KR102142775B1 - Tnks 억제제의 연골조직 재생 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 탄키레이즈 억제제를 포함하는 관절염 치료용 조성물 또는 탄키레이즈를 표적으로 하는 연골조직 재생 약물 스크리닝 방법을 개시한다. 본원에 따른 조성물은 연골조직 재생에 중요한 표적 단백질의 분자적 수준에서의 효과적 조절을 통해 연골 조직에서 매트릭스 합성을 극대화시킴으로서 연골조직 재생 및 이와 관련된 골관절염의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TNKS 억제제의 연골조직 재생 용도{Use of TNKS inhibitors for regeneration of cartilage}

본원은 연골조직 재생과 관련된 기술분야이다.

기존 퇴행성관절염 연구는 관절이 퇴행하는 기전에 대한 연구가 주로 진행되어 왔다. 그에 따라 퇴행기전을 유도하는 주요 인자는 잘 알려져 있다. 기존 치료전략 역시 퇴행유도인자를 억제함으로써 질병의 진행을 늦추는데 초점이 맞춰져 있으며 이러한 전략은 연골을 재생하는 근본적인 치료효과를 낼 수 없다.

연골 조직은 노화나 상해에 의해 손상이 되기 시작하면 점진적으로 퇴행이 진행되는 조직으로, 퇴행성 관절염은 2014년 기준 국내 441만 명이 겪고 있는 질환으로 치료에 대한 수요가 급증하고 있다. 퇴행성관절염의 치료제 역시 히아루론산 치료제나 소염제와 같은 통증완화 수준이며, 연골의 근본적인 재생을 유도하는 치료제는 아직 개발되어 있지 않은 상황이며, 연구도 초기 상태이다.

한국 공개특허 2014-0144508호는 연골손상 재생 치료용 조성물에 관한 것으로, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor; GM-CSF)를 유효성분으로 포함하는 연골손상 재생 치료용 약학 조성물을 개시한다.

한국 공개특허 2005-0012226호는 연골세포 및 TGF-베타를 사용한 연골재생에 관한 것으로 전환성장인자(TGF) 슈퍼 패밀리 일원을 세포에 처리하여 골관절염을 치료하는 내용을 개시하고 있다.

상기 어떤 문헌도 본원에서 표적으로 하는 연골재생 치료와 관련되서는 개시하고 있지 않다. 퇴행이 일어난 연골을 근본적으로 재생시키기 위해서는 연골 재생인자를 조절하는 분자적 기전규명이 필요하고, 해당 인자의 조절을 통한 치료전략의 개발이 요구된다.

연골세포 내의 SOX의 상위조절자로서 Tankyrase의 기능을 밝히고 Tankyrase-SOX9를 조절함으로써 연골세포의 매트릭스 합성 능력을 극대화하여 연골조직 재생을 통한 관련된 질환의 근본적 치료방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 Tankyrase의 억제제를 포함하는 관절염 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

일구현예에서 본원에 따른 조성물은 상기 Tankyrase 억제제는 Sox9 단백질의 상위 조절자로서 상기 Sox9 단백질을 분해를 촉진하는 Tankyrase의 활성을 억제하여 Sox9 단백질을 안정화 또는 상기 Sox 단백질의 농도를 증가시키고, 그 결과 연골세포의 분화에 중요한 Sox9의 전사 활성을 증가하여 연골세포로의 분화가 촉진되고, 연골 세포의 메트릭스 합성능력이 극대화를 통한 치료가 근본적 치료가 가능하다.

일 구현예에서 본원에 따른 조성물에 포함될 수 있는 Tankyrase의 억제제는 상기 Tankyrase 단백질의 촉매 영역인 ARTD 영역의 니코틴아마이드 서브영역에 결합하는 물질, 아데노신 서브영역에 결합하는 물질 또는 결합 영역이 규명되지 않은 Tankyrase 효소 활성 억제 기능을 가진 억제제를 포함하는 물질이다.

일 구현예에서 상기 억제제로서, 상기 니코틴아마이드 서브영역 결합 Tankyrase 억제제는 XAV939 {3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로베틸)페닐]-4H-씨오피라노[4,3-d]피리미딘-4-원} 또는 MN-64 {2-[4-(1-메틸에틸)페닐]-4H-1-벤조피란-4-원}; 상기 아데노신 서브영역 결합 억제제는 IWR-1 [4-(1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일)-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드], JW55 {N-[4-[[[[테트라하이드로-4-(4-메톡시페닐)-2H-피란-4-일]메틸]아미노]카르보닐]페닐]-2-퓨란카르복사미드}, WIKI4 2-[3-[[4-(4-메톡시페닐)-5-(4-피리디닐)-4H-1,2,4-트리아졸-3-일]씨오]프로필]-1H벤즈[de]이소퀴놀린-1,3(2H)-디온, TC-E5001 {3-(4-메톡시페닐)-5-[[[4-(4-메톡시페닐)-5-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일]씨오]메틸]-1,2,4-옥사디아졸 또는 G007-LK {(E)-4-(5-(2-(4-(2-클로로페닐)-5-(5-(메틸설포닐)피리딘-2-일)-4H-1,2,4-트리아졸-3-yl)비닐)-1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤조니트릴}; 및 상기 결합영역이 규명되지 않은 억제제는 G244-LM {3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-[2-(메틸설포닐)페닐]-1-피페라지닐]-4H-씨오피라노[4,3-d]피리미딘-4-원}, 또는 AZ6102 {rel-2-[4-[6-[(3R,5S)-3,5-디메틸-1-피페라지닐]-4-메틸-3-피리디닐]페닐]-3,7-디하이드로-7-메틸-4H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-원}, 또는 상기 각 물질의 이성질체, 또는 그 유도체를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서 상기 억제제는 상기 Tankyrase 유전자의 단백질로의 발현을 억제하는 siRNA이며, 특히 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 RNA와 서열번호 2로 표시되는 RNA를 포함하는 dsRNA 또는 서열번호 3으로 표시되는 RNA와 서열번호 4로 표시되는 RNA를 포함하는 dsRNA이다.

다른 양태에서 본원은 Tankyrase 및 SOX9을 발현하는 세포를 제공하는 단계;

상기 세포에 Tankyrase의 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계; 상기 처리 후 상기 세포에서 상기 SOX9 단백질의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과, 상기 시험물질로 처리된 세포에서 처리하지 않은 세포와 비교하여, 상기 SOX9 농도가 증가한 경우, 상기 시험물질을 연골재생 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 연골 재생 약물 스크리닝 방법을 제공한다.

일 구현예에서 상기 Tankyase의 활성은 폴리-ADP-라이보실트렌스페라제 활성을 억제한다.

일 구현예에서 상기 세포는 연골 조직 유래의 일차 연골세포 또는 이로부터 유래된 확립된 세포주를 포함한다.

일 구현예에서 상기 연골 재생 약물은 관절염 치료제로 사용된다.

또 다른 양태에서 본원은 Tankyrase 억제제를 포함하는 성체 줄기세포의 연골세포 분화 촉진용 조성물이다. 연골 조직 내에도 내재적인 MSC가 존재하며 연골 주변의 골수와 활액에는 많은 MSC가 존재하여 연골재생에 관여할 수 있다. 본원에서는 MSC를 활용하여 세포 및 래트에서의 연골 재생 모델에서 Tankyrase 억제에 의해 연골 세포로의 분화촉진을 확인하였고, 이는 관절염의 연골 재생 과정에 MSC의 연골세포로의 분화촉진이 기여할 수 있을 수 있음을 나타낸다. 본원의 연골재생은 연골 조직내 존재하는 연골세포의 연골 기질 단백질 합성 촉진과 MSC의 연골세포로의 분화 촉진에 의해 가능하다.

또 다른 양태에서 본원은 Tankyrase 유전자의 발현, 또는 전사된 메신저 RNA의 단백질로의 발현이 억제되거나, 또는 Tankyrase 유전자가 낙다운(knock-down)된 줄기세포 특히 성체 줄기세포, 특히 중간엽줄기세포 또는 연골 유래 중간엽줄기세포를 포함하는 세포치료제로서 관절염 치료용 조성물을 제공한다.

연골세포에서 연골기질 형성에 가장 중요하다고 알려진 SOX9의 상위조절자로서 Tankyrase를 규명하고, Tankyrase 억제를 통해 인비트로 및 인비보에서 연골 재생 및 관절염 치료 효과를 규명하였다. 본원의 연골재생은 연골 조직내 존재하는 연골세포의 연골 기질 단백질 합성 촉진과 MSC의 연골세포로의 분화 촉진에 의해 가능하다. 따라서 규명된 기전을 통한 Tankyrase의 억제를 통해 관절염 등과 같은 연골재생이 필요한 질환을 근본적으로 치료할 수 있다.

도 1은 본원의 한 구현예에 따른 연골 동맥 축의 조정자로서 tankyrase의 동정을 나타낸다. (a) 연골 기질 유전자에 대한 전사 수준의 피어슨 상관 계수 히트 맵. (b) transcription abundance의 관점에서 14개의 연골 기질 유전자의 factor loadingings plot. Tnks1 / 2가 플롯에 추가됨. (c) Tnks1 / 2와 Col2a1 또는 Acan mRNA 수준 사이의 상관 관계. (d) Tnks1과 Tnks2 siRNA 3가지의 분해 효율 (n=d). siTnks #2 and siTnks2 #3가 본원에 사용됨. (e) 표시된 siRNA (n≥5) 또는 (f, g) 약물 (n = 7)로 치료한 연골 세포의 연골 특이적 매트릭스 유전자의 (e-g) mRNA 및 단백질 수준. Col6a5, Col6a6 및 Col13a1 mRNA는 검출되지 않았다. (h) siTnks와 siTnks2를 이용해 Tnks의 발현을 낮추거나 (i) 약물을 이용하여 Tnks활성을 억제한 마우스 연골세포의 연골 표지 유전자 군에 대하여 GSEA를 수행하였다. (d-g) 데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001; ANOVA.
도 2는 본원의 한 구현예에 따른 β-catenin과 독립적으로 tnks 억제를 한 경우의 아나볼릭 효과 확인(연골 기질 관련 유전자 발현 확인)을 나타낸다. (a) 신호 회로를 활성화된 상태의 연골 세포에서 shTnks와 shTnks2를 처리 후 β-catenin리포터 분석 (n = 7). (b) β-catenin 신호 회로를 활성화된 상태의 연골 세포에서 siRNA 치료 후 β-catenin 면역 블롯. (c) β-catenin 신호 회로를 활성화된 상태의 연골 세포에서 Tnks활성 억제 약물을 처리 후 β-catenin리포터 분석 (10 μM, 48 h; n = 5). (d) β-catenin 신호 회로를 활성화된 상태의 연골 세포에서 Tnks활성 억제 약물을 처리 후 β-catenin면역 블롯. (e) siRNA 처리 후 연골 기질 유전자의 mRNA 수준 (n = 4). (f) β-catenin 신호 회로를 활성화된 상태의 연골 세포에서 β-catenin 직접적 억제제를 처리 후 β-catenin 리포터 분석 (n = 4). (g) β-catenin 신호 회로를 활성화된 상태의 연골 세포에서 β-catenin 직접적 억제제를 처리 후 연골 기질 단백질 면역 블롯. (a-d, f) Wnt-3a 재조합 단백질을 24시간 동안 처리하였음. (a, c, e, f) 데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001; ANOVA (b, d, g).
도 3은 본원의 한 구현예에 따라 Tankyrase가 SOX9과의 상호작용을 통해 SOX9 단백질의 안정성을 조절하는 것을 나타내며, 직접적으로 Tankyrase와 SOX9이 상호작용하고, Tankyrase 억제시 Sox9 단백질 농도가 변화하는 것을 보여준다 (a) 연골 세포에서의 tankyrase 기질 확인의 흐름도. (b) LC/MS-MS를 사용하여 3가지 샘플의 tankyrase 결합 단백질을 결과를 밴다이어그램으로 나타냄. (c) 식별된 tankyrase- 결합 단백질의 최대 TTS의 히스토그램. ▼는 연골 형성에 관여하는 단백질을 포함하는 상자를 나타낸다. (d) 예측된 탱크 라이스 (tankyrase) - 결합 단백질로부터 TBD의 TTS 및 무질서 스코어의 히트 맵. (e) 연골 세포에서 SOX9와 내인성 TNKS1 / 2의 공 면역 침전. (f) PLA 실험 기법을 활용하여 연골 세포 내의 TNKS와 SOX9 단백질의 결합을 검출함. 빨간색은 TNKS와 SOX9 단백질의 결합된 상태를 보여주며, 파란색 DAPI 염색은 핵을 보여줌. 스케일 바, 25 μm (위), 10 μm (아래). (g) HEK 293T 세포에서 SOX9와 TNKS1 또는 SOX9과 TNKS2을 발현한 뒤 공 면역 침전. (h) 여러 척추동물 종 내의 Sox9 유전자 내의 TBD(Tankyrase-bindind domain, Tankyrase 결합 부위)로 예측되는 부위를 확인. (i) TNKS2 : 3BP2 및 TNKS2의 중첩 : TNKS2가 SOX9-TBD1 / 2에 결합된 MCL1 복합체. (j) HEK293T 세포에서 야생형 또는 TBD1 - 삭제 또는 TBD2 -결손 SOX9와 TNKS2의 풀다운 분석. (k) HEK293T 세포에서 야생형 또는 TBD1 / 2 - 결손 SOX9와 TNKS2의 풀다운 분석. (l) HEK293T 세포에서 야생형 또는 TBD1 / 2 - 결손 SOX9의 PARylation. (m) siRNA 치료 후 연골 세포에서 SOX9 면역 블롯. (n) 약물 치료 후 연골 세포에서 SOX9 면역 블롯. (o) HEK293 세포에서 야생형 또는 TBD1 / 2- 제거된 SOX9의 Cycloheximide (CHX) 추적 분석. (e, f, j-o).
도 4는 본원의 한 구현예에 따른 RNF146이 SOX9의 활성과 연골 기질 합성을 조절하지 않음을 나타낸다. (a) β-catenin 신호 회로를 활성화된 상태의 연골 세포에서 shRnf146 을 처리 후 β-catenin리포터 분석 (n = 5). (b) β-catenin 신호 회로를 활성화된 상태의 연골 세포에서 siRNF146 처리 후 β-catenin면역 블롯. (a, b) Wnt-3a 재조합 단백질을 24시간 동안 처리하였음. (c) 연골 세포에서 shRNA 을 처리 후 SOX9 리포터 분석 (n = 8). (d) 연골 세포에서 siRNA 처리 후 연골 기질 유전자의 mRNA 수준 (n = 5). (e, f) 연골 세포에서 siRNF146을 처리 후 연골 기질 단백질 및 SOX9 단백질 면역 블롯. (g) RNF146이 플롯에 추가됨. (a, c, d) 데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001; ANOVA. (b, e, f).
도 5는 본원의 한 구현예에 따른 Tankyrase 억제를 통한 연골 기질 유전자의 합성이 SOX9 의존적인 방식으로 진행됨을 나타낸다. 앞에서 보았던 Tankyrase 억제를 통한 연골 기질 합성 현상이 Sox9 조절을 통해 일어나고 있음을 증명한 것이다. (a-c) 연골세포에서 SOX9 리포터 확인. (a) shTnks 또는 shTnks2 또는shTnks와 shTnks2를 처리하거나 (n = 8) (b-c) 약물을 처리 후 확인하였음 (b, n ≥ 5; c, n = 3). (d) 야생형 TNKS2 또는 TNKS-PD(PARP-dead, 효소 활성부분 억제 돌연변이)이 발현되는 연골 세포에서 SOX9 리포터 확인. (e) SOX9 표적과 다른 유전자의 배 변화 (t test)의 박스 플롯. SOX9 표적 유전자 리스트는 표 8에 나타냈다. (f) siRNA 치료 (n = 3) 또는 (g) 약물 치료 (n = 4) 후 야생형 SOX9를 발현하는 HEK293T 세포에서 SOX9 리포터 분석. (h) 야생형 SOX9 또는 TNKS 연결 부위 돌연변이 SOX9(R257A, R271A, R2A는 R257A 와R271A를 모두 포함.)이 각각 발현되는 HEK293T세포에서 SOX9 리포터 확인 (n = 6). (i) SOX9 siRNA 3가지의 분해 효율 (n = 3). siSox9 #2가 본 연구 전반에서 사용됨. (j) 연골 세포에서 siSox9 #2 처리 후 연골 기질 유전자의 mRNA 수준 (n = 6). (a-d, f-j) 데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001; ANOVA.
도 6은 본원의 한 구현예에 따른 tankyrase 억제는 마우스 OA 모델에서 연골 수복을 향상시킴을 나타낸다. (a, b) 연골세포에 (a) siTnks와 siTnks2를 치료 또는 (b) 약물 치료 후 OA에서 상향 조절되거나 또는 하향 조절되는 유전자에 대하여 GSEA를 그린다. (c) DMM 모델과 치료 일정의 도식적 설명. (d) Safranin O 염색, (e) OARSI 등급, 및 (f) 연골 기질 단백질의 면역 염색으로 평가한 연골 파괴. (g) SOX9 면역 염색. 스케일 바, (d) 500 μm, (f,g) 25 μm. (e) 데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. *** P <0.001; Kruskal-Wallis test.
도 7은 본원의 한 구현예에 따른 Tankyrase 억제가 줄기세포의 연골화를 유도함을 나타낸다. (a) 알시안 블루(알시안 Blue) 염색 및 지시약 (n = 4)으로 처리된 마이크로 매스 배양된 사지 - 간엽 간세포의 흡광도 정량. 스케일 바, 1 mm (상단), 300 μm (하단). (b, c) (b) 표시된 약물로 치료 또는 (c) 표시된 shRNA 렌티 바이러스에 감염된 hMSC 세포의 연골 조직화 결과를 알시안 블루 염색. 스케일 바, 100 μm. (d) ShRNA의 분해 효율 (n = 4). (e) 연골 병변의 심한 외관 (위) 및 조직학적 이미지 (중간 및 바닥). ▼는 이식 부위를 나타낸다. (f) ICRS 거시적 점수 시스템 (n = 6). (g) SOX9 단백질의 면역 염색. (h) 연골 기질 단백질의 면역 염색을 사용하여 평가한 연골 재생. 스케일 바, (g, h) 25 μm, (a, d, f) 데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; ANOVA (a, f) 또는 t test (d).
도 8은 비(非)-연골 조직에서 연골 기질 유전자들 간의 발현에 연관성이 없음을 나타낸다. 16종의 BXD 마우스에서 넙다리뼈(bone femur), 신장(kidney), 폐(lung), 뇌(brain) 조직 내의 연골 기질 유전자의 발현 정도를 Pearson 상관계수로 구한 뒤 히트맵으로 나타냄.
도 9는 Tankyrase 억제를 통해 연골 특이 유전자 집단의 발현을 이끌어낼 수 있음을 나타낸다. (a) siRNA 또는 약물을 처리하여 Tankyrase를 억제한 마우스 연골 세포에서 유전자 발현의 변화를 볼케이노 플랏으로 나타냄. 빨간 점은 배수 변화도가 > 3이면서 FDR q 값이 < 1×10^-5인 유전자를 표시함. 파란 점은 배수 변화도가 <

이면서 FDR q 값이 < 1×10^-5인 유전자를 표시함. (b) 최소 한 가지 조건의 연골 세포에서 (siTnks + siTnks2, XAV939, 또는 IWR-1) 각각의 대조군 값과 비교하여 다르게 발현 양상을 보이는 유전자의 배수 변화도를 계층 분석하여 나타냄. RNA-시퀀싱은 독립된 3개의 생물학적 샘플(BR, Biological Replicates)에서 결과를 얻음. (c) 세 가지 조건 모두에서 (siTnks + siTnks2, XAV939, 그리고 IWR-1) 발현이 증가한 유전자들에 대하여 GO 분석을 진행함. (d) siRNA 또는 약물을 처리한 마우스 연골 세포 내에서 연골-특이 유전자에 대해 배수 변화도를 구하고 히트맵으로 나타냄. 연골-특이 유전자들은 표 9에 제공되어 있음.
도 10은 OA 연골에 관련된 유전자들의 발현 양상을 Tankyrase 억제를 통해 뒤집을 수 있음을 나타낸다. (a, b) siRNA 또는 약물을 처리한 마우스 연골 세포 내에서 OA-관련 유전자에 대해 배수 변화도를 구하고 히트맵으로 나타냄. OA 연골 내에서 발현이 증가하거나 감소되는 유전자들은 표 10와 11에 각각 제공되어 있음. (c) 16종의 BXD 마우스의 연골 조직에서 기질 분해성 유전자(catabolic genes)와 Tnks1 또는 Tnks2의 발현 정도를 Pearson 상관계수로 구한 뒤 히트맵으로 나타냄. (d) 16종의 BXD 마우스의 연골 조직에서 기질 분해성 유전자(catabolic genes)와 Tnks1 또는 Tnks2 간의 상관관계를 나타냄.
도 11은 Tankyrase 억제가 OA의 진행을 막을 수 있음을 나타낸다. (a) 매개체 없는 형광 물질(carrier-free DiD) 또는 형광 물질을 탑재한 하이드로젤(DiD-loaded ascorbyl palmitate hydrogel)을 마우스 무릎 관절강 내에 주사 후, 9일 동안 LED와 형광 아래서 이미지를 촬영하였음. IR은 매개체 없는 형광 물질을 주사 후 즉각적인 방출(carrier-free immediate release) 보이며, CR은 형광 물질을 탑재한 하이드로젤 주사 후 제어되는 방출(controlled release)를 보여줌. (b) (a)와 같은 방식으로 실험을 진행하고, 주사 후 9일째 되는 마우스의 넙다리뼈의 대퇴골(femoral condyle)과 종아리뼈의 경골 고평부(tibial plateau)를 형광 이미지로 촬영하였음. (c) DMM을 시행한 마우스의 무릎 연골에서 MMP13 단백질의 면역 염색. (d) DMM 모델과 OA 유도 수술 후 6주차부터 시행한 치료 일정의 도식적 설명. (e, f) (d) 일정대로 마우스 실험을 진행한 뒤 연골의 부식 정도를 (e) Safranin O 염색과 (f) OARSI 등급 책정을 하여 확인함. 데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. *P <0.05; Mann-Whitney U test.
도 12는 Tankyrase 억제가 중간엽줄기세포의 연골세포로의 분화를 촉진함을 나타낸다. (a) 대조군 shRNA 렌티바이러스 혹은 TNKS shRNA 및 TNKS2 shRNA 렌티바이러스로 감염시킨 인간 중간엽줄기세포를 피브린 젤에 담아 쥐 무릎의 연골 병변에 주입함. 피브린만 주입한 실험군을 대조군으로 사용함. 이미지는 이식 8주 뒤 각 실험군의 연골 병변을 육안으로 촬영함. TNKS 및 TNKS2가 낙다운된 인간 중간엽줄기세포를 이식한 경우 병변 부위가 회복이 더 잘 됐으며, 연골과 유사한 조직으로 채워졌음. (b) 연골 병변의 연골 재생 정도는 ICRS의 visual histological score system을 이용해 점수를 매김 (n = 6). 데이터는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. *P <0.05; ANOVA.
도 13은 본원에서 규명된 기전을 도식적으로 나타낸 것이다.

본원은 연골세포에서 연골기질 형성에 가장 중요 역할을 하는 것으로 알려진 SOX9의 상위 조절자가 규명한 것에 근거한다. 구체적으로 본원에서는 TNKS(Tankyrase, 탄키레이즈)가 SOX9의 상위조절자로서, Tankyrase는 SOX9을 패릴화(parylation)시키며, 이렇게 패릴화된 SOX9은 세포내 단백질 분해기전을 통해 분해가 되어 세포내 SOX9의 양은 낮아지고, 그 결과 연골세포는 연골세포 특이적인 기질 형성이 어렵게 되는 것을 규명하였다. 또한 상기 SOX9의 분해과정에 관여하는 E3 유비퀴틴 단백질 라이게이즈의 하위단계에서의 조절기전을 또한 규명하였다. 나아가 실제 상기 규명된 기전에 영향을 주는 Tankrase 억제제를 사용한 상기 기전의 억제를 통해 기전 조절을 통한 연골재생, 관절염 치료효과 및 연골세포로의 분화효과를 규명하였다.

이에 한 양태에서 본원은 Tankyrase 억제제를 포함하는 관절염 치료용 약학 조성물 또는 연골세포 재생 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.

Tankyrases (TNKS)는 ARTD (Diphtheria toxin-like ADP-ribosyltransferase) 효소 수퍼패밀리(EC 2.4.2.30)에 속하는 17개 일원 중의 하나로, 후술하는 ARTD는 활성 부위에서 아미노산의 차이에 따라 중합 효소(pARTD : ARTD1-6), 모노 트랜스퍼 라제(mARTD : ARTD7, 8, 10-12, 14-17) 및 불활성 효소(ARTD9, 13)로 구분된다.

인간 Tankyrase 1 (telomeric repeat binding factor 1 (TRF1)-inter-acting ankyrin-related ADP-ribose polymerase; TNKS1/ ARTD5 / PARP5a)과 Tankyrase 2 (TNKS2 / ARTD6 / PARP5b)는 각각 1327 [NCBI DB: NP_003738.2]과 1166 [NCBI DB: NP_079511, AF329696.1]를 포함하는 다중 도메인 단백질이다. 특히 C-말단에 ADP-라이보실트렌스페라제 활성을 책임지는 촉매성 ARTD 도메인을 가지고 있다. 인간 ARTD는 또한 poly(ADP-ribose)polymerases (PARP)로도 알려져 있으며, TNKS1과 TNKS2간에 매우 보존되어 전체 서열 동일성이 89%를 나타낸다. 보존된 SAM 도메인은 ARTD 도메인의 N- 터미널에 위치하며 동종 또는 이종 oligomer의 형성에 관여한다. Tankyrases은 또한 단백질 - 단백질 상호 작용에 관여하는 5개의 ankyrin 반복 클러스터로 구성되는 ankyrin repeat를 포함한다.

특히 ARTD는 NAD+ (Nicotinamide adenine dinucleotide, 산화된 형태)를 ADP-ribose (ADPr)와 니코틴아마이드로 가수분해하는 활성을 가진다. 가수분해 후 니코틴아마이드는 ARTD의 결합부위에서 방출되고, 여러 개의 ADP-리보오스 분자를 표적 단백질에 부착시켜 번역후 변형에 관여한다 (Lehtio et al., Pharmacology of ADP ribosylation, Vol 280, pp3576-3593).

본원에서는 Tankyrase가 SOX9의 상위조절자 임을 규명하였다. Tankyrase는 SOX9를 PARsylation (poly(ADP-ribosyl)ation) 하여 궁극적으로 SOX9 단백질의 분해를 유도하는 것을 규명하였다. 그런데 SOX9은 기존에 연골세포에서 연골의 매트릭스를 구성하는 collagen type 2와 Aggrecan 등의 연골기질을 형성하는데 있어 가장 중요하다고 잘 알려진 마스터 전사인자이다 (Ng LJ, Wheatley et al. Dev Biol. 1997;183(1):108-21; Lefebvre V, et al. EMBO J. 1998;17(19):5718-33; Wright E et al. Nat Genet. 1995;9(1):15-20; Ohba S, et al. Cell Rep. 2015;12(2):229-43).

따라서 상위조절자인 Tankyrase의 조절, 특히 억제를 통해 SOX9의 조절은 효과적인 연골 재생이 필요한 다양한 질환 또는 증상의 치료에 사용될 수 있는 것이다.

일 구현예에서 연골 재생은 줄기세포의 연골세포로의 분화 촉진에 기인한 것이다. 일 구현예에서 퇴행성관절염을 유도한 마우스 모델에서 Tankyrase 억제제를 관절강 내 주사를 통해 주입한 결과 대조군과 비교해서 Tankyrase 억제제가 주입된 마우스에서 연골의 재생 효과를 확인할 수 있었다. 또한 래트 모델에서 연골 내 결함를 만들고 줄기세포를 주입하였을 때 대조군과 비교하여 Tankyrase를 유전적으로 억제한 줄기세포는 연골 세포로 분화되어 조직 수준에서 연골 재생이 되는 것을 확인하였다.

본원에서 연골 재생이 필요한 질환은 일 구현예에서 골관절염이다. 흔히 퇴행성관절염이라고도 불리는 골관절염은 관절 질환 중에서 가장 많이 발생하는 관절염이다. 뼈의 관절면을 감싸고 있는 관절 연골이 마모되어 연골 밑의 뼈가 노출되고, 관절 주변의 활액막에 염증이 생겨서 통증과 변형이 발생하는 질환으로, 연골 재생이 치료에 필수적이다.

일 구현예에서 본원에 따른 Tankyrase 억제제는 TNKS1 및 TNKS2의 ARTD 도메인의 촉매활성을 억제한다. 따라서 본원에 따른 Tankyrase 억제제는 이러한 ARTD 또는 PARP의 ADP-라이보실트렌스페라제 활성에 영향을 미치는 다양한 억제제가 사용될 수 있다.

일 구현예에서 Tankyrase 억제제는 상기 Tankyrase 단백질의 촉매 영역인 ARTD domain 영역의 서브 영역으로서, 니코틴아마이드 서브 영역, 아데노신 서브영역, 또는 상기 둘 모두에 결합하는 영역에 결합하는 물질, 또는 Tankyrase 억제 기능은 있으나 결합 영역이 규명되지 않은 물질 일 수 있다. 상기 각 서브 영역은 기존에 그 위치가 알려진 것이다 (Lehtio et al., Pharmacology of ADP ribosylation, Vol 280, pp3576-3593).

예를 들면 Tankyrase 억제제는 니코틴아마이드 서브영역에 결합하는 XAV939 {3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one} 또는 MN-64 (2-[4-(1-Methylethyl)phenyl]-4H-1-benzopyran-4-one); 상기 아데노신 서브영역 결합 억제제는 IWR-1 [4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide], JW55 {N-[4-[[[[Tetrahydro-4-(4-methoxyphenyl)-2H-pyran-4-yl]methyl]amino]carbonyl]phenyl]-2-furancarboxamide}, WIKI4 2-[3-[[4-(4-Methoxyphenyl)-5-(4-pyridinyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl]thio]propyl]-1Hbenz[de]isoquinoline-1,3(2H)-dione, TC-E5001 (3-(4-Methoxyphenyl)-5-[[[4-(4-methoxyphenyl)-5-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl]thio]methyl]-1,2,4-oxadiazole) 또는 G007-LK [(E)-4-(5-(2-(4-(2-chlorophenyl)-5-(5-(methylsulfonyl)pyridin-2-yl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)vinyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzonitrile] ; 및 상기 결합영역이 알려지지 않은 억제제는 G244-LM{ 3,5,7,8-tetrahydro-2-[4-[2-(methylsulfonyl)phenyl]-1-piperazinyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one}, 또는 AZ6102 {rel-2-[4-[6-[(3R,5S)-3,5-Dimethyl-1-piperazinyl]-4-methyl-3-pyridinyl]phenyl]-3,7-dihydro-7-methyl-4H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-one} 물질 또는 상기 각 물질의 이성질체, 또는 그 유도체를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 당업자라면 본원의 효과를 고려해서 상기 각 물질의 이성질체 및 유도체를 적절하게 선택할 수 있을 것이다.

다른 구현예에서, Tankyrase 억제제는 뉴클레오타이드 예를 들면 siRNA (small interfereing RNA) 또는 shRNA (small hairpin RNA) 또는 miRNA (microRNA) 이다. siRNA, shRNA 및 miRNA는 RNA 간섭(interference) 작용을 통해, 예를 들면 짧은 길이의 간섭 RNA (siRNA)가 서열 특이적으로 전사체에 결합하여, RISC (RNA Induced Silencing Complex)를 형성하여, 전사된 RNA가 세포내에 단백질로 발현될 수 없도록(silencing) 한다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 그 표적 서열에 상당히 상보적인 서열을 갖는다. 상당히 상보적 서열이란, 표적 유전자의 적어도 연속적인 15 베이스 길이의 서열과 적어도 약 70% 상보성, 적어도 약 80% 상보성, 적어도 약 90% 상보성, 또는 약 100% 상보성을 의미한다. 표적 핵산에 결합하여 사일런싱의 기능을 하는 한 다양한 유래의, 본원에 따른 Tankyrase 유전자를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및/또는 miRNA가 사용될 수 있으며, 이들의 생물학적 동등체, 유도체 및 유사체도 포함하는 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들면 표적 단백질의 임의의 코딩 서열에 결합하여, 표적 단백질의 발현을 억제/감소시키는 짧은 합성 핵산이다. 안티센스 RNA는 표적 유전자 및 전달 방법에 따라 적절한 길이를 가질 수 있으며, 예를 들면 약 6, 8 또는 10 내지 40, 60 또는 100 뉴클레오타이드이다. 일구현예에서는 siRNA가 Tankyrase 유전자 발현 억제에 사용된다. 이러한 siRNA는 목적하는 유전자의 발현을 감소시켜 목적하는 효과를 달성하는 한 다양한 서열이 포함될 수 있으며 일 구현예에서는 다음 표와 같다.

[표 1]

상기 서열은 센스/안티센스가 결합한 dsRNA로 사용될 수 있으며, 상기 서열은 3'에 dTdT 오버행을 포함할 수 있다. 도 5에 기재된 바와 같이 이러한 siRNA는 세포 수준에서 TNKS1/2의 발현을 억제하여 궁극적으로 SOX9의 증가를 가져왔으며, 이는 연골 재생, 및 관절염 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 "치료"란 본원에 따른 조성물의 투여로 연골재생이 필요한 질환 예를 들면 관절염 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

본원에서 사용된 "담체"란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.

필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 공지된 억제제의 투여량을 적용할 수 있다. siRNA, miRNA, 안테센스 올리고뉴클레오타이드, shRNA 제제 및 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01mg 내지 100mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본원은 Tankyrase가 연골 재생에 중요한 역할을 하는 SOX9의 상위조절자 임을 규명한 것으로, Tankyrase 활성을 저해하는 물질을 스크리닝하여 연골 재생 물질, 또는 연골 재생이 필요한 질환의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 관점에서 본원은 다음의 단계를 포함하는 연골 재생 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 Tankyrase 및 SOX9을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포에 Tankyrase의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계; 상기 처리 후 상기 세포에서 상기 SOX9 단백질의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과, 상기 시험물질로 처리된 세포에서 처리하지 않은 세포와 비교하여, 상기 SOX9 농도가 증가한 경우, 상기 시험물질을 연골재생 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 사용되는 Tankyrase 및 SOX9 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 예를 들면 포유류, 특히 인간유래 또는 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사 용될 수 있다. Tankyrase의 단편이 사용되는 경우는 이는 특히 ARTD를 포함한다.

Tankyrase 1 서열은 공지된 것으로 예를 들면 인간 단백질 서열은 NCBI Reference Sequence: NP_003738로 공지되어 있으며, 이를 코딩하는 유전자 서열을 적절하게 선택될 수 있으며 예를 들면 NM_003747.2로 공지되어 있다. Tankyrase 2 서열을 공지된 것으로 예를 들면 인간 단백질 서열은 NCBI Reference Sequence: NP_079511로 공지되어 있으며, 이를 코딩하는 유전자는 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들면 NM_025235.3로 공지되어 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 본원에 따른 효과를 나타내는 한 다양한 길이 및 서열의 단백질 또는 유전자가 사용될 수 있다.

SOX9 (SRY(sex determining reiong Y)-box9)은 서열은 공지된 것으로 예를 들면 인간 단백질 서열은 NCBI Reference Sequence: NP_000337로 공지되어 있으며, 이를 코딩하는 유전자 서열을 적절하게 선택될 수 있으며 예를 들면 NM_000346.3로 공지되어 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 본원에 따른 효과를 나타내는 한 다양한 길이 및 서열의 단백질 또는 유전자가 사용될 수 있다.

본원의 방법에 사용될 수 있는 Tankyrase 및 SOX9은 분리된 형태 또는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 세포의 경우 본원의 방법에 채용되는 단백질을 내인적으로 발현하거나, 또는 이를 발현하는 플라스미드의 도입(transient 또는 stable 전달이입)에 의해 이를 발현 또는 과발현하는 세포주일 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포주는 연골 조직 유래의 일차(primary) 연골세포 또는 이로부터 확립된 연골 세포주이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 Tankyrase의 발현 또는 활성을 억제 또는 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 감소의 경우 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본원의 "시험물질"은 Tankyrase의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

일 구현예에서는 특히 Tankyrase의 활성을 억제할 가능성이 있는 물질이 시험물질로서 사용된다. 앞서 언급한 바와 같이 Tankyrase의 활성은 ARTD 촉매활성을 언급하는 것이다.

다른 구현예에서는 Tankyrase 유전자의 mRNA로의 발현, 또는 mRNA의 단백질로의 발현을 억제할 가능성이 있는 물질이 시험물질로서 사용된다.

예를 들면 Tankyrase의 발현 또는 활성을 억제하는 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고 머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물(예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클(예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

다른 양태에서 본원은 또한 Tankyrase 발현이 억제된 줄기세포를 포함하는 관절염 치료용 약학 조성물 또는 세포 치료제에 관한 것이다.

본원에서는 도 7 및 도 12에 나타난 바와 같이 줄기세포에 Tankyrase 발현 발현을 억제하거나 Tankyrase 유전자가 낙다운 된 줄기세포를 이용하여 관절염을 치료하였다.

본원에서 Tankyrase 발현의 억제는 유전자의 메신저 RNA(messanger RNA)로의 발현, 또는 mRNA의 단백질로의 번역을 억제하는 것을 모두 포함한다.

일 구현예에서는 본원 실시예에 개시된 바와 같이 Tankyrase에 특이적인 shRNA를 이용하여 달성될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 당업자라면 본원에 개시된 것 및 당업계의 지식을 고려하여 줄기세포에서 Tankyrase 발현 발현을 억제하는 방법을 적절하게 선택할 수 있을 것이다.

다른 구현예에서는 본원 실시예에 개시된 바와 같이 Tankyrase 유전자를 낙다운시켜 달성될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 당업자라면 본원에 개시된 것 및 당업계의 지식을 고려하여 줄기세포에서 Tankyrase 발현 발현을 억제하는 방법을 적절하게 선택할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)"는 이미 성인이 된 몸의 각 부위에서 얻어지는 성체줄기세포이며 제대혈, 지방, 골수(bone marrow), 혈액, 진피 또는 골막 등에서 분리되는 줄기세포로서, 본원에 개시된 바와 같이 연골 세포로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 또한, 중간엽줄기세포는 면역억제제의 사용 없이도 동종 또는 이종 수혜자에서 효과적으로 생착될 수 있는 특징이 있다. 상기 중간엽줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직 하게는 인간의 중간엽줄기세포일 수 있다. 더욱 특히는 연골에 존재하는 줄기세포일 수 있다.

일 구현예에서 중간엽줄기세포를 얻는 과정을 설명하면 다음과 같다: 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포 소스로부터 중간엽줄기세포를 분리한다. 이어 상기 세포를 적합한 배지에서 배양한다. 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된(established) 중간엽줄기세포를 수득한다. 중간엽줄기세포의 확인은, 예컨대, 유세포 분석을 통하여 할 수 있다.

본원에 따른 약학 조성물은 또한 세포 치료제로 언급될 수 있다. 본원에서 세포치료제는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하는 등 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품을 말하는 것으로, 인간의 세포 혹은 다른 종의 세포를 화학물질 의약품처럼 치료제로서 사용하는 것으로 결합이 있는 세포를 치환(replace)하거나 재생(repair)시켜준다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다.

본원의 세포 치료제에 포함되는 중간엽줄기세포는 자가(autologous) 또는 타가 또는 동종이계(allogenic) 또는 이종(Xenogenic) 일 수 있다. 가장 바람직하게는 자가유래의 것으로 수용자로부터 유래한 것이기 때문에 약제학적 조성물의 투여 시 면역 반응의 문제가 없고 안전하다는 이점이 있다.

일 구현예에서 본원의 약학적 조성물 또는 세포치료제에 포함되는 중간엽줄기세포는, 동물의 중간엽줄기세포일수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포일 수 있다.

본원에 따른 세포 치료제 또는 세포를 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 정맥 투여 또는 본 발명에 따른 세포 또는 조성물의 투여가 필요한 장기에 직접 주사되는 방식으로 투여될 수 있다.

본원에 따른 세포 치료제 또는 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 세포치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 ‘치료적으로 유효한 양’은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.

그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 세포치료제는 무릎 관절강내 투여될 수 있다.

상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분을 기준으로 1.0×10⁷ 내지 1.0×10⁸ 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁸ 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

BXD 마우스 집단의 다중 조직 전 사체의 in silico 분석. GeneNetwork (www.genenetwork.org)에서 Suwanwela, J. et al. Systems genetics analysis of mouse chondrocyte differentiation. J Bone Miner Res 26, 747-760, doi:10.1002/jbmr.271 (2011)의 연골 (GN208), Zhu, M. et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. J Bone Miner Res 24, 12-21, doi:10.1359/jbmr.080901 (2009)의 대퇴골 (GN411), 신장 (GN118), Alberts, R., Lu, L., Williams, R. W. & Schughart, K. Genome-wide analysis of the mouse lung transcriptome reveals novel molecular gene interaction networks and cell-specific expression signatures. Respir Res 12, 61, doi:10.1186/1465-9921-12-61 (2011)의 폐 (GN160), Saba, L. et al. Candidate genes and their regulatory elements: alcohol preference and tolerance. Mamm Genome 17, 669-688, doi:10.1007/s00335-005-0190-0 (2006)의 뇌 (GN123) 데이터 세트를 얻었다. 데이터 세트의 프로브는 illuminaMousev1.db 1.26.0, lluminaMousev1p1.db 1.26.0 또는 mouse4302.db 3.2.3 R 패키지를 사용하여 reannotated 되었다. 연골 및 대퇴골 데이터 세트의 경우, 겹쳐지지 않은 SNP, '완벽한' 품질 및 가장 높은 표현을 갖는 프로브가 각 성적서에 사용되었다. 다른 데이터 세트의 경우, 가장 높은 발현을 갖는 프로브가 각각의 전사물에 사용되었다. 데이터 값은 클러스터 3.0 (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm)에서 계층적 클러스터링 알고리즘(완전한 연결 및 중심에서 벗어난 상관 거리)을 사용하여 클러스터되었으며, 상관 히트 맵은 Perez-Llamas, C. & Lopez-Bigas, N. Gitools: analysis and visualisation of genomic data using interactive heat-maps. PLoS One 6, e19541, doi:10.1371/journal.pone.0019541 (2011)의 Gitools 2.3.1로 그렸다. 요인 분석은 IBM SPSS Statistics 24 (http://www.ibm.com/ analytics / us / ko / technology / spss /)를 사용하여 수행되었다. 주성분 분석은 두 가지 요인을 추출하는데 사용되었으며, 요인 점수는 회귀 분석법을 사용하여 계산되었다.

마우스 관절 연골 세포의 일차 배양. 마우스 관절 연골 세포의 기본 배양을 위해, 이전에 Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S. & Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc 3, 1253-1260, doi:10.1038/nprot.2008.95 (2008)에서 설명한 바와 같이, 4-5일 된 ICR 생쥐의 대퇴 아지 및 경골 원판으로부터 세포를 분리하였다. 연골 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS), 100 units/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM에서 유지하고 각 실험에서 지시된 대로 세포를 처리하였다. 트랜스펙션은 METAFECTENE PRO (Biontex)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 마우스 관절 연골 세포에서 RNA interference (RNAi)에 사용되는 small interfering RNAs (siRNA)는 표 1에 나타냈다. 음성 대조군 siRNA를 포함한 모든 siRNA는 Bioneer에서 구입하였다.

RT-PCR 및 qPCR. 총 RNA는 TRI reagent (Molecular Research Center, Inc.)를 사용하여 추출하였다. RNA는 EasyScript Reverse Transcriptase (Transgen Biotech)를 사용하여 역전사되었다. 그런 다음 cDNA를 표 3에 나열된 프라이머로 PCR 또는 qPCR로 증폭시켰다. qPCR은 전사체 존재량을 결정하기 위해 SYBR TOPreal qPCR 2 x preMIX (Enzynomics)로 수행하였다. 전사량은 ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였고, Hprt 또는 HPRT1 수준은 하우스 키핑 대조군으로 사용하였다. siRNA로 처리한 마우스 관절 연골 세포의 연골 기질 유전자의 log₂(배수 변화) 값을 실사 1.0.4 R 패키지에서 계층적 클러스터링 알고리즘(평균 연관성 및 중심 상관 거리)을 사용하여 클러스터링하였다. PCA는 동일한 R 패키지를 사용하여 수행되었다.

전체 세포 lysate 준비. 전체 세포용 lysates은 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma-Aldrich)이 보충된 RIPA 완충액 (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris, pH 8.0, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 용해액을 BCA 분석을 사용하여 정량하고 SDS-PAGE로 분석하였다.

항체. anti-FLAG 태그 항체 (3165)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. GFP (sc-9996), Sox-9 (sc-20095), Tankyrase-1/2 (sc-8337), Actin (sc-1615), Ubiquitin (sc-8017), 정상 마우스 IgG (sc-2025), 정상 토끼 IgG (sc-2027)는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. Sox-9에 대한 항체(sc-20095)는 Fig. 3e, m에서 사용되었고, Sox-9에 대한 또다른 항체(sc-166505)는 Fig. 3g에서 사용 되었다. Aggrecan (AB1031) 및 II형 콜라겐 (MAB8887)에 대한 항체는 Millipore에서 구입하였고 Myc tag (2276) 및 Sox9 (82630) 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. Aggrecan을 검출하기 전에 시료를 Sigma-Aldrich의 chondroitinase ABC (C3667)로 처리하였다. anti-β-카테닌 항체(610154)는 BD Biosciences로부터 입수하였다. Anti-Poly(ADP-ribose) 항체(AG-20T-0001)는 AdipoGen에서 구매하였다. 모든 1차 항체를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하였다.

Tankyrase, PARP1/2 또는 β-catenin 반응 전사 억제제. XAV939 (X3004), IWR-1 (I0161), JW55 (SML0630) 및 WIKI4 (SML0760)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. G007-LK (B5830)는 Apexbio로부터 구입하였고, G244-LM (1563007-08-8)은 MedChem Express의 AOBIOUS, MN-64 (HY19351) 및 SelleckChem의 AZ6102 (S7767) 및 Tocris의 TC-E 5001 (5049)로부터 구입하였다. Tankyrase 억제제는 그들의 작용 방식에 따라 Lehtio, L., Chi, N. W. & Krauss, S. Tankyrases as drug targets. FEBS J 280, 3576-3593, doi:10.1111/febs.12320 (2013) 및 Haikarainen, T., Krauss, S. & Lehtio, L. Tankyrases: structure, function and therapeutic implications in cancer. Curr Pharm Des 20, 6472-6488 (2014)에서와 같이 세 가지 다른 종류로 분류되었다. ABT-888 (11505)는 Cayman에서 구입하였다. iCRT 14 (4299)는 Tocris로부터 입수하였다.

RNA sequencing (RNA-seq). 일차배양한 쥐의 연골세포에 DMSO or 10uM의 XAV939 or IWR-1을 108hr 동안 treat 되었고, 이 세포에는 동시에 control siRNA or Tnks and Tnks2 siRNAs가 도입되었다. 각각의 실험군은 생물학적으로 3반복 하여 실험하였다. 고품질의 RNA samples (RIN > 7.0)의 1ug이 TruSeq Stranded mRNA Library Prep kit (Illumina)을 이용하여 RNA-seq libraries를 구성하기 위해 사용되었다. Libraries는 Agilent 2100 Bioanalyzer에 의해 확인 되었다. RNA-seq은 Macrogen의 Illumina HiSeq 2500 sequencer를 이용하여 진행되었다. 각각의 서열의 reads는 Trimmomatic 0.3을 이용하여 손질되었고, 쥐의 대표 genome 서열 (mm10)에 TopHat 2.0.13을 이용하여 매칭하였다. 유전자의 read counts는 HTSeq 0.6.1p184를 이용하여 측정하였다. 대조군과 실험군간 차이가 나는 유전자(Differntial expression gene; DEG)의 발현 분석은 DESeq2 1.16.1 R package85를 이용하여 분석하였다. DEG는 |발현양의 차이| cutoff of > 3과 a FDR q cutoff of < 1×10^-5 기준으로 선택하였다. 최소 한 조건에서의 DEGs은 gplots 3.0.1 R package의 hierarchical clustering algorithm (ward.D linkage with euclidean distance)을 이용하여 분류하였다. GO 분석은 Enrichr (release 24-Aug-2017)을 이용하여 수행하였다. DEGs의 heatmaps은 Gitools 2.3.1을 이용하여 그렸고, cartilage-signature gene set or the osteoarthritis-signature gene sets을 이용하였다.

GSEA 분석. 유전자는 DESeq2를 통해 계산된 수축된 log₂ 배 변화(fold change)에 따라 순위가 매겨졌다. GSEA(Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550, doi:10.1073/pnas.0506580102 (2005))는 연골 표지 유전자 세트 또는 골관절염 서명 유전자 세트에 대한 모든 기본 매개 변수를 사용하여 사전 순위 결정 모드로 수행되었다. P 값을 계산하기 위해 1만 개의 순열이 사용되었다.

연골-서명 유전자 세트의 생성. 배아 일 17.5에 비강 연골 세포에 대한 microarray 데이터와 출생 후의 날 1에 늑골 연골 세포는 Ohba, S., He, X., Hojo, H. & McMahon, A. P. Distinct Transcriptional Programs Underlie Sox9 Regulation of the Mammalian Chondrocyte. Cell Rep 12, 229-243, doi:10.1016/j.celrep.2015.06.013 (2015)의 GSE69108에서 얻었다. 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs)에 대한 마이크로 어레이 데이터는 GSE23547(Brellier, F. et al. Tenascin-C triggers fibrin accumulation by downregulation of tissue plasminogen activator. FEBS Lett 585, 913-920, doi:10.1016/j.febslet.2011.02.023 (2011))의 GSM577694, GSM577695 및 GSM577696으로부터 수득하였다. limma 3.30.8 R package(Ritchie, M. E. et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res 43, e47, doi:10.1093/nar/gkv007 (2015))은 비강 연골 세포와 MEF 사이 또는 늑골 연골 세포와 MEF 사이의 미분 표현을 계산하는 데 사용되었다. 가장 높은 발현을 갖는 프로브가 각각의 전사 물에 사용되었다. 비강 연골 세포와 늑골 연골 세포에서 MEF에 비해 5배 이상의 배율 변화 및 1/10^-5 이하의 FDR q를 갖는 유전자를 연골 표지 유전자로 선택하였다. 연골 표지 유전자는 표 9에 열거되어있다.

면역 침전. 도 3f에 표시된 것을 제외하고, 세포를 용해 전에 6시간 동안 ApexBio로부터 10μM MG-132 (A2585)로 처리하였다. 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 EBC200 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40 및 1 mM EDTA)을 사용하여 세포용 lysates을 제조하였다. PARylated 단백질을 검출하기 위해 Calbiochem의 ADP-HPD (118415) 5μM을 용해 완충 용액에 넣었다. 유비퀴틴 분석을 위해, Sigma-Aldrich사의 100 mM N-에틸말레이미드 (E3876)를 용해 완충액에 첨가하였다. 지시된 항체 및 단백질 A / G- 세 파로스 비드 (GE Healthcare)를 사용하여 세포 용해물을 풀다운 용으로 사용하였다. 혼합물을 4℃에서 하룻밤 배양하고 EBC200 완충액으로 5회 세척하였다. 결합된 단백질을 SDS-PAGE 또는 LC-MS/MS 분석하였다.

내인성 TNKS1/2 풀다운 및 질량 분광법. 일차 마우스 관절 연골 세포를 4일 동안 성장시킨 후 10μM MG132 (Apexbio, A2585)로 6시간 처리하였다. 세포를 용균시키고, 용해물을 정상 토끼 IgG 또는 내인성 TNKS1/2와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 단백질은 37℃에서 1시간 동안 50 mM NH4HCO3 완충액 (pH 8.2)에서 8 M 우레아로 용출되었고, 용액 내 소화는 이전에 Kim, J. S., Monroe, M. E., Camp, D. G., 2nd, Smith, R. D. & Qian, W. J. In-source fragmentation and the sources of partially tryptic peptides in shotgun proteomics. J Proteome Res 12, 910-916, doi:10.1021/pr300955f (2013)에서 설명한 대로 수행되었다. Thermo Q-Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량 분석기에 결합된 Thermo Ultimate 3000 RSLCnano 고압 액체 크로마토 그래피 시스템에서 LC-MS/MS로 펩티드 시퀀싱을 수행하였다. LC-MS/MS raw 데이터는 ProteoWizard MSConvert 3.0.8789 (Chambers, M. C. et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nat Biotechnol 30, 918-920, doi:10.1038/nbt.2377 (2012))을 사용하여 .mzML 파일로 변환되었으며, 효소 기준 및 정적 시스테인 수정 (+ 57.022 Da)으로 구성된 매개 변수 파일을 사용하는 MS-GF + 알고리즘 (Kim, S. & Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun 5, 5277, doi:10.1038/ncomms6277 (2014))을 모든 MS / MS 스펙트럼을 마우스 Uniprot 데이터베이스 (release 08-Jun-2016)와 비교하기 위해 정적 시스테인 변형 (+ 57.022 Da)을 사용하였다. 최종 펩타이드 동정은 유일한 펩티드 수준에서 1% 미만의 거짓 발견률(FDR) q를 가졌다. 오직 완전히 트립신과 semitryptic 펩타이드만이 고려되었다. 각각의 생물학적 복제물에 대해서, 단 한 번 검출된 단백질 및 정상 토끼 IgG로 동시 면역 침전시킨 단백질은 고려하지 않았다. 하나 이상의 생물학적 복제물에서 검출된 단백질의 경우, 펩타이드와 단백질은 표 11에 나열되어있다. 벤 다이어그램은 Micallef, L. & Rodgers, P. eulerAPE: drawing area-proportional 3-Venn diagrams using ellipses. PLoS One 9, e101717, doi:10.1371/journal.pone.0101717 (2014)의 오일러 (EulerAPE) v3으로 그려져있다.

Tankyrase 기질 단백질의 in silico 예측. Guettler, S. et al. Structural basis and sequence rules for substrate recognition by Tankyrase explain the basis for cherubism disease. Cell 147, 1340-1354, doi:10.1016/j.cell.2011.10.046 (2011)에서 생성된 8×20 위치 별 스코어링 매트릭스(PSSM)는 LC-MS/MS에 의해 동정된 단백질에서 각각의 옥타 펩티드에 대한 TTS를 계산하는데 사용되었다.

각 tankyrase 결합 단백질에 대한 최대 TTS를 계산하는 파이썬 코드는 Supplementary Source Code에 있다. TTS가 0.385 이상인 적어도 하나의 옥타 펩티드를 가진 단백질만이 고려되었다. 이 절단은 마우스 AXIN1 및 AXIN2의 TNKS- 결합 모티프의 TTS이다. 기존의 tankyrase(Huang, S. M. et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature 461, 614-620, doi:10.1038/nature08356 (2009)) 기질인 AXIN1과 AXIN2는 4th와 5th의 부 최적 아미노산으로 인해 기존의 tankyrase 류 기질 중에서 가장 낮은 최대 TTS를 가지고 있다 (Guettler, S. et al. Structural basis and sequence rules for substrate recognition by Tankyrase explain the basis for cherubism disease. Cell 147, 1340-1354, doi:10.1016/j.cell.2011.10.046 (2011)). 추가 검사를 위해 IPA (2014년 9월 출시) (https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/)의 연골 형성 카테고리가 사용되었다. IPA 연골 형성 카테고리의 마우스 단백질은 표 7에 나열되어 있다. 후보 단백질의 경우 IUPred 장애 점수는 TAP가 0.385 이상인 옥타 펩티드에 대해 계산되었다. 후보 단백질에 대한 TTS 및 IUPred 장애 점수의 히트맵은 Perez-Llamas, C. & Lopez-Bigas, N. Gitools: analysis and visualisation of genomic data using interactive heat-maps. PLoS One 6, e19541, doi:10.1371/journal.pone.0019541 (2011)의 Gitools 2.3.1을 사용하여 그렸다.

세포주 배양. HEK293 및 HEK293T를 10% FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 형질 감염은 METAFECTENE PRO 또는 PEI 형질 전환 시약 (Sigma-Aldrich)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. HEK293T에 사용된 siRNA는 표 1에 나와있다. TNKS1 또는 TNKS2를 표적으로 하는 siRNA 서열은 Huang, S. M. et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature 461, 614-620, doi:10.1038/nature08356 (2009)에 기술되어있다.

Plasmids. 인간 SOX9 cDNA (hMU008919)를 한국 휴먼 진 뱅크로부터 구입하고 pcDNA3-HA 플라스미드에 서브 클로닝하였다. 돌연변이체를 생성하기 위해 PCR 매개 돌연변이 유발을 수행하였다. GFP- 표지된 사람 TNKS1 플라스미드는 이창우 박사의 기증(a gift)이며, Myc- 표지된 인간 TNKS2 플라스미드는 Dr. Junjie Chen의 기증이었다. SOX9 기자 구조는 Veronique Lefebvre 박사의 기증이었다. 인간 TNKS2 cDNA를 pEGFP-C1 플라스미드에 서브 클로닝하여 GFP- 태그된 인간 TNKS2 플라스미드를 제조하였다. 대조 shRNA 서열을 pLKO.1 puro 및 pLKO.1 hygro plasmid에 삽입하였다. 인간 TNKS1 및 TNKS2 shRNA 서열을 각각 pLKO.1 puro 및 pLKO.1 hygro 플라스미드에 삽입하였다. 인간 TNKS1 또는 TNKS2를 표적으로 하는 shRNA 서열은 이전에 기재된 바와 같다. Mouse Tnks1 및 Tnks2 shRNA 서열을 각각 pLKO.1 puro 및 pLKO.1 hygro plasmid에 삽입하였다. 마우스 Rnf146 shRNA 서열을 pLKO.1 puro 플라스미드에 삽입하였다. 마우스 Tnks1을 표적으로 하는 shRNA 서열은 이전에 기술된 Levaot, N. et al. Loss of Tankyrase-mediated destruction of 3BP2 is the underlying pathogenic mechanism of cherubism. Cell 147, 1324-1339, doi:10.1016/j.cell.2011.10.045 (2011)와 같다. 상기 플라스미드를 생성하는데 사용된 프라이머는 표 4, 5 및 6에 열거되어있다.

in sity PLA. 일차 배양한 쥐의 연골세포는 in situ PLA를 위해 사용 되었다. Duolink® PLA를 제조사의 설명서에 따라 수행하였다 (Sigam-Aldrich). Sox-9 (sc-166505) and Tankyrase-1/2 (sc-8337) 항체는 각각 내제한 쥐의 SOX9과 TNKS를 표지하기 위해 사용되었다.

척추 동물 중 SOX9의 TBD1과 TBD2의 서열 정렬. NP_000337.1 (Homo sapiens SOX9), NP_035578.3 (Mus musculus SOX9), NP_989612.1 (Gallus gallus SOX9), NP_001016853.1 (Xenopus tropicalis SOX9) 및 SOX9의 TBD1과 TBD2의 서열 정렬을 위해, NP_571718.1 (Danio rerio SOX9)을 사용하였다.

단백질-펩타이드 상호 작용의 구조 모델링. Lee, H., Heo, L., Lee, M. S. & Seok, C. GalaxyPepDock: a protein-peptide docking tool based on interaction similarity and energy optimization. Nucleic Acids Res 43, W431-435, doi:10.1093/nar/gkv495 (2015)는 인간 SOX9의 TBD1 또는 TBD2 펩타이드와 복합체로된 인간 TNKS2의 ARC4 도메인의 모델링에 사용되었다. Guettler, S. et al. Structural basis and sequence rules for substrate recognition by Tankyrase explain the basis for cherubism disease. Cell 147, 1340-1354, doi:10.1016/j.cell.2011.10.046 (2011)은 ARC4 : 3BP2 (PDB ID : 3TWR)와 ARC4 : MCL1 (PDB ID : 3TWU)의 구조를 얻었다. 인간 TNKS2 (PDB ID : 3TWU_A) 및 MCL1 펩타이드 (PDB ID : 3TWU_B)의 ARC4 도메인을 주형으로 사용하였다. MCL1 펩타이드는 인간 SOX9의 TBD1 (255-266 aa) 또는 TBD2 (269-280 aa) 펩티드로 치환되고 복합체에 도킹되었다. ARC4 : SOX9 TBD1 및 ARC4 : SOX9 TBD2 각각에 대해 가장 잘 예측된 모델을 선택하였다. 모델 구조는 ARC4 : 3BP2 및 ARC4 : MCL1과 겹쳐졌으며 BIOVIA Discovery Studio Visualizer 4.0 (http://accelrys.com/products/collaborative-science/biovia-discovery-studio/visualization.html)을 사용하여 시각화되었다.

Cycloheximide 체이스 분석. HEK293 세포를 녹이기 전 표시된 시간 동안 Goldbio의 cycloheximide (C-930-1) 100 μg/ml로 처리하였다. 단백질 샘플을 SDS-PAGE에 적용하여 단백질 안정성을 분석하였다.

리포터 유전자 분석. SOX9 의존성 Col2a1 인핸서 요소(Murakami, S., Lefebvre, V. & de Crombrugghe, B. Potent inhibition of the master chondrogenic factor Sox9 gene by interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha. J Biol Chem 275, 3687-3692 (2000))를 갖는 반딧불 루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 사용하여 SOX9의 전사 활성을 정량화하였다. β-카테닌 전사 활성을 정량하기 위해, TOPFlash 리포터 플라스미드 56 및 재조합 마우스 WNT-3a (PeproTech, 315-20)를 사용하였다. 일차 마우스 관절 연골 세포 또는 HEK293T 세포를 리포터 플라스미드 및 레닐라 루시퍼라아제 플라스미드로 형질 감염시켰다. 세포를 siRNA 또는 약물로 처치하였다. Renilla 및 반딧불이 루시퍼라제 활성을 Dual Luciferase Assay Kit (Promega)를 사용하여 순차적으로 측정하였다. Renilla 루시퍼라아제를 대조군으로 사용하였다.

연골 세포의 SOX9 표적 유전자 목록. Oh, C. D. et al. SOX9 regulates multiple genes in chondrocytes, including genes encoding ECM proteins, ECM modification enzymes, receptors, and transporters. PLoS One 9, e107577, doi:10.1371/journal.pone.0107577 (2014)에 근거하여, 늑골 연골 세포에서 Sox9 결실 후 log₂(fold change)가 -2 이하이고 늑골 연골 세포에서 SOX9 ChIP-Seq 피크와 연관된 유전자가 연골 세포에서 SOX9 표적 유전자로 선택되었다. 연골 세포에서 SOX9 표적 유전자는 표 8에 열거되어있다.

골관절염 시그니처 유전자 세트의 생성. Dunn, S. L. et al. Gene expression changes in damaged osteoarthritic cartilage identify a signature of non-chondrogenic and mechanical responses. Osteoarthritis Cartilage 24, 1431-1440, doi:10.1016/j.joca.2016.03.007 (2016)에 기초하여, |fold change| 골관절염이 있는 동일한 환자 내 손상되지 않은 부위와 비교한 관절 연골 손상 부위의 FDR q는 1×10^-5 미만이었고, biomaRt 2.30.0 R package(Durinck, S., Spellman, P. T., Birney, E. & Huber, W. Mapping identifiers for the integration of genomic datasets with the R/Bioconductor package biomaRt. Nat Protoc 4, 1184-1191, doi:10.1038/nprot.2009.97 (2009))를 사용하여 마우스 명명법으로 변환되었다. 골관절염 연골에서 상향 조절되고 하향 조절되는 유전자는 표 9 및 10에 각각 수록되어있다.

임베디드 분자의 제어 방출에 대한 하이드로 겔 및 생체 내 확인의 준비. 6-O-팔미토일-1-아스코르브 산 (76183)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 하이드로 겔은 이전에 Zhang, S. et al. An inflammation-targeting hydrogel for local drug delivery in inflammatory bowel disease. Sci Transl Med 7, 300ra128, doi:10.1126/scitranslmed.aaa5657 (2015)에 기술된 바와 같이 6-O- 팔미토일-1-아스코르브 산으로 제조되었다. Tocris에서 구입한 DiD perocholate (5702)를 하이드로 젤에 넣고 마우스 무릎 관절에서 제어 방출 이미징에 사용하였다. 50 pmol의 DiD를 함유한 PBS로 현탁된 하이드로 겔(PBS:hydrogel = 1:1)을 관절 내 투여하고, 주입 후 1-9일에 발광 다이오드(LED)와 무릎 관절의 형광 이미지 얻은. LuminoGraph II (Atto)를 사용하여 이미지를 수집하였다.

쥐 실험 OA. 8주령의 수컷 ICR 마우스를 실험용 OA 용으로 사용하였다. 실험용 OA는 우측 뒷다리의 DMM 수술에 의해 유발되었으며, 가짜 수술은 왼쪽 뒷다리에서 대조군으로 시행되었다 (Glasson, S. S., Blanchet, T. J. & Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage 15, 1061-1069, doi:10.1016/j.joca.2007.03.006 (2007)). 비히클 또는 10 nmol 약물을 함유한 PBS-현탁된 하이드로 겔(PBS:하이드로 겔 = 1:1) 10 μl를 관절 내 투여하였다.

조직학 및 면역조직화학. 마우스 또는 쥐 무릎 관절 견본을 4℃에서 밤새 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 4℃에서 2-4주 동안 0.5M EDTA, pH 7.4에서 탈 보호하고, 파라핀에 매입시켰다. 파라핀 블록은 6μm의 두께로 절단되었다. Safranin O 염색, Alcian Blue/Fast Red 염색, 또는 면역 염색을 위해, 절편을 크실렌으로 탈 파라핀 화하고 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 사용하여 수화시켰다. 연골 파괴를 평가하기 위해 Safranin O 염색 표본은 세 명의 시각 장애인 관찰자가 골 관절염 연구 협회 (OARSI) Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B. & Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage 18 Suppl 3, S17-23, doi:10.1016/j.joca.2010.05.025 (2010)을 기준으로 점수를 매겼다. OARSI 등급 0-2는 OA 초기 단계, OARSI 등급 2 이상은 OA 중후반 단계로 분류되었다. 연골 재생은 3명의 시각 장애인 관찰자가 국제 연골 수리 학회(International Cartilage Repair Society, ICRS) 점수 시스템(Haikarainen, T., Krauss, S. & Lehtio, L. Tankyrases: structure, function and therapeutic implications in cancer. Curr Pharm Des 20, 6472-6488 (2014) 및 Mainil-Varlet, P. et al. Histological assessment of cartilage repair: a report by the Histology Endpoint Committee of the International Cartilage Repair Society (ICRS). J Bone Joint Surg Am 85-A Suppl 2, 45-57 (2003))에 따라 점수를 매겼다.

마우스 limb-bud 마이크로매스 배양. 간엽 세포의 micromass 배양을 위해 E11.5 ICR 마우스 배아에서 limb-bud 세포를 분리하였다. 2.0×10⁷ cell/ml를 10% FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM에 현탁하고, 15μl 방울을 배양 접시에 띄웠다. 24시간 후, 세포를 3일 동안 지시된 바와 같이 처리하고 알시안 블루 염색시켰다.

인간 MSC의 연골세포로의 분화. MSC는 Lonza and Thermo Scientific에서 구입하였다. hMSCs는 20% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 250 ng/ml amphotericin B가 첨가된 α-MEM에서 배양하였다. 3일 후, 배지를 100 μg/ml 스트렙토마이신, 250 μg/ml 암포테리신 B, 1.25 mg/ml BSA, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1 mM 나트륨 피루베이트, 50 μM L-아스파라긴산, 50 μM L-프롤린, 100 nM dexamethasone, 및 10 ng/ml TGF-β1을 보충한 DMEM/F-12로 구성된 연골 형성 배지로 바꾸었다. 21일(약물 치료를 위해) 또는 28일(siRNA 치료를 위해), 세포를 수확하고 Alcian Blue/Fast Red 염색을 시행하였다.

대조 shRNA 또는 TNKS1/2 shRNA- 감염 인간 간엽 줄기 세포의 생성. psPAX2 및 pMD2.G를 HEK293T로 형질 감염시켰다. 3일 후, 세포 상등액을 수확하고 0.45㎛ 필터로 여과하였다. hMSC를 8 μg/ml polybrene으로 처리하고 표시된 렌티 바이러스에 감염시켰다. 감염 24시간 후, 5 μg/ml 퓨로마이신 및 200 μg/ml 하이그로마이신으로 4일 동안 hMSC를 선별하였다.

쥐 osteochondral 결점 모델. 12주된 수컷 Sprague Dawley 흰쥐를 골 연골 결손 모델로 사용하였다. 관절 연골을 무릎 관절에 노출시키기 위해 내측 비파절 절개를 하고 슬개골을 내측 관골쪽으로 약간 옮겼다. 대퇴 슬개골 표면에 직경 1mm의 구형 드릴을 사용하여 3mm × 1mm × 1mm의 전층 연골 결함을 만들었다. 동시에, hMSCs는 도청에 의해 섬유소 접착제 (TISSEEL) 10 μl에 정지하고 결함에 이식되었다. 면역 거부 반응을 피하기 위해 Toronto Research Chemicals의 cyclosporine A (C988900)를 매일 복강 내 주사하였다. 8주에 조직학적 분석을 위해 쥐를 희생시켰다.

통계 분석. 모든 실험은 최소 3회 독립적으로 수행되었다. 모든 이미지는 적어도 세 번의 독립적인 임상 시험을 대표한다. 파라메트릭 테스트의 경우, two-tailed Student's t test 또는 one-way analysis of variance (ANOVA) 후 피셔의 가장 유의미한 차이 포스트-혹 테스트가 사용되었다. 비모수 테스트의 경우, Mann-Whitney 테스트가 사용되었다. 모든 통계 분석은 IBM SPSS Statistics 24를 사용하여 수행되었다. P 값 <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

[표 2] siRNA의 목록

[표 3] PCR 프라이머의 목록

[표 4] 서브클로닝에 사용된 프라이머의 목록

[표 5] 돌연변이에 사용된 PCR 프라이머의 목록

[표 6] shRNA 플라스미드 제작에 사용한 PCR 프라이머의 목록

[표 7] IPA chondrogenesis 범주 내의 마우스 단백질 목록

[표 8] 연골 세포 내의 SOX9의 표적 유전자들의 목록

[표 9] 연골-특이 유전자 목록

[표 10] OA 연골 내에서 발현이 증가하는 유전자 목록

[표 11] OA 연골 내에서 발현이 감소하는 유전자 목록

실시예 1. 연골기질 동화작용을 조절하는 인자의 규명

연골기질의 동화(anabolism) 작용을 자극하는, 표적화 될 수 있는 주요 조절 인자를 스크리닝하기 위해, 본원에서는 post-hoc factor analysis를 사용하여 마우스 레퍼런스 집단의 전사체(transcriptome) 분석을 수행했다. 먼저 BXD 생쥐 16 계통의 연골 조직에서 전사 변이를 평가했다. 본원에서는 Heinegard와 Saxne26에 의해 나열된 21개의 연골 기질 유전자 중에서 14개의 연골 기질 유전자가 이들의 전사체와(transcript abundance)에서 강한 양의 상관 관계를 보였다 (도 1a). 이러한 높은 상관 관계는 대퇴골, 신장, 폐, 뇌와 같은 연골 기능이 없는 기관에서는 발견되지 않았다 (도 8). 본원에서는 상호 연관성이 높은 14개의 연골 기질 유전자(도 1a의 블랙 박스 참조)에 대한 주성분 분석(PCA)을 수행함으로써 연골 동화 작용의 기본 축을 확인하였다. 그 결과 확인 된 첫 번째 축(Factor 1, 인자 1)은 본질적으로 연골 기질 동화 작용의 상태를 반영하는 것으로 나타났다 (도 1b). Factor 1과 전사 인자, 효소 또는 연골에서 기능이 알려지지 않은 신호 분자로 표기된 다양한 유전자 사이의 Pearson 상관 계수를 계산했다. 이 중 탄키라제(Tankyrase)는 이 동화 축뿐만 아니라 개별적인 연골 기질 유전자와의 명백한 음의 상관 관계를 보여 주었고 후보자로 선별하였다 (도 1b, c).

이어 연골 동화 작용에서의 탄키라제의 조절자로서의 기능을 분석하였다. 이를 위해 탄키라제 유전자인 Tnks1 및 Tnks2의 낙다운은 일차 배양 된 마우스 연골 세포에서 연골 특이적 매트릭스 유전자의 발현을 총체적으로 유도하는 것으로 나타났다 (도 1d, e). 반면 Tnks 또는 Tnks2 중 하나 만의 낙다운 연골 기질 대사를 증가시키지 못했는데, 이는 tankyrase-1과 -2의 이중(reduandant) 역할을 나타내는 것이다. 매우 특이적이고 강력한 TNKS1/2 억제제인 XAV939 또는 IWR-1로 치료한 결과, 연골 세포에서 연골 특이적 매트릭스 유전자의 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 1f, g). 반면 PARP1/2 억제제 인 ABT-888은 그 발현을 증가시키지 못했다. PARP는 PARylation의 효소 활성을 가지는 단백질 패밀리이다. PARP1부터 PARP16까지 알려져 있으며, TNK1과 TNKS2는 각각 PARP-5a와 PARP-5b에 해당한다. 따라서 상기와 같은 결과는 XAV939는 TNKS 억제제로 ABT-888은 PARP1/2 억제제이므로, PARP 중에서도 TNKS의 억제만이 연골 특이적 매트릭스 유전자 발현을 유도할 수 있음을 정확히 보여주고 있으며, ABT-888은 음성 대조군으로 사용되었다.

전체 전사체 수준에서 tankyrase 억제 효과를 종합적으로 밝히기 위해 본원에서는 Tnks와 Tnks2, XAV939 또는 IWR-1 (도 9a)을 표적으로 하는 siRNA로 처리 한 연골 세포에 대해 RNA 서열분석을 수행했다. 그 결과 3개의 tankyrase 억제 군에서 (각 대조군과 비교하여) 차별적으로 발현 된 유전자(DEGs)의 군집 양상이 유사하게 나타났다 (도 9b). tankyrase 억제에 반응하여 일반적으로 상향 조절 된 유전자의 유전자 온톨로지(GO) 분석은 연골 발달과 관련된 항목과 강력한 연관성을 보여 주었다 (도 9c). 다음으로, 본원은 공개 전사체 데이터 세트를 활용하여 연골-시그니처 유전자의 포괄적인 목록을 작성하였다. Tankyrase 억제는 주요 연골-아이덴터티 유전자의 강력한 전사를 유도했다 (도 9d). 또한, 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 연골 시그니쳐 유전자가 siTnks 및 siTnks2 또는 tankyrase 억제제 XAV939 및 IWR-1 (도. 1H, J)로 처리된 연골 세포로부터 얻은 전체 전사체에서 증가한 것으로 나타났다. 따라서, tankyrase 억제는 연골 기질 동화를 촉진시키며 연골 세포의 전반적인 연골 형성 특징을 강화시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 2. tankyrase와 SOX9의 상호 작용 규명

Tankyrase와 SOX9와 보존된 tankyrase-binding domains를 통해 상호작용하는 것을 규명하였다.

본 실시예에서는 연골 형성 촉진에 영향을 미치는 분자 기전을 이해하기 위해 연골 기질 유전자의 조절에 관여하는 Tankyrase의 기질을 규명하고자 하였다. tankyrase의 잘 알려진 표적인 Axin은 tankyrase-RNF146 복합체에 의한 PARylation 의존적 유비퀴틴화가 되어 분해된다 (Huang, S. M. et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature 461, 614-620, doi:10.1038/nature08356 (2009)., Zhang, Y. et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol 13, 623-629, doi:10.1038/ncb2222 (2011).). 이와 일관되게, tankyrase 억제는 연골 세포의 β-catenin 안정성과 활성을 감소시켰다 (도 2a, b, c, d). 그러나, Ctnnb1 siRNA 또는 β- 카테닌에 반응하는 전사 억제제인 iCRT 1429를 사용한 처리 결과, 이는 연골 matrisome의 발현에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이는 β- 카테닌은 연골 동화작용에 대한 tankyrase 억제효과와 관련성이 없음을 나타낸다 (도 2e , f, g).

이어 연골 기질 동화를 조절하는 새로운 tankyrase 결합 기질을 찾기 위해 본원에서는 연골 세포의 내인성 tankyrase와 함께 면역 침전된 proteome에 대해 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분광법(LC-MS / MS) 분석을 수행했다 (도 3a 및 표 11). 본원에서는 하나 이상의 생물학적 레플리케이트에서 검출 된 단백질을 추정적인 tankyrase 상호 작용 단백질로 간주했다 (도 3b). 이들 결합 파트너 중 TTS (tankyrase-targeting score) 시스템 (Guettler, S. et al. Structural basis and sequence rules for substrate recognition by Tankyrase explain the basis for cherubism disease. Cell 147, 1340-1354, doi:10.1016/j.cell.2011.10.046 (2011).)을 사용하여 후보 물질을 추가로 스크리닝 하였다. Ingenuity pathway analysis (IPA)를 이용하여 연골 형성 카테고리에 속하는 TTS 컷오프 (≥0.385)인 4개의 후보 단백질을 규명하였다 (도 3c). 이어 IUPred 디스오더 점수 (Dosztanyi, Z., Csizmok, V., Tompa, P. & Simon, I. IUPred: web server for the prediction of intrinsically unstructured regions of proteins based on estimated energy content. Bioinformatics 21, 3433-3434, doi:10.1093/bioinformatics/bti541 (2005).)를 이용하여 tankyrase 결합 모티프가 고도로 구조화 된 영역에 위치하는 가능성이 적은 표적을 걸러냈다 (도 3d). SOX9는 높은 TTS 및 디스오더 점수를 나타내었으며, 이를 기질 후보로서 선별하였다. 연골 세포에서의 tankyrase와 SOX9 사이의 내인성 상호 작용은 co-immunoprecipitation assay와 in situ proximity ligation assay (PLA)를 분석으로 확인되었다 (도 3e, f). 또한, 본원의 세포 기반 분석은 SOX9가 tankyrase-1과 tankyrase-2 모두에 결합하는 것으로 나타났다 (도 3g). TBD1과 TBD2로 지칭되는 두 개의 SOX9의 tankyrase-binding domains (TBDs)는 척추 동물 사이에 고도로 보존되어있다 (도 3h). 구조적 시뮬레이션에 기초하여, TBD1 및 TBD2 펩타이드는, 기존의 알려진 기질인 SH3 도메인 결합 단백질 (3BP2) 및 골수 세포 백혈병 서열 1 단백질 (MCL1)에 존재하는 tankyrase의 ankyrin repeat cluster (ARC) IV 도메인의 중앙에 위치한 결합 포켓에 맞는 것으로 나타났다 (도 3i). TBD1 또는 TBD2의 결실은 tankyrase (도 3j)에 대한 SOX9의 결합 친화도를 감소시키는 반면, 두 개 TBD 모두의 동시 결손은 결합을 거의 무력화시키는 것으로 나타났다 (도 3k).

실시예 3. Tankyrase 억제를 통해 SOX9와 패릴화-의존적 단백질 분해를 분리시킴으로써 SOX9 안정성과 활성의 향상

본 실시예에서는 SOX9에 대한 Tankyrase의 결합이 SOX9의 패릴화(PARylation)와 연관되어 있는 지를 조사했다. 야생형 SOX9는 광범위한 패릴화가 일어났지만, 두 개의 TBD가없는 SOX9 돌연변이는 패릴화 수준이 현저히 감소했다 (도 3l). Tankyrase 의존성 패릴화는 일반적으로 기질 단백질의 분해와 관련이 있다 (Riffell, J. L., Lord, C. J. & Ashworth, A. Tankyrase-targeted therapeutics: expanding opportunities in the PARP family. Nat Rev Drug Discov 11, 923-936, doi:10.1038/nrd3868 (2012).). 실제로, tankyrase 억제는 연골 세포 (도 3m, n)에서 SOX9 단백질 발현을 촉진 시켰고, SOX9 TBD 돌연변이체는 야생형 SOX9 (도 3o)와 비교하여 증가 된 안정성을 나타내었다. 이러한 결과는 Tankyrase과 SOX9 간의 물리적 상호작용의 와해가 결과적으로 SOX9의 패릴화를 막아서 SOX9의 안정화를 초래하는 것을 나타낸다.

현재까지 RNF146은 PARylation 의존성 유비퀴틴화와 기질 분해를 매개하는 유일한 E3 유비퀴틴 라이게이즈이다 (Zhang, Y. et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol 13, 623-629, doi:10.1038/ncb2222 (2011)., DaRosa, P. A. et al. Allosteric activation of the RNF146 ubiquitin ligase by a poly(ADP-ribosyl)ation signal. Nature 517, 223-226, doi:10.1038/nature13826 (2015)., Andrabi, S. A. et al. Iduna protects the brain from glutamate excitotoxicity and stroke by interfering with poly(ADP-ribose) polymer-induced cell death. Nat Med 17, 692-699, doi:10.1038/nm.2387 (2011).). 특히, RNF146은 tankyrase 의존성 Axin 분해와 베타-카테닌 안정화를 조절하는 것으로 알려져 있다. tankyrase 억제제 또는 siRNA에 의한 RNF146의 낙다운은 β-catenin 수준과 TOPFlash 활성을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다 (도 4a, b). 그러나, Tnks 및 Tnks2 이중 낙다운과 달리, 연골세포의 Rnf146 녹아웃은 SOX9 단백질 안정성과 전사 활동, 또는 연골 매트릭스 유전자의 발현을 증가시키지 못하는 것으로 나타났다 (도 4c, d, e, f). 상기 실험 결과는 또한 마우스 참조 집단에 기반한 인자분석 결과에 의해 뒷받침되었다. 총 14개의 상호-연관된 연골 기질 유전자는 Rnf146과 유의한 상관 관계를 나타내지 않았다 (r = -0.12; P = 0.66, 도 4g). 상기 결과는 RNF146 이외의 패릴화-의존성 E3 라이게이즈가 존재할 수 있으며, 이것이 패릴화-의존적 SOX9 조절을 조절할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 4. SOX9은 tankyrase 억제에 의해 유도된 연골 기질 유전자 발현에 필수적 성분임을 규명

연골 형성의 마스터 전사 인자인 SOX9는 다양한 연골 특이적 매트릭스 유전자의 전사에 관여한다. 본 실시예에서는 4x48-p89 SOX9 의존 Col2a1 enhancer reporter (Murakami, S., Lefebvre, V. & de Crombrugghe, B. Potent inhibition of the master chondrogenic factor Sox9 gene by interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha. J Biol Chem 275, 3687-3692 (2000).)를 사용하여 tankyrase 억제가 SOX9의 전사 활성에 미치는 영향을 조사했다. Tnks와 Tnks2의 이중 낙다운 및 9개의 다른 tankyrase 특이적 억제제가 연골 세포에서 SOX9의 전사 활성을 특이적으로 증가시키는 것으로 나타났다 (도 5a, b, c). 또한, 야생형 TNKS2의 과발현은 SOX9의 전사 활성을 현저하게 감소시키는 반면, 촉매적으로 비활성인 TNKS2 (TNKS2 M1054V)는 SOX9 활성을 중간 정도로 억제 하였다 (도 5d).

SOX9 표적 유전자 (Oh, C. D. et al. SOX9 regulates multiple genes in chondrocytes, including genes encoding ECM proteins, ECM modification enzymes, receptors, and transporters. PLoS One 9, e107577, doi:10.1371/journal.pone.0107577 (2014).)는 전반적인 전사체 수준에서 tankyrase 낙다운 또는 억제에 의해 전반적으로 상향 조절되었다 (도 5e). SOX9는 그 자체의 인핸서에 결합하여 그 발현을 자동 조절한다 (Mead, T. J. et al. A far-upstream (-70 kb) enhancer mediates Sox9 auto-regulation in somatic tissues during development and adult regeneration. Nucleic Acids Res 41, 4459-4469, doi:10.1093/nar/gkt140 (2013).). 앞서 Tankyrase가 SOX9 분해에 관여한다고 생각했기 때문에, SOX9의 전사 활성이 SOX9 mRNA(전사 수준)의 증가가 아닌 SOX9 단백질(단백질 수준)의 증가에 의해 일어남을 보이고자 이를 위해 도 5f 및 도 5g에서 SOX9 단백질을 많이 발현시켜놓은 상황에서 tankyrase 억제가 어떤 영향을 주는지 분석하였다. Tankyrase의 SOX9에 대한 조절이 단백질 수준에서 일어나고 있음을 확인하기 위해 SOX9 단백질이 CMV 프로모터 하에서 발현되는 조건에서 SOX9 의존성 Col2a1 enhancer-luciferase 리포터 분석을 수행하였다. siRNA 또는 약물을 이용한 Tankyrase 억제는 HEK-293T 세포에서 외인성으로 발현된 SOX9의 전사 활성을 증가시켰다 (도 5f, g). 또한, SOX9의 TBD1과 TBD2 모두에서 Ala에 대한 첫 번째 위치의 Arg의 점 돌연변이는 SOX9의 전사 활성에 상승작용을 나타냈다 (도 3h). 이러한 결과는 SOX9과 Tankyrase 사이의 상호 작용의 와해로 SOX9의 전사활성을 증가시키기에 충분함을 나타낸다. Tankyrase 억제로 유도된 연골 매트릭스 유전자 발현은 SOX9의 낙다운으로 완전히 사려졌다 (도 5i, j). 이러한 결과는 SOX9이 연골세포에서 동화 조절자로서 Tankyrase의 역할에 있어, Tankyrase의 필수 표적임을 나타낸다.

실시예 5. Tankyrase 억제를 통한 마우스 골관절염 연골 파괴 예방 효과

상기 결과는 tankyrase가 연골 기질 항상성의 조절에 생리적 역할을 수행 할 수 있음을 시사한다. 관절염(OA) 발생 과정에서 연골의 항상성이 파괴되면서, Tankyrase 억제가 OA 관련 유전자의 발현에 어떻게 영향을 미치는지를 조사했다. 공개 전사체 데이터 세트를 활용하여 OA 환자에서 상향 조절되고 하향 조절되는 OA 관련 유전자의 포괄적인 목록을 작성하였다. 특히, 환자에서 상향 조절 된 OA 관련 유전자는 tankyrase 억제시 연골 세포에서 전반적으로 억제되었다 (도 10a). 대조적으로, 환자에서 억제 된 OA 관련 유전자는 tankyrase 억제에 의해 강력하게 활성화(transactivated) 되었다 (도 10b). 이러한 유전자 발현 프로파일링의 이러한 상반된 패턴은 전체 전사체 레벨에서조차도 명백했다 (도 6a, b).

다음으로 외과적으로 유도된 OA 마우스 모델에서 연골 기질 항상성에 대한 tankyrase 억제의 생체 내 효과를 평가했다. 마우스 무릎 관절에 tankyrase 억제제를 안정적으로 장기간 투여하기 위해 아스코르빌 팔미틴산 염 38으로 만든 주사 가능한 하이드로 젤을 사용하였다. 이 하이드로젤 기반 약물 전달 시스템의 관절 내 (IA) 주사로 인해 하적된 저분자 약물이 9일에 걸쳐 관절 연골에 국소 방출되었다 (도 11a, b). 서로 다른 작용 기전을 가진 두 가지 대표적인 tankyrase 억제제인 hydrogel-mediated XAV939 또는 IWR-1의 IA 투여는 medial meniscus (DMM)의 불안정화로 인해 야기된 연골 기질의 퇴행을 유의하게 감소시켰다 (도 6c, d, e). II 형 콜라겐과 aggrecan의 동시 증가가 관찰되었고 (도 6f), SOX9 단백질 발현은 tankyrase 억제제로 치료된 연골에서 유지되었다 (도 6g). 또한, 본원에서는 tankyrase 억제제의 IA 전달이 타입 II 콜라겐의 이화 작용에 기여하는 핵심효소 인 matrix metalloproteinase 13 (MMP13)의 생성을 효과적으로 감소 시킨다는 것을 관찰했다 (도 10c)(Billinghurst, R. C. et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. J Clin Invest 99, 1534-1545, doi:10.1172/JCI119316 (1997).). 이러한 실험 결과는 마우스 참조 집단에 기초한 연관분석 결과와 일치하는 것으로, tankyrase가 연골 기질 유전자 및 이화(catabolic) 조절자와 각각 음(도 1b, c) 그리고 양(도 10d, e)의 상관관계가 있음을 나타내는 것이다.

tankyrase 억제제의 프로- 동화 효과에 기초하여, 본원에서는 XAV939이 후기 단계의 OA 연골을 치료할 수 있는지 시험하였다. 마우스 DMM 모델 (Kim, J. H. et al. Matrix cross-linking-mediated mechanotransduction promotes posttraumatic osteoarthritis. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 9424-9429, doi:10.1073/pnas.1505700112 (2015).)에서는 DMM 수술 후 6주 후에 생쥐의 70%가 후기 단계의 OA에 도달한 반면, 조기 관절염 병변은 수술후에 2주에 관찰되었다. 추가로 6주간 XAV939 투여 (도 11c)는 OA가 진행된 비히클 처리 마우스와 비교하여 연골 파괴를 감소 시켰다 (도 11d, e). 이러한 결과는 tankyrase 억제제가 효과적으로 매트릭스 동화 작용과 이화작용사이의 사이의 불균형의 약화를 통해 생쥐의 연골 파괴를 경감시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 6. Tankyrase 억제에 의한 MSC의 연골 세포 분화 자극 및 치료 효과

간엽 전구세포가 손상된 연골의 재생 능에 관여하기 때문에 (Johnson, K. et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science 336, 717-721, doi:10.1126/science.1215157 (2012)., Jiang, Y. & Tuan, R. S. Origin and function of cartilage stem/progenitor cells in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol 11, 206-212, doi:10.1038/nrrheum.2014.200 (2015).), 본원에서는 tankyrase 억제가 MSC에서 연골 분화에 어떻게 영향을 미치는지를 조사했다. Tankyrase 억제제는 마우스 limb-bud mesenchymal 세포의 micromass 배양에서 효과적으로 연골 결절 형성을 유도했다 (도 7a). TNKS1 / 2의 약리학적 저해 및 낙다운은 모두 인간 골수 유래 MSC (hMSCs)의 연골 분화를 효과적으로 향상시켰다 (도 7b, c, d).

또한 히알린(hyaline) 연골의 줄기 세포 기반 수복에 대한 tankyrase 억제 효과를 평가했다. 전체-두께의 골연골 병변은 대조군 또는 TNKS 및 TNKS2 shRNA로 형질 도입 된 hMSC를 함유하는 섬유소 겔로 채웠다. 8주 후, hMSCs- 컨트롤 shRNA로 이식된 병변은 히알린 연골 조직을 완전히 회복하지 못하고 섬유성 연골의 특징을 나타냈다 (도 7e, f 및 도 12). 그러나 hMSCs-shTNKS 및 -shTNKS2로 이식 된 병변은 SOX9 및 연골 특이적 매트릭스 단백질의 강한 발현과 함께 관절 연골과 유사한 히알린 연골이 재생된 것으로 나타났다 (도 7g, h).

연골 조직 내에도 내재적인 MSC가 존재하며 연골 주변의 골수와 활액에는 많은 MSC가 존재하여 연골재생에 관여할 수 있다. 본원에서는 MSC를 활용하여 세포 및 래트에서의 연골 재생 모델에서 Tankyrase 억제에 의해 연골 세포로의 분화촉진을 확인하였기 때문에, 퇴행성 관절염의 연골재생 과정에 MSC의 연골세포로의 분화촉진이 기여할 수 있을 수 있음을 나타낸다. 본원의 연골재생은 크게 연골 조직내 존재하는 연골세포의 연골 기질 단백질 합성 촉진과 MSC의 연골세포로의 분화 촉진에 의해 가능하다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Use of TNKS inhibitors for regeneration of cartilage <130> DP201807002P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNKS1 Sense <400> 1 gcauggagcu uguguuaauu u 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNKS1 Antisens <400> 2 auuaacacaa gcuccaugcu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNKS2 Sense <400> 3 ggaaagacgu aguugaauau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNKS2 Antisense <400> 4 uauucaacua cgucuuuccu u 21

Claims (14)

1. Tankyrase 단백질 또는 유전자의 억제제를 포함하는 관절염 치료용 조성물로, 상기 Tankyrase 단백질 또는 유전자의 억제제는 Sox9 단백질의 상위 조절자로서 상기 Sox9 단백질을 분해를 촉진하는 Tankyrase의 활성을 억제하여 Sox9 단백질을 안정화 또는 상기 Sox 단백질의 농도를 증가시키며,
   상기 Tankyrase 단백질 억제제는 Tankyrase 효소활성 억제제로, 상기 Tankyrase 단백질의 촉매 영역인 ARTD 영역의 니코틴아마이드 서브영역에 결합하는 물질, 아데노신 서브영역에 결합하는 물질 또는 결합 영역이 규명되지 않은 Tankyrase 효소 활성 억제 기능을 가진 결합 억제 물질로서,
   상기 니코틴아마이드 서브영역 결합 Tankyrase 억제제는 XAV939 {3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로베틸)페닐]-4H-씨오피라노[4,3-d]피리미딘-4-원} 또는 MN-64 {2-[4-(1-메틸에틸)페닐]-4H-1-벤조피란-4-원};
   상기 아데노신 서브영역 결합 억제제는 IWR-1 [4-(1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일)-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드], JW55 {N-[4-[[[[테트라하이드로-4-(4-메톡시페닐)-2H-피란-4-일]메틸]아미노]카르보닐]페닐]-2-퓨란카르복사미드}, WIKI4 2-[3-[[4-(4-메톡시페닐)-5-(4-피리디닐)-4H-1,2,4-트리아졸-3-일]씨오]프로필]-1H벤즈[de]이소퀴놀린-1,3(2H)-디온, TC-E5001 {3-(4-메톡시페닐)-5-[[[4-(4-메톡시페닐)-5-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일]씨오]메틸]-1,2,4-옥사디아졸 또는 G007-LK {(E)-4-(5-(2-(4-(2-클로로페닐)-5-(5-(메틸설포닐)피리딘-2-일)-4H-1,2,4-트리아졸-3-yl)비닐)-1,3,4-옥사디아졸-2-일)벤조니트릴}; 및
   상기 결합영역이 규명되지 않은 억제제는 G244-LM {3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-[2-(메틸설포닐)페닐]-1-피페라지닐]-4H-씨오피라노[4,3-d]피리미딘-4-원}, 또는 AZ6102 {rel-2-[4-[6-[(3R,5S)-3,5-디메틸-1-피페라지닐]-4-메틸-3-피리디닐]페닐]-3,7-디하이드로-7-메틸-4H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-원}이고,
   상기 Tankyrase 유전자 억제제는 상기 유전자의 단백질로의 발현을 억제하는 siRNA로, 상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 RNA와 서열번호 2로 표시되는 RNA를 포함하는 dsRNA 또는 서열번호 3으로 표시되는 RNA와 서열번호 4로 표시되는 RNA를 포함하는 dsRNA인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은 연골세포 분화를 촉진하고 연골을 재생하는 것인, 관절염 치료용 약학 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. Tankyrase 및 SOX9을 발현하는 세포를 제공하는 단계;
   상기 세포에 Tankyrase의 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계;
   상기 처리 후 상기 세포에서 상기 SOX9 단백질의 농도를 측정하는 단계; 및
   상기 측정 결과, 상기 시험물질로 처리된 세포에서 처리하지 않은 세포와 비교하여, 상기 SOX9 농도가 증가한 경우, 상기 시험물질을 연골재생 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 연골 재생 약물 스크리닝 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 Tankyase의 활성은 폴리-ADP-라이보실트렌스페라제 활성인, 연골 재생 약물 스크리닝 방법.
   
9. 제 7 항에 있어서,
   상기 세포는 연골 조직 유래의 일차 연골세포인, 연골 재생 약물 스크리닝 방법.
   
10. 제 7 항에 있어서,
    상기 연골 재생 약물은 관절염 치료제로 사용되는 것인, 연골 재생 약물 스크리닝 방법.
    
11. 삭제
12. Tankyrase 발현이 억제되거나 또는 Tankyrase 유전자가 낙다운된 중간엽 줄기세포를 포함하는 관절염 치료용 약학 조성물.
    
13. 삭제
14. 제 12 항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래인, 관절염 치료용 약학 조성물.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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