CN101349599A - 碱性脂肪酶型时间温度指示方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碱性脂肪酶型时间温度指示方法及产品，属于农产品贮运技术领域。反应体系包括：浓度为1g·L－1的碱性脂肪酶溶液0.1mL；反应底物三乙酸甘油酯0.5mL；浓度为20g·L－1的乳化剂PVA9.5mL；浓度为1mol·L－1的CaCl2溶液0.7mL；浓度为0.05mol·L－1、pH 10.6的Gly－NaOH缓冲溶液39mL；0.2mL酚红－酚酞－百里酚酞混合溶液作为反应的指示剂，开始反应后，据色度学上CIE测定的反应体系颜色参数L*、a*、b*值，判断确定其与时间温度累计效应对应关系。本发明的碱性脂肪酶型时间温度指示方法可以准确指示出物品在生产、储藏、运输和销售过程中的时间温度的累积效应。
Description
一、技术领域
本发明涉及碱性脂肪酶型时间温度指示方法及产品，属于农产品贮运技术领域。可用于指示物品在生产、储藏、运输和销售过程中时间温度的累积效应，并在一定程度上能指示产品的品质。
二、背景技术
食品质量安全问题频频出现，引起了人们的广泛关注。食品质量除受其自身组成等内部因素影响外，还受大气压、机械压力、光照、温度等外部环境条件的影响，并且质量安全问题往往在食品的生产贮存、运输或货架期中出现，所以控制好外部环境是一个很重要的环节。在所有的外部环境影响因素中，温度是一个不可预测性较高的因素，往往因环境的变化而发生波动，贮藏环境中的温度控制不当，将造成食品腐败变质，而引起经济损失。有因为产品的品质还与贮存的时间有关，在一定的温度条件下，贮存时间越长，其品质越差。当流通的温度和时间两个因素累积在一起，就决定了该产品的品质了。因此需要一种有效的手段来监控产品在流通过程中的时间和温度的累积，同时指示产品的质量信息，提供产品的剩余货架期的信息。
三、发明内容
1、技术问题：针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种告知人们产品在生产、储藏、运输和销售过程中时间温度的累积效应的酶型时间温度指示方法。
2、技术方案：
碱性脂肪酶型时间温度指示方法，包括：
1)反应体系
取反应体系总体积为50mL，包括：浓度为1g·L-1的碱性脂肪酶溶液0.1mL；反应底物三乙酸甘油酯0.5mL；浓度为20g·L-1的乳化剂PVA9.5mL；浓度为1mol·L-1的CaCl2溶液0.7mL；浓度为0.05mol·L-1、pH 10.6的Gly-NaOH缓冲溶液39mL；0.2mL酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液作为反应的指示剂；其中酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液配制方法为称取0.1g酚红、0.5g酚酞和0.2g百里酚酞，溶于100mL的体积比60％的乙醇中，过滤，常温下保存；
2)反应体系开始反应后，根据色度学上CIE，即国际照明委员会推荐的颜色空间和色度计测定的反应体系颜色参数L*、a*、b*值，判断确定其与反应时间和反应温度累计效应对应关系。其中，
反应体系出现酒红色：明度值L*为48.2～51.3；红色度a*值为31.3～35.6；黄度值b*为15.4～17.2；对应反应时间和反应温度为20℃和26～34小时；25℃和15～20小时；或者30℃和10～13小时；
反应体系出现橙黄色：明度值L*为56.0～57.8；红色度a*值为11.5～12.9；黄度值b*为28.3～29.7；对应反应时间和反应温度为20℃和48～56小时；25℃和24～28小时；或者30℃和20～22小时；
反应体系出现黄色：明度值L*为60.9～63.1；红色度a*值为-2.0～-0.9；黄度值b*为40.8～43.2；对应反应时间和反应温度为20℃和96～105小时；25℃和52～60小时；或者30℃和44～50小时。
利用上述碱性脂肪酶型时间温度指示方法可制作酶型时间温度指示卡或比色卡产品。
3、有益效果
(1)系统地研究了碱性脂肪酶反应体系的各影响因素，确定了各影响因素的最优组合。根据脂肪酶与油脂发生水解反应，反应体系的pH下降，以pH指示剂为指示剂，通过颜色变化显示时间温度的累积效应，从而达到指示存放时间和温度的目的。系统研究底物种类、乳化处理、底物含量、金属离子对碱性脂肪酶反应体系的影响确定了指示卡的反应体系并选择了适合该反应体系的pH指示剂；通过测定碱性脂肪酶反应体系的活化能确定该反应体系的适用范围并制定与指示卡配套的比色产品。
(2)根据碱性脂肪酶反应体系在不同温度下不同反应时间的颜色制定了比色卡，这将有利于消费者和管理者根据比色卡的颜色判断所指示产品各阶段的时间温度的累积情况。
(3)首次使用三乙酸甘油酯作为碱性脂肪酶的底物，并用于碱性脂肪酶时间温度指示反应体系，这将大大地降低时间温度指示反应体系的成本。
(4)首次使用酚红、酚酞、百里酚酞混合溶液作为碱性脂肪酶时间温度指示反应体系的pH指示剂，这将使碱性脂肪酶时间温度指示反应体系得颜色变化更加明显且更易于人们辨别。
(5)实际使用时，将本发明碱性脂肪酶型时间温度指示方法所述反应体系做成时间-温度指示产品置于对温度敏感的物品的外包装上，那么时间-温度指示产品与物品将经历的相同的全部温度时间变化，对照颜色比色卡就能知道物品的所经历的时间和温度变化。并还可以将反应体系颜色值做成标准颜色比色卡配套使用。
四、附图说明
图1底物对反应体系的影响
图2乳化处理对反应体系的影响
图3底物含量对反应体系的影响(试验组I、II、III、IV和V见表1)
图4混合指示剂的L*、a*、b*与pH关系图
图5不同pH混合指示剂对应的颜色
图6温度对反应体系的影响
图7不同温度条件下TTI速率常数与1/T半对数图
图8不同温度下反应体系的L*-时间关系图
图9不同温度下反应体系的a*-时间关系图
图10不同温度下反应体系的b*-时间关系图
图114℃条件下反应体系的颜色变化
图1210℃条件下反应体系的颜色变化
图1315℃条件下反应体系的颜色变化
图1420℃条件下反应体系的颜色变化
图1525℃条件下反应体系的颜色变化
图1630℃条件下反应体系的颜色变化
五、具体实施方式
(一)时间-温度指示反应体系的确立
1材料与方法
1.1材料与仪器
材料：碱性脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限公司，LVK-F100)、三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、氢氧化钠、甘氨酸、聚乙烯醇124、氯化钙、百里香酚蓝、溴甲酚绿、酚红、百里酚酞、酚酞、中性红、无水乙醇等
仪器：分散机(IKA-ULTEA-TURRAX T 25 basic)；pH计(pH211，HANNAinstrument)；便携式色差仪(Minolta-CR200，日本)；水浴锅等
1.2试验方法
1.2.1底物的选择
分别将三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和三乙酸甘油酯与20g·L-1PVA按照1∶19(V∶V)混合，进行乳化，乳化系数设定为：9500r·min-1，每次30s，共10次。反应条件：取8mL乳化液加入到41mL pH10.6的Gly-NaOH(0.05mol·L-1)缓冲溶液中，每组设5个平行，20℃水浴中预热10min，加入0.1mL 1g·L-1碱性脂肪酶，每2h测定1次反应体系的pH值。
1.2.2TTI体系乳化处理工艺参数的确定
试验分为3组：A组：三乙酸甘油酯与20g·L-1PVA按照1∶19(V∶V)混合，使用分散机进行乳化，参数为：9500r·min-1，每次30s，共10次。B组：三乙酸甘油酯与20g·L-1PVA按照1∶19(V∶V)混合，不使用分散机进行乳化。C组：取0.4mL三乙酸甘油酯和7.6mL Gly-NaOH缓冲溶液混合。反应条件同1.2.1。
1.2.3金属离子对TTI反应体系的影响
将三乙酸甘油酯与20g·L-1PVA按照1∶19(V∶V)配成乳化液，取8mL乳化液加入到41mLpH10.6的Gly-NaOH(0.05mol·L-1)缓冲溶液中。试验分4组，在第1组中加入1mol·L-1CaCl2 1mL，第2组加入1mol·L-1NaCl 1mL，第3组加入1mol·L-1KCl 1mL，第4组为对照组，加入0.05mol·L-1Gly-NaOH缓冲溶液1mL，每组设5个平行样，其余反应条件同1.2.1。
1.2.4底物含量的选择
底物含量配比见表1，反应条件同1.2.1。
表1不同底物含量的配比
1.2.5TTI体系pH指示剂的确定
取0.05mL酚红、酚酞和百里酚酞混合指示剂(称取0.1g酚红，0.5g酚酞和0.2g百里酚酞，溶于100mL的60％的乙醇中，过滤，常温下保存)分别加入10mL pH为7.0、7.5、8.0、8.6、9.0、9.6、10.0、10.6的Gly-NaOH(0.05mol·L-1)溶液，混匀后用色差仪测定颜色指标(L*、a*、b*值)，每组测4个平行。
1.3数据处理
利用SAS9.0对数据进行统计分析，用Duncan法进行多重比较，数据以x±SE表示。
2结果与分析
2.1底物的选择
从图1可以看出，随着反应的进行，三乙酸甘油酯组pH下降的速度最快，从10.06下降到7.86；三丁酸甘油酯，从9.97下降到9.59；而三油酸甘油酯组pH值基本没有下降，一直在10.60附近。
此外，从反应体系的外观和气味上分析，三油酸甘油酯组最不稳定，经乳化处理后，呈现为乳白色的油状液体，静置后出现分层；三丁酸甘油酯组液体无色透明，但有很多细小的三丁酸甘油酯的小油滴，并具有刺激性气味；三乙酸甘油酯组是无色无味，透明均一液体。另外，从成本方面考虑，三丁酸甘油酯价格昂贵，而三乙酸甘油酯则价格低廉。综合考虑，所以选择使用三乙酸甘油酯作为反应底物。
2.2乳化处理对反应体系的影响
由图2可见，结果显示加乳化剂并均质和加乳化剂不均质这两组与不加乳化剂不均质组差异显著(P＜0.05)，而加乳化剂并均质和加乳化剂不均质组之间差异不显著(P＞0.05)。但由于加乳化剂并均质组要经过均质处理，在这个处理过程中产生的热量能促进三乙酸甘油酯的水解，使得体系的pH值降低从而影响结果，因此本试验选择添加乳化剂不均质作为乳化处理条件。
2.3金属离子对反应体系的影响
从表2可知，NaCl和KCl组与对照组反应体系中pH值差异不显著(P＞0.05)(KCl组反应12h除外)，对数据进行拟和处理得出的结论是一致的。CaCl2处理组与对照组pH差异显著(反应0h除外)(P＜0.05)，也就是说，CaCl2能在一定程度上降低反应产物对酶的抑制作用。因此，反应体系需要加入一定量的CaCl2来维持体系反应的进行。Na+能降低反应体系界面电荷效应的抑制作用，Ca2+是脂肪酸的受体，能在酶反应的后期降低脂肪酸对酶的抑制作用，KCl能提高酶的稳定性。
表2金属离子对反应体系pH值的影响
2.4底物含量的选择
由图3可知：5组体系反应速度的趋势一致，都是在反应前期速度较快，之后趋向平稳。但是，酶反应的速度与底物含量呈正相关，底物含量越大，酶反应速度就越快，如，在50mL反应体系(其中0.9mL预留给金属盐溶液和pH指示剂)中，三乙酸甘油酯为0.3～0.5mL时酶反应的速度增长的最快。
酶反应的速度不同导致到达反应终点所需要的时间不同。试验结果表明：I组反应总时间最短，II组和III组时间稍长，IV组、V组时间基本相同且在所有组中是最长的。除此之外，IV组和V组体系的pH值变化幅度是最大的，如果应用于时间-温度指示卡，那么对应于相同的时间和温度的变化该指示卡的变化是最明显的。再从成本考虑，本试验选择IV组的底物含量(0.5mL三乙酸甘油酯)。
2.5pH指示剂的确定
将酚红、酚酞和百里酚酞混合后与不同pH缓冲溶液混合，测定混合溶液的L*、a*、b*值，它们随pH的变化关系见图4。
L*值随pH值变小呈现由小到大的趋势，这表明，在碱性脂肪酶反应初期pH值较大的时候，反应液呈现比较暗沉的颜色，随着反应进行，反应液变明。当pH为7.0～9.6时，a*值呈现由小到大的趋势，当pH为9.6～10.6时，a*值呈现由大到小的趋势，但都是正值，说明随着反应的进行，反应液呈现淡红-红-淡红的趋势。当pH为7.0～9.0时，b*值变小，当pH为9.0～10.6时，b*值呈现平稳恒定趋势，说明随着反应的进行，反应液先呈现蓝色，后期由蓝色到黄色。
将仪器测定颜色得到的数据与肉眼进行观察相结合，结果显示混合指示剂能在pH在7.0～10.6范围内指示颜色的变化，且颜色的变化趋势是深紫色、紫色、深粉红、粉红、淡粉红、酒红色、橙黄色、黄色，具有较好的辨别力(图5)。
3结论
本试验确定了碱性脂肪酶型时间温度指示反应体系的主要参数。反应体系的总体积为50mL:1g·L-1的碱性脂肪酶0.1mL；三乙酸甘油脂作为底物，用量为0.5mL；9.5mL的20g·L-1PVA作为乳化剂，不经分散机乳化；1mol·L-1的CaCl2 0.7mL；pH为10.6的Gly-NaOH(0.05mol·L-1)的缓冲溶液39mL；0.2mL酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液作为反应的指示剂。试验结果显示，该反应体系的pH值随温度和时间的变化呈现出较好的规律性的变化，且反应体系具有明显的颜色变化，能反应时间-温度的累积变化。因此，此反应体系能够起到指示时间温度累积效应的作用。
(二)反应体系时间、温度动力学参数的测定
1材料和方法
1.1材料：
试剂：碱性脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限公司，LVK-F100)三乙酸甘油酯 氢氧化钠 甘氨酸 聚乙烯醇124 氯化钙 酚红 百里酚酞 酚酞 无水乙醇等
仪器：pH计(pH211，HANNA instrument)，恒温培养箱
1.2试验方法
取5个100mL锥形瓶，往每个锥形瓶中依次加入pH为10.6的Gly-NaOH(0.05mol·L-1)缓冲溶液39mL、混合指示剂0.2mL、1mol·L-1 CaCl2溶液0.7mL、20g·L-1PVA 9.5mL、0.5mL三乙酸甘油酯和1g·mL-1碱性脂肪酶0.1mL，让酶-底物体系在4、10、15、20、25、30℃恒温培养箱中反应，每2h测定1次反应体系的pH值。
对体系在不同温度条件下的反应曲线进行拟合，通过拟合方程测定不同温度的反应速率K。酶催化反应中温度对反应速率K的影响遵循Arrenhenius方程，方程如下：
K＝KAexp(-EA/RT)(1)
KA是指前因子，EA是活化能，R为通常气体常数，T为热力学温度。
将方程(1)转换为：
lnK＝lnKA-EA/RT (2)
以lnK对1/T作图得到1条直线，由这条直线的斜率可以求得EA，再根据截距可以求出KA。
2结果与分析由图6可以看出，随温度的升高反应速度加快，且反应的变化趋势呈指数函数的形式。对图6的曲线进行指数函数的拟合，得到反应速率和对应的相关系数，结果见表3。
表3不同温度下体系的反应速率K和拟合曲线的相关系数
根据Arrenhenius方程，结合图7可以求得反应体系的EA为44.85kJ·mol-1，KA为1.02×106，R2为0.9951。再根据引起食品质量下降的主要反应的活化能，可以判断出本试验所研制的TTI可以应用于酶促反应，脂肪氧化等为主要引起食品变质因素的食品中。
3结论
在发现体系的pH值与时间之间(每2h测定1次反应体系的pH值)存在良好的线性关系规律的前提下，以pH值的变化为反应函数，测取了4、10、15、20、25和30℃六个不同温度下的反应速率K，发现反应速率常数很好的遵循了Arrhenius方程，并通过Arrhenius方程，求出体系的动力学参数活化能EA和指数前因子kA。试验表明，碱性脂肪酶时间温度指示反应体系里，pH值可以作为反应函数，用于建立数学模型，求取动力学参数。因此，应用碱性脂肪酶反应体系开发时间温度指示体系具有可行性。
(三)反应体系颜色与时间温度累积效应的对应
1材料与方法
1.1材料同(二)
1.1方法
取5个100mL锥形瓶，往锥形瓶中依次加入39mL pH为10.6的Gly-NaOH(0.05mol·L-1)缓冲溶液、0.2mL混合指示剂、0.7mL 1mol·L-1 CaCl2溶液、9.5mL PVA(20g·L-1)、0.5mL三乙酸甘油酯和0.1mL碱性脂肪酶(1g·L-1)，让酶-底物体系在设定的温度的恒温培养箱中进行反应，根据反应体系的颜色的变化用照相机记录下体系的颜色变化历程。
2结果
2.1反应体系在不同温度条件下的颜色变化
如图8所示，根据色度学上CIE，即国际照明委员会推荐的颜色空间和色度计测定的反应体系颜色参数L*、a*、b*值，在不同的温度条件下，反应体系的L*随时间的变化趋势是一致的，都是逐渐增大的，即反应体系的颜色是逐渐变亮的，反应液变明。a*值的变化有转折点，在反应前期呈现由小到大的趋势，然后在变小(见图9)，这说明随着反应的进行，反应液呈现淡红-红-淡红的趋势。b*值随时间的变化呈现增大的趋势(见图10)，即随着反应的进行，反应液先呈现蓝色，后期由蓝色到黄色。由于反应体系在不同温度条件下，其反应的速度是随温度上升而加快，故随温度的上升，L*、a*和b*的变化也在加快。
2.2反应体系在不同温度条件下的颜色
由图11至图16可以看出，将在反应体系在不同温度下反应，反应体系的颜色变化趋势是一致的，呈现深紫色-紫色-深粉红-粉红-淡粉红-酒红色-橙黄色-黄色的变化趋势。且在4、10和15℃的反应温度下，反应体系的颜色停留在淡粉色的阶段，只有当温度到达20℃以上时，反应体系才会出现酒红色、橙黄色、黄色，其中酒红色：明度值L*为48.2～51.3；红色度a*值为31.3～35.6；黄度值b*为15.4～17.2；对应反应时间和反应温度为20℃，26～34小时；25℃，15～20小时；或者30℃，10～13小时；
橙黄色：明度值L*为56.0～57.8；红色度a*值为11.5～12.9；黄度值b*为28.3～29.7；对应反应时间和反应温度为20℃，48～56小时；25℃，24～28小时；或者30℃，20～22小时；
黄色：明度值L*为60.9～63.1；红色度a*值为-2.0～-0.9；黄度值b*为40.8～43.2；对应反应时间和反应温度为20℃，96～105小时；25℃，52～60小时；或者30℃，44～50小时。
从不同温度下反应体系的颜色变化图可以看出，在反应的起始阶段，反应体系的颜色变化比较快，而随着反应的进行颜色的变化逐渐减慢。
3结论
本试验研制的碱性脂肪酶时间温度指示反应体系的颜色是不断变化的，实际使用时，将本发明碱性脂肪酶型时间温度指示方法所述反应体系做成时间-温度指示产品置于对温度敏感的物品的外包装上，那么时间-温度指示产品与物品将经历的相同的全部温度时间变化，对照颜色比色卡就能知道物品的所经历的时间和温度变化，并还可以将反应体系颜色值做成标准颜色比色卡配套使用。它可以连续地指示时间和温度，不断地给消费者和管理者提供产品的信息。
Claims (4)
1、碱性脂肪酶型时间温度指示方法，其特征在于：
1)配制反应体系
反应体系总体积为50mL，包括：浓度为1g·L-1的碱性脂肪酶溶液0.1mL；反应底物三乙酸甘油酯0.5mL；浓度为20g·L-1的乳化剂PVA9.5mL；浓度为1mol·L-1的CaCl2溶液0.7mL；浓度为0.05mol·L-1、pH 10.6的Gly-NaOH缓冲溶液39mL；0.2mL酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液作为反应的指示剂，其中酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液配制方法为称取0.1g酚红、0.5g酚酞和0.2g百里酚酞，溶于100mL的体积比60％的乙醇中，过滤，常温下保存；
2)根据反应体系反应颜色参数判断反应时间和反应温度累计效应
反应体系开始反应后，根据色度学上CIE，即国际照明委员会推荐的颜色空间和色度计测定的反应体系颜色参数L*、a*、b*值，判断确定反应时间和反应温度累计效应。
2、根据权利要求1所述碱性脂肪酶型时间温度指示方法，其特征在于，
反应体系开始反应后，根据色度学上CIE，即国际照明委员会推荐的颜色空间和色度计测定的反应体系颜色参数L*、a*、b*值，判断确定其与反应时间和反应温度累计效应对应关系为，
反应体系出现酒红色：明度值L*为48.2～51.3；红色度a*值为31.3～35.6；黄度值b*为15.4～17.2；对应反应时间和反应温度为20℃和26～34小时；25℃和15～20小时；或者30℃和10～13小时；
反应体系出现橙黄色：明度值L*为56.0～57.8；红色度a*值为11.5～12.9；黄度值b*为28.3～29.7；对应反应时间和反应温度为20℃和48～56小时；25℃和24～28小时；或者30℃和20～22小时；
反应体系出现黄色：明度值L*为60.9～63.1；红色度a*值为-2.0～-0.9；黄度值b*为40.8～43.2；对应反应时间和反应温度为20℃和96～105小时；25℃和52～60小时；或者30℃和44～50小时。
3、根据权利要求1或2所述碱性脂肪酶型时间温度指示方法所制作的酶型时间温度指示产品。
4、根据权利要求1或2所述碱性脂肪酶型时间温度指示方法所制作的酶型时间温度标准比色产品。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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