CN101347615A - 稳定神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了钙依赖蛋白酶Calpain或其激动剂或拮抗剂在制备调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体(AchR)聚集物稳定性方面的用途。本发明还公开了利用钙依赖蛋白酶Calpain筛选调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂的方法。

Description

稳定神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的方法。

背景技术

神经肌肉接头形成于运动神经元和肌肉纤维之间。AChR在突触后膜上形成聚集体，以保证有效的、精确的突触传递。AChR形成聚集体的过程是一个动态的过程，新形成的被运动神经末梢支配的AChR聚集体能被运动神经元分泌的一种糖蛋白一聚集素Agrin以及肌细胞自己合成的与AChR结合的蛋白-偶联蛋白Rapsyn所稳定。同时，运动神经元也释放负向调节的因子来消散没有被神经支配的AChR聚集体，从而优化突触后结构。遗传学的证表明，ACh可能就是这样一种负向调节因子。在缺乏乙酰胆碱转移酶-ChAT(一种ACh合成的关键酶)的突变小鼠中发现AChR聚集物体变大，同时与Agrin敲除的突变小鼠相比，在Agrin和ChAT双敲除的突变小鼠中，更多的AChR聚集体保留下来没有被消散。正向和负向因子的协同作用对于神经末梢与突触后结构的精确匹配是非常重要的。

现在有研究显示一种细胞内的丝氨酸/苏氨酸激酶Cdk5可能是AChR聚集物消散和优化过程中的效应分子。ACh能够激活Cdk5。遗传上敲除Cdk5基因或者用药理学的方法抑制Cdk5的活性能增加体外培养肌肉细胞形成的AChR聚集体的大小并改善Agrin敲除的突变小鼠的表型。ACh引起的消散作用能够被Agrin所拮抗，可能是通过Agrin激活聚集在神经肌肉接头突触后膜上的一种肌肉特异的酪氨酸受体激酶-Musk来实现的。因此，由ACh和Cdk5引起的全局性的抑制作用在局部被Agrin的信号通路所逆转，使得AChR聚集物最终在突触部位稳定下来。Rapsyn一直以来被认为是Agrin引起的AChR聚集体形成和稳定过程中的关键信号分子。然而Rapsyn的效应分子尚不清楚。

因此，本领域还有必要进一步研究神经肌肉接头中AChR聚集体的形成和消散的机制以及其中产生关键作用的一些因子，从而为相关疾病如重症肌无力等的预防或治疗提供有效的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的方法。

在本发明的第一方面，提供钙依赖蛋白酶Calpain或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体(AchR)聚集物稳定性的制剂。

在另一优选例中，所述的钙依赖蛋白酶Calpain的激动剂不包括胆碱能激动剂CCh(卡巴胆碱，carbachol)；和/或所述的钙依赖蛋白酶Calpain的拮抗剂不包括聚集素(agrin)。

在另一优选例中，所述的钙依赖蛋白酶Calpain的拮抗剂用于制备提高乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。

在另一优选例中，所述的提高乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂用于预防或治疗肌肉萎缩或重症肌无力(myasthenia gravis)。

在另一优选例中，所述的钙依赖蛋白酶Calpain或其激动剂用于制备降低乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。

在另一优选例中，所述的钙依赖蛋白酶Calpain的拮抗剂选自：Calpeptin，或Calpastatin(钙依赖蛋白酶抑制蛋白)。

在本发明的第二方面，提供钙依赖蛋白酶Calpain的用途，用于筛选调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。

在本发明的第三方面，提供一种筛选调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的潜在物质的方法，所述方法包括步骤：

(a)将候选物质与含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系接触；

(b)观察候选物质对于钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性的影响；

其中，若所述候选物质可降低钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性，则表明该候选物质是提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质；

若所述候选物质可提高钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性，则表明该候选物质是降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系中；和/或

步骤(b)包括：检测测试组的体系中钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系；

如果测试组钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的潜在物质；如果测试组中钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性在统计学上高于对照组，就表明该候选物是降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的方法还包括：向含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系中加入偶联蛋白Rapsyn，观察候选物质对于钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用的影响；

其中，若所述候选物质可加强(优选显著加强)钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用，则表明该候选物质是提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质；

若所述候选物质可减弱(优选显著减弱)钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用，则表明该候选物质是降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质。

在另一优选例中，所述的钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用是：钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互结合。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系，溶液体系，动物体系，组织体系、或器官体系。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以选出对于调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性有用的制剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.胆碱能激动剂能够激活Calpain。

(A)CCh处理引起Calpain激活。C2C12肌肉细胞系用0.1mM的CCh刺激相应的时间，加或不加20μM的Calpeptin。细胞裂解物中Calpain的活性用Suc-Leu-Tyr-AMC进行测量。对照细胞Calpain的活性值被当作是1.0。数据以平均值±标准误显示(n＝3)。***，代表P＜0.001，是在每一个时间点CCh实验组和CCh+Calpeptin实验组进行比较的结果。

(B)CCh刺激引起肌肉细胞中p25的积累。C2C12肌肉细胞在CCh处理前后，以及0.1mM或1mMCCh刺激不同时间的结果。细胞裂解物(30μg蛋白总量)用免疫印迹的方法显示p35和β-actin的表达量。

(C和D)CCh引起Cdk5的激活依赖于Calpain的激活。C2C12肌肉细胞系在CCh(0.1mM)处理5小时之前先用Calpeptin(20μM)处理2小时。用免疫沉淀方法得到纯化的Cdk5蛋白后，用组蛋白H1作为底物在同位素标记的三磷酸腺苷([γ-³²P]-ATP)存在的情况下检测Cdk5的活性。标准化的Cdk5活性分析总结如图D所示，对照细胞Cdk5的活性被视为1.0。数据以平均值±标准误显示(n＝3；***，代表P＜0.001，t检验)。

图2.抑制Calpain的活性或降低Calpain的表达可以阻止胆碱能激动剂诱导的AChR聚集体的消散过程。

(A)用Calpeptin处理肌肉细胞提高AChR聚集体的稳定性。C2C12肌肉细胞先用Agrin(10ng/ml，12hr)诱导出AChR聚集体，然后转移到没有Agrin的培养基，在有或没有Calpeptin  的情况下加上0.1mM CCh刺激细胞1-3个小时。用R-BTX标出AChR聚集体。图示是来源于一次典型实验的图片，实验重复三次，结果相似。比例尺为50μm

(B和C)统计分析每100μm肌管上5μm以上AChR聚集物的总长度(B)和总个数(C)。Agrin撤去以后DMSO处理细胞后的分析值作为对照。来自于至少三次独立实验的数据以平均值±标准误显示(***，代表P＜0.001，与对照相比，t检验)。统计的肌管数量如下：对照组226个，Calpeptin组198个，CCh组278个，CCh+Calpeptin组233个。

(D)在肌肉细胞中用小干扰RNA下调m-Calpain的表达。原始对照质粒pSUPER-EGFP和编码m-Calpain小干扰RNA序列(CP-siRNA)的质粒转染C2C12肌肉细胞，以β-actin的量作为内参检测细胞裂解物中m-Calpain的水平。

(E)CP-siRNA提高肌肉细胞中AChR聚集体的稳定性。给C2C12成肌细胞转染对照质粒和编码CP-siRNA的质粒，转染12小时以后开始诱导分化。分化好的肌肉细胞经Agrin处理12小时以后，转入无Agrin的培养基，加或不加CCh(0.1mM)刺激1小时。R-BTX标出AChR聚集物。共表达的GFP显示出细胞的形态。

(F)每100μm阳性转染肌管上AChR聚集物的总长度。来自于至少三次独立实验的数据以平均值±标准误显示。每种处理至少分析100个以上的肌管。与Agrin撤去以后的对照细胞相比，***，代表P＜0.001。

图3.Rapsyn与Calpain相互结合。

(A)图示Rapsyn的结构域。

(B)Calpain与Rapsyn相互作用的结构域。数据来自于酵母双杂交，免疫共沉淀(Co-IP)和沉降技术的总结。+，代表有相互作用；-，代表没有相互作用；ND，表示没有进行检测。

(C和E)Calpain的结构域III与Rapsyn的TPR结构域相互结合。共表达了HA标记的Rapsyn和Myc标记的Calpain各种结构域的HEK293细胞的裂解物经过Rapsyn抗体(C)或Myc抗体(E)的免疫沉淀后，用免疫印迹的方法检测相应的蛋白。IgG H，免疫球蛋白G重链；IgG L，免疫球蛋白G轻链；NSP，非特异蛋白。星号代表能够相互作用的条带。

(D)转染了HA标记的Rapsyn的HEK293细胞的裂解物与结合了His标记的Calpain的Ni-NTA金属亲合树脂共孵育。结合的蛋白用HA抗体来检测。

(F)Rapsyn与Calpain的相互作用不受钙离子的调节。用含有5mMEGTA或5mM钙离子的改良RIPA缓冲液来裂解C2C12细胞。细胞裂解物与结合了GST-Rapsyn或GST蛋白的谷胱甘肽偶联球珠一起孵育。球珠上的结合蛋白用Calpain的抗体进行检测。

图4.Rapsyn和Agrin对Calpain活性的调节。

(A)Rapsyn可以抑制大鼠脑裂解物中Calpain的酶活性。大鼠脑裂解物中加入5mM的钙离子能够激活Calpain。通过检测p25的水平进行Calpain的活性分析。实验组中，脑裂解物分别与20μM的Calpeptin，2μg的GST或者2μg的GST-Rapsyn一起反应。

(B)在细胞内Rapsyn能抑制Calpain的活性。用ionomycin处理共表达了myc标记的p35和Rapsyn-EGFP或EGFP蛋白的HEK293细胞1小时。细胞裂解物用相应的抗体进行检测。

(C)siRNA抑制Rapsyn的表达。将HEK293细胞转染HA标记的Rapsyn和EGFP，以及Rapsyn-siRNA233，siRNA270或对照siRNA。细胞裂解物用HA或GFP的抗体进行检测。

(D)siRNA233使肌肉细胞中p25的水平增加。将C2C12肌肉细胞转染对照siRNA或者siRNA-233。分化好的肌管经过0.1mM CCh处理5小时后检测m-Calpain和p25的水平。

(E)Agrin促进肌肉细胞中Rapsyn和Calpain的相互作用。C2C12肌管在有无Agrin(10ng/ml)存在的情况下培养8小时。细胞裂解物用Rapsyn的单抗或者Flag的单抗进行免疫沉淀。得到的免疫复合物用Rapsyn或m-Calpain的抗体进行检测。5％用于免疫沉淀的裂解物用于计算免疫沉淀的效率。在没有Agrin处理的情况下，仅有相当于总量1％的Calpain被Rapsyn沉淀下来，Agrin处理之后，2.5％的Calpain被沉淀下来。因为只有8％的Rapsyn被沉淀下来，所以与Rapsyn结合在一起的m-Calpain总量应该是图上反应的12倍(100/8)，也就是说，在Agrin刺激前后，分别有12％(1％×12)和30％(2.5％×12)的Calpain与Rapsyn结合在一起。柱状图显示定量结果。没有Agrin刺激情况下与Rapsyn结合的Calpain的量被视为1.0。数据以平均值±标准误显示(n＝3)。

(F)Agrin促进Calpain与AChR/Rapsyn复合物的结合。如(E)显示方法对C2C12肌管进行处理，细胞裂解物用AChRα的抗体进行免疫沉淀。检测与AChR结合在一起的Rapsyn和m-Calpain的水平。

(G)Agrin能减少肌肉细胞中p25的积累。C2C12成肌细胞转染了编码siRNA-233的质粒(4列)或者对照质粒(1-3列)，转染12小时后诱导分化。肌管在有无Agrin(10ng/ml)过夜处理的情况下用CCh(0.1mM)刺激5小时。细胞裂解物用相应的抗体进行了检测。

(H)Agrin的预处理可以抑制CCh引起的Calpain活性的升高。C2C12肌管在有无Agrin

(10ng/ml)预处理15分钟的情况下用CCh(0.1mM)刺激30分钟。用Suc-Leu-Tyr-AMC作为底物检测Calpain的活性。数据以平均值±标准误显示(n＝3；***，代表P＜0.001，t检验)。

(I)突触部位和非突触部位p25水平的比较。横隔肌的不同区域被分离出来(SR，代表被神经覆盖的突触部位；NSR，代表远离神经分叉的肌肉边缘区域)。来自于突触部位和非突触部位相同量(100ug)的蛋白样品被用来检测不同蛋白的表达。图下数字标示不同蛋白的相对水平，非突触部位的蛋白水平被视为1.0。p25的水平反应了肌肉不同区域Calpain的相对活性。

图5.阻断Rapsyn-Calpain间的相互作用可以降低AChR聚集的稳定性。

(A)Calpain第三结构域(DIII)能够破坏Calpain和Rapsyn间的相互作用。Rapsyn-GFP单独或与DIII或DIV共同转染C2C12成肌细胞。细胞裂解物用GFP抗体免疫共沉淀后，用图中所示抗体检测。

(B)过量表达DIII促进CCh诱导产生的p25的积累。转染后的C2C12细胞经0.1mM CCh处理5hr。免疫印迹检测内源p25和转染的Calpain片段。

(C、D)Calpain各片段对Agrin诱导产生的AChR聚集的影响。用空载体(pCS2+MT)或DIII或DIV转染C2C12细胞。用10ng/ml Agrin处理12hr诱导形成AChR聚集。C、D分别显示每100μm肌管上AChR聚集的数目和大小。实验中统计分析的肌管数目如下：pCS2：77，DIII：83，DIV：116。(*p＜0.05，**p＜0.01，t检验)。

(E)在roscovitine(Ros)存在与否的情况下，过量表达Calpain各片段对AChR聚集稳定性的影响。C2C12转染与Agrin处理同C、D，随后在撤除Agrin的情况下，用0.1mM CCh或0.1mM CCh及10μM Ros处理2hr。用R-BTX或Myc抗体对上述细胞染色。比例尺：25μm。

(F-I)定量分析Myc阳性的肌管上每100μm肌管上AChR聚集的长度(F、G)和数目(H、I)。统计的细胞数目如下：pCS2+MT：90，Calpain：147，DIII：145，DIV：104.(***p＜0.001，t检验)。

图6.注射Calpain抑制剂可以维持Agrin基因敲除小鼠体内的AChR聚集。

E13.5天起每天向孕鼠腹腔注射Calpeptin(15mg/kg)或DMSO(对照)，连续注射3天，在E16.5天取Agr in基因敲除鼠(AGD-/-，B和D)和同窝对照野生型小鼠(+/+，A和C)，进行全组织染色。绿色指示synaptophysin标记的突触前囊泡，红色指示AChR聚集。选用膈肌腹部左侧区域分析AChR聚集情况。比例尺：100μm。

图7.Agrin基因敲除小鼠AChR聚集的消失能够被过量表达Calpastatin所阻止。

(A)Calpastatin转基因小鼠质粒构建示意图。HSA，人骨骼肌肌动蛋白启动子。

(B)不同发育时期CS Tg小鼠骨骼肌Calpastatin表达情况。免疫印迹检测E14.5至P0期不同发育阶段CS Tg与对照小鼠骨骼肌蛋白。

(C)肌肉特异性表达Calpastatin。等量的不同组织样品用于检测Calpastatin表达的特异性。

(D)CS Tg小鼠p25水平下降。等量的E18.5的CS Tg小鼠及对照小鼠用于检测p25水平。

(E)CS Tg小鼠中Calpain酶活性降低。以m-Calpain作为参照，相对的p25水平反应骨骼肌中Calpain的活性。(mean±SEM，*p＜0.001)F-I.膈肌腹侧AChR聚集及神经末梢的代表性示例。取自E16.5天的对照(+/+[F]，AGD-/-[G]，CS Tg[H]，AGD-/-；CS Tg[I])分别用R-BTX(红色)和synaptophysin抗体(绿色)染色。比例尺：100μm。

图8.实验假说ACh对Cdk5的激活依赖于Calpain。激活Cdk5促使AChR聚集的消散。Agrin加强Rapsyn与Calpain相互作用，从而抑制Calpain活性，进而稳定AChR的聚集。

图9.m-Calpain在神经肌肉接头中的定位。

(A)在成年小鼠的横隔肌肌肉组织切片中用R-BTX标记AChR聚集物(红色)和兔源m-Calpain的抗体显示m-Calpain的分布(绿色)。

(B)用Calpain抗原(GST-m-Calpain，510-700氨基酸)预吸附过的m-Calpain抗体作为阴性对照。比例尺，10μm。

图10.在培养的肌肉细胞中抑制Calpain的活性可以促进AChR聚集体的形成。

(A)Calpeptin  对自发形成以及Agrin诱导形成AChR聚集体的影响。C2C12肌管用20μM Calpeptin或10ng/mlAgrin分别或同时进行处理。R-BTX显示AChR聚集体。图示是来源于一次典型实验的图片，实验重复三次，结果相似。比例尺，50μm。

(B，C)对A所示的自发(B)以及Agrin诱导(C)形成的聚集体的统计分析。数据以平均值±标准误显示，每组样品分析了多于40个视野，实验重复三次(***，代表P＜0.001；**，代表P＜0.01，t检验)。

图11.注射Calpeptin对AGD-/-小鼠横隔肌背侧区域AChR的影响。AGD-/-小鼠从E13.5天开始每天注射一次Calpeptin或者对照DMSO，16.5天时取出横隔肌用synaptophysin的抗体和R-BTX做整体染色。分析横隔肌背侧部分的AChR聚集体和神经分布。

(A)为代表性视野。比例尺，100μm。箭头指示没有被神经支配的AChR聚集。

(B)统计学分析横隔肌背侧相同区域AChR聚集体的数量。数据以平均值±标准误显示(n＝3，**，代表P＜0.01，t检验)。

图12.注射Calpeptin对正常小鼠神经肌肉接头发育的影响。孕鼠从E13.5天开始每天腹腔注射一次Calpeptin或者DMSO。连续注射3天后，E16.5天胎鼠的横隔肌被取出，用synaptophysin的抗体和R-BTX做整体染色(分别是绿色和红色)。值得注意的是，几乎所有AChR聚集体都与synaptophysin标记的神经末梢突触前结构共定位。比例尺，100μm。

图13.注射Calpeptin对早期形成的AChR聚集物的影响。

(A)孕鼠从E10.5天开始每天腹腔注射一次Calpeptin或者对照DMSO。连续注射4天后，E14.5天AGD-/-胎鼠的横隔肌被取出，用synaptophysin的抗体和R-BTX做整体染色。比例尺，50μm。

(B)注射DMSO(对照)或Calpeptin的AGD-/-小鼠的横隔肌的平均终板宽度如图示。

(C)注射DMSO(对照)或Calpeptin  的E14.5天AGD-/-小鼠的横隔肌中不同大小(面积)AChR聚集物的比例。每个横隔肌至少分析了200个聚集体的面积。数据以平均值±标准误显示，不同处理各分析了3只小鼠(n＝3)。

图14.E17.5天Calpastatin转基因小鼠的神经肌肉接头的发育。E17.5天AGD-/-或AGD-/-/CSTg小鼠的横隔肌被取出做整体染色，用synaptophysin的抗体标记神经末梢(绿色)，用R-BTX标记AChR聚集物(红色)。代表性的图示来源于小鼠横隔肌腹侧的相应区域。比例尺，100μm。箭头指示没有被神经支配的AChR聚集体。统计分析见图7J和7K。

图15.Calpastatin转基因小鼠横隔肌背侧区域神经肌肉接头的发育。

(A)E16.5天AGD-/-或AGD-/-/CS Tg小鼠的横隔肌被取出做整体染色，synaptophysin的抗体和R-BTX分别标记神经和AChR聚集体。代表性的图示来源于小鼠横隔肌背侧的相应区域。比例尺，100μm。

(B)对相同区域AChR聚集体数量的统计学分析。数据以平均值±标准误显示，不同类型的小鼠各分析3只(n＝3)，**，代表P＜0.01，t检验。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次发现钙依赖蛋白酶Calpain在神经肌肉接头形成过程中具有调节突触后分化的新功能。调节钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性可调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体(AchR)聚集物的稳定性；并且，偶联蛋白Rapsyn可以通过与Calpain的结合抑制Calpain的活性，因而可通过调节两者的结合程度来调节乙酰胆碱受体聚集物的稳定性。在此基础上完成了本发明。

神经肌肉接头突触发生的过程受到两种相互拮抗作用的调节：其一是聚集素(Agri n)，能诱导乙酰胆碱受体(AChR)聚集物的形成；其二是乙酰胆碱(ACh)，它能使形成好的AChR聚集物消散。两者相互作用的最终结果是使神经肌肉接头的突触后膜聚集了AChR，9而突触以外部分的AChR聚集体被解体。尽管Agrin和ACh的作用已经知道，但是它们相互对抗的分子机制在现有技术中仍然不清楚。本发明人证明了一种钙离子依赖的蛋白酶-Calpain能被AChR激动剂(CCh)激活，且它的激活对于CCh引起的AChR聚集体的消散是必需的。有意思的是，与AChR结合在一起的Agrin的下游信号分子-偶联蛋白Rapsyn也能与Calpain结合，它们之间的相互作用受到Agrin的调节。Rapsyn与Calpain的结合可以抑制Calpain的蛋白酶活性，破坏它们在体外培养肌肉细胞内的结合可以进一步加快CCh诱发的AChR聚集物的消散过程。此外，给Agrin敲除的突变小鼠注射能通过细胞膜的Calpain的蛋白酶抑制剂-Calpeptin，或是通过转基因技术使Agrin敲除的突变小鼠的肌肉组织特异地过表达一种Calpain的内源性抑制剂-Calpastatin均能改善突变小鼠的表型，减少AChR聚集物的消散。这些结果显示Calpain参与了ACh诱导的AChR聚集体的消散过程，Agrin通过Rapsyn抑制Calpain的酶活性来稳定突触部位的AChR聚集物。

钙依赖蛋白酶Calpain及其应用

Calpain是一类存在于细胞内的钙激活半胱氨酸蛋白酶家族，广泛表达于哺乳动物的组织和细胞中。在中枢神经系统中，Calpain参与了一系列生理过程，如长时程可塑性，以及神经病理过程，如脑缺血和阿尔茨海默综合症。从不同的组织中已经确认了很多作为Calpain底物的蛋白分子，p35就是其中之一。P35是Cdk5的一个调节分子，当它被Calpain切成p25之后，能大大提高对Cdk5的活化程度。在海马区域，p25的瞬时表达能够增强长时程可塑性、促进海马区域依赖的记忆，而p25的长时程表达则会导致突触消失和神经元的死亡。然而，在本发明前的现有技术中还没有发现Calpain对于调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的作用。

在本发明中，所用的Calpain可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的Calpain也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组Calpain蛋白。

任何适合的Calpain均可用于本发明。所述的Calpain包括全长Calpain或其生物活性片段。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Calpain的氨基酸序列也包括在本发明中。本发明也可采用经修饰或改良的Calpain，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的Calpain。也就是说，任何不影响Calpain的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

本发明人发现了Calpain在神经肌肉接头形成过程中调节突触后分化的新功能。胆碱能激动剂CCh提高Calpain的活性，导致Cdk5更有效的激活子p25的积累。抑制Calpain的活性能够阻止在体外培养肌肉细胞中CCh对AChR聚集体的消散作用，而且避免Agrin敲除的突变小鼠中AChR聚集体的消散。同时，本发明人还研究了Calpain酶活性的调节机制，发现Rapsyn可以通过与Calpain的结合抑制Calpain的活性。以上工作发现了Ach是AChR聚集体消散的一条重要信号通路，及Rapsyn在调节AChR聚集和神经肌肉接头形成过程中的一个新功能。

基于本发明的新发现，可以利用Calpain来制备调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂，或筛选调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。

优选的是利用Calpain来制备或筛选提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。所述的提高乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂可用于预防或治疗肌肉萎缩或重症肌无力(myasthenia gravis)。

肌肉萎缩是指横纹肌营养不良，肌肉体积较正常缩小，肌纤维变细甚至消失。肌肉营养状况除肌肉组织本身的病理变化外，更与神经系统有密切关系。重症肌无力(myasthenia gravis)是一种神经-肌肉接头部位因乙酰胆硷受体减少而出现传递障碍的自家免疫性疾病。重症肌无力见于任何年龄，约60％在30岁以前发病，女性多见。发病者常伴有胸腺瘤。近年来的遗传学研究、超微结构的研究发现，重症肌无力主要是突触后膜乙酰胆碱受体(AChR)聚集异常病变所致。其病变原因除AChR本身基因突变外，另一类突变是偶联蛋白(Rapsyn)发生突变所致。Rapsyn对于神经肌肉部位突触的形成异常重要，但其作用机理及致病原因始终不明。本发明人的研究首次发现了在体内广泛存在的钙依赖蛋白酶Calpain负向调节AChR的聚集，而Rapsyn可以与Calpain结合，抑制其活性。失去Rapsyn抑制后，Calpain的活性在突触部位异常增高，影响正常的突触发生。因此，用药物手段或基因手段抑制病人体内神经肌肉接头突触部位Calpain的异常活性，为这些疾病的治疗提供了新的途径。

钙依赖蛋白酶Calpain的拮抗剂或激动剂及其用途

由于Calpain的拮抗剂或激动剂可调节Calpain的活性或表达，因此，所述的Calpain的拮抗剂或激动剂也可通过对Calpain的影响来调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物的稳定性，从而达到预防或治疗相关疾病的目的。

所述的Calpain的拮抗剂是指任何可降低Calpain的活性、降低Calpain的稳定性、下调Calpain的表达、减少Calpain有效作用时间、或抑制Calpain的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为可用于提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的物质。例如，所述的Calpain拮抗剂可以是：Calpeptin，或Calpastatin。

所述的Calpain的激动剂是指任何可提高Calpain的活性、维持Calpain的稳定性、促进Calpain表达、延长Calpain有效作用时间、或促进Calpain的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为可用于降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的物质。

优选的是一类可用于提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的物质。

筛选方法

在得知了所述的Calpain的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的物质。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选方法，所述的方法包括：将候选物质与含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系接触；观察候选物质对于钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性的影响；若所述候选物质可降低(优选显著降低，如降低20％或更低；更优选降低40％或更低)钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性，则表明该候选物质是提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质；若所述候选物质可提高(优选显著提高，如提高20％或更高；更优选提高40％或更高)钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性，则表明该候选物质是降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质。

更优选的，可通过设置对照组来观察候选物质对于钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性的影响状况；所述对照组是不添加所述候选物质的含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系。

作为本发明的更优选的方式，所述的方法还包括：向含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系中加入偶联蛋白Rapsyn，观察候选物质对于的钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用的影响；其中，若所述候选物质可加强(优选显著加强，如加强20％或更多；更优选加强40％或更多)钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用，则表明该候选物质是提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质；若所述候选物质可减弱(优选显著减弱，如减弱20％或更多；更优选减弱40％或更多)钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用，则表明该候选物质是降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质。

材料与方法

试剂与抗体

化学合成的小鼠Calpain(m-Calpain)和Rapsyn siRNA双链寡核苷酸片段由上海吉玛制药技术有限公司合成。Rapsyn siRNA针对小鼠cDNA第233和270位核苷酸起始的序列设计。

#233序列为：5’-ATGCTGACTTCCTGCTCGAAA-3’(正向，SEQ ID NO：1)和5’-TTTCGAGCAGGAAGTCAGCAT-3’(反向，SEQ ID NO：2)。

#270序列为：5’-GCGCAGCAATGAGAAGCTATG-3’(正向，SEQ ID NO：3)和5’-CATAGCTTCTCATTGCTGCGC-3’(反向，SEQ ID NO：4)。

m-Calpain siRNA(即CP-siRNA)序列为：5’-GGATGGCGATTTCTGCATC-3’(正向，SEQ ID NO：5)和5’-GATGCAGAAATCGCCA TCC-3’(反向，SEQID NO：6)。

对照siRNA购自Qiagen-Xeragon，其序列与任何已知的哺乳动物基因均不匹配，序列为5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO：7)。

分别以6ST-Rapsyn C末端(aa 354-412)和m-Calpain第4结构域(aa 510-700)为免疫原制备兔抗血清。其他抗体分别购自下述公司：Chemicon(抗β-actin抗体)，Santa Cruz(抗CDK5抗体、抗p35抗体、抗GFP抗体)，BD/Clontech(抗Myc抗体)，和Sigma(抗HA抗体)，Calpain抑制剂Calpeptin购自Calbiochem，R-BTX购自Molecule Probes，Agrin购自R&D，glutathione-sepharose购自AmershamPharmacia，protein A或protein G agarose购自Roche。

质粒

Rapsyn亚克隆入表达载体pEGFP-N1(购自Clontech)。Rapsyn(Genbank登录号NM 009023)不同结构(TPRs(aa 1-320)，coiled-coil(aa 290-360)，RING-H2(aa354-412)；两侧均设置EcoRI酶切位点)分别插入pKH3载体(购自美国佐治亚医学院)形成蛋白N末端带3×HA标签的融合蛋白。小鼠Calpain(m-Calpain，Genbank登录号NM_009794)各结构域(domain III，aa 350-515；domain IV，aa 510-700；两侧均设置了BamHI酶切位点)亚克隆入pCS2+MT(购自美国佐治亚医学院)形成N端带有6×Myc标签的融合蛋白，或者亚克隆入pGEX-2T载体(购自Amersham Pharmacia)形成GST-融合蛋白。HA-Calpain见文章Benetti，R.等(2001)，The death substrateGas2 binds m-Calpain and increases susceptibility to p53-dependent apoptosis.Embo J 20，2702-2714。p35(Genbank登录号NM_009871，两侧分别设置了BamHI/ClaI酶切位点)和Cdk5(Genbank登录号BC052007，两侧分别设置了BamHI/EcoRI酶切位点)从大鼠大脑总RNA经反转录后分别克隆入pCS2+MT和pKH3载体。

细胞培养、转染和生化实验

HEK293和C2C12细胞按常规方法培养(Luo，Z.G.等(2002)，Regulation of AChRclustering by Dishevelled interacting with MuSK and PAK1.Neuron 35，489-505)。细胞按常规磷酸钙法转染或通过常规FuGEGE6转染。用含有蛋白酶抑制剂的改良RIPA缓冲液收集细胞裂解物，在Pull-down实验中，取0.5-1.0mg蛋白与5μg GST融合蛋白反应，经过SDS-PAGE胶分离后，用免疫印迹检测。在免疫共沉淀实验中，0.3-0.5mg蛋白与2.5-3.0μg特异性抗体反应，用40μl Protein A或Protein G-琼脂糖免疫沉淀后经SDS-PAGE胶电泳分离，再用免疫印迹实验检测。

Calpain酶活实验

用Suc-Leu-Tyr-7-氨基-4-甲基香豆素(Suc-Leu-Tyr-AMC)为底物检测Calpain酶活(Chen，M.等(2001)，Bid is cleaved by calpain to an active fragmentin vitro and during myocardial ischemia/reperfusion.J Biol Chem 276，30724-30728)。C2C12肌管用DMSO或0.1mM CCh处理。Calpeptin浓度为20μM，处理时间见后。100μg细胞裂解物与含有80μM的Suc-Leu-Tyr-AMC的反应缓冲液(145mM NaCl，100mM Tris-HCl，pH7.3)混合，室温反应30min。Calpain酶切释放产生的AMC用GENios荧光系统检测(激发光360nm，发射光460nm)。实验至少重复3次。

Calpastatin转基因小鼠构建

人源Calpastatin(GenBank登录号D16217)通过NotI和PacI位点插入到pBSX-HSAvpA(购自美国佐治亚医学院)的HSA启动子下游。HSA-Calpastatin片段经KpnI和NaeI酶切，胶回收后，显微注射进vC57BL/6JxSJL受精卵(购自中科院动物中心)中，随后再转移到假孕受体母鼠子宫。用于载体构建的引物1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGAATCCCACAGAAACCAAGGC-3’(SEQ ID NO：8)，引物2：5’-CCTTAATTAACTAGTCATCTTTTGGCTTGGAAGTTT-3’(SEQ I D NO：9)(该对引物用于克隆人源Calpastatin)。母鼠生育获得Calpastatin转基因小鼠(经PCR及蛋白免疫印迹鉴定)。Calpastatin转基因小鼠(CS Tg)通过PCR方法作基因型鉴定。转基因小鼠在形态学上与野生型小鼠无明显差别。为检测转基因的表达水平，骨骼肌和其他组织在分离缓冲液(改良的RIPA缓冲液，含有1MMDTT及蛋白酶抑制剂)中电动匀浆破碎，150000g超速离心分离上清液。裂解液通过免疫印迹检测Calpastatin表达水平。CS Tg小鼠与AGD-/-小鼠交配产生AGD-/-；CS Tg小鼠。

免疫组织化学肌肉冰冻切片样品或单层培养细胞固定后与相应抗体孵育、洗涤、再与FITC-标记的山羊抗小鼠或抗兔二抗孵育，同时加入四甲基若丹明-α-银环蛇毒素(R-BTX)以标记AChR(Luo，Z.G等(2003)，Implication ofgeranylgeranyltransferase I in synapse formation.Neuron 40，703-717.)。显微图像使用蔡司激光共聚焦显微镜采集。统计分析大于5μm的AChR聚集的数目和总长度。膈肌样品制备及染色参照前述文献。突触神经末梢用突触体素(synaptophysin)标记。AChR聚集用R-BTX标记，一般选用腹部左侧区域采集图像，不同小鼠个体间该区域的解剖学差异较小。有时对背部区域的AChR聚集加以分析。

实施例1胆碱能激动剂CCh能够激活Calpain

Calpain的活性受到钙离子的调节，胆碱能激动剂以及肌肉细胞的去极化能够引起钙离子的升高。本发明人检测了胆碱能激动剂能否调节肌肉细胞中Calpain的活性。

如图1A所示，用一种不易被水解的胆碱能激动剂CCh处理肌肉细胞，不仅能够在肌细胞中诱发钙离子流，同时也升高肌管中Calpain的活性。Calpain活性在CCh刺激15分钟后达到高峰，接着就衰减了。当用一种能通透细胞膜的Calpain抑制剂-Calpeptin  预先处理细胞，CCh引起的Calpain的激活被抑制。这些结果说明胆碱能激动剂能够激活肌细胞中的Calpain。

肌细胞中的Cdk5也能够被CCh激活(Lin，W等，Neurotransmitteracetylcholine negatively regulates neuromuscular synapse formation by aCdk5-dependent mechanism.Neuron 46，569-579，2005)，但如何被激活还不清楚。P35是Cdk5的一个调节分子，同时也是Calpain的一个特异性底物。P35被Calpain蛋白水解后成为p25，p25能够使Cdk5过度激活。本发明人检测了CCh是否调节p25的产生。图1B显示肌管中p25的量在CCh刺激之后增加了。与p25发生变化相反的是p35的水平似乎保持一致，这可能是因为p35的半衰期比较短，新合成的p35能够迅速得到补充。

如果肌细胞预先经过Calpeptin  处理，CCh引起的p25的这种积累能被阻止(图1C，3和4列)，提示Calpain对于p25的积累作用是特异的。为了检测由Calpai n活性引起的p25的积累的功能，本发明人测试抑制Calpain活性的对Cdk5激酶活性的影响。本发明人用组蛋白H1的磷酸化程度指示Cdk5的活性，与先前的报道一致，本发明人用CCh处理也引起了放射性[³²P]标记的组蛋白H1的大量增加(图1C和1D)。有意思的是，CCh引起的Cdk5的激活能够被Calpeptin  抑制(图1C和1D)，提示Calpain介导CCh对Cdk5的激活。

实施例2抑制Calpain的活性可以提高AChR聚集物的稳定性

进一步，本发明人检测Calpain是否参与胆碱能激动剂诱发的AChR聚集体的消散过程。体外培养的肌细胞先经过Agrin处理诱导出AChR聚集体，然后转移到没有Agrin的培养基，在有或者没有Calpeptin处理的情况下加上CCh刺激。单独CCh的刺激能够促进AChR聚集物的解聚，使得单位长度肌管的AChR聚集体的总长度变短以及总个数变少(图2A，2B和2C)。由CCh引起的AChR聚集体的减少在Calpeptin处理过的细胞中得到改善(图2B和2C)，提示Calpain参与了胆碱能激动剂诱发的AChR聚集体的消散过程。

了进一步了解Calpain对于AChR聚集的调节作用，本发明人使用小干扰RNA的策略抑制内源性Calpain的表达。因为体外培养肌肉细胞和肌肉组织主要表达m-Calpain而不是μ-Calpain，因此本发明人筛选了一些小干扰RNA序列，发现序列Calpain-siRNA(CP-siRNA)可以有效的抑制内源m-Calpain的表达(图2D示)。与用Calpeptin处理肌肉细胞一致的是，CP-siRNA也能够抑制CCh引起的AChR聚集体的消散过程(图2E和2F)。这些结果表明Calpain参与了胆碱能激动剂诱发的AChR聚集体的消散过程。

实施例3Rapsyn能够与Calpain相互结合

当在酵母双杂交体系中用Rapsyn作为钓饵去寻找它的结合蛋白时，本发明人找到了m-Calpain的大亚基。M-Calpain由两个亚基组成：一个独特的80KD大小的大亚基，以及一个与μ-Calpain共享的28KD大小的小亚基。大亚基本身也包含四个结构域：氮端的一个短小的结构域(结构域I)，一个具有酶催化活性的结构域(结构域II)，一个调节酶活性的结构域(结构域III)以及一个包含EF手性结构的能结合钙离子的结构域(结构域IV)。最初从酵母中筛选出来的克隆包含266氨基酸序列(相当于m-Calpain本身氨基酸序列的435-700氨基酸序列)，包含了结构域IV和部分结构域III，提示与Rapsyn结合的区域可能就在结构域III和结构域IV中(图3B)。为了描绘出m-Calpain与Rapsyn结合的区域，本发明人在人源胚胎肾细胞293细胞系(HEK293)中共表达了HA标记的全长Rapsyn和Myc标记的m-Calpain结构域III或者m-Calpain结构域IV。对Rapsyn进行免疫沉淀导致m-Calpain结构域III而不是结构域IV的免疫共沉淀，因此Rapsyn结合的区域在m-Calpain的结构域III中，而不是结构域IV当中(图3C)。

Rapsyn本身也包含好几个结构域：七个tetratricopeptide重复的区域(TPR)介导Rapsyn分子之间的自我结合，一个coiled-coil的结构域介导与AChR的结合，以及一个RING结构域介导与β-肌营养不良多聚糖(β-dystroglycan)的相互作用(图3A)。为了了解Rapsyn的哪些区域介导与Calpain的相互作用，一系列编码Rapsyn不同区域的质粒被构建并表达在HEK293细胞中。细胞裂解物与偶联了His标记的m-Calpain的珠子(beads)一起孵育。本发明人发现包含有TPR结构域的片段，如全长Rapsyn片段以及包含Rapsyn1-320氨基酸的片段，能够结合m-Calpain(图3D)，而包含coiled-coil结构域或者RING结构域的片段不能结合。以上结果提示，Rapsyn中的TPR结构域介导与Calpain的相互作用。在免疫共沉淀实验中本发明人也得到了相同的结论(图3E)。图3B总结了Calpain与Rapsyn的相互作用以及结合区域的定位。此外，Rapsyn和Calpain的相互作用不受钙离子的调节，因为在实验过程中螯合钙离子或者额外加入钙离子都不能改变它们的相互作用(图3F)。

实施例4Rapsyn抑制Calpain的活性

Calpain的蛋白酶活性可以通过结构域III与钙离子、磷脂或调节蛋白的结合而受到调节。在了解Rapsyn可以和Calpain结构域III结合之后，本发明人推测Rapsyn可能通过与结构域III的结合来调节Calpain的活性。为了检测这一可能性，本发明人用Calpain特异性的底物p35降解成p25作为Calpain活性的指示，在有无GST-Rapsyn融合蛋白的情况下，分析了大鼠脑裂解物中Calpain的酶活性。Calpain能够被钙离子激活，进而促进p35降解成p25(图4A示，2列)。P35降解成p25的过程可以被Calpeptin  抑制，显示这个降解过程是Calpai n特异的(图4A，4列)。结果显示，与GST对照相比，GST-Rapsyn融合蛋白显著抑制p35的降解和p25的积累(图4A，3列)，提示Rapsyn可能抑制Calpain的活性。为了检测在细胞内Rapsyn是否也能调节Calpain的活性，Myc标记的p35和Rapsyn-EGFP或EGFP共表达于HEK293细胞中(图4B)。转染后的细胞用ionomycin处理，ionomycin是一种钙离子载体，能够使细胞通透钙离子从而激活Calpain。Ionomycin处理表达EGFP的对照细胞能造成p35的剪切和p25的积累(图4B，2列)，而处理表达Rapsyn-EGFP的细胞则不能导致p25的积累。为了进一步了解在肌肉细胞中Rapsyn是否调节Calpain活性的，本发明人采用小干扰RNA的策略。本发明人设计了两段小干扰RNA(Rapsyn-siRNA#233和#270)将它们转入HEK293细胞中。

如图4C和4G所示，与对照siRNA相比，只有si-RNA-233能够抑制HEK293细胞中外源Rapsyn及肌肉细胞系内源Rapsyn的表达，而si-RNA-270几乎没有抑制效果，因此在下面的实验中本发明人通常采用si-RNA-233来抑制Rapsyn的表达。肌肉细胞中siRNA-233的表达并不会影响Calpain的表达，但提高肌肉细胞中p25的水平(图4D)。与Rapsyn体外能抑制Calpain活性的结论一致的是，在肌肉细胞内抑制内源Rapsyn的表达可以提高Calpain的活性。

实施例5在肌肉细胞中Agrin能够抑制Calpain的活性

既然Rapsyn对于AChR聚集的过程是必需的，那么Agrin是否调节Rapsyn和Calpain之间的相互作用？为了回答这个问题本发明人采取了一系列策略。首先，本发明人用免疫沉淀的方法分别检测Agrin刺激前后的肌肉细胞中内源Rapsyn和Calpain的相互作用情况(图4E)。用Rapsyn的单抗对Rapsyn进行免疫沉淀可以导致Calpain的免疫共沉淀(图4E，3列)。与此相反的是，用对照抗体(Flag)或者不加抗体的情况下进行免疫共沉淀不能检测到Calpain(图4E，1和2列)，显示Rapsyn和Calpain之间相互作用的特异性。肌肉细胞经Agrin处理后，Rapsyn和Calpain之间的相互作用增加到Agrin处理之前的2.5倍(图4E，柱状图)。统计结果显示，在Agrin处理前，肌肉细胞中有12％的Calpain与Rapsyn结合在一起，而Agrin处理之后，与Rapsyn结合的Calpain的量增加到了30％。因为Rapsyn能与AChR结合，而且Agrin能够促进它们之间的相互作用，本发明人猜测Calpain也在AChR的复合物中。如图4F所示，用AChR的α亚基的抗体(即AChRα)进行免疫沉淀可以导致Rapsyn以及m-Calpain的免疫共沉淀。同样，Agrin的刺激可以增加AChR与m-Calpain之间以及AChR与Rapsyn之间的相互作用(图4F，4和6列)。它们之间的相互作用也是特异的，因为用对照抗体进行的免疫沉淀实验没有得到类似结果(图4F，3和5列)。与m-Calpain存在于Rapsyn和AChR形成的复合物的结果一致的是，在肌肉组织切片的观察中本发明人发现m-Calpain存在神经肌肉接头中，与AChR聚集体共定位(图9)。

Agrin能够调节Rapsyn和Calpain之间相互作用的结果提示Agrin可能也调节肌肉细胞中Calpain的活性。本发明人发现，当肌肉细胞用Agrin预处理后，CCh引起的p25的积累减少(图4G，1-3列)，显示Agrin对Calpain活性的抑制作用。Agrin对Calpain的抑制作用依赖于Rapsyn，因为在肌肉细胞中下调Rapsyn的表达能够防止Agri n对CCh引起p25积累的抑制作用(图4G，4列)。此外，CCh引起的Calpain活性的升高同样能被Agrin抑制(图4H)。以上结果提示Agrin可能通过促进Rapsyn和Calpain之间的相互作来抑制Calpain的活性。为了进一步探索体内Calpain活性的调节机制，本发明人同样以p25的水平比较骨骼肌组织中突触部位和非突触部位(图4I左示)Calpain活性的不同。如图4I所示，突触部位(SR)Rapsyn和AChRα的水平远远高于非突触部位(NSR)，而m-Calpain的水平在突触部位和非突触部位没有明显差异。μ-Calpain的表达在横隔肌组织中很少。有趣的是，p25在突触部位的量仅仅是非突触部位的60％(图4I右)，提示在神经肌肉接头局部Calpain的活性被Agrin和Rapsyn所抑制。

实施例6阻断Calpain和Rapsyn的相互作用可增强Calpain活性，促进CCh诱导的AChR消散

通过破坏Calpain和Rapsyn在肌肉细胞内的相互作用，可以验证这种相互作用对AChR聚集的影响。Calpain的第三结构域可以竞争性地与Rapsyn结合，阻断后者与内源性的Calpain的相互作用，从而解除Rapsyn对Calpain活性的抑制。如图5所示，在过量表达Myc-DIII的肌肉细胞里，与Rapsyn共沉淀的Calpain的数量减少，而CCh诱导产生的p25的量却增加。相反，由于不能破坏Rapsyn和Calpain的相互作用，过量表达Myc-DIV对p25的产生没有影响(图5B)。为确定Rapsyn和Calpain的相互作用是否调节AChR的聚集，本发明人在C2C12细胞系中过量表达野生型Calpain及其各个结构域蛋白。如图5C和5D所示，过量表达Myc-DIII的细胞里AChR聚集体的数量及总长度均显著降低，过量表达Myc-DIV则无此效果，意味着Calpain参与调节Agrin诱导的AChR聚集。

为研究Calpain对AChR聚集稳定性的影响，上述转染的细胞先用Agrin诱导形成AChR聚集，再用CCh处理以促使AChR聚集的消散。如图5F、5G所示，类似于过量表达Calpain，过量表达DIII而不是DIV可以促使CCh诱导的AChR聚集的消散，意味着破坏Rapsyn和Calpain的相互作用可以促进乙酰胆碱诱导的消散作用。过量表达Calpain对AChR聚集稳定性的影响与其对AChR聚集形成的影响是一致的。引人注目的是，Calpain及DIII对AChR聚集的消散作用能够被Cdk5的抑制剂roscovitine(Ros)所阻止(图5G、5I)。上述结果提示Rapsyn与Calpain的相互作用通过抑制cdk5来调节AChR聚集。

实施例7抑制Calpain可以维持Agrin基因敲除小鼠的AChR聚集

在体外培养的肌肉细胞上进行的实验已证明抑制Calpain可以稳定AChR聚集(图2)，本发明人进一步用体内实验分析抑制Calpain对突触形成的影响(Calpain抑制剂Calpeptin对肌肉细胞AChR聚集的影响见图S2)。在Agrin基因敲除小鼠体内，敲除ChAT基因或抑制Cdk5活性可以维持AChR聚集(Lin，W等(2005)，Neurotransmitteracetylcholine negatively regulates neuromuscular synapse formation by aCdk5-dependent mechanism.Neuron 46，569-579；Misgeld，T.等(2002)，Roles ofneurotransmitter in synapse formation：development of neuromuscular junctionslacking choline acetyltransferase.Neuron 36，635-648)，因此，如果Calpain通过同一通路发挥作用，那么抑制Calpain将会有类此效果。为验证这一可能性，本发明人从胚胎期E13.5起连续三天在Agrin基因敲除孕鼠体内注射Calpeptin，在第E16.5天取膈肌观察。如图6B，注射DMSO的AGD-/-小鼠体内存在少量AChR聚集；而注射Calpeptin的AGD-/-小鼠体内存在大量AChR聚集。其中的部分AChR聚集不被神经末梢支配(图6D插图；图S3箭头)。定量分析表明，Calpeptin处理的AGD-/-小鼠AChR聚集的平均面积和总数均显著高于DMSO对照组(表1及图11B)。Calpeptin的这种挽救(rescue)效果在膈肌的腹侧(图6D)和背侧(图11)同样明显。有趣的是，在同窝的野生型对照组小鼠体内，尽管Calpeptin注射组AChR的聚集高于DMSO注射组，但大多数AChR聚集与神经末梢共定位(图6A、6C、S4和表1)，这可能是突触前和突触后协同作用的结果。上述结果表明抑制Calpain对于AChR聚集的稳定有重要作用。在突触发育的早期，AChR的聚集不依赖于神经支配，这些聚集的形成需要Rapsyn和MuSK，但Agrin则不是必需的。为检测抑制Calpain对“前式型”(prepatterned)AChR聚集是否有影响，本发明人从胚胎期E10.5天起连续每天向孕鼠注射Calpeptin，在第E14.5天取膈肌检测，结果表明Calpeptin处理能够轻微增加AGD-/-小鼠体内较大体积的聚集的比例，并使运动终板(endplate)变宽。但这些变化没有显著意义(图13)。

表1.不同种类小鼠E16.5天AChR聚集的分析

每个AChR聚集的平均面积(mm²)和每一区域AChR聚集的数目。数值按mean±SEM显示。括号中的数字分别指AChR聚集的数目(中间)和检测的动物数目(右侧)。

^ap＜0.01，与对照(DMSO)相比；

^bp＜0.05，与AGD-/-(DMSO)相比；

^cp＜0.01，与control(+/+)相比；

^dp＜0.05，与AGD-/-相比；

^ep＜0.001，与AGD-/-相比。

实施例8在Agrin基因敲除鼠体内过量表达Calpastatin可以维持AChR聚集

为避免Calpeptin的药物潜在的副作用的影响，本发明人用Calpain的内源性抑制剂Calpastatin来进一步研究Calpain在AChR聚集的消散过程中所起的作用。本发明人以人骨骼肌肌动蛋白(human skeletal actin，HSA)启动子控制下的Calpastatin转基因小鼠(CS Tg，图7A)为试验对象，该品系小鼠在肌肉组织特异性过量表达Calpastatin(Brennan，K.J.等(1993)，Quantitative analysis of the humanalpha-skeletal actin gene in transgenic mice.J Biol Chem 268，719-725；Luo，Z.G.等(2003)，Implication of geranylgeranyltransferase I in synapse formation.Neuron40，703-717)。免疫印迹实验证明CS Tg在骨骼肌部位特异性地表达Calpastatin(图7B)，在E14.5天表达水平较低，E16.5天可以检测到Calpastatin的表达，表达量随着发育逐渐增高。图中显示的多个条带可能是Calpastatin选择性剪切以及蛋白酶解作用造成的(Takano et al.，1993)。在CS转基因小鼠的骨骼肌部位，作为Calpain酶活性指示的p25蛋白水平低于野生型小鼠，而突触部位的其他蛋白，如Rapsyn、MuSK、AChRα和Calpain的蛋白水平在两种小鼠中没有差别(图7D)。通过p25的水平来定量分析Calpain的相对酶活性，在CS转基因小鼠中，Calpain的酶活性显著降低(图7E)。

本发明人进一步用Calpastatin Tg小鼠和AGD-/-小鼠研究神经肌肉接头的发育。与在野生型小鼠中注射Calpeptin引起AChR聚集数目增加相一致，CS Tg小鼠的AChR聚集的数目也增加(图7F、7H和表1)。更重要的是，与AGD-/-小鼠(图7G)相比，AGD-/-；CS Tg小鼠(图7I)存在大量的AChR聚集，定量分析显示，后者的AChR聚集的数量和大小均显著高于前者(图7J、7K和表1)。这种差异既体现在不同的胚胎期，如E16.5和E17.5(图7F、7K和S6)，也体现在膈肌腹侧和背侧的不同部位(腹侧的分析见图7F-7K，表1；背侧的分析见图S7)。如图7F-7K和S6，与E16.5相比，AGD-/-小鼠在E17.5几乎没有AChR聚集“热点”(hotspots)存在，而AGD-/-；CS Tg小鼠在E16.5和E17.5的AChR聚集均有显著增加，但这种挽救效果在E17.5的表现并不比E16.5更明显，尽管在E17.5时Calpastatin的表达量更高，如图7J和7K，与AGD-/-小鼠相比，AGD-/-；CS Tg小鼠在E16.5和E17.5的AChR聚集的数目分别增加了4.5±0.6倍(E16.5)和4.1±1.1倍(E17.5)，面积分别增加了1.9±0.2倍(E16.5)和2.0±0.4倍(E17.5)。这可能是由于体内存在其他不依赖于Calpain的AChR聚集的消散机制。在AGD/Cdk5或AGD/ChAT双重基因敲除小鼠中，突触前分化相当明显，但在AGD-/-；CS Tg小鼠中，多数AChR聚集没有被突触前神经末梢所支配。因此，在骨骼肌部位抑制Calpain增加了AGD-/-小鼠AChR聚集，但对突触前分化没有明显效果。

实施例9抑制Calpain的活性促进肌肉细胞形成AChR聚集

为了解Calpain在AChR聚集体形成中的作用，本发明人检测了Calpeptin对于肌肉细胞形成AChR聚集体的影响。图10显示，Calpeptin的处理促进自发AChR聚集体的形成后，对照组每视野形成2.6±0.5个5-15-μm长的聚集体，而Calpeptin处理组形成5.7±0.2个5-15-μm长的聚集体，对照组形成0.4±0.1个15-25-μm长的聚集体，而Calpeptin  处理组1.2±0.1个15-25-μm长的聚集体(图10B)。尽管如此，Calpeptin对于Agrin诱导形成的AChR聚集体没有明显作用(图10C)。因为Agrin能够促进Rapsyn和Calpain之间的相互作用(图4E)而使Calpain的活性被Rapsyn抑制，所以通过Calpeptin进一步抑制Calpain的活性不再改变Agrin诱导形成的AChR聚集。这些结果与Calpain调节AChR聚集体形成的结论一致。

实施例10筛选药物

以肌肉细胞为受试对象，用免疫沉淀的方法分别检测候选物质刺激前后的肌肉细胞中内源Rapsyn和Calpain的相互作用情况，基本方法如实施例5。

测试组：添加候选物质的肌肉细胞；

对照组：不添加候选物质的肌肉细胞。

利用免疫共沉淀法观察测试组和对照组的肌肉细胞内Rapsyn和Calpain的相互作用，如果测试组中的肌肉细胞中Rapsyn和Calpain的相互作用加强，则说明该候选物质是促进AChR聚集的物质。

讨论

本研究揭示了钙依赖蛋白酶Calpain在神经肌肉接头调节突触后分化的作用。类胆碱能刺激能够激活Calpain，Rapsyn能够与Calpain结合并抑制其活性，在体外培养的肌肉细胞及Agrin基因敲除鼠上证实，这种抑制作用能够稳定AChR的聚集。阻断Rapsyn-Calpain的相互作用可以增强CCh诱导的AChR聚集的消散；而Agrin可以加强Rapsyn-Calpain的相互作用并抑制CCh诱导的Calpain的激活。P35是Calpain可能的底物之一，被Calpain酶解后形成Cdk5的强效激活剂p25，抑制Cdk5能够阻碍Calpain对AChR聚集的消散作用。上述结果支持这样一个机制(图8)：胆碱能刺激引起的电活动能够促使由Calpain介导的AChR聚集消散，Agrin能够加强突触部位Rapsyn与Calpain的相互作用，从而抑制Calpain的活性，最终促使新的AChR聚集的形成，维持已有的AChR聚集存在。

AChR的激活导致配体门控离子通道介导的钙内流，或者通过钠离子流间接引起胞内钙库的释放。但Ca²⁺在AChR聚集中的作用很复杂，仍有待研究。Calpain是一类钙依赖的蛋白酶，本发明人的研究显示Calpain参与AChR聚集的调节。通过检测特异性荧光底物及p25蛋白水平，本发明人证实CCh可以激活Calpain(图1)。体外(图2)和体内(图6、7)实验表明抑制Calpain可以稳定AChR聚集，而过量表达Calpain可以促进AChR聚集的消散。这些结果表明Calpain在AChR聚集中起消极作用。Calpain的一个可能的底物是Cdk5，后者能够被Calpain激活，基因敲除后导致形成的AChR聚集变大。上述假说受到以下证据支持：首先，CCh诱导的Cdk5的激活依赖于Calpain。其次，CCh处理引起cdk5强效激活剂p25的积累。再次，过量表达Calpain能够促进CCh诱导的AChR聚集的消散，该消散作用能够通过抑制Cdk5所阻断。Agrin/MuSK信号通路的许多下游分子已被证实参与AChR聚集。Calpain也可能酶切其他底物以促使AChR聚集的消失。Cdk5在乙酰胆碱刺激很短时间后即被激活，但p25的积累则缓慢得多(图1)。这意味着其他胞内活动，例如磷酸化修饰作用，可能也参与Cdk5的激活。

突触活动能够引发胞内钙浓度升高，激活Calpain，调节突触蛋白的完整性和定位，以及突触的可塑性。Calpain的活性受磷酸化、自身降解和磷脂修饰等多种因素调节。此外，Calpain活性还受与其结合的蛋白的调节，主要是Calpastatin。本发明人鉴定出Rapsyn是Calpain的又一调节分子。Rapsyn是AChR聚集和神经肌肉接头形成必需的重要膜蛋白，参与Agrin/MuSK信号通路，引起AChR聚集。当前的研究揭示了Rapsyn在调节AChR聚集中意想不到的作用。体内和体外的实验证实Rapsyn和Calpain相互作用，Calpain的第三结构域(DIII)与Rapsyn相结合，次结构域是已知的Calpain活性调节区域。阻断两者间的相互作用能够激活Calpain，促使AChR聚集的消散。P25的水平的差异反应了突触部位Calpain的活性高于非突触部位(图4I)，支持这一论断：在神经肌肉接头，Calpain可能通过Agrin和Rapsyn，在突触局部被抑制。在Agrin基因敲除小鼠中，抑制Calpain活性能够阻止AChR聚集的消散(图6、7)。Lin和Misgeld等人证实敲除Cdk5或ChAT具有相似的挽救效果。AGD/ChAT基因敲除小鼠能增加突触前分化，在AGD/ChAT或AGD/Cdk5小鼠体内，所有的AChR聚集都被突触神经末梢所支配。但在AGD-/-；CS Tg小鼠则没有这样的挽救效果，这可能是肌肉特异表达的Calpastatin的作用造成的。Cdk5或ChAT基因敲除小鼠突触前的表型，可能是因为这些基因在运动神经元中的缺失造成的。

综上所述，Calpain在突触形成中的负效应能够被Agri n所逆转，Agrin对Calpain的抑制通过加强Rapsyn与Calpain的相互作用来实现。本研究揭示了Rapsyn在突触形成中的作用以及Agrin信号通路的作用机制，这将有助于阐明Calpain在中枢神经系统突触发生中的调节机制。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>稳定神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集的方法

<130>074222

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>1

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<210>2

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<223>寡核苷酸

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tttcgagcag gaagtcagca t    21

<210>3

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<213>人工序列

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<223>寡核苷酸

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gcgcagcaat gagaagctat g    21

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<223>寡核苷酸

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catagcttct cattgctgcg c    21

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ggatggcgat ttctgcatc                           19

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gatgcagaaa tcgccatcc                           19

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<223>寡核苷酸

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<223>引物

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<223>引物

<400>8

ataagaatgc ggccgcatga atcccacaga aaccaaggc    39

<210>9

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

<400>9

ccttaattaa ctagtcatct tttggcttgg aagttt        36

Claims (10)

1.钙依赖蛋白酶Calpain或其激动剂或拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的钙依赖蛋白酶Calpain的拮抗剂用于制备提高乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的提高乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂用于预防或治疗肌肉萎缩或重症肌无力。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的钙依赖蛋白酶Calpain或其激动剂用于制备降低乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的钙依赖蛋白酶Calpain的拮抗剂选自：Calpeptin，或Calpastatin。

6.钙依赖蛋白酶Calpain的用途，其特征在于，用于筛选调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的制剂。

7.一种筛选调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)将候选物质与含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系接触；

(b)观察候选物质对于钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性的影响；

其中，若所述候选物质可降低钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性，则表明该候选物质是提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质；

若所述候选物质可提高钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性，则表明该候选物质是降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系中；和/或

步骤(b)包括：检测测试组的体系中钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系；

如果测试组钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的潜在物质；如果测试组中钙依赖蛋白酶Calpain的表达或活性在统计学上高于对照组，就表明该候选物是降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的潜在物质。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：向含有钙依赖蛋白酶Calpain的体系中加入偶联蛋白Rapsyn，观察候选物质对于钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用的影响；

其中，若所述候选物质可加强钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用，则表明该候选物质是提高神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质；

若所述候选物质可减弱钙依赖蛋白酶Calpain与偶联蛋白Rapsyn相互作用，则表明该候选物质是降低神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性的的潜在物质。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以选出对于调节神经肌肉接头的乙酰胆碱受体聚集物稳定性有用的制剂。

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