处理的对照来说，用培养基替换其中一种药物处理。药物处理后，通过将细胞在含有10％alamar blue(Roche，Lewes，East Sussex，U.K.)的培养基中培养1小时并在544-595nm处读取吸光度来估算每孔中的细胞数。使用商业软件包Calcusyn分析药物相互作用，所述软件包基于Chou和Talalay的半数有效(median effect)模型(Chou，T.C.&Talalay，P.(1984)Adv.EnzymeRegul.22，27-55.Quantatative analysis of dose-effect relationships：thecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors)。组合指数(combinationindex，C.I.)为1表示具有相加的药物相互作用，而C.I.大于1表示拮抗作用，且分数小于1表示协同作用。
蛋白质印迹分析
蛋白裂解物产生于10cm板，该板中在含有10％FCS的培养基中以大约5×105个细胞/孔接种。细胞以所示浓度和时间用HDAC抑制剂和/或seliciclib培养，然后收获。培养后，移除上清液，并在2000rpm下离心5分钟以沉淀任何漂浮的细胞。用冰冷却的缓冲液A(50mM HEPES，pH 7.0，含20mMNaCl)洗涤板上的细胞一次，然后将每个板刮入至0.15ml缓冲液A中，所述缓冲液A含有1mM的DTT、蛋白酶抑制剂(以1∶1000稀释至缓冲液A)和磷酸酶抑制剂(10mM焦磷酸钠，10mM氟化钠和1mM原钒酸钠)。将上层细胞沉淀再悬于50μl含有DTT、蛋白酶和磷酸酶抑制剂的缓冲液A中，然后从板中收集合适的样品。细胞通过超声处理(用探针超声破碎仪2×3s突然的声音)裂解，使用BCA实验测定每管的蛋白浓度。将溶胞产物(20-30μg负载的蛋白/孔)溶解在含有12％丙烯酰胺的Bis-Tris凝胶上，然后转移到硝基纤维素上用于蛋白质印迹分析。在室温下，将该膜在含有0.02％(v/v)Tween 20和5％(w/v)脱脂无水牛奶的PBS中阻断1小时。在含有0.02％(v/v)Tween 20和3％(w/v)无水牛奶的PBS中，在2-8℃下将抗体培养过夜。硝基纤维素膜用下述抗体检测：
抗体              来源              靶蛋白          稀释倍数
肌动蛋白(A5441)   Sigma             β-肌动蛋       1∶15000
裂解的PARP        BD Pharmingen     裂解的PARP      1∶500
乙酰基-组蛋白H4   Upstate           乙酰化的组蛋H4  1∶1000
XIAP              Cell Signalling   XIAP            1∶1000
Bcl-2(clone 100)  Upstate           Bcl-2           1∶1000
Mcl-1(S-19)       Santa Cruz        Mcl-1           1∶1000
Bax(06-499)       Upstate           Bax             1∶1000
存活蛋            AbCam             存活蛋          1∶500
裂解的胱冬酶3     Cell Signalling   裂解的胱冬酶3   1∶1000
裂解的胱冬酶9     Cell Signalling   裂解的胱冬酶9   1∶1000
流式细胞术：seliciclib/丁酸钠组合
将H460细胞以大约3×105个细胞/板接种于10cm板上，然后放置过夜。第二天，以所示浓度加入seliciclib、丁酸钠或两种药物。处理24小时或72小时后，通过胰蛋白酶化收获细胞。通过碘化丙锭(PI)染色分析细胞周期，包括在-20℃将细胞于70％(v/v)乙醇中固定过夜，然后在流式细胞仪上分析。如操作说明对活的没有固定的细胞进行锚定蛋白染色。
流式细胞术：seliciclib/丙戊酸钠组合
将H460细胞以大约0.5×106个细胞/板接种到10cm板上，然后放置24小时。用丙戊酸钠处理细胞24小时，然后用seliciclib再处理24小时。所使用的化合物的浓度等于1xIC50。同时也进行单试剂的对照处理。对照包括用丙戊酸钠处理细胞24小时，然后用不含药物的培养基再处理24小时，或用不含药物的培养基处理24小时，然后用seliciclib再处理24小时。在48小时更换培养基前，通过收集培养基收获所有细胞。通过胰蛋白酶化收获贴壁细胞，收集为细胞的混悬液，在PBS中洗涤两次，然后通过再悬于1ml冰冷却的70％乙醇固定。在流式细胞仪上通过碘化丙锭染色进行标准细胞周期分析。结果为两次重复实验样品的平均数。
时间间隔实验的M30/TPS分析
将A549细胞接种与96孔板中，放置过夜。细胞以所示浓度的seliciclib、丁酸钠或组合处理。处理72小时后，收集培养基，放置在-20℃并保存。在M30ELISA中按所述操作说明分析样品。
结果
Seliciclib和HDAC抑制剂组合对NSCLC细胞株的影响
使用3种不同的处理方案，检测Seliciclib与所示HDAC抑制剂的组合对H460和A549细胞株的影响。每种药物处理的组合指数见ED50、ED75和ED90值(其对应于曲线上当50％、75％和90％的细胞被杀死时的点)所示。数据为至少3组独立实验的平均值(表1)。
表1：seliciclib和HDAC抑制剂对细胞株的作用的数据(A549的数据显示在括号中)：
Figure A20068005090500251
这些结果证明seliciclib和丁酸盐对于H460和A549细胞有协同作用(所有所检测的3组处理方案)。Seliciclib和制毛癣素A对H460细胞有中等协同作用(所有所检测的3组处理方案)。Seliciclib和SAHA，当用SAHA预处理然后用seliciclib处理时对H460细胞有中等协同作用，且对于另两个处理方案为加和作用。对于依次用seliciclib和丙戊酸钠(给药顺序无关)观察到协同作用。因此，当使用所有四种所检测的HDAC抑制剂组合时，如果细胞用HDAC抑制剂预处理，则seliciclib有协同作用，从而证明了seliciclib与HDAC抑制剂组合用于治疗NSCLC细胞株是一个很好的概念。
流式细胞术研究
Seliciclib和丁酸盐诱导在亚-G1期A549细胞的协同增加
将A549细胞在IC50的丁酸盐、0.25-1.5xIC50的seliciclib，或在IC50的丁酸盐存在0.25-1.5xIC50的seliciclib中培养72小时。然后收获细胞，用碘化丙锭染色，通过流式细胞术分析它们的DNA含量。数据表示两组独立的实验(图1)。
单独使用丁酸盐导致在亚-G1期细胞的少量增加(＜2n DNA)，这些细胞为死细胞或正在经历细胞凋亡。Seliciclib处理导致亚-G1期细胞的剂量依赖性增加，通过加入丁酸盐而被协同增加。这些数据表明seliciclib和butyrate导致死亡或正在死亡的细胞的协同增加。
Seliciclib和丁酸盐诱导H460细胞凋亡的协同增加
将H460细胞在0.25-1.5xIC50的丁酸盐、0.25-1.5xIC50的seliciclib，或0.25-1.5xIC50的seliciclib和丁酸盐中培养72小时。然后收获细胞，用锚定蛋白染色，并在流式细胞仪上分析。数据表示两组独立的实验(图2)。
锚定蛋白标记正在经历凋亡的活细胞。在0.67x和1xIC50的浓度下，丁酸盐和seliciclib产生比单独用两种药物处理之和大得多的锚定蛋白信号，表明凋亡细胞的协同增加。最高浓度的丁酸盐和seliciclib(1.5x IC50)与0.67x或1xIC50相比看起来含有较少的经历凋亡的细胞，原因现在尚不清楚。
Seliciclib和丁酸盐协同诱导A549细胞凋亡
A549细胞用DMSO(对照)或如所示用IC50浓度的seliciclib、丁酸钠，或seliciclib和丁酸盐处理72小时。收获细胞培养上清液，然后用M30apoptosense ELISA法检测，并且收获细胞，对于裂解的PARP和Mcl-1通过蛋白质印迹法分析。数据表示两组独立的实验(图3)。
结果表明，seliciclib和丁酸盐一起组合得到比两个单个药物处理之和大的M30信号，表明它们协同增加细胞凋亡。该数据通过下述事实支持，seliciclib和丁酸盐得到比单独使用seliciclib或丁酸盐大的裂解的PARP信号，其表明加和/协同增加细胞凋亡。Seliciclib和丁酸盐也降低了A549细胞中抗凋亡蛋白Mcl-1的水平，而单个药物处理对该蛋白没有明显作用。这可能在促进所检测到的细胞凋亡的增加中起重要作用。
Seliciclib和丁酸盐以剂量依赖方式调节几种凋亡蛋白
H460细胞用丁酸盐、seliciclib，或seliciclib和丁酸盐，以1x或1.5xIC50的浓度处理24小时。收获细胞，并通过蛋白质印迹法用所示抗体分析细胞溶胞产物。数据表示两组独立的实验(图4)。
数据表明，通过24小时的处理，seliciclib和丁酸盐协同降低了抗凋亡蛋白Mcl-1和胱冬酶抑制剂XIAP的蛋白水平。丁酸盐处理降低了抗凋亡蛋白Bcl-2和胱冬酶抑制剂存活蛋白的水平。这些变化一起会提供很强的凋亡前信号。事实上，虽然以1.5xIC50浓度增加的PARP充其量仅表现出加和作用，但以1xIC50的浓度协同增加了裂解的PARP，这与图2中以1.5xIC50浓度产生的锚定蛋白数据一致。
Seliciclib和丁酸盐以时间依赖性调节几种凋亡蛋白
H460细胞用1xIC50的丁酸盐、seliciclib，或seliciclib和丁酸盐处理所示时间。收获细胞，且通过蛋白质印迹用所示抗体分析细胞溶胞产物。数据表示两组独立的实验(图5)。
结果证明了图4中的结论，丁酸盐降低了存活蛋白和Bcl-2的水平，且seliciclib和丁酸盐协同降低了Mcl-1和XIAP水平。这些数据也证明药物组合导致活性形式胱冬酶3和9的协同增加，其与裂解的PARP的增加出现在大致相同的时间。有趣的是，增加的细胞凋亡(通过裂解的PARP的出现检测)直到Mcl-1、Bcl-2、存活蛋白和XIAP降低后才出现，说明在此种细胞株中需要任何或所有这些变化以促进凋亡。
Seliciclib/丙戊酸钠组合
丙戊酸钠/seliciclib组合的流式细胞术分析按如上所述进行。选择丙戊酸钠预处理方案，使得其为通过Calcusyn为协同的方案。在H460细胞中，用seliciclib处理导致在亚-G1期的细胞(凋亡细胞)比例的少量增加，但是在所用的浓度下没有明显影响到H460细胞的整个细胞周期分布(图6)。
与单个试剂对照组相加比较，丙戊酸钠与seliciclib的组合导致在亚-G1期的细胞(凋亡细胞)比例的明显增加，这与Calcusyn分析得到的数据一致。
上述数据提供了证明seliciclib与HDAC抑制剂丙戊酸钠对H460细胞以时间依赖性有协同作用的证据。
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种改变和变化对本领域的那些技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应该认识到要求的本发明不应该不适当地限制至这种具体实施方案。事实上，对相关领域那些技术人员明显的用于实施本发明上述方式的各种改变都被本发明覆盖。

Claims (45)

1.组合，其包含roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
2.根据权利要求1的组合，其中所述HDAC抑制剂为丁酸钠或其前药。
3.根据权利要求2的组合，其中所述前药为丁酸(新戊酰基氧基甲基)酯。
4.根据权利要求1的组合，其中所述HDAC抑制剂为N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)。
5.根据权利要求1的组合，其中所述HDAC抑制剂为制毛癣素A(TSA)。
6.根据权利要求1的组合，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠。
7.根据上述权利要求中任一项的组合，其中roscovitine为R-roscovitine。
8.药物组合物，其包含上述权利要求中任一项的组合和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
9.权利要求1-7中任一项的组合在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。
10.药物制品，其包含roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，作为在治疗中同时、依次或分别使用的组合制剂。
11.根据权利要求10的药物制品，其中所述HDAC抑制剂为丁酸钠或其前药。
12.根据权利要求11的药物制品，其中所述前药为丁酸(新戊酰基氧基甲基)酯。
13.根据权利要求10的药物制品，其中所述HDAC抑制剂为N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)。
14.根据权利要求10的药物制品，其中所述HDAC抑制剂为制毛癣素A(TSA)。
15.根据权利10的药物制品，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠。
16.根据权利要求10-15中任一项的药物制品，其中所述roscovitine为R-roscovitine。
17.根据权利要求10-16中任一项的药物制品，其为包含可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物形式。
18.根据权利要求10-17中任一项的药物制品，其用于治疗增殖性疾病。
19.根据权利要求18的药物制品，其中所述增殖性疾病为癌症。
20.根据权利要求19的药物制品，其中所述癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。
21.一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包含同时、依次或分别给药roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
22.根据权利要求21的方法，其中所述roscovitine为R-roscovitine。
23.根据权利要求21或权利要求22的方法，其中丁酸钠的前药为丁酸(新戊酰基氧基甲基)酯。
24.根据权利要求21-23中任一项的方法，其中roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，对于单个成分各自以治疗有效量给药。
25.根据权利要求21-23中任一项的方法，其中roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂，对于单个成分各自以亚治疗量给药。
26.根据权利要求21-25中任一项的方法，其中所述HDAC抑制剂和roscovitine或其可药用盐为同时给药。
27.根据权利要求21-25中任一项的方法，其中所述HDAC抑制剂和roscovitine或其可药用盐为依次或分别给药。
28.根据权利要求27的方法，其中在给药roscovitine或其可药用盐之前，依次或分别给药HDAC抑制剂。
29.根据权利要求27的方法，其中在给药HDAC抑制剂之前，依次或分别给药roscovitine或其可药用盐。
30.根据权利要求21-29中任一项的方法，其中所述增殖性疾病为癌症。
31.根据权利要求30的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。
32.roscovitine或其可药用盐在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述治疗包含向患者同时、依次或分别给药HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
33.HDAC抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，其中所述治疗包含向患者同时、依次或分别给药roscovitine或其可药用盐。
34.roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中用途，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
35.HDAC抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)和制毛癣素A(TSA)，其中所述药物用于与roscovitine或其可药用盐的组合治疗。
36.roscovitine或其可药用盐在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于与HDAC抑制剂的组合治疗，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
37.roscovitine或其可药用盐在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于以HDAC抑制剂的预处理治疗中，所述HDAC抑制剂选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
38.根据权利要求32-37中任一项的用途，其中所述roscovitine为R-roscovitine。
39.根据权利要求32-38中任一项的用途，其中丁酸钠的前药为丁酸(新戊酰基氧基甲基)酯。
40.根据权利要求32-39中任一项的用途，其中所述增殖性疾病为癌症。
41.根据权利要求40的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。
42.roscovitine或其可药用盐，和HDAC抑制剂在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途。
43.roscovitine或其可药用盐，和选自下列的HDAC抑制剂在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)。
44.试剂盒，其包含：
(i)roscovitine或其可药用盐，任选与可药用稀释剂、赋形剂或载体混合；和
(ii)HDAC抑制剂，其选自：丁酸钠或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠和制毛癣素A(TSA)，任选与可药用稀释剂、赋形剂或载体混合。
45.基本上如本文所述的组合、药物组合物、药物制品、方法、用途或试剂盒。
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