CN101343639A - 一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用。所述的真核表达穿梭载体，是一种环状载体，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次由两个转录方向相同的启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述连接片段含有EcoRV识别序列。用本发明的真核表达穿梭载体构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，并且该载体含有两个真核复制起点，可以在表达T抗原的细胞中大量增值，从而提高蛋白表达的水平。本发明的真核表达穿梭载体具有很好的应用前景。

Description

一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用。

背景技术

哺乳动物细胞真核表达载体是目前市场中最常见的表达载体之一，被广泛的应用于科研，生产等领域。与原核蛋白表达载体相比，由哺乳动物细胞翻译的蛋白，经过翻译后的加工修饰过程，所以在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。目前已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和生产，有些产品已投入临床应用或试用。

目前市场上使用的真核表达蛋白质粒构建表达外源基因质粒的过程中，是通过传统的连接方法连接的，首先选择合适的酶切位点，要求连接的外源基因片段中没有所选择的酶切位点，然后用限制性内切酶酶切载体与外源基因片段，再用T4DNA连接酶将载体与目的片段连接成一个完整的质粒。传统的这种酶切的连接方法存在步骤比较烦琐，成本高(需要购买内切酶与连接酶)，连接效率较低等问题，在构建过程中PCR产物与载体都要通过反复的酶切，电泳，回收等步骤，才能进行进一步的连接。

发明内容

本发明的目的是提供一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用。

本发明所提供的真核表达穿梭载体是一种环状载体，命名为pHP-DSV40，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次由两个转录方向相同的启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述连接片段含有EcoRV识别序列。

其中，所述真核复制起点具体可为SV40病毒复制起点。所述两个转录方向相同的启动子具体可为巨细胞病毒启动子和T7噬菌体启动子；所述多聚腺苷酸加尾信号具体可为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述两个真核复制起点的位置没有特别的限制，最好尽量均分于所述环状载体的中。

本发明的pHP-DSV40的核苷酸序列具体为序列表中的序列1。

本发明还提供了一种线性的载体。

所述线性的载体是用EcoRV酶切pHP-DSV40得到的。

本发明的另一个目的是提供pHP-DSV40的构建方法。

本发明所提供的pHP-DSV40的构建方法，包括如下步骤：

1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’和5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’进行PCR扩增，得到片段A；

2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC3’和5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3’进行PCR扩增，得到片段B；

3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体I；

4)以重组载体I为模板，用如下引物：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3’和5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’进行PCR扩增，得到片段D；

5)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：

5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’或5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’进行PCR扩增，得到片段C；

6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体II；

7)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’

GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG 3’和5’

GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG3’进行PCR扩增，得到片段F；

8)以重组载体II为模板，用如下引物：5’

CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC 3’和5’

CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’进行PCR扩增，得到片段E；

9)将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，获得pHP-DSV40。

本发明的pHP-DSV40可作为外源基因的表达载体，导入能表达SV40大T抗原的肿瘤细胞中，来表达外源蛋白。

以本发明的pHP-DSV40为出发载体，利用同源重组构建表达外源基因的重组载体，避免了传统的酶切，连接等环节，整个构建过程中不使用任何内切酶与连接酶，且比传统的连接过程省略了2-3个步骤，连接的效率也较理想。使用本发明的pHP-DSV40构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。本发明的pHP-DSV40含有两个真核复制起点，可以在表达T抗原的细胞中大量增值，从而提高蛋白表达的水平。本发明的真核表达穿梭载体具有很好的应用前景。

附图说明

图1为pHP-DSV40图谱。

图2为绿色荧光蛋白的荧光显微镜观察结果。

具体实施方式

实施例1、pHP-DSV40的构建

1)pHP的构建

设计引物pHP Vector1上游和pHP Vector1下游、pHP Vector2上游和pHPVector2下游，引物pHP Vector1上游和pHP Vector1下游、pHP Vector2上游和pHP Vector2下游的序列如下：

pHP Vector1上游：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG 3’；

pHP Vector1下游：5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’。

pHP Vector2上游：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC 3’(划线部分为EcoR V酶识别位点)；

pHP Vector2下游：5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACA TGT 3’。

以pEGFP-N1(Invitrogen)质粒为模板，用引物pHP Vector1上游和pHP Vector1下游PCR扩增片段A，以pCDNA3.0质粒为模板，用引物pHP Vector2上游和pHPVector2下游PCR扩增片段B。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段A和B后混匀，片段A和B质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pHP。

2)pHP-SV40的构建

设计引物SV40(1)上游和SV40(1)下游、pHP Vector(1)上游和pHP Vector(1)下游，引物SV40(1)上游和SV40(1)下游、pHP Vector(1)上游和pHP Vector(1)下游序列如下：

SV40(1)上游：5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’；

SV40(1)下游：5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC3’。

pHP Vector(1)上游：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3’；

pHP Vector(1)下游：5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG3’。

以pEGFP-N1质粒为模板，用引物SV40(1)上游和SV40(1)下游PCR扩增片段C；以pHP Vector质粒为模板，用引物pHP Vector(1)上游和pHP Vector(1)下游PCR扩增片段D。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段C和D后混匀，片段C和D质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pHP-SV40。

2)pHP-DSV40的构建

设计引物SV40(2)上游和SV40(2)下游、pHP Vector(2)上游和pHP Vector(2)下游，引物SV40(2)上游和SV40(2)下游、pHP Vector(2)上游和pHP Vector(2)下游序列如下：

SV40(2)上游：CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC；

SV40(2)下游：CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC。

pHP Vector(2)上游：GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG；

pHP Vector(2)下游：GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG。

以pEGFP-N1质粒为模板，用引物SV40(2)上游和SV40(2)下游PCR扩增片段E；以pHP-SV40 Vector质粒为模板，用引物pHP Vector(2)上游和pHP Vector(2)下游PCR扩增片段F。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段C和D后混匀，片段C和D质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该载体命名为pHP-DSV40，pHP-DSV40图谱如图1所示。

挑取单克隆提取质粒，将pHP-DSV40测序，测序结果表明，pHP-DSV40的核苷酸序列如序列表中的序列1，序列1自5′末端第1-712位为CMV启动子，自5′末端第712-716位为EcoR V酶的识别序列，自5′末端第716-1071位为BGH Ploy A，，自5′末端第1072-1223位为SV40 Origin，自5′末端第1224-1843位为COIE1Origin，自5′末端第1844-3034位为氨苄青霉素抗性基因，自5′末端第3035-3195位为SV40 Origin。序列1的自5′端第700-715位的核苷酸序列和序列1的自5′端第716-730位的核苷酸序列为能与外源基因上的PCR扩增产物发生同源序列重组的序列。

实施例2、pHP-DSV40表达蛋白的能力

1)表达绿色荧光蛋白的pHP-DSV40的构建

设计引物EGFP上游和EGFP下游，引物EGFP上游和EGFP下游序列如下：

EGFP上游：GGAA TTCTGCAGAT TCGCCACCATGGTGAG；

EGFP下游：A TGCA TGCTCGAGGAT TTACTTGTACAGCTCG。

引物中GGAATTCTGCAGAT和ATGCATGCTCGAGGAT序列为能与序列1的自5′端第700-715位的核苷酸序列和序列1的自5′端第716-730位的核苷酸序列发生同源重组的序列。

以pEGFP-N1质粒为模板，用引物EGFP上游和EGFP下游PCR扩增EGFP基因片段。

反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

pHP-DSV40用StuI内切酶酶切线性化，回收线性化的pHP-DSV40。

酶切体系如下：

10×D buffer10μl，BSA 1μl，EcoRV 2μl(20U PROMEGA公司购买)，pHP-DSV4050μl，补水至100μl，37℃酶切过夜。

酶切产物在1×TAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，120v，电泳30分钟，DNA回收试剂盒回收目的片段。回收产物-80℃保存备用。

50μl感受态细胞中加入线性化的pHP-DSV40和EGFP基因片段后混匀，线性化的pHP-DSV40和EGFP基因片段质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pHP-DSV40-EGFP。

2)绿色荧光蛋白的的检测

取10ul lipofectamine 2000(Invitrogen公司)加入到250ul的OPTI-MEMI培养基(Invitrogen公司)中，室温放置5分钟，获得溶液1；将5ug pHP-DSV40-EGFP质粒加入到250ul的OPTI-MEMI培养基中，获得溶液2；将溶液1和2混合，室温孵育20分钟，再加入500ul的OPTI-MEMI培养基，得到溶液3。

将293T细胞置于6孔细胞板中培养，等待细胞长至60-80％时将细胞用PBS洗涤两次，然后加入溶液3，37℃孵育5个小时，吸出溶液3，加入新鲜的OPTI-MEMI培养基，继续培养。培养24h后，在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。

以pEGFP-N1质粒转染的293T细胞作为阳性对照，以未转染任何质粒的细胞作为阴性对照。

荧光显微镜结果如图2所示，表明pHP-DSV40-EGFP转染后24小时293T细胞(图2C)有较强的荧光信号，阳性对照(图2B)也有荧光出现，而阴性对照组(图2A)没有荧光，而且pHP-DSV40-EGFP的荧光强度明显强于阳性对照pEGFP-N1，说明具有两个真核复制子的的pHP-DSV40质粒具有良好的蛋白表达能力。

图2中，A为阴性对照；B为阳性对照；C为pHP-DSV40-EGFP质粒转染的细胞。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用

<130>CGGNARW81623

<160>1

<210>1

<211>3195

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc  60

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa  120

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac  180

tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca  240

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg  300

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt  360

agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg  420

gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg  480

gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat  540

gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc taactagaga  600

acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga cccaagcttg    660

gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattctg cagatatcct    720

cgagcatgca tctagagggc cctattctat agtgtcacct aaatgctaga gctcgctgat    780

cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt    840

ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat    900

cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg    960

gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg    1020

aggcggaaag aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca cgcgccctgt agcggcgatc    1080

ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt    1140

atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc    1200

ttttttggag gcctaggctt ttgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc    1260

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga    1320

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata    1380

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac    1440

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg    1500

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc    1560

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag    1620

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt    1680

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt    1740

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg    1800

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac    1860

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca    1920

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac    1980

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac    2040

ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt    2100

tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt    2160

accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt    2220

atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc    2280

cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa    2340

tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg    2400

tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt    2460

gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc    2520

agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt    2580

aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg    2640

gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac    2700

tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc    2760

gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt    2820

tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg    2880

aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag    2940

catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa    3000

acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtcc aaaagcctag    3060

gcctccaaaa aagcctcctc actacttctg gaatagctca gaggccgagg cggcctcggc    3120

ctctgcataa ataaaaaaaa ttagtcagcc atggggcgga gaatgggcgg aactgggcgg    3180

agttaggggc gggat                                                     3195

Claims (7)

1、一种环状载体，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次由两个转录方向相同的启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述连接片段含有EcoRV识别序列。

2、根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述真核复制起点为SV40病毒复制起点。

3、根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述两个转录方向相同的启动子为巨细胞病毒启动子和T7噬菌体启动子；所述多聚腺苷酸加尾信号为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。

4、根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。

5、权利要求4所述载体的构建方法，包括如下步骤：

1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’和5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’进行PCR扩增，得到片段A；

2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC3’和5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3’进行PCR扩增，得到片段B；

3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体I；

4)以重组载体I为模板，用如下引物：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3’和5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’进行PCR扩增，得到片段D；

5)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：

5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’或5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’进行PCR扩增，得到片段C；

6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体II；

7)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG3’和5’GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG3’进行PCR扩增，得到片段F；

8)以重组载体II为模板，用如下引物：5’CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC3’和5’CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’进行PCR扩增，得到片段E；

9)将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，获得权利要求4所述的载体。

6、一种线性的载体，是用EcoRV酶切权利要求1至4中任一所述的载体得到的线性载体。

7、在表达SV40大T抗原的肿瘤细胞中，权利要求1至4中任一所述载体表达外源蛋白的应用。

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