CN101347625A - 核磁共振血栓靶向对比剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核磁共振血栓靶向对比剂及其制备方法，该对比剂是由抗人P－选择素凝集素－表皮生长因子功能域单克隆抗体(PsL－EGFmAb)与二乙三胺五乙酸钆(Gd－DTPA)－血清白蛋白偶联成的大分子多聚体。该对比剂中一分子单抗可带有70～100个Gd3+。本发明靶向对比剂可特异性聚集于血栓局部，实现靶向显影，其血栓信号值较普通对比剂增强成像出现早、且增强效果更为明显，可用于血栓形成的早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种核磁共振靶向对比剂，特别涉及一种基于单克隆抗体的核磁共振血栓靶向对比剂及其制备方法。
背景技术
血栓性疾病是一种严重危害人类生命和健康的血液回流障碍性疾病，包括动脉血栓与静脉血栓性疾病，涉及临床各科尤见心、脑血管血栓性栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞的并发症以及外周动脉闭塞性疾病，且发病率、死亡率与致残率均高。
目前临床上对于血栓性疾病的影像诊断主要依赖于血管造影、多普勒超声、放射性核素血管造影等技术。但是上述技术存在需注入造影剂、放射性核素或者假阳性率高等缺点，且当血栓得到确诊时患者一般均已出现临床症状，或者不可逆的器质性改变。而核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)是一种完全无创的影像学诊断方法，但核磁共振(MR)检查血栓采用普通对比剂如顺磁性对比剂二乙三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)等，不能使早期血栓得到特异性增强。因此，血栓的早期诊断受到限制，以至不易掌握最佳溶栓的治疗时间，进而影响其治疗效果，总之目前尚缺乏血栓早期特异诊断方法。
现有研究证实，P-选择素参与免疫炎症损伤、血栓形成及肿瘤转移等多种病理生理过程。在本申请人的专利号为ZL 200310108522.5的中国专利中，公开了针对P-选择素lectin-EGF(L-EGF)功能域的鼠源单克隆抗体(PsL-EGFmAb)及其制备方法(包括杂交瘤细胞)和应用。试验数据表明PsL-EGF mAb较P-选择素全长单抗更具有抗黏附/抗炎靶向抑制效应。之后，本申请人又成功地制得针对该功能域的人源单抗(参见申请号为CN20061的专利申请)。为进一步研究抗PsL-EGF功能域单抗在诊断和治疗血栓性疾病中的应用提供了基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题即是提供一种基于PsL-EGFmAb的核磁共振血栓靶向对比剂及其制备方法。
本发明人选用目前应用最广泛的MR对比剂Gd-DTPA进行研究，其是一种顺磁性T1加权阳性对比剂(结构式如下式I所示)，具有亲水性、分子量小的特点，注入血管后迅速向周围组织间隙分布，由肾脏排泄，即使肾功能有损害，它也能经肾排除。Gd-DTPA不具有组织或器官的选择性，故如果要作为靶向的对比剂，即需要连接特异性的抗体。
本发明人经研究发现，由于DTPA(分子质量393.36)结合数量增加对抗体具有一定的空间位阻效应，经DTPA修饰的抗体免疫活性随着DTPA结合量的增加而降低，当DTPA连接数量＞30个后，其免疫活性较单抗的免疫活性下降程度显著。而Gd-DTPA的连接数量又直接决定了对比剂的对比度，当Gd-DTPA连接数量＜30个后，其相对对比度已经很低不能达到肉眼明显区分的目的。使用Gd-DTPA直接连接抗体不能同时满足具备相应的免疫结合力和MR成像对比度的要求，并非最佳的对比剂结合方式。本发明人经过进一步的研究发现，将PsL-EGFmAb通过大分子物质如血清白蛋白，特别是牛血清白蛋白(BSA)与含顺磁性物质Gd-DTPA连接，制备了具有P-选择素靶特异性的核磁共振对比剂(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb，进行了体外MR成像结果显示，该对比剂可明显增强模拟血小板血栓及全血血栓的MR成像信号，同时亦能增强离体受损血管内膜的成像信号。在此基础上，本发明人制备了犬股静脉血栓模型，利用(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb进行体内活体MR分子成像，结果表明该对比剂可早期显影和定位血栓，且能明显提高血栓的MR信号强度和信噪比。
因此，本发明提供的一种核磁共振血栓靶向对比剂，其是由抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域单克隆抗体与二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白偶联而成的大分子多聚体。
根据本发明，所述的二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白优选二乙三胺五乙酸钆-牛血清白蛋白，得到的对比剂为(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb，其中n＝70～100。本发明利用BSA放大系统，可使一分子多聚体对比剂、即一分子PsL-EGFmAb上载带有70～100个Gd3+时，可增强对比剂效果，并保持了单抗较佳的免疫结合力。
本发明还提供一种上述核磁共振血栓靶向对比剂的制备方法，其包括将PsL-EGFmAb溶解在pH＝9.6、0.1mol/L的NaHCO3/Na2CO3缓冲液中，然后加入EDC(偶联剂)和二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白，在室温下搅拌反应24～30hr后，利用Sepharose CL-4B层析柱除去未反应的抗体。
根据本发明，所述的二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白优选二乙三胺五乙酸钆-牛血清白蛋白(Gd-DTPA-BSA)。
所述的Gd-DTPA-BSA可以根据现有技术(如文献Ogan MD，Schmiedl U，Moseley ME，et al.Albumin labeled with Gd-DTPA.An intravascularcontrast-enhancing agent for magnetic resonance blood pool imaging：preparationand characterization.Invest Radiol，1987，22(8)：665-71.)制备。
本发明具体采用的制备方法，可以包括下列步骤：
①将BSA溶于pH＝9.6、0.1mol/L的NaHCO3/Na2CO3缓冲液中，在冰浴中加入DTPA双酸酐溶液，其中BSA∶DTPA双酸酐的摩尔比＝1∶50，室温下再搅拌反应20hr后结束反应，除去未反应的BSA，减压浓缩，得到DTPA-BSA；
②在步骤①经过减压浓缩的DTPA-BSA溶液中加入GdCl3溶液，其中Gd3+与DTPA-BSA中连接的DTPA等摩尔，然后在室温下再搅拌反应24～30hr后，去除未反应的Gd3+，得到Gd-DTPA-BSA。
较佳地，根据本发明上述制备方法制得的Gd-DTPA-BSA中，一分子BSA上载带有20～30个Gd3+。
根据本发明，所述的PsL-EGFmAb可以是ZL 200310108522.5中公开的由保藏号为CCTCC-C2003012的杂交瘤细胞株产生的鼠源单抗，也可以是本申请人在2006年11月17日递交的申请号为CN200610118483.0的专利申请中所述的由保藏号为CCTCC NO：C200634的杂交瘤细胞株产生的人源单抗。这些针对P-选择素lectin-EGF功能域的单克隆抗体，较全长单抗具有较小的分子量和较低的免疫原性及更强的靶向性等优点。因此本发明将其通过BSA与Gd-DTPA相连接，利用单抗与P-选择素的高亲和力结合特性实现靶向显影，并利用BSA等血清白蛋白的氨基反应可连接多个Gd3+离子和抗体，以提高结合率，使靶组织局部处于Gd3+离子较高浓度状态，从而增强对比剂效果。
从实验结果看，合成的大分子多聚体在免疫活性测定中，具有与抗体相似的免疫活性曲线，说明该多聚体具有与P-选择素高亲和力结合的特性。每分子多聚体载有70-100个Gd3+离子，使核磁共振的信号得到增强。
在进一步的犬股静脉血栓模型的实验中，本发明血栓靶向对比剂特异性聚集于血栓局部，实现MR靶向显影。从实验结果看，血栓信号值在注射本发明核磁共振血栓靶向对比剂后，较普通对比剂增强成像出现早且增强效果更为明显。
本发明核磁共振血栓靶向对比剂选择有效磁矩高的Gd3+作为顺磁中心，且与大分子偶联提高配合物旋转相关时间，两者都能提高其驰豫率。它在体内的有效期内为稳定的配合物，不易出现金属离子Gd3+和稀土离子的置换效应，减低了对比剂的毒副作用。又因为其是大分子物质，故在体内代谢较慢，有充分的时间可以与靶点结合。所以可以考虑将本发明对比剂作为一种MRI诊断各类血栓性疾病的靶向对比剂。此外由于本发明的抗P-选择素lectin-EGF功能域的单克隆抗体同时具有抑制靶分子表达效应，故除了可应用为诊断试剂，尚具有抗黏附治疗作用，可以早期干预血栓的形成并影响疾病的转归。
附图说明
图1为本发明核磁共振血栓靶向对比剂(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb的免疫活性测定，结果得到与原单抗PsL-EGFmAb类似的竞争性曲线。
图2显示犬股静脉血栓体内靶向对比剂增强MR成像，本发明靶向对比剂可以增强血栓成像；其中，A、B、C分别为注入Gd-DTPA后0.5hr、1hr、3hr，D、E、F分别为注入本发明靶向对比剂后0.5hr、1hr、3hr。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1
①DTPA-BSA制备
称量BSA(分子质量67000，Sigma化学公司)50mg，溶解于2.5ml的0.2mol/L NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH＝9.6)中，在冰浴中边不停地搅拌边加入DTPA双酸酐(CaDTPA)溶液(复旦大学放射药学研究所)，其中BSA∶CaDTPA＝1∶50(摩尔比)，室温下再搅拌反应20hr后结束反应。取出反应混合液，用SephadexG-25柱(Sigma化学公司)，0.01mol/L PBS，pH7.4缓冲液洗脱纯化，溶液经过减压浓缩后用于后续实验。
②Gd-DTPA-BSA制备
加入GdCl3溶液(分析纯，Sigma化学公司)到上述经过减压浓缩的DTPA-BSA溶液中，其中Gd3+与DTPA-BSA中连接的DTPA等摩尔，然后在室温下再搅拌反应24～30hr后，用Sephadex-25柱，0.01mol/L PBS，pH7.4缓冲液洗脱纯化除去游离的Gd3+。
③(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb制备(单抗与Gd-DTPA-BSA的偶联)
将PsL-EGFmAb(由保藏号为CCTCC-C2003012的杂交瘤细胞株产生的单抗)(10mg/5ml)溶解在0.1mol/L NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH＝9.6)，然后加人EDC(2mg/200ul)(碳化二亚胺，分析纯，Sigma化学公司产品)和Gd-DTPA-BSA(8mg/2ml)，在室温下再搅拌反应24～30hr后，用SepharoseCL-4B层析柱(1×25cm，Sigma化学公司)除去没连接上的单抗(0.01mol/LPBS，pH7.4缓冲液)，收集单抗与Gd-DTPA-BSA的连接体，经0.2um针式滤器(上海安谱科学仪器有限公司)除菌过滤后冷冻浓缩，4℃保存。
(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb体外表征：
1)Gd3+含量测定：采用高频电感藕合等离子体发射光谱法(ICP-AES)测量。计算所得到的每分子Gd-DTPA-BSA中Gd3+含量在20～30个范围内；每个抗体大约连接有70-100个Gd3+。本发明对比剂的分子量为30,000～50,000道尔顿。
2)大分子的纯度测定：使用高效液相色谱(HPLC)分析，显示其纯度＞98％。
3)活性测定：采用竞争性ELISA检测方法证明本发明核磁共振血栓靶向对比剂(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb的活性。具体步骤为：P-选择素标准蛋白(R&D公司)0.1ug/ml，100ul/孔包被，包被液用0.01mol/L PBS(pH＝7.4)，4℃过夜放置后甩干；用1％BSA在37℃ 30min封闭后，300ul/孔洗涤液洗涤、甩干3次；加入100ul/孔的不同量抗体(PsL-EGFmAb)或相应本发明对比剂后，再加入100ul/孔生物素Biotin标记的抗体(PsL-EGFmAb)进行抗体竞争结合反应(Biotin标记各相应抗体取自复旦大学放射药学研究所)；37℃放置1hr后取出，300ul/孔洗涤液洗涤、甩干3次；加入100ul/孔Avidin-HRPO(生物素-辣根过氧化物酶，Sigma)(1∶2000稀释)，37℃恒温下放置60分钟后，用300ul/孔洗涤液洗涤、甩干3次；加入100ul/孔ABTS显色液，室温下发色20min或更长时间，在波长λ＝405nm情况下，测量每孔的OD值。结果如图1所示，本发明对比剂可得到与单抗未连接前类似的竞争曲线，说明靶向对比剂通过大分子连接的方式，可以连接70-100个Gd-DTPA而基本不影响单抗的免疫活性，即保持了单抗与P-选择素的高亲和力结合的特性。
试验实施例1本发明核磁共振血栓靶向对比剂对犬静脉血栓的体内增强试验
1)犬静脉血栓模型的制备
家犬适应性饲养后，随机分为实验组和对照组。家犬称重麻醉(0.3％戊巴比妥钠腹腔注射，1ml/kg体重)后，固定、备皮、消毒，于腹股沟区沿股动、静脉走行切开皮肤8cm左右，钝性分离皮下及肌肉组织，充分暴露股静脉，于静脉两端放置动脉夹后切开股静脉，向心方向采用表面刮出毛刺心脏导管(新洁尔灭浸泡消毒)反复抽拉，使静脉血管内膜充分损伤。然后取出导管，使用显微手术器械缝合股静脉，去除两端动脉夹，使血液恢复流动。经观察，犬静脉血栓模型均在造模后1天即出现肉眼可见的静脉血栓，2～3天后血栓逐渐纤维机化。
2)犬静脉血栓MR成像
于造模后尚未除去动脉夹恢复血流前，实验组犬静脉损伤局部注射本发明磁共振血栓靶向对比剂(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb(1.5mg/ml)600ul，对照组注射相同Gd浓度的Gd-DTPA(马根维显，469mg/ml，Schering公司，用PBS稀释)600ul，20min后除去动脉夹，使血流通畅，创面开放，便于观察血栓形成状况。将实验犬下肢采用绷带和胶布固定于木板上，分别在注射后30min、1hr、3hr进行MRT1W1增强成像。线圈与犬下肢表面平行，3平面定位扫描：TE＝20ms，TR＝500ms，FOV＝12cm×12cm，256×256像素分辨率，3mm层厚，垂直3个方向共15层；标本的横截面与纵截面FSE T1WI(TE＝minimums，TR＝500ms)扫描：FOV 6cm×6m，314×256像素分辨率，1mm层厚，0mm间隔，NEX＝3。
结果发现，实验组犬在注入(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb 30min后进行MR成像，可以看到股静脉血管周围信号增强，高于周围肌肉信号(如图2的D所示)，而对照组则无血管周围信号增强(如图2的A所示)；1hr后实验组股静脉MR成像可看到血栓增强信号，高于周围肌肉信号(如图2的E所示)，而对照组则可以观察到股静脉中有低于肌肉信号的血栓信号(如图2的B所示)；3hr后的MR增强成像，可以看到实验组的血栓范围增大(如图2的F所示)，而对照组血栓因纤维蛋白沉积等原因，信号较之前增强(如图2的C所示)。
可见，本发明对比剂可早期显影和定位血栓，且能明显提高血栓的MR信号强度和信噪比，为早期诊断血栓性疾病提供了一种可行的方法。
Claims (6)
1、一种核磁共振血栓靶向对比剂，其是由抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域单克隆抗体与二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白偶联而成。
2、如权利要求1所述的核磁共振血栓靶向对比剂，其特征在于所述的二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白为二乙三胺五乙酸钆-牛血清白蛋白，得到的对比剂为(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb，其中n＝70～100。
3、一种如权利要求1所述的核磁共振血栓靶向对比剂的制备方法，其包括将抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域单克隆抗体PsL-EGFmAb溶解在pH＝9.6、0.1mol/L的NaHCO3/Na2CO3缓冲液中，然后加入EDC和二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白，在室温下搅拌反应24～30hr后，利用SepharoseCL-4B层析柱除去未反应的抗体。
4、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白为二乙三胺五乙酸钆-牛血清白蛋白Gd-DTPA-BSA。
5、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于在所述的Gd-DTPA-BSA中一分子BSA上带有20～30个Gd离子。
6、如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的Gd-DTPA-BSA的制备方法包括下列步骤：
①将BSA溶于pH＝9.6、0.1mol/L的NaHCO3/Na2CO3缓冲液中，在冰浴中加入DTPA双酸酐溶液，其中BSA∶DTPA双酸酐的摩尔比＝1∶50，室温下再搅拌反应20hr后结束反应，除去未反应的BSA，减压浓缩，得到DTPA-BSA；
②在步骤①经过减压浓缩的DTPA-BSA溶液中加入GdCl3溶液，其中Gd3+与DTPA-BSA中连接的DTPA等摩尔，然后在室温下再搅拌反应24～30hr后，去除未反应的Gd3+，得到Gd-DTPA-BSA。
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