CN115656505B - 一种检测AChR阻断型抗体的试剂盒、检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测AChR阻断型抗体的试剂盒、检测方法与应用，属于医学检测技术领域，本发明提供了可代替α‑BGT检测AChR阻断型抗体的化合物，该化合物与α‑BGT相比，没有毒性，且价格便宜，容易得到，高温处理后仍然可以检出AChR阻断型抗体。本发明还提供了通过使用该化合物检测AChR阻断型抗体的方法。本发明所述的化合物无需放射性碘或其它物质标记，减少成本的同时，也避免了放射性物质对环境的影响以及对实验人员的危害，绿色环保。本发明所述的化合物还可以与血清样本同时孵育，缩短了检测时间，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，尤其涉及一种检测AChR阻断型抗体的试剂盒、检测方法与应用。
背景技术
重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)是一种由自身抗体介导的获得性神经－肌肉传递障碍的自身免疫性疾病，临床主要表现为部分或全身骨骼肌无力、易疲劳，活动后症状加重，经休息后症状减轻。乙酰胆碱受体(AChR)抗体是MG最主要的致病性抗体，根据以往文献报道，AChR抗体根据其不同的效应机制可以分为三种类型：结合型(binding)、阻断型(blocking)和调节型(modulating)。AChRbinding抗体可与受体结合的同时激活补体系统，在神经肌肉接头处(NMJ)的突触后膜形成膜攻击复合物，导致严重的终板膜损伤，从而引起受体和受体相关蛋白结构破坏；modulating抗体的交联作用，可以使结合的受体发生内化并使其加速降解，导致AChR表达缺失；blocking抗体可以直接结合在受体上的乙酰胆碱结合位点，从而阻断受体与乙酰胆碱的结合，引起乙酰胆碱结合位点的功能性阻断，导致肌肉收缩不良。
在MG患者中，约50％～60％的眼肌型MG、85％～90％的全身型MG血清中可检测到AChR抗体，有研究称AChR binding和blocking抗体双阳，基本出现于全身型MG，且抗体双阳的患者预后更差，胸腺瘤风险增大。然而在眼肌型和轻度全身型MG患者中发现的更多的是仅blocking或binding抗体单阳，此外，仅有blocking抗体的患者均出现于眼肌型，所以检测blocking AChR抗体在辅助诊断眼肌型和全身型MG、尤其是binding AChR抗体阴性的患者中具有重要的实用价值。而MG患者中儿童及青少年高达50％，且以眼肌型为主，很少向全身型转化，总体来说眼肌型MG患病率较高，因此检测AChR阻断型抗体对MG患者的诊断和预后具有重要的意义。
α-银环蛇毒素(alpha-bungarotoxin，α-BGT)是从银环蛇毒液中提取的一种肽类，由于α-BGT可高度选择性地与AchR的α-亚单位结合，因此广泛应用于AchR抗体的检测。目前，AChR阻断型抗体血清学检测应用最广泛的检测方法是放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation，RIPA)，即先使样本中的AChR阻断型抗体与AChR结合，再加入125I放射标记的α-银环蛇毒素(125I-α-bungarotoxin，125I-α-BGT)与受体上的剩余结合位点结合，受体随Sepharose-ConA沉淀，离心后，沉淀中含有125I-α-BGT，通过测定沉淀的放射性得到125I-α-BGT的含量，与原始样本中AChR-blocking抗体的浓度成反比。
但现有技术仍存在以下缺陷和不足：
1)α-BGT是一种毒素，具有一定毒性，且不易获得；
2)RIPA检测AChR阻断型抗体时不仅要用到α-BGT，还需要用放射性同位素125I标记，放射性碘的制造和处理都是昂贵的，对环境的影响更大，对实验人员也具有一定的危害性，不仅如此还需对接触放射性物质的实验室人员进行相关的培训以及安全监测；
3)RIPA检测AChR阻断型抗体，要先使样本中的AChR阻断型抗体与AChR结合，这个过程约2h，有的甚至更长需要过夜，之后再加入125I-α-BGT与AChR上的剩余结合位点结合，整个实验过程比较耗时。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测AChR阻断型抗体的试剂盒、检测方法与应用，利用氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、卡巴胆碱或顺苯磺阿曲库铵检测AChR阻断型抗体的安全性更高，且上述化合物成本更低、容易得到。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种化合物在制备检测AChR阻断型抗体试剂中的应用，所述化合物包括氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、卡巴胆碱或顺苯磺阿曲库铵。
优选的，所述氯化乙酰胆碱溶液的浓度为0.2mg/mL～100mg/mL；所述溴化乙酰胆碱溶液的浓度为0.2mg/mL～125mg/mL；所述卡巴胆碱溶液的浓度为0.01mg/mL～100mg/mL；所述顺苯磺阿曲库铵溶液的浓度为0.05mg/mL～50mg/mL。
本发明提供了一种检测AChR阻断型抗体的试剂盒，所述试剂盒包括工作液、阻断试剂、AChR细胞爬片和pcDNA3.1细胞爬片，所述阻断试剂为上述的化合物溶液。
优选的，所述工作液为PBST或PBS，更优选为PBST。
所述阻断试剂为上述化合物溶液，所述化合物溶液(如氯化乙酰胆碱溶液、溴化乙酰胆碱溶液、卡巴胆碱溶液或顺苯磺阿曲库铵溶液等)由工作液配得。
优选的，所述试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
本发明提供了一种基于CBA法检测AChR阻断型抗体的方法，包括以下步骤：
将上述的工作液稀释的血清作为未阻断组一抗，将上述的阻断试剂稀释的血清作为阻断组一抗，分别与加样区的细胞爬片反应，洗涤后，再将荧光标记的二抗与处理的细胞爬片孵育，通过对比阻断组与未阻断组荧光信号的变化情况判断血清中的AChR抗体是否为阻断型。
优选的，所述反应的时间为2～3h。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了可代替α-BGT检测AChR阻断型抗体的化合物，所述化合物与α-BGT相比，没有毒性，且价格便宜，容易得到，高温处理后仍然可以检出AChR阻断型抗体；
(2)本发明还提供了检测AChR阻断型抗体方法，本发明所述的化合物无需放射性碘或其它物质标记，减少成本的同时，也避免了放射性物质对环境的影响以及对实验人员的危害，绿色环保；
(3)本发明提供了检测AChR阻断型抗体方法，本发明所述的化合物可以与血清样本同时孵育，缩短了检测时间，提高了检测效率。
附图说明
图1为贴有AChR细胞爬片和pcDNA3.1细胞爬片的载玻片；
图2为表2中的阻断试剂对5号血清的阻断结果；
图3为表2中的阻断试剂对8号血清的阻断结果；
图4为表2中的阻断试剂对19号血清的阻断结果；
图5为表2中的阻断试剂对22号血清的阻断结果；
图6为氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、卡巴胆碱和顺苯磺酸阿曲库铵阻断试剂经高温处理后，对5号血清的阻断结果。
具体实施方式
本发明提供了一种化合物在制备检测AChR阻断型抗体试剂中的应用，所述化合物包括氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、卡巴胆碱或顺苯磺阿曲库铵。
在本发明中，所述化合物能与乙酰胆碱受体上的乙酰胆碱结合位点结合，可与AChR阻断型抗体竞争性结合AChR，可用于检测AChR阻断型抗体。本发明的化合物可以替代α-BGT，且无毒、价格便宜、易得，高温处理后仍然可以检出AChR阻断型抗体。
作为一种优选的实施方式，所述氯化乙酰胆碱溶液的浓度为0.2mg/mL～100mg/mL；所述溴化乙酰胆碱溶液的浓度为0.2mg/mL～125mg/mL；所述卡巴胆碱溶液的浓度为0.01mg/mL～100mg/mL；所述顺苯磺阿曲库铵溶液的浓度为0.05mg/mL～50mg/mL。本发明的化合物溶液(如氯化乙酰胆碱溶液、溴化乙酰胆碱溶液、卡巴胆碱溶液或顺苯磺阿曲库铵溶液等)通过工作液配制得到。
本发明还提供了一种检测AChR阻断型抗体的试剂盒，所述试剂盒包括工作液、阻断试剂、AChR细胞爬片和pcDNA3.1细胞爬片，所述阻断试剂为上述的化合物溶液。
在本发明中，上述化合物(如氯化乙酰胆碱溶液、溴化乙酰胆碱溶液、卡巴胆碱溶液或顺苯磺阿曲库铵溶液等)可以用于所有检测AChR阻断型抗体的实验方法，包括但不限于ELISA、WB、免疫荧光技术、流式细胞术等，所述化合物可以依据阻断原理应用于所选实验方法。
在本发明中，所述工作液优选为PBS或PBST，更优选为PBST。本发明对稀释比例没有特殊限定，只要能够保证阻断试剂检测AChR阻断型抗体时，未阻断组的特异性荧光染色信号与阻断试剂的有明显差异即可。本发明中的AChR细胞爬片和pcDNA3.1细胞爬片的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的制备方法即可，如申请号为202111021985.2，专利名称为一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用中所述的制备方法。在本发明中，将AChR细胞爬片和pcDNA3.1细胞爬片贴在载玻片上如图1所示，所述载玻片有两个加样区，加样区1和加样区2；所述加样区1为未阻断组加样区，加样区2为阻断组加样区；所述加样区1和加样区2均贴有2张细胞爬片，左边为AChR细胞爬片，右边为pcDNA3.1细胞爬片；
在本发明中，所述试剂盒还优选的包括洗涤液，所述洗涤液优选为磷酸盐缓冲液，进一步的，所述磷酸盐缓冲液优选为PBST或PBS。本发明对PBST或PBS的来源没有特殊限定，采用本领域公知的市售产品或制备方法制备得到。
本发明提供了一种基于CBA法检测AChR阻断型抗体的方法，包括以下步骤：
将上述的工作液稀释的血清作为未阻断组一抗，将上述的阻断试剂稀释的血清作为阻断组一抗，分别与加样区的细胞爬片反应，洗涤后，再将荧光标记的二抗与处理的细胞爬片孵育，通过对比阻断组与未阻断组荧光信号的变化情况判断血清中的AChR抗体是否为阻断型。
在本发明中，上述加样区加入的溶液(包括一抗、二抗以及洗涤液)体积优选为100μL。
在本发明中，所述反应的时间优选为2～3h。本发明将用PBST稀释的血清作为未阻断组，用上述化合物溶液稀释的血清作为阻断组，分别孵育对应加样区的AChR细胞爬片，与未阻断组做平行对照，阻断组中化合物可以与AChR的乙酰胆碱结合位点结合，从而阻断AChR阻断型抗体与其的结合，由于阻断组中化合物阻断了AChR阻断型抗体与细胞爬片上表达的AChR的结合，而未阻断组AChR阻断型抗体与细胞爬片上表达的AChR正常结合，所以与未阻断组AChR阻断型抗体的特异性荧光染色对比，阻断组的特异性荧光染色明显减弱，即AChR阻断型抗体阳性信号被阻断，则该血清中的AChR抗体为阻断型。本发明在荧光显微镜下观察结果，结果判断如表1所示：
表1结果判断
本发明判断血清中的AChR抗体是否为阻断型方法为：(1)若未阻断组AChR为阳性，且与未阻断组相比阻断组AChR细胞爬片的特异性荧光染色明显减弱或阻断组为阴性，即AChR抗体阳性信号被阻断，则该血清中的AChR抗体是阻断型；(2)若未阻断组AChR为阳性，且与未阻断组对比阻断组AChR细胞爬片的特异性荧光染色基本无变化，即AChR抗体阳性信号未被阻断，则该血清中的AChR抗体不是阻断型，为结合型或调节型；(3)若未阻断组与阻断组AChR均为阴性，则该血清中的没有AChR抗体；(4)若未阻断组AChR细胞爬片的特异性荧光染色很强，阻断组与其相比减弱不明显，可先通过增加一抗中化合物含量或减少一抗中血清抗体含量，将血清继续稀释至合适比例，再通过上述实验步骤验证，明显减弱则该血清中AChR抗体为阻断型。
本发明中，所述增加一抗中化合物含量或减少一抗中血清抗体含量的方式，可以是使用范围内更高浓度的阻断试剂稀释血清至1：10，仅通过增加一抗中化合物含量以达到更明显的阻断效果；还可以是先将血清用PBST稀释至1：100、1：1000等比例(本发明对该稀释比例没有特殊限定，只要能够保证阻断试剂检测AChR阻断型抗体时，未阻断组的特异性荧光染色信号与阻断试剂的有明显差异即可)，使血清中被检测抗体浓度降低，再使用原浓度阻断试剂稀释血清至1：10，仅通过减少一抗中血清抗体含量以达到更明显的阻断效果；还可以是用范围内更高浓度的阻断试剂以更高稀释比例如1：100稀释血清，通过增加一抗中化合物含量同时减少一抗中血清抗体含量，以达到更明显的阻断效果。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在以下的实施例中，本发明采用的待测样品为AChR自身抗体阳性血清26例，将这些血清编号为1～26，用现有的放射性免疫法检测26例AChR自身抗体阳性血清，有7例为放射免疫法检出的AChR自身抗体阻断型，即AChR阻断型抗体阳性，序号分别为5、8、12、14、17、19、22。
实施例1基于CBA法用氯化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
1、用氯化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
将上述26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1:10稀释(即90μL PBST+10μL血清)，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL氯化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：
(1)取用于检测AChR阻断型抗体得检测材料，所述检测材料为贴有AChR细胞爬片和pcDNA3.1细胞爬片的载玻片如图1所示；
(2)一抗孵育：将一抗A加入加样区1，将一抗B加入加样区2，孵育时间1h；
(3)一抗洗脱：使用PBST洗涤3次，每次5min，得到处理的细胞爬片；
(4)二抗孵育：用FITC标记的二抗与处理的细胞爬片孵育时间30min；
(5)二抗洗脱：使用PBST洗涤3次，每次5min；
(6)封片：用甘油进行封片；
(7)观察结果：在荧光显微镜下观察结果，与未阻断组AChR抗体的特异性荧光染色对比，阻断组的特异性荧光染色明显减弱，即AChR抗体阳性信号被阻断，则该血清中的AChR抗体为阻断型。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有7例血清明显降低，血清序号分别为5、8、12、14、17、19、22，其余血清基本无变化。
2、用经过高温处理的氯化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
将已有的26例放射免疫法检出的AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL 100℃高温处理30min后的氯化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和上述实验步骤相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有7例血清明显降低，血清序号分别为5、8、12、14、17、19、22，其余血清基本无变化。
实验结论：在CBA方法中，氯化乙酰胆碱溶液对AChR阻断型抗体有阻断作用，7例AChR阻断型抗体阳性血清均可检出；经过高温处理后，对这7例血清仍有阻断作用，均可检出。
实施例2基于CBA法用溴化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
1、用溴化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL溴化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有7例血清明显降低，血清序号分别为5、8、12、14、17、19、22，其余血清基本无变化。
2、用经过高温处理的溴化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL 100℃高温处理30min后的溴化乙酰胆碱将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有7例血清明显降低，血清序号分别为5、8、12、14、17、19、22，其余血清基本无变化。
实验结论：在CBA方法中，溴化乙酰胆碱对AChR阻断型抗体有阻断作用，7例AChR组阻断型抗体阳性血清均可检出；经过高温处理后，对这7例血清仍有阻断作用，均可检出。
实施例3基于CBA法用卡巴胆碱检测AChR阻断型抗体
1、用卡巴胆碱检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL卡巴胆碱将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有6例血清明显降低，血清序号分别为5、12、14、17、19、22，其余血清基本无变化。
2、用经过高温处理的卡巴胆碱检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释记为一抗A，用2mg/mL 100℃高温处理30min后的卡巴胆碱溶液将血清按1：10稀释记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有6例血清明显降低，血清序号分别为5、12、14、17、19、22，其余血清基本无变化。
实验结论：在CBA方法中，卡巴胆碱对AChR阻断型抗体有阻断作用，可检出6例AChR阻断型抗体阳性血清；经过高温处理后，对这6例血清仍有阻断作用，均可检出。
实施例4基于CBA法用顺苯磺阿曲库铵检测AChR阻断型抗体1、用顺苯磺阿曲库铵检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL顺苯磺阿曲库铵将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有5例血清明显降低，血清序号分别为5、12、14、17、22，其余血清基本无变化。
2、用经过高温处理的顺苯磺阿曲库铵检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL 100℃高温处理30min后的顺苯磺阿曲库铵溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有5例血清明显降低，血清序号分别为5、12、14、17、22，其余血清基本无变化。
实验结论：在CBA方法中，顺苯磺阿曲库铵对AChR阻断型抗体有阻断作用，可检出5例AChR阻断型抗体阳性血清；经过高温处理后，对这5例血清仍有阻断作用，均可检出。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：本实施例是用0.2mg/mL氯化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B，其余的实验步骤与实施例1相同。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于：本实施例是用100mg/mL氯化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B，其余的实验步骤与实施例1相同。
实施例7
本实施例与实施例2的区别在于：本实施例是用0.2mg/mL溴化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B，其余的实验步骤与实施例2相同。
实施例8
本实施例与实施例2的区别在于：本实施例是用100mg/mL溴化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B，其余的实验步骤与实施例2相同。
实施例9
本实施例与实施例3的区别在于：本实施例是用0.01mg/mL卡巴胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B，其余的实验步骤与实施例3相同。
实施例10
本实施例与实施例3的区别在于：本实施例是用100mg/mL卡巴胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B，其余的实验步骤与实施例3相同。
实施例11
本实施例与实施例4的区别在于：本实施例是用0.05mg/mL顺苯磺阿曲库铵溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B，其余的实验步骤与实施例4相同。
实施例12
本实施例与实施例4的区别在于：本实施例是用50mg/mL顺苯磺阿曲库铵溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B，其余的实验步骤与实施例4相同。
对比例1基于CBA法用α-BGT检测AChR阻断型抗体
1、用商品化α-BGT检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用0.1mg/mL商品化α-BGT将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：与实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有5例血清明显降低，血清序号分别为5、8、12、14、17、19，其余血清基本无变化。
2、通过原核表达获得的重组α-BGT检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用0.1mg/mL重组α-BGT将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和上述实验步骤相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有5例血清明显降低，血清序号分别为5、8、12、14、17、19，其余血清基本无变化。
3、用经过高温处理的α-BGT检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL 100℃高温处理30min后的α-BGT将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和上述实验步骤相同
实验结果：这26例AChR自身抗体阳性血清，在AChR细胞爬片上的特异性染色，阻断组与未阻断组相比阳性信号的荧光强度均一致。
实验结论：购买的商品化α-BGT和本实验室表达纯化的重组α-BGT，在CBA方法中，对AChR阻断型抗体的阻断作用一致，5例AChR阻断型抗体阳性血清均可检出；但是α-BGT经过高温处理后，对这5例血清均没有阻断作用，所以全部未检出。
对比例2基于CBA法用维库溴铵胆碱检测AChR阻断型抗体
1、用维库溴铵检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL维库溴铵溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有3例血清明显降低，血清序号分别为5、14、17，其余血清基本无变化。
2、用经过高温处理的维库溴铵检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL 100℃高温处理30min后的维库溴铵溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有3例血清明显降低，血清序号分别为5、14、17，其余血清基本无变化。
实验结论：在CBA方法中，维库溴铵对AChR阻断型抗体有阻断作用，可检出3例AChR阻断型抗体阳性血清；经过高温处理后，对这3例血清仍有阻断作用，均可检出。
对比例3基于CBA法用碘化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
1、用碘化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL碘化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有2例血清明显降低，血清序号分别为17、22，其余血清基本无变化。
2、用经过高温处理的碘化乙酰胆碱检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL 100℃高温处理30min后的碘化乙酰胆碱溶液将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，有2例血清明显降低，血清序号分别为17、22，其余血清基本无变化。
实验结论：在CBA方法中，碘化乙酰胆碱对AChR阻断型抗体有阻断作用，可检出2例AChR阻断型抗体阳性血清；经过高温处理后，对这2例血清仍有阻断作用，均可检出。
对比例4基于CBA法用其他无关蛋白检测AChR阻断型抗体
取本实验室一些与AChR无关的蛋白CV2、Ma2、Titin、PKC、Recoverin、GAD65、Zic4、SOX1、Tr、S100B，分别将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用2mg/mL CV2、Ma2、Titin、PKC、Recoverin、GAD65、Zic4、SOX1、Tr、S100B将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，所有蛋白的阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，所有血清基本无变化。
实验结论：与实施例相比，其他无关蛋白不与AChR阻断型抗体竞争结合位点，对AChR阻断型抗体没有阻断作用，7例AChR阻断型抗体阳性血清全部未检出，所以其他无关蛋白不能用于检测AChR阻断型抗体。
对比例5基于CBA法用相同摩尔浓度的盐溶液检测AChR阻断型抗体
将已有的26例AChR自身抗体阳性血清，每份血清制备两份一抗，用PBST将血清按1：10稀释，作为未阻断组一抗记为一抗A，用0.64mg/mLNaCl将血清按1：10稀释，作为阻断组一抗记为一抗B。
实验步骤：和实施例1相同。
实验结果：在26例AChR自身抗体阳性血清中，阻断组与未阻断组在AChR细胞爬片上特异性染色的荧光强度相比，所有血清基本无变化。
实验结论：与实施例1相比，相同摩尔浓度的NaCl不与AChR阻断型抗体竞争结合位点，对AChR阻断型抗体没有阻断作用，7例AChR阻断型抗体阳性血清全部未检出，所以其他无关蛋白不能用于检测AChR阻断型抗体。
实验结论总结：
实施例和对比例中所有物质用CBA法检测已有的26例AChR自身抗体阳性血清，AChRblocking抗体检出情况如表2所示：
表2不同化合物检测AChRblocking抗体的检出情况
表2中阻断试剂对部分血清的阻断结果如图2、3、4、5所示，其中图2为5号血清，图3为8号血清，图4为19号血清，图5为22号血清。表2中部分阻断试剂(如氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、卡巴胆碱和顺苯磺酸阿曲库铵)经高温处理后，对5号血清的阻断结果如图6所示。
由表2和图2～5可知，不同的胆碱衍生物都能与AChRblocking抗体竞争AChR结合位点，但竞争能力不同，所以对含AChRblocking抗体的血清也有不同的阻断作用，其中一部分化合物与α-BGT相比可以检出的血清更多，可以代替α-BGT检测AChRblocking抗体，检测结果更加准确，例如氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、卡巴胆碱；而还有一部分对部分α-BGT可以检出的血清没有明显阻断作用，还不能完全代替α-BGT，例如维库溴铵和碘化乙酰胆碱。
如图6所示，氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、卡巴胆碱和顺苯磺酸阿曲库铵经高温处理后，仍有阻断作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.氯化乙酰胆碱溶液在制备检测AChR阻断型抗体试剂中的应用，其特征在于，用工作液稀释的血清作为未阻断组，用氯化乙酰胆碱溶液稀释的血清作为阻断组；
判断血清中的AChR抗体是否为阻断型方法为：(1)若未阻断组AChR为阳性，且与未阻断组相比阻断组的阳性信号明显减弱或阻断组为阴性，即AChR抗体阳性信号被阻断，则该血清中的AChR抗体是阻断型；(2)若未阻断组AChR为阳性，且与未阻断组对比阻断组的阳性信号基本无变化，即AChR抗体阳性信号未被阻断，则该血清中的AChR抗体不是阻断型，为结合型或调节型；(3)若未阻断组与阻断组AChR均为阴性，则该血清中的没有AChR抗体；
所述工作液为PBST或PBS。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氯化乙酰胆碱溶液的浓度为0.2mg/mL～100mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，基于CBA法检测AChR阻断型抗体的方法，包括以下步骤：
将工作液稀释的血清作为未阻断组一抗，将所述的氯化乙酰胆碱溶液稀释的血清作为阻断组一抗，分别与加样区的细胞爬片反应，洗涤后，再将荧光标记的二抗与细胞爬片孵育，通过对比阻断组与未阻断组荧光信号的变化情况判断血清中的AChR抗体是否为阻断型；
所述细胞爬片为AChR细胞爬片和pcDNA3.1细胞爬片。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述反应的时间为2～3h。
5.一种检测AChR阻断型抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括工作液、阻断试剂、AChR细胞爬片和pcDNA3.1细胞爬片，所述阻断试剂为权利要求1或2所述的氯化乙酰胆碱溶液；所述工作液为PBST或PBS。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液。
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