CN101338308B - 酶制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶制剂，其可以通过固定在惰性载体上的酶或含酶微生物的酶固定物获得，所述酶固定物提供有通过氢化硅烷化获得的聚硅氧烷涂层，本发明还涉及这种酶制剂的制备方法和酶制剂作为工业生物催化剂的用途。

Description

酶制剂
技术领域
本发明涉及用作生物催化剂的新的酶制剂。
背景技术
微生物和分离的酶广泛用作化学工业或食品制造中的催化剂。例如A.Liese，K.Seelbach，C.Wandrey，Industrial Biotransformations，Wiley-VCH：2000，Weinheim，Germany提供了综述。
为了保证经济使用这些生物催化剂，必需满足一些条件：生物催化剂必需在反应条件下保持活性足够长时间，在反应结束之后应容易除去并且应尽可能多次重复使用。理想地，应当在非常广泛的反应条件(例如温度范围、所用溶剂类型、压力，等)下满足这些条件，以提供尽可能通用的催化剂。
为了满足这些条件，通常需要将所用酶或含有酶的微生物固定。
通常，酶或含酶微生物非共价地固定在载体上；所用载体经常是具有适当粒度分布的离子交换树脂或聚合物颗粒。其实例有市售产品得自Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark的Novozym 435、Lipozym RM IM或Lipozym TL IM或者得自Amano，Japan的Amano PS。这些实例是具有广泛用途的固定脂肪酶，由于这些固定物在非水系统，即，仅包括有机溶剂(即使有的话)的系统，中也具有工业可利用的活性，例如J.Chem.Soc.，Chem.Comm.1989，934-935中所述。然而使用这种固定物的缺陷首先是根据所用反应系统发生的酶或含酶微生物的解吸附，例如在使用表面活性剂组分的情况下。在对比实施例1中显示与这种解吸附有关的活性损失。此外，这种制剂不具有足够的机械稳定性，结果，即使能使用，仅可以在接受大大受限制的重复使用性的情况下，在简单的搅拌反应器中使用。在对比实施例2中显示了这些制剂的机械不稳定。
为了能够重复使用这些酶制剂，需要使用其它反应器设计。例如，Eur.J.Lipid Sci.Technol.2003，105，601-607描述了使用固定床反应器进行脂肪酶-催化的酯化反应。然而，该方法的缺陷是限于低粘度均匀反应混合物，这是由于高粘度混合物或悬浮体不能通过固定床运送。
K.Faber″Biotransformations in Organic Chemistry″，Springer：2000，Berlin，Germany在第384页描述了使用加入到海藻酸盐中的酶。然而，由此获得的制剂具有极其低的机械稳定性并且在非水系统中仅呈现低的活性。
此外，描述了固定酶与反应物质(例如戊二醛)的随后交联。然而，缺陷是与改性之前的活性相比，交联的制剂的比活经常大大降低。而且，该方法不能改善机械稳定性。
同样描述了在反应载体上共价固定酶。其缺陷是在酶表面需要有合适的官能团，其可以与载体反应；此外，结果经常导致酶活损失。
J.Am.Chem.Soc.1999，121，9487-9496描述了将酶加入到称之为溶胶-凝胶的硅氧烷基质中。溶胶-凝胶制剂的缺陷是粒度分布低，使通过过滤的有效去除复杂化、缺少机械稳定性、发生解吸附、使用有毒反应物(TEOS的毒性，例如参见Nippon Sanso Giho 1990，9，68-72和Archives of Toxicology1994，68，277-283；TMOS的毒性例如参见Fundamental and AppliedToxicology 1989，13，285-295)；对于无毒溶胶-凝胶的生产，需要大量步骤，例如贮藏超过6个月或者在350℃下热处理，如Polimery w Medycynie 2000，30，45-54中所述，并且其溶胀性能非常大地取决于所用溶剂并且不能通用于不同反应系统(含水和非水)。J.Sol Gel Sci.Technol.2003，26，1183-1187通过实例显示了观察到的酶活性的溶剂依赖性并因此不能满足广泛使用性的需要。
Landbauforschung 
Figure S2008101282599D00021
2002，special edition 241，41-46描述了其中酶首先固定在“细”聚硅氧烷颗粒上然后包封在溶胶-凝胶中的溶胶-凝胶制剂。因此部分解决了机械稳定性的问题，但是所述实验显示仅在所选溶剂中获得足够的活性；完全没有描述在无溶剂系统中的使用。此外，这些制剂不是以直接可用的形式获得，而是首先必需切成适当大小，这仅仅在工业规模可以实施。
J.Mol.Catal.B，2005，35，93-99描述了通过将酶水溶液加入到称之为静态乳剂的机械稳定的聚硅氧烷球中的固定酶。所得制剂的比活尽管高达33U/g，但是与上述在惰性载体上的固定物相比还太低，其中可以容易地获得大于1000U/g的比活(U＝单位或μmol/min)。
WO 03/106607A1同样描述了这种静态乳剂，但是专门描述了在含水系统中使用；该应用是洗涤组合物，即不是生物催化，并且所得粒度为约10μm，对于从有机反应混合物中有效过滤掉来说太小。
因此一直需要一种酶固定方法，克服现有技术的缺陷，以实现迄今不能实现的生物催化过程。
发明内容
因此，本发明的目的是提供没有现有技术制剂的一种或多种缺陷的酶制剂。具体地说，应提供酶制剂，它相对机械力和解吸附具有高的稳定性，同时优选在不同的含水和非水反应混合物中具有的比活足够高，以能够工业应用。基于它们的粒度分布，酶制剂应优选能够以简单方式从反应系统中除去并且重复使用。
从下面说明书的内容、实施例和权利要求，没有具体解释的其它目的将是显而易见的。
已出人意料地发现，通过将酶或含酶微生物固定在惰性载体上，然后用通过氢化硅烷化获得的聚硅氧烷涂层涂布获得的酶制剂能够实现上述目的。
本发明因此提供了酶制剂以及它们作为工业生物催化剂的用途，该酶制剂可以通过包括固定在惰性载体上的酶或含酶微生物的酶固定物并提供有通过氢化硅烷化获得的聚硅氧烷涂层获得。
本发明还提供了一种制备本发明酶制剂的方法，其特征在于对包括固定在惰性载体上的酶或含酶微生物的酶固定物提供通过氢化硅烷化获得的聚硅氧烷涂层。
本发明的酶制剂具有相对机械应力和解吸附的稳定性高的优点。除了这些改进的性能，本发明的酶制剂在各种含水反应混合物(例如在三丁酸甘油酯的水解中)和非水反应混合物(例如在月桂酸丙酯的无溶剂合成中)中具有工业应用的足够高的比活，本发明的酶制剂也具有通过选择载体材料和其相关粒度分布来调整粒度，使得能够从反应系统中简单地除去酶制剂，并因此也可以重新使用该酶制剂的优点。
具体实施方式
下面通过实例描述本发明的酶制剂及其制备方法，然而本发明决不限于这些描述的实施方案。当下面描述范围、通式或化合物类时，它们不应仅包括明确提及的相应范围或基团，而是也包括通过选择单个值(范围)或化合物获得的所有子范围和次基团。当将文献引入本说明书时，它们的内容应完全加入到本发明的公开内容中。当可能具有多于一个的不同单元的化合物在本发明的内容中描述时，例如有机改性的聚硅氧烷，它们可以以随机分布(统计学低聚物)或规则(嵌段低聚物)存在于这些化合物中。至于在这些化合物中的单元的数目的信息应解释为平均值，所有适合化合物的平均。
本发明的酶制剂显著的是它们可以通过向固定在惰性载体上的包括酶或含酶微生物的酶固定物提供通过氢化硅烷化获得的聚硅氧烷涂层获得。
为了制得该酶固定物，可以使用整个细胞、静止细胞、纯化酶或含有相应酶的细胞提取物、或它们的混合物。优选使用水解酶，例如脂肪酶、酯酶或蛋白酶，例如得自皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、假单胞菌属、Thermomyces langosiosus、猪胰腺、米黑毛霉(Mucor miehei)、Alcaligines sp.的脂肪酶、得自皱褶假丝酵母的胆固醇酯酶、得自猪肝的酯酶，更优选脂肪酶。因此，酶固定物优选包括得自水解酶类的酶，优选脂肪酶。
所用惰性载体可以是惰性有机或无机载体。所用或者存在于酶固定物中的惰性载体优选是具有其中至少90％的颗粒具有10-5000μm，优选50μm-2000μm的粒度的粒度分布的那些微粒载体。所用有机载体尤其可以是那些包含聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、PTFE和/或其它聚合物或者由它们组成。根据待固定的酶，所用载体材料可以特别是酸性或碱性离子交换树脂，例如Duolite A568、Duolite XAD 761、Duolite XAD 1180、Duolite XAD 7HP、Amberlite IR 120、Amberlite IR 400、Amberlite CG 50、Amberlyst 15(都是Rohm and Haas的产品)或Lewatit CNP 105和Lewatit VPOC 1600(Lanxess，Leverkusen，Germany的产品)。所用无机载体可以是现有技术已知的氧化的和/或陶瓷载体。特别是，所用无机载体例如可以是C盐、沸石、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或其它载体，如L.Cao，″Carrier-boundImmobilized Enzymes：Principles，Application and Design″，Wiley-VCH：2005，Weinheim，Germany中所述。更优选，存在于酶固定物中的惰性载体或者用于制备酶固定物的惰性载体包括聚乙烯基苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯。
根据本发明，在颗粒上的固定可以共价或非共价地进行，优选非共价地进行。就非共价固定而言，载体例如可以用酶水溶液(可以任选含有其它组分，例如无机盐或去污剂)培养或浸渍。该培养/浸渍例如可以在0℃-50℃，优选0℃-40℃的温度下进行。优选培养/浸渍进行几分钟到几小时。该培养过程可以随后通过蛋白质测定的常规方法测定溶液中的酶浓度。达到所需固定度之后，载体可以优选用水洗涤，并且如果需要的话，进行干燥。以这种方式获得的酶固定物然后可以提供有本发明的聚硅氧烷涂层。
然而，根据本发明，也可以使用可商购获得的酶固定物，例如得自Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark的Novozym 435、Lipozym RM IM或Lipozym TL IM，或者得自Amano，Japan的Amano PS。
根据本发明，聚硅氧烷涂层是通过氢化硅烷化获得的。为此，优选Si-H-官能的聚硅氧烷在有催化剂，优选过渡金属催化剂的情况下，与具有至少一个末端碳-碳双键，优选至少两个碳-碳双键的有机改性的聚硅氧烷反应。
所用Si-H-官能的聚硅氧烷优选是通式I的SiH聚硅氧烷
Figure S2008101282599D00051
其中
N＝a+b+c+d+2＝3-850，优选6-160，
a＝1-800，优选2-150，
b＝0-400，优选2-75，
c＝0-10，优选0，
d＝0-10，优选0，
R1各自相同或不同，并且选自以下的组：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基，优选具有1-4个碳原子的烷基或苯基，特别是甲基；
R2a各自是氢或R1；
R2b各自是氢或R1；
R3各自是相同或不同的通式Ia的基团
Figure S2008101282599D00061
其中
N＝a+b+c+d+2＝3-850，优选6-160，
a＝1-800，优选2-150，
b＝0-400，优选2-75，
c＝0-10，优选0，
d＝0-10，优选0，
R1各自相同或不同，并且选自以下的组：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基，优选具有1-4个碳原子的烷基或苯基，特别是甲基；
R2a各自是氢或R1；
R2b各自是氢或R1；
R3各自是相同或不同的式Ia的基团或R1基团。
优选使用通式I的聚硅氧烷作为SiH-官能的聚硅氧烷
Figure S2008101282599D00062
其中
N＝a+b+c+d+2＝6-160，
a＝2-150，
b＝2-75，
c＝0，
d＝0，
R1各自相同或不同，并且选自以下的组：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基，优选具有1-4个碳原子的烷基或苯基，特别是甲基；
R2a各自是氢或R1；
R2b各自是氢或R1。
本领域技术人员公知这些化合物是具有实质上通过统计规律控制的分布的混合物的形式或者可以该形式存在。下标a、b、c和d的值因此通常是平均值。
根据本发明，烯烃反应物，即含末端碳-碳双键的聚硅氧烷，优选是通式II的聚硅氧烷：
其中
N＝m+n+o+p+2＝3-1000，优选10-600，
m＝1-800，优选2-600，
n＝0-20，优选0-10、更优选0，
o＝0-10，优选0，
p＝0-10，优选0，
R4各自相同或不同并且选自以下基团：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基，优选具有1-4个碳原子的烷基或苯基，特别是甲基；
R5各自是末端不饱和的烷基，优选乙烯基，或烷氧基，优选具有3-20个碳原子，或R4；
R6各自是相同或不同的通式IIa的基团
其中
N＝m+n+o+p+2＝3-1000，优选10-600，
m＝1-800，优选2-600，
n＝0-20，优选0-10，更优选0，
o＝0-10，优选0，
p＝0-10，优选0，
R4各自相同或不同并且选自以下基团：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基，优选具有1-4个碳原子的烷基或苯基，特别是甲基；
R5各自是末端不饱和的烷基，优选乙烯基，或烷氧基，优选具有3-20个碳原子，或R4；
R6各自是相同或不同的通式IIa的基团或R4基团。
所用含末端碳-碳双键的聚硅氧烷优选是通式II的聚硅氧烷：
Figure S2008101282599D00082
其中
N＝m+n+o+p+2＝10-600，
m＝2-600，
n＝0，
o＝0，
p＝0，
R4各自相同或不同并且选自以下基团：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基，优选具有1-4个碳原子的烷基或苯基，特别是甲基；
R5各自是末端不饱和的烷基，优选乙烯基，或烷氧基，优选具有3-20个碳原子。
本领域技术人员公知式II的化合物是具有实质上统计规律控制分布的混合物的形式或者可以该形式存在。下标m、n、o和p的值因此通常是平均值。
氢化硅烷化可以在有催化剂的情况下通过已建立的方法进行。例如可以使用常用于氢化硅烷化的催化剂，例如铂、铑、锇、钌、钯、铱的络合物或类似化合物或相应的纯元素或者它们固定在二氧化硅、氧化铝、活性碳或类似载体材料上的衍生物。优选在有Pt催化剂例如顺氯氨铂或Karstedt催化剂[三(二乙烯基四甲基二硅氧烷)双-铂]的情况下进行氢化硅烷化。
每摩尔烯烃或每摩尔末端碳-碳双键的催化剂的用量优选是10-7-10-1mol，优选1-100ppm。氢化硅烷化优选在0-200℃，优选20-120℃的温度下进行。
氢化硅烷化可以在有或者没有溶剂的情况下进行。通常，反应的进行不需要溶剂。然而，反应可以在适宜溶剂，例如脂族或芳香烃、环状低聚硅氧烷、醇或酯中进行。合适的溶剂特别是环己烷或甲苯。
根据本发明，基于所用载体的质量，优选使用1-500质量％，更优选10-200质量％，尤其优选20-150质量％的硅氧烷组分。硅氧烷组分尤其包含式I和II的化合物和它们的反应产物的总和。
氢化硅烷化可以用包含各种不同比例的式I的化合物与式II的化合物。优选以反应基团计摩尔比为1∶10-10∶1，更优选1∶5-5∶1，尤其优选1∶1.1-1.1∶1，最优选1∶1进行氢化硅烷化。所用通式I和II的化合物的选择以及它们的混合比的改变，使得可以针对基质的渗透性和其它反应性能调整聚硅氧烷涂层的性质。选择聚硅氧烷组分与酶固定物的重量比可以改变聚硅氧烷涂层的层厚并调整至适宜要求。
本发明的通过氢化硅烷化制得的聚硅氧烷涂层，可以在有酶固定物的情况下通过进行氢化硅烷化获得。然而，也可以通过接着对酶固定物施加经氢化硅烷化获得的硅氧烷获得涂层。这例如可以通过用硅氧烷溶液，例如硅氧烷在有机溶剂，特别是环己烷或甲苯中的溶液，处理酶固定物进行。接着，可以通过例如蒸发除去溶剂。硅氧烷在溶液中的浓度优选是10-100质量％，更优选30-100质量％。然而，优选在有酶固定物的情况下进行氢化硅烷化获得本发明的聚硅氧烷涂层。
本发明的酶制剂优选通过下面所述的本发明的方法制得。制备酶制剂的该方法显著在于包括固定在惰性载体上的酶或含酶微生物的酶固定物提供有通过氢化硅烷化获得的聚硅氧烷涂层。
优选本发明的方法以这种方式进行：通过将酶固定物与含SiH-官能的聚硅氧烷、含末端碳-碳双键的聚硅氧烷和在氢化硅烷化条件下催化氢化硅烷化的催化剂的反应混合物接触，向酶固定物提供聚硅氧烷涂层。具体地说，该方法可以这样进行：氢化硅烷化反应在存在包括固定在惰性载体上的酶或含酶微生物的酶固定物的情况下进行。在氢化硅烷化时形成的聚硅氧烷向酶固定物提供了聚硅氧烷涂层。
氢化硅烷化可以本领域技术人员已知的方式进行。优选使用上述参数/供料/催化剂进行氢化硅烷化。
在本发明方法的优选实施方案中，将特定量的酶固定物与聚硅氧烷试剂(式I和II的化合物+催化剂)的混合物(反应混合物)混合，例如通过加入含通式I和通式II的化合物和Karstedt催化剂的混合物。例如，可以向1g酶固定物中加入摩尔混合比为10∶1-1∶10的式I和II的化合物的混合物，以及Karstedt催化剂，例如以存在的聚硅氧烷组分的量为基础计50ppm。为了使涂布性能最佳化，可以优选的是在加入之前将含催化剂的聚硅氧烷组分溶解在溶剂，例如环己烷、甲苯或另一有机溶剂中，然后将该溶液加入到酶固定物中。例如，当使用环己烷作为溶剂时，已发现在将该溶液加入到酶固定物之后，例如通过涡流器(Ika，level 9)将该混合物剧烈分散约15-30分钟，直到大量环己烷蒸发掉是有益的。接着，所得酶制剂在干燥箱中于50℃下干燥例如12小时，即硬化。改变通式I和II的化合物的混合比可以毫无疑问地改变聚硅氧烷涂层的性能并调整至适宜要求。
本发明方法的另一实施方案与上面实施方案的不同在于将待涂布的酶固定物浸泡在所需反应混合物中，然后从反应混合物中取出并干燥。取出可以用例如截留酶固定物颗粒的筛进行。浸泡时间优选是1-10分钟。干燥可以在常规干燥箱中进行。优选在20℃-80℃，优选40℃-60℃，更优选在约50℃的温度下进行干燥/硬化。
在本发明方法的另一实施方案中，特别适用于以工业规模进行，氢化硅烷化是用造粒锅装置(例如得自Erweka或Eirich)进行的。这种情况下，将定量酶固定物颗粒加入到所谓的锅装置中搅拌。接着，或者加入含式I和II的化合物以及催化剂和溶剂(如果合适)的混合物，或者优选使用双物质喷嘴(例如得自Schlick或其它)，其中混合物或组分在压力(例如氮或合成气)下以细液滴雾的形式施加，以确保在颗粒上非常均匀分布。长时间涂布之后，如上所述取出颗粒并在20℃-80℃，优选40℃-60℃，更优选50℃，的温度下，在干燥箱中干燥几小时，即硬化，然后贮藏在室温下直到下次使用。
在另一实施方案中，颗粒在流化床反应器(例如得自Erweka)中产生，其中颗粒和反应混合物以适宜混合比高度分散施加。
本发明的酶制剂例如可用作生物催化剂，特别是作为工业生物催化剂。
参照图1和2详细描述本发明，但不限于此。
图1和2显示在底部直径为4cm的100ml烧杯中搅拌悬浮体的图。这些悬浮体如实施例2所述制得。图1显示基于未处理的NZ435的搅拌悬浮体因细粒而为混浊。相反，基于根据本发明处理的NZ435的搅拌悬浮体澄清，即不含颗粒或者至少不含可见大小的颗粒(图2)。
下面实施例打算详细描述本发明，但不限制从说明书和权利要求书显而易见的保护范围。
实施例
材料和方法：
Novozym 435(NZ435)是得自Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark的市售酶固定物，通过吸附在聚甲基丙烯酸酯上固定得自C.antarctica的脂肪酶B。
水解活性(三丁酸甘油酯在含水介质中水解)：
水解活性是通过所谓的pH-stat法测定的。在该方法中，水解释放的酸用碱滴定，从而使溶液的pH保持恒定。碱消耗的时间依赖性使得酸释放，并因此定量酶活。示例性步骤：将10-20mg的催化活性颗粒加入到25ml的Tris-HCl缓冲液(1mM，pH 7.5；还含有0.1mM NaCl和CaCl2)中并加入500μl的三丁酸甘油酯。在自动滴定器(Tritroline alpha，得自Schott)上经其中滴定的碱的量(50mM NaOH)定量水解活性。
水解活性(戊酸乙酯在含水介质中)：
与使用三丁酸甘油酯的实施例测定水解活性类似，也可以使用戊酸乙酯。示例性步骤：将10-20mg的催化活性颗粒加入到25ml的磷酸盐缓冲液(1mM，pH 8.0)和500μl的戊酸乙酯中。在自动滴定器(Tritroline alpha，得自Schott)上经其中滴定的碱的量(10mM NaOH)定量水解活性。
以PLU单位计的合成活性(月桂酸丙酯在无溶剂系统中的合成活性)：
将10mg的催化活性颗粒加入到5ml的等摩尔底物溶液(月桂酸和1-丙醇)中并在摇动和/或搅拌下于60℃培养。在25min内每隔5min取出样品(V样品：50μl)并转移到950μl的癸烷(内部标准：4mM十二烷)中。参照最初产品形成速度确定PLUs。通过气相色谱法检测月桂酸丙酯(停留时间：9.791min)(Shimadzu 2010，得自SGE的BTX柱；长25m、I.D.0.22μm；薄膜：0.25μm；检测器型号：FID，于300℃；注射器温度275℃和注射体积1μl、分流比35.0；载体气压力(氦)150kPa；温度程序：开始温度60℃、保持1.5min、升温20℃/min、最终温度250℃、保持2.5min)。
漆酶活性的测定：
为了测定漆酶活性，将催化活性颗粒(原始或固定化漆酶)与1ml的ABTS溶液(即用型溶液、1.8mM、得自Sigma-Aldrich)转移到19ml的磷酸钾缓冲液(100mM、pH 6、37℃)中并光谱计量地测定405nm下增加的消光。监测20min内的漆酶活性。以5min的间隔取样。
可以如下确定活性：
Figure S2008101282599D00121
ΔExt.405 为时间的函数的消光变化
Vtotal    反应批次的总体积[20ml]
Vsample   样品的体积[2ml]
Δt       时间的变化[min]
ε        ABTS在405nm下的消光系数[43.2ml μmol-1cm-1]
d         元件的路径长度[1cm]
活性以每分钟1μmol的底物的转化率定义的单位(U/ml或U/g)计。
按照Bradford测定蛋白质：
按照Bradford法(Anal.Chem.1976，72，248-254)进行上清液中蛋白质含量的测定，这是基于三芳基甲烷染料考马斯亮蓝G-250和蛋白质中的碱性和芳香氨基酸残基的结合。该结合使得最大吸收从465nm偏移至595nm。为了建立该校准，测定BSA在5-20μg/l的浓度下的吸光度。为此，用H2O将这些特定样品补至800μl，并加入200μl的Bradford试剂(Bio Rad，Munich)，并在595nm下测定样品。
为了测定催化活性颗粒在苛刻反应条件下的滤出性能，通过下面步骤延伸该过程：
通过下面的方案测定Novozym 435(NZ435)的蛋白质含量。将NZ435颗粒于45℃下在乙腈/H2O(1∶1，v/v)中摇动培养30min，然后从上清液中取出样品(例如1ml)，冻干并再次悬浮于H2O(同样1ml)中。接着，如上所述测定蛋白质含量。结果示于表1。
表1：未处理的酶固定物的测定结果
  原始(没有涂层)   水解活性[U/mg]   PLU[U/g]   解吸的蛋白质量[μg蛋白质/mgNZ435]   解吸的蛋白质量[％]
  NZ435   1.05±0.15   8000±500   56±1   5.6
对比实施例1：传统酶固定物的机械稳定性的测定
为了确定颗粒的机械稳定性，将它们在各种高粘度等摩尔底物溶液(例如聚乙二醇(摩尔质量约2400)和油酸)中以高输入功率并在＞60℃的温度下培养，然后研究颗粒的完整性。使用NZ435(5重量％于聚乙二醇中(摩尔质量约2400)和油酸)，24小时后用肉眼可以检测到形成细粒，例如通过清楚地产生混浊。
对比实施例2：传统酶固定物的解吸稳定性的测定
为了测定颗粒在苛刻反应条件下的解吸稳定性，将50mg的NZ435在20ml的MeCN/H2O(1∶1，v/v)溶液中于45℃摇动30min。从上清液中取出定量样品(例如1ml)并如上所述测定上清液的蛋白质含量。通过带凹槽过滤器回收颗粒并用100ml的H2O洗涤，在50℃干燥12h，以便接下来按照上述方案测定水解活性和以PLU计的合成活性。结果可以示于表2。
表2：对比实施例2的测定结果
  原始(没有涂层)   水解活性[U/mg]   合成活性[PLU/g]   解吸的蛋白质量[μg蛋白质/mgNZ435]
  NZ435   0*   0*   56
*在上述活性测定中，不能定量活性。
实施例1：稳定酶制剂的生产
示例性制备：
将1g的NZ435颗粒在金属盘中与1ml的反应混合物混合，该反应混合物包含各种组成的通式I和II的化合物(组成参见表3；通式I和II的组分是通过本领域技术人员熟悉的方法通过化学平衡制得的，例如US 7,196,153B2中所述)和Karstedt催化剂(Syloff4000，Dow Corning，USA的产品)。在应用之前将包括催化剂的聚硅氧烷组分每次溶解在3ml的环己烷中，然后加入到金属盘中的颗粒中。该添加随后紧接着是通过涡流器(Ika，level 9)强分散15-30min直到大量环己烷蒸发掉。接着，将颗粒在50℃于干燥箱内干燥约12h。
表3：各种涂层颗粒的组成
  编号   NZ435的初始重量   通式I的组分；c＝d＝0；R1＝R2a＝甲基，R2b＝H 通式II的组分；b＝c＝d＝0；R4＝甲基，R5＝乙烯基   NZ435的比例[％]   水解活性[U/mg的固定物(U/mg的NZ435)]   合成活性[PLU/g的固定物(PLU/g的NZ435)]
  NZ4351   1g   - -   100   1.05   8000(8000)
  i   1g   a＝43、b＝5100μl a＝98900μl   57.4   0.44(0.77)   4300(7500)
  ii   1g   a＝64.5、b＝3.5300μl a＝98700μl   57   0.39(0.68)   3100(5400)
  iii   1g   a＝43、b＝5100μl a＝348900μl   57.4   0.44(0.77)   3800(6700)
1未处理的原始固定物的数据，参见对比实施例1
通过该方法制得的颗粒，与未处理的固定物相比，水解时活性收率(activity yield)高达73％(实施例1i和1iii，0.77U/mg的NZ435，与未处理的NZ435的1.05U/mg相比，如对比实施例1中所述)，或65％(实施例1ii，0.68U/mg的NZ435)。在该合成中，获得94％(实施例1i)、84％(实施例1iii)或68％(实施例1ii)的活性收率。
实施例2：本发明的酶制剂的机械稳定性的测定
将300mg的颗粒(未处理的、原始NZ435或者按照表3中iii处理过的NZ435)分别于60℃下在5ml的月桂酸中剧烈搅拌90min(Ika的磁性搅拌器板，RT Power型，level 5，搅拌器棒：长度3.1cm，宽度0.6cm)。除去搅拌器之后，对搅拌悬液拍照(图1和2)。
图1清楚地显示基于未处理的NZ435的搅拌悬液因细粒而混浊。基于按照本发明处理过的NZ435的悬液，相反为澄清的，即不含颗粒或者至少不含可见大小的颗粒(图2)。
接着，从悬液中通过带凹槽过滤器取出颗粒，用约10ml的丙酮冲洗并在50℃干燥12h。
为了测定颗粒的机械稳定性，测定粒度分布。这里所用筛分具有以下排除大小：800μm、500μm、300μm、150μm和75μm。通过筛选，测定搅拌之前和之后的粒度分布。结果可以示于表4。
表4：未涂层NZ435和涂层NZ435的平均粒度分布(PSD)
  通式I的组分；c＝d＝0；R1＝R2a＝甲基、R2b＝H   通式II的组分；b＝c＝d＝0；R4＝甲基，R5＝乙烯基   NZ435的比例[％w/w]   之前的PSD[μm]   之后的PSD[μm]  PSD的相对降低[％]
  原始NZ435 - -   100   392   293  25
  涂层NZ435   a＝43、b＝5100μl   a＝98900μl   57.4   547   501  8.5
  涂层NZ435   a＝64.5、b＝3.5300μl   a＝98700μl   57   486   458  5.8
  涂层NZ435   a＝43、b＝5100μl   a＝348900μl   57.4   491   432  12
实施例3：稳定酶制剂的解吸稳定性的测定
与对比实施例2相似，将实施例1获得的颗粒用水/乙腈处理然后测定水解活性、合成活性和蛋白质的释放量。该测定的结果可以示于表5。
表5：实施例3的结果
 样品   水解活性[U/mg的固定物(U/mg的NZ435)]   合成活性[PLU/g的固定物(PLU/g的NZ435)]   解吸的蛋白质量[μg/mg的固定物(μg/mg的NZ435)]
 原始NZ435(对比实施例1)   1.05(1.05)   8000(8000)   -
 未涂层NZ435(对比实施例2)   0   0   56
i   0.25(0.44)   1182±13(2059)   10(17)
ii   0.29(0.51)   1699±24(2980)   4.5(7.9)
iii   0.28(0.49)   1235±54.3(2152)   9(16)
尽管培养之后未处理的原始酶固定物无论如何未呈现水解活性并且可以测定56μg/mg的固定物为自由蛋白质，聚硅氧烷-涂布过的颗粒呈现起始活性的高达75％的水解活性(样品ii、0.51U/mg的NZ435相对0.77U/mg的滤去之前的NZ435)、起始活性的高达55％的合成活性(样品ii、2980U/g的NZ435相对5400U/g的滤去之前的NZ435)，并且酶解吸降低高达86％(样品ii)。
实施例4：酶固定物的生产
将1g的Lewatit VPOC1600(得自Lanxess)在室温下于5ml的CALB溶液(Lipozym CALB L，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark，水解活性：2700U/ml)中搅拌约18h，通过带凹槽过滤器取出并用250ml的蒸馏水冲洗，然后在空气中干燥3h，用1ml的异丙醇冲洗并在空气中再次干燥1h。将由此制得的固定物在可密封反应容器中于4℃贮藏直到下次使用。
通过如上所述的方法测定酶固定物的活性(水解活性1.04U/mg和合成活性6000PLU/g)。通过Bradford实验测定加载密度约为30μg蛋白质/mgVPOC1600。
由此产生的酶固定物在第二步通过上述方法用聚硅氧烷涂布(组成如表3中实验i)。酶固定物在制剂中的质量比例相当于63％。涂层制剂的水解活性是0.43U/mg，合成活性是2927PLU/g。
与对比实施例2相似，未涂层颗粒和聚硅氧烷-涂层颗粒用水/乙腈处理，然后测定水解活性、合成活性和蛋白质的释放量。结果可以示于表6。
表6：实施例4的结果
  样品 通式I组分；c＝d＝0；R1＝R2a＝甲基、R2b＝H   通式II组分；b＝c＝d＝0；R4＝甲基、R5＝乙烯基  水解活性[U/mg的固定物(U/mg原始固定物)] 合成活性[PLU/g的固定物(PLU/g的原始固定物)] 解吸的蛋白质量[μg/mg的固定物(μg/mg的原始固定物)]
  CALB于VPOC1600上、未涂层、新鲜的 - -   1.04 6000 -
  CALB于VPOC1600上、涂层、新鲜的 A＝43、b＝5100μL   a＝348900μL   0.43(0.68) 2930(4650) -
  CALB于VPOC1600上、未涂层解吸之后 - -   0 0 27±5
  CALBVPOC1600上涂层解吸之后 A＝43、b＝5100μL   a＝348900μL   0234±0.005(0.37) 1765±369(2800) 3±1.3(4.7)
由表6可以看出，在为未处理的固定物的情况下解吸9倍量的蛋白质。同时，可以获得54％(水解活性)和60％(合成活性)的活性收率。上述的用聚硅氧烷涂布酶固定物的方法已经显示了适用于已商业化的采用NZ435的制品，同样也证明了适用于自载酶固定物。
实施例5：测定在有机溶剂中的酶活性
通过在甲基环己烷中进行月桂酸丙酯合成测定实施例1和4的酶制剂、以及相应原始固定物的活性(底物的起始浓度＝10mM、T＝25℃)。
表7：在甲基环己烷中的合成活性(PLU/g)
  编号   NZ435的初始重量   通式I组分；c＝d＝0；R1＝R2a＝甲基、R2b＝H   通式II组分；b＝c＝d＝0；R4＝甲基、R5＝乙烯基  原始NZ435的比例[％w/w] 活性[U/g的固定物(U/mg的原始固定物)] 解吸之后活性[U/g的固定物.(U/g的原始固定物)]
  NZ435原始   1g   -   -   100   581   0
  实施例1的i   1g   a＝43、b＝5100μL   a＝98900μL   57.4   227(395)   142(247)
  实施例1的ii   1g   a＝64.5、b＝3.5300μL   a＝98700μL   57   240(421)   141(247)
  实施例1的iii   1g   a＝43、b＝5100μL   a＝348900μL   57.4   267(465)   133(232)
  CALB于VPOC1600上原始   1g   100   311   0
  CALB于VPOC1600上涂层   1g   a＝43、b＝5100μL   a＝98900μL   51   151(296)   118(231)
由表7可知在有机溶剂中使用时酶制剂的活性收率优异并且解吸稳定性同样清楚。
实施例6：其它脂肪酶制剂的制备
与实施例1相似，Lipozym RM IM(得自M.Miehei的脂肪酶，固定在Lanxess的Duolite A568上，可从Novozymes A/S获得)提供有聚硅氧烷涂层并与实施例5类似地在有机溶剂中测定活性收率。
表8：涂层脂肪酶Lipozym RM IM的活性的测定
  名称   RMIM的初始重量 通式I组分；c＝d＝0；R1＝R2a＝甲基、R2b＝H   通式II组分；b＝c＝d＝0；R4＝甲基、R5＝乙烯基   原始固定物的比例[％w/w]   在有机溶剂中的PLUs
 RM IM原始   1g -   -   100   321±40
 RM IM涂层   1g a＝43、b＝5100μL   a＝98900μL   51   171±5
由表8可知，基于Lipozym RM IM的用量，在误差范围内获得定量活性收率。
实施例7：其它脂肪酶制剂的制备
与实施例4类似，将得自T.lanuginosa的脂肪酶(可以Esterase TL01从Asa Spezialenzyme获得，包括具有其它酯酶功能的脂肪酶)固定在LewatitVPOC1600上并提供有硅氧烷涂层。通过测定戊酸乙酯水解测定活性。
表9：实施例5的结果
  原始固定物的初始重量 通式I组分；c＝d＝0；R1＝R2a＝甲基、R2b＝H 通式II组分；b＝c＝d＝0；R4＝甲基、R5＝乙烯基   原始固定物的比例.[％w/w]   活性[U/g的固定物](U/g的原始固定物)
TL01于VPOC1600上、原始   1g - -   100   261
TL01onVPOC1600、涂层   1g a＝43、b＝5250μL a＝198750μL   55   157(285)
表9显示该原始制剂的活性为261U/g，而涂层制剂的活性为157U/g。基于原始固定物的含量，这代表活性为285U/g；即，可以获得在误差范围内的定量活性收率。
实施例8：酯酶制剂的制备
与实施例7相似，将得自R.oryzeae的酯酶固定在Lewatit VPOC1600上，经过涂层并以水解戊酸乙酯测定其活性。
表10：得自R.oryzeae的固定化酯酶的活性测定。
  原始固定物的初始重量 通式I组分；c＝d＝0；R1＝R2a＝甲基、R2b＝H 通式II组分；b＝c＝d＝0；R4＝甲基、R5＝乙烯基   原始固定物的比例[％w/w]   活性[U/g的固定物](U/g的原始固定物)
  原始VPOC1600+酯酶R.O.   1g - -   100   67
  涂层VPOC1600+E.R.O.   1g a＝43、b＝5250μL a＝198750μL   约45   295(65)
再次，在误差范围内定量活性收率。
实施例9：漆酶制剂的制备
与实施例4相似，将得自Myceliophthora Thermophila的漆酶(EC1.10.3.2)(可以Flavorstar从Novozymes A/S得到)固定在Lewatit VP OC 1600上(4.5mg的蛋白质在1g的Lewatit VPOC 1600上)，提供硅氧烷涂层并在ABTS实验中测定活性。
Figure S2008101282599D00221

Claims (12)

1.酶制剂，通过包括固定在惰性载体上的酶或含酶微生物的酶固定物获得，所述酶固定物提供有通过氢化硅烷化获得的聚硅氧烷涂层，
其中所述聚硅氧烷涂层是通过用含末端碳-碳双键的聚硅氧烷氢化硅烷化SiH-官能的聚硅氧烷获得的，
所用的SiH-官能的聚硅氧烷是通式I的聚硅氧烷
Figure FSB00000626010400011
其中
N＝a+b+c+d+2＝3-850，
a＝1-800，
b＝0-400，
c＝0-10，
d＝0-10，
R1各自相同或不同，并且选自以下的组：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R2a各自是氢或R1；
R2b各自是氢或R1；
R3各自是相同或不同的通式Ia的基团：
Figure FSB00000626010400012
其中
N＝a+b+c+d+2＝3-850，
a＝1-800，
b＝0-400，
c＝0-10，
d＝0-10，
R1各自相同或不同，并且选自以下的组：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R2a各自是氢或R1；
R2b各自是氢或R1；
R3各自是相同或不同的式Ia的基团或R1基团，
所用的含末端碳-碳双键的聚硅氧烷是通式II的聚硅氧烷：
Figure FSB00000626010400021
其中
N＝m+n+o+p+2＝3-1000，
m＝1-800，
n＝0-20，
o＝0-10，
p＝0-10，
R4各自相同或不同的且选自以下基团：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R5各自是末端不饱和的烷基或烷氧基或R4；
R6各自是相同或不同的通式IIa的基团：
Figure FSB00000626010400031
其中
N＝m+n+o+p+2＝3-1000，
m＝1-800，
n＝0-20，
o＝0-10，
p＝0-10，
R4各自相同或不同并且选自以下基团：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R5各自是末端不饱和的烷基或烷氧基，或R4；
R6各自是相同或不同的通式IIa的基团或R4基团。
2.权利要求1的酶制剂，其中通式Ia中的N为6-160。
3.权利要求1的酶制剂，特征在于所述酶是得自水解酶类的酶。
4.权利要求1的酶制剂，其中所述酶为脂肪酶类。
5.权利要求1和2任一项的酶制剂，特征在于所述惰性载体具有其中90％的颗粒的粒度为10-5000μm的粒度分布。
6.权利要求1或2的酶制剂，特征在于所用的惰性载体包括聚乙烯基苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯。
7.权利要求1的酶制剂，特征在于所用的SiH-官能的聚硅氧烷是通式I的聚硅氧烷
Figure FSB00000626010400041
其中
N＝a+b+c+d+2＝6-160，
a＝2-150，
b＝2-75，
c＝0，
d＝0，
R1各自相同或不同，并且选自以下的组：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R2a各自是氢或R1；
R2b各自是氢或R1。
8.权利要求7的酶制剂，特征在于所用含末端碳-碳双键的聚硅氧烷是通式II的聚硅氧烷：
Figure FSB00000626010400042
其中
N＝m+n+o+p+2＝10-600，
m＝2-600，
n  ＝0-10，
o  ＝0，
p  ＝0，
R4各自相同或不同并且选自以下基团：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R5各自是末端不饱和的烷基或烷氧基。
9.权利要求1-7任一项的酶制剂的制备方法，特征在于对包括固定在惰性载体上的酶或含酶微生物的酶固定物提供通过氢化硅烷化获得的聚硅氧烷涂层，
其中所述聚硅氧烷涂层是通过用含末端碳-碳双键的聚硅氧烷氢化硅烷化SiH-官能的聚硅氧烷获得的，
所用的SiH-官能的聚硅氧烷是通式I的聚硅氧烷
Figure FSB00000626010400051
其中
N＝a+b+c+d+2＝3-850，
a＝1-800，
b＝0-400，
c＝0-10，
d＝0-10，
R1各自相同或不同，并且选自以下的组：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R2a各自是氢或R1；
R2b各自是氢或R1；
R3各自是相同或不同的通式Ia的基团：
Figure FSB00000626010400061
其中
N＝a+b+c+d+2＝3-850，
a＝1-800，
b＝0-400，
c＝0-10，
d＝0-10，
R1各自相同或不同，并且选自以下的组：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R2a各自是氢或R1；
R2b各自是氢或R1；
R3各自是相同或不同的式Ia的基团或R1基团，
所用的含末端碳-碳双键的聚硅氧烷是通式II的聚硅氧烷：
Figure FSB00000626010400062
其中
N＝m+n+o+p+2＝3-1000，
m＝1-800，
n＝0-20，
o＝0-10，
p＝0-10，
R4各自相同或不同的且选自以下基团：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R5各自是末端不饱和的烷基或烷氧基或R4；
R6各自是相同或不同的通式IIa的基团：
其中
N＝m+n+o+p+2＝3-1000，
m＝1-800，
n＝0-20，
o＝0-10，
p＝0-10，
R4各自相同或不同并且选自以下基团：饱和或不饱和的、任选枝化的具有1-30个碳原子的烷基、具有7-30个碳原子的烷芳基和具有6-30个碳原子的芳基；
R5各自是末端不饱和的烷基或烷氧基，或R4；
R6各自是相同或不同的通式IIa的基团或R4基团。
10.权利要求9的方法，其中通式Ia中的N为6-160。
11.权利要求9的方法，特征在于通过将所述酶固定物与含SiH-官能的聚硅氧烷、含末端碳-碳双键的聚硅氧烷和在氢化硅烷化条件下催化氢化硅烷化的催化剂的反应混合物接触，向所述酶固定物提供聚硅氧烷涂层。
12.权利要求1-8任一项的酶制剂作为工业生物催化剂的用途。
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