CN101351123A - 具有低丙烯酰胺的加工调味剂 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了新颖的酵母提取物、自溶酵母和蛋白水解产物，其具有不高于1mg/g的游离天冬酰胺。该酵母提取物、自溶酵母和蛋白水解产物可有利地用于生产具有不超过800ppb的丙烯酰胺的加工调味剂。该加工调味剂特别适用于对食品或饲料的调味。

Description

具有低丙烯酰胺的加工调味剂
发明领域
本发明涉及酵母提取物、自溶酵母、蛋白水解产物和生产它们的方法，以及其在食品或饲料或食品或饲料成分中的用途。本发明还涉及加工调味剂(process flavour)、生产它的方法及它在食品或饲料或食品或饲料成分中的用途。
发明背景
经加工食品和方便餐食在我们的社会中的使用正日益增加。通常，在加工期间或之后，将若干种类型的调味品(flavouring)，例如经水解植物蛋白、酵母提取物、奶酪、辛香料(spices)等等加入这些类型的食品中，以使得食品更美味。人们已知，食品的香味是烹饪期间发生的不同反应途径的复杂组合导致的。在生产经加工食品或方便餐食的过程中可能遇到的问题是，其生产过程中的加热步骤可能不够长，不足以发展出满意的香味。但是，可通过向经加工食品中加入加工调味剂(也被称为“反应调味剂”)，来填补可能在此类食品中遇到的香味缺陷。通常在完成主要的加工步骤之后，向经加工食品中加入加工调味剂。
术语“加工调味剂”在本说明书通篇中用于具有独特香味的组合物，例如，肉类调味剂，其可通过下述过程来获得：在足以发展香味的pH、温度、压力和反应时间的条件下，对至少包含含氨基形式的氮的化合物(优选地，至少包含还原碳水化合物)的成分混合物进行加热。用于加工调味剂生产过程中的成分混合物还可包含一种或多种脂类、含硫化合物、含羰基化合物等等。
加工调味剂是通过加热步骤期间成分间发生的反应途径的复杂组合来获得的。对加工调味剂生产过程中涉及的若干种反应途径的综述，例如参见，“Savory Flavours”，1995，T.W.Nagodawithana著，Esteekay AssociatesInc.，Wisconsin，USA，103-163页。
在根据本发明生产的加工调味剂中，“含氨基形式的氮的化合物”可从选自酵母提取物、自溶酵母、蛋白水解产物或这些成分中一种或多种的混合物的来源获得，可选地，所述来源组合有一种或多种补充氨基酸。
丙烯酰胺长期以来已被商业生产用于多种技术应用，其被认为可能对动物和人致癌。1991年，the Scientific Committee on Food对丙烯酰胺与食品材料的接触进行了研究，评估的结论是丙烯酰胺是遗传毒性致癌剂。
近来，公开了丙烯酰胺在多种食品和烤制食品中的存在(Tareke et al.Chem.Res.Toxicol.13，517-522.(2000))，这引起了世界性的关注。进一步的研究揭示，在多种经烘焙、煎炸和烤制食品中都可检测到相当大量的丙烯酰胺，这表明丙烯酰胺在食品中的存在是烘焙过程的结果。
丙烯酰胺在加工调味剂(随后用于多种类型的食品)中的存在是人们非常不想看到的。出人意料地，现已发现，不幸地是，加工调味剂可能包含相当大量的丙烯酰胺(其可能高至例如10000ppb)。加工调味剂中的丙烯酰胺甚至可能在低于120℃的温度下产生，在此温度下根本没有预料到会形成丙烯酰胺。丙烯酰胺在加工调味剂中的存在这一问题目前还未知。
酵母提取物、自溶酵母和蛋白水解产物可有利地用作为生产加工调味剂的氨基酸源。
申请人现已令人吃惊地发现，在加工调味剂生产过程中，用常规的酵母提取物、常规的自溶酵母和或常规的蛋白水解产物作为氨基酸源时，可能会产生高水平的丙烯酰胺。
本发明因此还涉及新颖的酵母提取物、新颖的自溶酵母和新颖的蛋白水解产物，它们适合用于生产具有低丙烯酰胺的加工调味剂。此外，本发明涉及新颖的具有低丙烯酰胺的加工调味剂。
发明详述
本发明在第一个方面涉及酵母提取物，其具有基于干物质而言不高于1mg/g的游离天冬酰胺，优选地，不高于0.2mg/g，更优选地，不高于0.1mg/g。根据本发明第一方面的酵母提取物中游离天冬酰胺的量可以低至～0mg/g。
酵母提取物被定义为包含从酵母细胞提取的水溶性组分的组合物。通常，酵母提取物包含氨基酸、蛋白质、肽、维生素、碳水化合物和盐(例如磷酸盐)。酵母提取物还可包含5’-核糖核苷酸。酵母提取物可以例如被分为自溶解酵母提取物和水解酵母提取物。
自溶解酵母提取物是细胞破裂和对聚合酵母材料进行消化(裂解)之后可从酵母获得的可溶材料的浓缩物。细胞破裂之后培养基中释放出的活性酵母酶发挥作用进行裂解。这些类型的酵母提取物富含氨基酸，并且通常不含5’-核糖核苷酸，因为自溶解过程期间天然RNA被分解或修饰为不能降解为5’-核糖核苷酸的形式。它们作为基础味道提供者用于食品工业。酵母提取物中存在的氨基酸向食品中添加肉羹(bouillon)类型的肉汤(brothy)味。
水解酵母提取物是可溶材料的浓缩物，其可在细胞破裂、消化(裂解)以及在裂解期间向酵母悬浮液中加入外来的酶(例如蛋白酶和/或肽酶以及尤其是核酸酶，例如5’-磷酸二酯酶以及可选地5’-腺苷酸脱氨酶)之后，从酵母获得。本身的酵母酶通常在裂解前被失活。其此过程期间，可形成鸟嘌呤(5’-鸟嘌呤单磷酸酯；5’-GMP)、尿嘧啶(5’-尿嘧啶单磷酸酯；5’-UMP)、胞嘧啶(5’-胞嘧啶单磷酸酯；5’-CMP)和腺嘌呤(5’-腺嘌呤单磷酸酯；5’-AMP)的5’-核糖核苷酸。当向混合物中加入5’-腺苷酸脱氨酶时，5’-AMP被转变为5’-次黄嘌呤核苷单磷酸酯(5’-IMP)。通过此方法获得的水解酵母提取物因此富含5’-核糖核苷酸，尤其是富含5’-GMP和5’-IMP。通常，酵母提取物还富含谷氨酸单钠(MSG)。5’-IMP、5’-GMP和MSG已知具有增强香味的性质。它们能在某些类型的食品中增强可口美妙的味道。该现象被描述为“口感”或鲜味(umami)。
在本发明第一方面的一种实施方式中，酵母提取物可以是自溶解酵母提取物或水解酵母提取物或其混合物。酵母提取物可包含5’-核糖核苷酸。术语“5’-核糖核苷酸”在本文中意指5’-GMP、5’-CMP、5’-UMP、和还有5’AMP和/或5’IMP的混合物，其中，混合物中的5’IMP是通过5’AMP向5’IMP的部分转化或完全转化来获得的。
在第二个方面，本发明涉及自溶酵母，其具有基于干物质而言不高于1mg/g的游离天冬酰胺，优选地，不高于0.2mg/g，更优选地，不高于0.1mg/g。自溶酵母提取物中游离天冬酰胺的量可以低至～0mg/g。
自溶酵母是自溶解酵母提取物的前体。其包含可溶材料的浓缩物和裂解期间形成的不可溶物，所述可溶材料可在细胞破裂和对聚合酵母材料进行消化(裂解)之后从酵母获得，其中，细胞破裂之后培养基中释放出的活性酵母酶发挥作用进行裂解，所述不可溶物主要是由于降解的酵母细胞壁级分导致的。
在第三个方面，本发明涉及蛋白水解产物，其具有基于干物质而言不高于1mg/g的游离天冬酰胺，优选地，不高于0.2mg/g，更优选地，不高于0.1mg/g。
蛋白水解产物是经酸或酶促处理的蛋白底物，其含有不同比例的氨基酸和肽的混合物，所述比例由水解程度和/或所用酶的类型决定。用于制备蛋白水解产物的典型蛋白底物是植物蛋白，例如，小麦麸质、玉米麸质、大豆蛋白、油菜蛋白、豌豆蛋白、紫花苜蓿蛋白、向日葵蛋白、蚕豆(fabaceous)蛋白、棉花或芝麻种子蛋白、苞谷蛋白、大麦蛋白、高粱蛋白、马铃薯蛋白、水稻蛋白、咖啡蛋白。其它可能的蛋白底物是动物蛋白，例如奶蛋白(例如，酪蛋白、乳清蛋白)、蛋的蛋白、鱼蛋白、肉类蛋白，包括明胶、胶原、血蛋白(例如血红蛋白)、毛发、羽毛和鱼肉。
酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物可以是任何形式的，例如溶解于液体中的或经干燥的形式。通常，酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物将是干燥形式的，例如，粉末或颗粒形式。
在第四个方面，本发明涉及生产第一个方面的酵母提取物、第二个方面的自溶酵母或第三个方面的蛋白水解产物的方法，所述方法包括用酶、用物理方法、用化学方法或用其组合对都含有游离天冬酰胺的起始酵母提取物、起始自溶酵母或起始蛋白水解产物进行处理，所述酶、物理方法、化学方法或其组合是能降低最终产物中游离天冬酰胺的量以及优选以在最终产物中获得基于干物质而言不高于1mg/g，更优选不高于0.2mg/g，最优选不高于0.1mg/g的游离天冬酰胺的那些。
都含有游离天冬酰胺的起始酵母提取物、起始自溶酵母或起始蛋白水解产物在本说明书通篇中也被称为“起始产物”。将用于本发明方法中的起始产物可以是可商业获得的产物，可以是制备工艺的终产物或者可以是在用于终产物的制备工艺的步骤中获得的中间产物。因此，在本发明的一种实施方式中，用酶、用物理方法、用化学方法或用其组合进行的处理在含有游离天冬酰胺的中间产物上进行，所述中间产物是在用于从酵母细胞制备酵母提取物或自溶酵母的制备工艺的步骤中或用于从蛋白底物制备蛋白水解产物的制备工艺的步骤中获得的。
将用于本发明方法中的起始产物可以是如上文所述的含有游离天冬酰胺的任何起始产物。起始产物可以是任何形式的，例如溶解于液体中的或经干燥的形式。通常，起始产物将是干燥形式的，例如，粉末或颗粒形式。
在根据本发明第四个方面的方法的一种实施方式中，用能降低游离天冬酰胺的量的酶、物理方法、化学方法或其组合进行的处理在起始产物上进行，优选在合适的溶剂中对其进行悬浮和/或溶解之后进行，其中，起始产物是可商业获得的或是制备工艺终产物的酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物。通常，溶剂可以是适合允许酶与游离天冬酰胺反应或适合用于物理或化学方法中的那些溶剂。通常，溶剂可以是基于水的溶剂，更优选地，溶剂是水。
在本发明的上下文中，“能降低游离天冬酰胺的量的酶、物理方法、化学方法或其组合”是能除去游离天冬酰胺的全部或部分和/或能将天冬酰胺降解为在存在还原糖的情况下加热时不能导致丙烯酰胺形成的形式的任何酶或酶混合物、任何物理方法或任何化学方法或其组合。
可用于降低游离天冬酰胺的量的处理中的物理方法是能从起始产物中除去游离天冬酰胺的部分或全部的方法。此类方法可包括，例如，使用分离技术，例如色谱技术。化学方法是能将游离天冬酰胺修饰和/或降解为不能导致丙烯酰胺形成的形式的方法。此类方法可包括，例如，使用化学反应，例如氧化、还原、脱氨。
在本发明的第四个方面的方法的一种优选实施方式中，用能降低最终产物中游离天冬酰胺的量的酶，在足以令酶与游离天冬酰胺发生反应的pH、温度和反应时间的条件下，来进行处理。
优选地，用酶进行的处理是用能修饰游离天冬酰胺侧链的酶，更优选地，用能水解游离天冬酰胺侧链酰胺基的酶，进一步更优选地，用天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1)来进行的。
用于本发明第三个方面的方法的优选实施方式中的酶或酶混合物可从多种来源获得，例如，从植物、动物和微生物(例如细菌、真菌或酵母)获得。合适的微生物的例子是Escherichia、Erwinia、Streptomyces、Pseudomonas、Aspergillu和Bacillus的种。合适的Escherichia菌株的例子是Escherichia coli。合适的Erwinia菌株的例子是Erwinia chrysanthemi。合适的Streptomyces菌株的例子是Streptomyces lividans或Streptomycesmurinus。合适的Aspergillus菌株的例子是Aspergillus oryzae、Aspergillusnidulans或Aspergillus niger。合适的Bacillus菌株的例子是Bacillusalkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacilluscirculans、Bacillus coagulans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacilluslicheniformis、Bacillus megateruim、Bacillus stearothemophilus、Bacillussubtilis或Bacillus thuringiensis。用于从Bacillus、Streptomyces、Escherichia或Pseudomonas的菌株产生天冬酰胺酶的合适的方法被描述于WO03/083043中。优选地，天冬酰胺酶从Aspergillus niger或Bacillussubtilis获得，更优选地，从Aspergillus niger获得。来自Aspergillus niger的合适的天冬酰胺酶被描述于WO2004/030468中。
用于本发明第四方面的方法的优选实施方式中的、能降低游离天冬酰胺的量的酶将在足以令酶与游离天冬酰胺反应的pH、温度和反应时间条件下使用。
已知，pH和温度将影响酶的活性。取决于所用的酶的类型，本发明技术人员将能确定酶反应的最优pH和温度条件。此外，此类条件可通过教科书获得和/或由酶的提供者所提供。足以令酶与游离天冬酰胺反应的反应时间将取决于：所用的酶的量和类型、最终产物中希望获得的天冬酰胺的转化的量等等。本领域技术人员将能确定最优反应时间。
加入起始产物中能降低游离天冬酰胺的量的酶的量将取决于所用的酶的类型和酶活性等等。本领域技术人员可确定合适的加入量。
在本发明第四方面的方法的一种优选实施方式中，用能降低游离天冬酰胺的量的酶、物理方法、化学方法或其组合进行的处理，优选地，用能降低游离天冬酰胺的量的酶进行的处理，在含有游离天冬酰胺的中间产物上进行，所述中间产物是在用于从酵母细胞生产酵母提取物或自溶酵母的方法的步骤中获得的。
在这种情况下，用于从酵母细胞生产酵母提取物或自溶酵母的方法可用酵母细胞开始，例如，用酵母细胞的水性悬浮液，例如酵母细胞的发酵培养液开始。任何类型的酵母细胞都可用于本发明的方法。特别地，属于Saccharomyces、Kluyveromyces或Candida属的酵母菌株可合适地使用。属于Saccharomyces属，例如Saccharomyces cerevisiae的酵母菌株是优选的。
适合用于生产酵母细胞悬浮液的发酵工艺是本领域已知的。在一些情况下，在用于从酵母细胞生产酵母提取物或自溶酵母的方法之前，可对发酵培养液加以浓缩，例如通过离心或过滤来进行。例如，可以使用膏状酵母(被浓缩至15-27％w/w/干物质含量的面包酵母)。
在本发明第四方面的方法的一种优选实施方式中，用能降低游离天冬酰胺的量的酶、物理方法、化学方法或其组合进行的处理，在含有游离天冬酰胺的中间产物上进行，所述中间产物是在用于从酵母细胞生产酵母提取物或自溶酵母的方法的步骤中获得的，优选地，在对酵母细胞进行处理以释放及可选地至少部分降解细胞内含物的处理期间获得的，或者更优选地，处理之后获得的。细胞壁由此(部分)损坏和/或破裂，导致释放出细胞内含物，以及可选地，细胞内含物(例如蛋白和/或RNA和/或多糖)至少部分被降解。
为了从细胞中释放出细胞内含物以及可选地至少部分降解细胞内含物，可使用本领域技术人员已知的方法，通过化学方法、机械方法、酶促方法或这些方法中两种或多种的组合来对细胞进行处理。机械方法包括高压均质技术。就此目的而言，可以使用高压均质机。其它均质技术可涉及：与颗粒，例如沙和/或玻璃珠混合，或者使用碾磨装置(例如珠粒碾磨)。化学处理包括使用盐、碱和/或一种或多种表面活性剂或去垢剂。一些情况下，化学处理是较不优选的，因为它们可能导致RNA部分降解，尤其是使用碱时，随后形成2’-核糖核苷酸和3’-核糖核苷酸。
优选地，对细胞进行酶促处理，可选地，在化学和/或机械处理之后进行。酶促处理可以这样进行：用本身的酵母酶和/或加入的外来的酶对酵母细胞发挥作用。酶促处理可在4至10之间的pH和/或40℃至70℃之间的温度下进行，这取决于所用的酶的类型。通常，酶促处理可以进行1至24之间的时间。酶促处理可不仅通过(部分)损坏和/或破裂细胞壁来释放细胞内含物，取决于所用的酶，其还可能导致细胞内含物(例如，蛋白、RNA和多糖)降解。
可向酵母细胞中加入一种或多种外来的酶，以进行酶促处理。优选地，可以用蛋白酶，更优选地，内切蛋白酶作为外来的酶。可选地，所述一种或多种外来的酶在本身的酵母酶已被失活后加入。本领域技术人员知道如何使本身的酵母酶失活。失活例如可通过pH处理或热冲击来实现，后一种方法是优选的。可以通过在80-97℃的温度下对酵母细胞进行5至10分钟的处理来合适地进行热冲击。当用本发明的方法来生产自溶解酵母提取物或自溶酵母时，本身的酵母酶通常不被失活。
可选地，用于将RNA转变为5’-核糖核苷酸的一种或多种，例如，5’-磷酸二酯酶(5’-Fdase)以及可选地，脱氨酶还可与上述酶一起加入，或者在上述酶的处理后随后加入。优选用5’-Fdase将RNA转化为5’-核糖核苷酸。5’-Fdase可从微生物或植物来源(例如，麦芽根提取物)获得。可商业获得的微生物5’-Fdase的例子是Amano(日本)生产的酶RP-1。可选地，通过脱氨酶，例如，5’-腺苷酸脱氨酶，将5’-AMP转化为5’-IMP。可商业获得的脱氨酶的例子是Amano(日本)生产的Deaminase 500。
如上文所述，在本发明第四方面的方法的一种优选实施方式中，处理在含有游离天冬酰胺的中间产物上进行，所述中间产物是在用于从酵母细胞生产酵母提取物或自溶酵母的方法的步骤中获得的。优选地，处理在对酵母细胞进行处理以释放及可选地至少部分降解细胞内含物的处理期间，更优选地，处理之后进行。但是，如果进行处理以将RNA转变为5’-核糖核苷酸，那么用能降低游离天冬酰胺的量的酶进行的处理可在RNA转变之前或之后进行。用能降低游离天冬酰胺的量的酶进行的处理可在对用于从酵母细胞释放及可选地至少部分降解细胞内含物的酶和/或化学物质去活之前或之后进行。对酶的失活可按照上文所述的方法来进行。用能降低游离天冬酰胺的量的酶进行的处理可能需要对发生反应的混合物的pH加以调节，这取决于进行之前的步骤的pH以及所用的酶的最优pH。处理之后，优选使用上文所述的方法之一对能降低游离天冬酰胺的量的酶加以失活。
当将用第四个方面的方法对酵母提取物进行处理时，(部分)损坏和/或破裂酵母细胞壁以及可选地降解酵母细胞内含物之后获得的不可溶级分可在所有酶促处理完成之后被除去，即，在RNA降解为5’-核糖核苷酸或者用能水解游离天冬酰胺侧链酰胺基的酶进行的处理(取决于哪个步骤最后进行)之后被除去。可通过任何常用的固液分离方法，例如离心或过滤，将不可溶级分与上清液分离开。当将用第三方面的方法来生产自溶酵母时，可省却除去不可溶级分的步骤。
除去固体级分之后获得的液体级分可被浓缩或干燥。液体级分可被浓缩，以产生液体形式的酵母提取物(通常具有大约40-65％w/w的干物质含量)，或者，其被进一步浓缩，以产生糊状形式的酵母提取物(通常具有大约70-80％w/w的干物质含量)。可对酵母提取物加以干燥，例如干燥至具有大约95％w/w或更高的干物质含量的干燥粉末。在生产自溶酵母的情况下，可按照与针对酵母提取物描述的方法相似的方法，来浓缩或干燥包含液体级分和不可溶级分的悬浮液。
在本发明的另一实施方式中，用于本发明第四方面的方法中的起始产物可以是含有游离天冬酰胺的、在用于从蛋白底物生产蛋白水解产物的方法的步骤中(优选地，在对蛋白底物进行处理以将其水解为肽和氨基酸的混合物的处理期间，更优选地，处理之后)获得的中间产物。
在该实施方式中，用于从蛋白底物生产蛋白水解产物的方法可以用蛋白底物开始，例如用蛋白底物在合适溶剂(例如水)中的悬浮液开始。上面提到的任何蛋白底物或其组合都可以使用。优选地，处理蛋白底物使其水解为肽和氨基酸的混合物。处理可通过化学或酶促方法进行。化学处理通常是按照本领域已知的方法(例如“Savory Flavours”，1995，T.W.Nagodawithana著，Esteekay Associates Inc.，Wisconsin，USA，233-237页所述)使用氢氯酸来进行的。优选地，通过酶促方法进行处理。优选地，使用内切蛋白酶和外切蛋白酶的混合物来进行酶促处理。合适的内切蛋白酶可以来源自动物、植物或微生物材料。它们包括重组的酶，例如，通过遗传工程改造技术获得的酶。合适的内切蛋白酶可以是，胰蛋白酶(EC3.4.21.4)、胰凝乳蛋白酶(EC3.4.21.1)、枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.14)和木瓜蛋白酶(EC 3.4.22.2)。合适的外切蛋白酶可包括羧肽酶(EC 3.4.16和EC 3.4.17)和/或氨肽酶(EC 3.4.11)。外切蛋白酶可来源自动物、植物或微生物材料。它们可以是重组的酶。合适的羧肽酶的例子可以是，例如，羧肽酶B(EC 3.4.17.2)。合适的氨肽酶的例子可以是，例如，来自Amano-Japan的Peptidase
Figure A20068005007100141
或来自ABEnzymes(英国)的Corolase
Figure A20068005007100142
。此外，可以使用包含内切蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶的复合酶制剂。此类制剂的例子是
Figure A20068005007100143
(NOVO，丹麦)或Sumizyme(ShinNihon，日本)。
取决于所用的酶的类型，可以使用合适的pH和温度。合适的pH可在大约pH 3至9之间变化。合适的温度可在大约5至75℃之间变化。外切蛋白酶和内切蛋白酶的混合物和蛋白底物可被一起孵育，或者可在蛋白底物与内切蛋白酶孵育之后(可选地，使内切蛋白酶失活之后)再与外切蛋白酶孵育。
用能降低游离天冬酰胺的量的酶进行的处理可在用内切蛋白酶和/或外切蛋白酶进行的酶促处理期间进行。取决于酶的pH最优值，用能降低游离天冬酰胺的量的酶进行的处理可在用内切蛋白酶进行的酶促处理期间或用外切蛋白酶进行的酶促处理期间进行。可选地，用能降低游离天冬酰胺的量的酶进行的处理可在用内切蛋白酶和外切蛋白酶进行的处理之后进行。
一旦已经获得了想要的蛋白水解产物，所述方法中使用的一种或多种酶可被失活。失活可在与对第三方面的方法中酶进行失活的条件相似的条件下进行。本领域技术人员将能选出用于使酶失活的最好的条件。
可按照本领域技术人员已知的方法，对通过第四个方面获得的蛋白水解产物进行后处理。例如，包含蛋白水解产物的水性悬浮液可被例如离心和/或超滤，然后通过例如蒸发以及可选地以任何方便的方式干燥(例如，喷雾干燥、冷冻干燥、流床处理或者这些方法的组合)对其加以浓缩。
在第五个方面，本发明提供了根据本发明第一个方面的酵母提取物或可通过根据本发明第四个方面的方法获得的酵母提取物在食品、饲料或食品或饲料成分或其制备方法中的用途。
在第六个方面，本发明提供了根据本发明第二个方面的自溶酵母或可通过根据本发明第四个方面的方法获得的自溶酵母在食品、饲料或食品或饲料成分或其制备方法中的用途。
在第七个方面，本发明提供了根据本发明第三个方面的蛋白水解产物或可通过根据本发明第四个方面的方法获得的蛋白水解产物在食品、饲料或食品或饲料成分或其制备方法中的用途。优选地，所述蛋白水解产物用于对加工调味剂的制备。
在本发明第五、第六或第七方面的优选实施方式中，酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物用于生产加工调味剂。
令人吃惊地，当将根据本发明的酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物用于加工调味剂的生产中时，获得了具有低丙烯酰胺含量的加工调味剂，所述含量比使用常规酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物获得的加工调味剂中存在的量要低相当多。
在第八个方面，本发明涉及具有基于干物质而言不高于800ppb，优选不高于600ppb，更优选不高于400ppb，最优选不高于200ppb的丙烯酰胺的加工调味剂。加工调味剂在本文中的定义如“发明背景”中所示。加工调味剂可从选自酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物或一种或多种这些成分的组合的氨基酸源获得，可选地，所述氨基酸源组合有一种或多种补充氨基酸。有利地，本发明的加工调味剂包含低含量的毒性组分——丙烯酰胺。优选地，在本发明的加工调味剂中，丙烯酰胺低至50ppb，更优选地，低至20ppb，进一步更优选地，低至10ppb，最优选地，几乎不存在。该特征使得本发明的加工调味剂特别适用于对食品产品或食品成分进行调味。
在第九个方面，本发明涉及生产本发明第八个方面的加工调味剂的方法。所述方法包括下述步骤：在足以发展香味的pH、温度、压力和反应时间的条件下，对下述混合物进行加热，所述混合物至少含有选自下述酵母提取物、自溶酵母、蛋白水解产物或其混合物的氨基酸源以及优选地还原碳水化合物，所述酵母提取物、自溶酵母、蛋白水解产物都含有不高于1mg/g，优选地，不高于0.2mg/g，更优选地，不高于0.1mg/g的游离天冬酰胺。
令人非常吃惊地，当在该方面的工艺中使用上述氨基酸源时，最终产物中丙烯酰胺的量较之使用常规氨基酸源的加工调味剂中存在的量而言降低了相当多。当通过挤出机来生产加工调味剂时，后者相当明显，这如实施例所示。
最终产物中丙烯酰胺的量基于干物质而言不高于800ppb，优选不高于600ppb，更优选不高于400ppb，最优选不高于200ppb。
在一种实施方式中，根据本发明第九个方面的方法用下述初始混合物开始，所述初始混合物包含选自下述酵母提取物、自溶酵母、蛋白水解产物或其混合物的氨基酸源，所述酵母提取物、自溶酵母、蛋白水解产物含有不高于1mg/g，优选地，不高于0.2mg/g，更优选地，不高于0.1mg/g的游离天冬酰胺，可选地，所述来源组合有一种或多种补充氨基酸。
在另一实施方式中，根据本发明第九个方面的方法还可用下述初始混合物开始，所述初始混合物包含选自酵母提取物、自溶酵母、蛋白水解产物或其混合物的氨基酸源，所述来源含有高于1mg/g的游离天冬酰胺。在该实施方式中，混合物可例如包含可商业获得的酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物。在对混合物施加下文所述适合产生加工调味剂的条件之前，首先用上文所述能降低游离天冬酰胺的量的酶、物理方法、化学方法或其组合对混合物加以处理，以将天冬酰胺的量减少至低于1mg/g的水平。降低游离天冬酰胺的量的步骤可与产生加工调味剂的步骤部分重叠。
优选地，上面两种实施方式中描述的起始混合物还至少包含还原碳水化合物。还原碳水化合物可以是单糖、二糖、多糖或者这些成分中一种或多种的混合物。优选地，还原碳水化合物选自单糖的组，优选地，C5-单糖或C6-单糖的组，更优选地，选自L-核糖或D-核糖、右旋糖(D-葡萄糖)、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-果糖的组。本发明不排除组合超过一种还原碳水化合物的可能性。在后面这种情况下，从对多糖进行化学或酶促降解获得的水解产物可以用作为还原碳水化合物的来源，例如，麦芽糊精。优选地，还原碳水化合物以基于混合物干物质而言0至25％w/w之间的量存在于混合物中，更优选地，1至25％w/w，进一步更优选地，2至25％。当混合物中存在多糖，例如麦芽糊精时，还原碳水化合物基于混合物干物质而言可在5至50％w/w之间变化，优选地，10至40％w/w，更优选地，15至40％w/w。
如本发明背景中所指出的，当除氨基酸源之外，起始混合物中还存在其它成分时，氨基酸源的量基于总混合物干物质而言可以在30至98％w/w之间。
用于生产加工调味剂的成分混合物还可包含一种或多种脂类(例如油或脂肪)、含硫化合物、含羰基化合物等等。
当混合物中存在油或脂肪时，它们可以以基于总混合物干物质而言0至5％w/w的量存在。
优选地，反应混合物包含溶剂，优选地，水，通常，反应混合物中干物质的含量基于包括水在内的总混合物而言可以在60至98％w/w之间，更优选地，75至95％w/w之间。
可以按照本领域已知的任何方法对成分加以混合，这还取决于混合物中存在的水的含量。成分可同时或随后加入混合物中。还可使用机械搅拌器。
在该方面的方法中，在足以发展出香味的pH、温度、压力和反应时间的条件下，对至少包含上文指出的氨基酸源或其混合物(可选地，组合有一种或多种氨基酸以及优选至少还包含还原碳水化合物)的混合物进行加热。
为获得良好的香味，本发明方法中混合物的pH通常可以至少为2。优选地，pH在4至8之间。更优选地，5至7之间，进一步更优选地，5.5至6之间。可使用本领域技术人员公知的可食用酸或碱来调节pH。
通常，为生产加工调味剂，可将反应混合物加热至70至200℃之间的温度，优选地，70至190℃，这还取决于反应时间。较长的反应时间通常需要较低的反应温度，而较短的反应时间通常需要较高的反应温度。反应时间可在数秒(例如，2秒)至6小时之间变化，优选地，10秒至4小时之间，更优选地，20秒至2小时之间。为避免加热期间溶剂的损失，可将反应混合物保持于回流条件下。
取决于应当获得的调味剂的类型和用于生产加工调味剂的系统，第九个方面的方法可在从减压(例如，低至50mbar，例如，在真空炉中)到高于大气压的压力(例如，高至2-5bar)间变化。
可选地，当加热步骤之后加工调味剂中的水含量为4％w/w或更高时，第九个方面的方法就包含下述步骤：对加工调味剂加以干燥。在这方面可以使用本领域已知的方法，例如，炉干燥、带干燥、喷雾干燥。
取决于人们希望发展出的香味类型，可以使用混合物干物质含量和/或加热步骤的温度和/或加热步骤的持续时间和/或加热步骤期间使用的压力的不同组合。
例如为生产出具有经烘烤味道的加工调味剂，通常可在高于100℃(例如，110-120℃)的温度下，减压(例如，50-400mbar)下，对包含基于包括水在内的总混合物而言80％w/w的干物质的混合物进行4-6小时的加热。
例如为生产出具有经烹煮味道的加工调味剂，通常可在大约100℃的温度下，对包含基于包括水在内的总混合物而言40至60％w/w的干物质的混合物进行大约1-2小时的加热。
在本发明第九个方面的方法的一种优选实施方式中，将至少包含如上文指出的氨基酸源以及优选至少还包含还原碳水化合物的混合物成分引入挤出机，在足以发展出香味的pH、温度和反应时间的条件下对混合物进行捏炼和加热，随后从挤出机中挤出反应混合物。
挤出机可以是适合用于生产加工调味剂的任何挤出机，例如双轴挤出机(twin extruder)。挤出机，例如双轴挤出机是本领域技术人员已知的。可通过相同或单独的进料机将成分引入挤出机。当使用挤出机时，优选地，在110至190℃的温度下，优选地，130至165℃的温度下对混合物进行捏炼和加热。优选地，使用1至3bar的压力。反应时间优选为2秒至30分钟，更优选地，10秒至5分钟。当使用挤出机时，反应混合物中干物质的量优选为：基于包括水在内的混合物总重而言，至少90％w/w。
反应产物可在从减压(例如5mbar)至大气压(例如，大约1bar)间变化的挤出机外压力下离开挤出机。可使用冷却带或任何适合的方法，对挤出的产物进行进一步冷却和/或干燥。
如果需要的话，第九个方面的方法还可包括：进行处理，以进一步降低最终的加工调味剂中丙烯酰胺的量。所述处理可以是适合用于降低产物中丙烯酰胺的量并且可应用于加工调味剂生产过程中的任何处理。
在一种实施方式中，对第九个方面的方法中的pH、温度、压力和反应时间加以调节，以降低该工艺中丙烯酰胺的量。例如，在减压下干燥加工调味剂。压力通常可在20-400mbar之间。
在另一实施方式中，用能修饰或降解丙烯酰胺的酶来处理最终产物。在足以使酶与丙烯酰胺反应的pH、温度和反应时间的条件下进行处理。优选地，可以使用酰胺酶。可使用的酶的例子以及可以使用酶的条件的例子在2005年10月13日提交的申请号为PCT/EP2005/055242的国际专利申请中给出。
根据本发明第八个方面或可用根据本发明第九个方面的方法获得的加工调味剂因其非常低的丙烯酰胺水平而非常适合用作为食品或饲料或食品或饲料成分中的调味品。
实施例
材料和方法
丙烯酰胺测量
样品预处理
使用5ml milliQ水来提取600mg经干燥和均质的样品。向提取物中加入1μg内标13C3丙烯酰胺(溶液中，CIL)。10分钟离心(6000rpm)后，将3ml上层放到Extreluut-3BT柱(Merck)上。使用15ml乙酸乙酯，从柱中洗脱丙烯酰胺。在温和氮气流下蒸发乙酸乙酯至大约0.5ml。
色谱条件
使用气相色谱来分析乙酸乙酯溶液。使用CP-Wax-57(Varian)柱(长度25m，内直径0.32mm，膜1.2μm)，用氦作为载气，以5.4ml/分钟的恒定流来实现分离。使用3μl的split-less注射。炉温在50℃中保持1分钟，之后温度以30℃/分钟升至220℃。在220℃恒温保持12分钟后，对炉进行冷却，在下次注射之前对其加以稳定。
使用在线化学离子化质谱，以正离子模式，用甲烷作为离子化气体来进行检测。监测特征离子m/z 72(丙烯酰胺)和m/z 75(13C3丙烯酰胺)用于定量。
使用的设备
GC：                 HP6890(Hewlet Packard)
MSD(质量选择检测器)：HP5973(Hewlet Packard)
测量游离氨基酸的方法
使用下述方法来测量游离氨基酸的量(例如，酵母提取物中的)。将经过精确称重的酵母提取物材料样品溶解于稀酸中，通过在Eppendorf离心机中离心来移走沉淀。按照Amino Acid Analysis System of Waters(Milford MA，美国)的操作手册指出的PicoTag方法，对清澈的上清液进行氨基酸分析。为达到该目的，从液体中获取合适的样品，加入稀酸，并进行均质。从后一溶液中取新的样品，干燥，用异硫氰酸苯酯进行衍生化。使用HPLC方法对存在的多种经衍生化氨基酸加以定量，加起来计算出经称重样品中游离氨基酸的总水平。
实施例1生产具有低游离天冬酰胺的自溶解酵母提取物
酶单位的定义：在pH 5.5和37℃每分钟从L-天冬酰胺释放1μ摩尔的NH3。
制造200升20％的自溶解酵母提取物(LS，DSM FoodSpecialties-荷兰)水溶液。使用4N KOH将该溶液pH调节至5.1。向酵母提取物溶液中加入20ml天冬酰胺酶溶液(该溶液含有4602个酶单位/ml)，混合物在51℃下孵育4小时。反应一旦终止后，就通过热处理对酶进行失活。将pH调节至pH 6.5之后，对得到的溶液进行喷雾干燥。最终产物含有低于3.5％w/w的水。在按照上文所述进行酶处理的开始时和处理之后，对混合物的氨基酸组成加以测量。结果列于表1中。
使用的天冬酰胺酶是WO2004/030468所述的Aspergillus niger天冬酰胺酶。
表1中的结果清楚表明，天冬酰胺酶处理之后的酵母提取物不含天冬酰胺。此外，天冬氨酸的量增加，增加的量与天冬酰胺降低的量相近。
表1：天冬酰胺酶处理对自溶解酵母提取物的影响
Figure A20068005007100221
*相对每克酵母提取物干物质的mg数
实施例2利用加热步骤期间使用不同温度的炉来制备加工调味剂
配方2a
81.3克LS粉末(DSM Food Specialties-荷兰)
16.0克
Figure A20068005007100223
Plus HS粉末(DSM Food Specialties-荷兰)
24.3克右旋糖单水合物
配方2b
81.3克实施例1中获得的酵母提取物，粉末
16.0克
Figure A20068005007100224
Plus HS粉末(DSM Food Specialties-荷兰)
24.3克右旋糖单水合物
Gistex LS粉末是自溶解酵母提取物，其中包含少于1％w/w的氯化钠、62％w/w的蛋白以及相对总蛋白而言40-50％w/w的游离氨基酸，所有重量百分比都基于干物质。
Maxarome Plus HS粉末是水解酵母提取物，其包含基于干物质而言约40％w/w的氯化钠。此外，其包含3％w/w的5’-GMP(作为二钠盐七水合物测量)和3％w/w的5’-IMP(作为二钠盐七水合物测量)，5％w/w的谷氨酸(作为游离酸测量)，72％w/w的蛋白和大约占总蛋白20％w/w的游离氨基酸，所有重量百分比都基于不含氯化钠的酵母提取物干物质。
在两种情况下，都用勺子搅拌粉末。在搅拌下，向粉末混合物中逐滴滴入3.4克向日葵油。
将粉末混合物分进铝盘。
在炉中于不同温度下对粉末进行固定时间的加热。获得的粉末具有经过烘烤的牛肉味。
针对丙烯酰胺的存在对粉末加以分析。结果如表2所示。
表2
  实验条件   丙烯酰胺(μg/kg)
  粉末混合物，配方2a，165℃，40分钟   935
  粉末混合物，配方2a，180℃，40分钟   1497
  粉末混合物，配方2b，165℃，40分钟   255
  粉末混合物，配方2b，180℃，40分钟   296
实施例3使用分批捏炼机来制备加工调味剂
将30克配方3、3a(其组成见表3)的样品转入被预热至特定温度的50cc分批捏炼机，于同样温度下混合180秒。
用于配方3、3a的温度：145和150℃。
表3
获得的加工调味剂具有经烘烤的鸡肉味。
针对丙烯酰胺含量对得到的加工调味剂加以分析。
结果示于表4中。
表4
  配方   温度(℃)   丙烯酰胺(ppb)
  3   145   5928
  3a   145   143
  3   150   6227
  3a   150   124
实施例4使用挤出机来制备加工调味剂
工艺描述：
使用单独的进料器，向装备有用于水的进料单元和注射器以及用于油的进料单元和注射器的双螺杆挤出机中加入糖和酵母提取物的混合物。使用两种不同的配方(配方4和4a，见表4)。于165℃，在挤出机中对8千克的每种配方进行1小时的加工。
在室温及大气压下，从挤出机中挤出产物，在装备有压辊的冷却带上对产物进行冷却和干燥，磨碎并取样。
表4
Figure A20068005007100241
获得产物具有经过深度烘烤的牛肉味。针对丙烯酰胺对样品加以分析。
结果：
配方4：4568ppb。
配方4a：400ppb。
实施例5生产低游离天冬酰胺的酪蛋白水解产物
酶单位的定义：在pH 5.5和37℃每分钟从L-天冬酰胺释放1μ摩尔的NH3。
制造1升10％的酪蛋白水解产物水溶液。将该溶液pH调节至5.1。向酪蛋白溶液中加入62ml天冬酰胺酶(含有14472个酶单位/mg)，混合物在51℃下孵育2小时。反应一旦终止后，就通过热处理对酶进行失活。对得到的溶液进行冷冻干燥。在按照上文所述开始进行酶处理时和酶处理之后，对混合物的氨基酸组成加以测量。结果列于表6中。
表6：天冬酰胺酶处理对酪蛋白水解产物的影响
Figure A20068005007100251
Figure A20068005007100261
*相对每克酪蛋白水解产物干物质的mg数
使用的天冬酰胺酶是WO2004/030468所述的Aspergillus niger天冬酰胺酶。
实施例6基于酪蛋白水解产物生产加工调味剂
制备由4.7g葡萄糖、0.4g甘氨酸、1.6g麦芽糊精和13.4g酪蛋白水解产物(按照实施例5所述制备，不含天冬酰胺)构成的混合物。作为参照，使用未经天冬酰胺酶处理的酪蛋白水解产物代替实施例5的酪蛋白水解产物，来制备相似的混合物。
在155℃对两种混合物都进行45分钟的炉处理。最后，使用材料和方法章节描述的方法来测量丙烯酰胺含量。
丙烯酰胺分析的结果列于表7中。
表7
  酪蛋白水解产物  丙烯酰胺(ppb)
  经天冬酰胺酶处理的酪蛋白水解产物  614
  未经处理的酪蛋白水解产物  2801
实施例7生产低游离天冬酰胺的自溶酵母
在存在2克内切蛋白酶
Figure A20068005007100262
(Novozymes-丹麦)时，于pH 5.1和51℃，对2升Saccharomyces cerevisiae膏状酵母(18.5％的干固体)进行24小时的自溶。接着，对反应混合物进行热处理，以失活所有的酶活性。
再在存在53mg天冬酰胺酶(具有14772个单位/mg)时，于pH 5.1和51℃，对1升反应混合物进行2小时孵育。接着，通过热处理使酶失活。对得到的溶液进行喷雾干燥。(未经天冬酰胺酶处理的)参照样品也被喷雾干燥。测量经干燥材料(经或未经天冬酰胺酶处理的)的氨基酸组成。结果列于表8中。
表8：天冬酰胺酶处理对自溶酵母的影响
*相对每克自溶酵母干物质的mg数
使用的天冬酰胺酶是WO2004/030468所述的Aspergillus niger天冬酰胺酶。
实施例8基于自溶酵母来生产加工调味剂
制备由4.7g葡萄糖、0.4g甘氨酸、1.6g麦芽糊精和13.4g自溶酵母(按照实施例7所述制备的，不含天冬酰胺)构成的混合物。作为参照，使用未经天冬酰胺酶处理的自溶酵母来制备相似的混合物。
在155℃对两种混合物都进行45分钟的炉处理。最后，使用材料和方法章节描述的方法来测量丙烯酰胺含量。
丙烯酰胺分析的结果列于表9中。
表9
  自溶酵母  丙烯酰胺(ppb)
  经天冬酰胺酶处理的自溶酵母  710
  未经处理的自溶酵母  2551
实施例9生产低游离天冬酰胺的酵母提取物
在存在2克内切蛋白酶
Figure A20068005007100281
(Novozymes-丹麦)时，于pH 5.1和51℃，对2升Saccharomyces cerevisiae膏状酵母(18.2％的干固体)进行17.5小时的自溶。再在存在613mg天冬酰胺酶(具有1802个单位/mg)时，于pH 5.1和51℃，对反应混合物进行2小时孵育。通过离心除去细胞壁，在95℃对上清液进行5分钟处理使所有存在的酶活性失活。接着，对上清液进行浓缩和喷雾干燥。
测量天冬酰胺酶处理之前和之后的反应混合物中以及最终的提取物粉末中的天冬酰胺浓度。结果列于表10中。
表10：天冬酰胺分析结果
  样品   天冬酰胺浓度(mg/g干物质)
  天冬酰胺酶处理之前   3.29
  天冬酰胺酶处理之后   ＜0.01
  酵母提取物粉末   ＜0.03
使用的天冬酰胺酶是WO2004/030468所述的Aspergillus niger天冬酰胺酶。

Claims (17)

1.一种酵母提取物，其具有基于干物质而言不高于1mg/g的游离天冬酰胺，优选地，不高于0.2mg/g，更优选地，不高于0.1mg/g。
2.一种自溶酵母，其具有基于干物质而言不高于1mg/g的游离天冬酰胺，优选地，不高于0.2mg/g，更优选地，不高于0.1mg/g。
3.一种蛋白水解产物，其具有基于干物质而言不高于1mg/g的游离天冬酰胺，优选地，不高于0.2mg/g，更优选地，不高于0.1mg/g。
4.生产权利要求1的酵母提取物、权利要求2的自溶酵母或权利要求3的蛋白水解产物的方法，所述方法包括用酶、用物理方法、用化学方法或用其组合对含有游离天冬酰胺的起始酵母提取物、起始自溶酵母或起始蛋白水解产物进行处理，所述酶、物理方法、化学方法或其组合是能降低酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物中游离天冬酰胺的量的那些，以使得酵母提取物、自溶酵母或蛋白水解产物中游离天冬酰胺的量基于干物质而言不高于1mg/g，更优选不高于0.2mg/g，最优选不高于0.1mg/g。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述处理用能降低所述最终产物中游离天冬酰胺的量的酶，在足以令所述酶与所述游离天冬酰胺发生反应的pH、温度和反应时间的条件下进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述处理用能修饰游离天冬酰胺侧链的酶，优选地，用能水解游离天冬酰胺侧链酰胺基的酶，更优选地，用天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1)来进行。
7.根据权利要求4至6中任意一项所述的方法，其中，所述起始酵母提取物、所述起始自溶酵母或所述起始蛋白水解产物是中间产物，所述中间产物是在用于从酵母细胞生产酵母提取物或自溶酵母的方法的步骤中获得的，优选地，在对所述酵母细胞进行处理以释放及可选地至少部分降解所述细胞内含物的处理期间获得的，更优选地，处理之后获得的；或者，所述中间产物是在用于从蛋白底物生产蛋白水解产物的方法的步骤中获得的，优选地，在对所述蛋白底物进行处理以将其水解为肽和氨基酸的混合物的处理期间获得的，更优选地，处理之后获得的。
8.权利要求1的酵母提取物或可通过权利要求4至7中任意一项所述的方法获得的酵母提取物在食品、饲料或食品或饲料成分或其制备方法中的用途，优选地，在加工调味剂的制备方法中的用途。
9.权利要求2的自溶酵母或可通过权利要求4至7中任意一项所述的方法获得的自溶酵母在食品、饲料或食品或饲料成分或其制备方法中的用途，优选地，在加工调味剂的制备方法中的用途。
10.权利要求3的蛋白水解产物或可通过权利要求4至7中任意一项所述的方法获得的蛋白水解产物在食品、饲料或食品或饲料成分或其制备方法中的用途，优选地，在加工调味剂的制备方法中的用途。
11.一种加工调味剂，其具有基于干物质而言不高于800ppb，优选不高于600ppb，更优选不高于400ppb，最优选不高于200ppb的丙烯酰胺。
12.生产权利要求11的加工调味剂的方法，所述方法包括：在足以发展香味的pH、温度、压力和反应时间的条件下，对下述混合物进行加热，所述混合物含有选自权利要求1的酵母提取物、权利要求2的自溶酵母或权利要求3的蛋白水解产物或其混合物的氨基酸源以及优选地至少还含有还原碳水化合物。
13.生产权利要求11的加工调味剂的方法，所述方法包括：用能降低游离天冬酰胺的量，优选地，降低至低于1mg/g的水平，的酶、物理方法、化学方法或其组合，对含有高于1mg/g的游离天冬酰胺的，包含选自酵母提取物、自溶酵母、蛋白水解产物或其混合物的氨基酸源的混合物进行处理，以及在足以发展香味的pH、温度、压力和反应时间的条件下进行加热。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述混合物的成分被引入挤出机，在足以发展出香味的pH、温度和反应时间的条件下对所述混合物进行捏炼和加热，随后从所述挤出机中挤出得到的加工调味剂。
15.根据权利要求12-14中任意一项所述的方法，其中，对所述pH、温度、压力和反应时间的条件加以调节，以降低所述加工调味剂中丙烯酰胺的量，优选地，在减压下干燥所述加工调味剂。
16.根据权利要求12-15中任意一项所述的方法，其中，用能修饰或降解丙烯酰胺的酶，优选用酰胺酶，对所述加工调味剂进一步处理。
17.根据权利要求11所述的或可通过权利要求12-16中任意一项所述的工艺获得的加工调味剂对食品或饲料或食品或饲料成分进行调味的用途。
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