CN101333531B - 一种CXCR4拮抗剂重组蛋白SDF-1βP2G及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种CXCR4拮抗剂重组蛋白SDF-1βP2G及其制备方法和应用。用特异性引物以人SDF-1βcDNA为模板，通过定点突变PCR扩增得到SDF-1βP2G cDNA，并将其直接插入克隆表达载体pET-30a(+)，构建成SDF-1βP2G/pET-30a(+)重组体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆，经IPTG诱导表达，纯化、复性、酶切和高效液相色谱分离制备SDF-1βP2G重组蛋白。SDF-1βP2G重组蛋白能够拮抗趋化因子受体CXCR4，促进干细胞、成血管细胞等从骨髓进入外周血，促进缺血器官血管再生和血流恢复。

Description

一种CXCR4拮抗剂重组蛋白SDF-1βP2G及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种能拮抗趋化因子受体CXCR4、促进缺血后血流恢复和血管再生的重组蛋白SDF-1βP2G的制备和应用。

背景技术

促进血管发生和新血管生成是挽救严重缺血组织或器官功能衰竭的有效治疗策略(Urbich and Dimmeler，Circ Res，2004，95：343-353)。利用促血管生成因子如VEGF(Schratzberger et al.，Nat Med，2000，6：405-413)，FGF-2(Cao et al.，Nat Med，2003，9：604-613；Khurana and Simons，Trends Cardiovasc Med，2003，13：116-122)和SDF-1(Jin et al.，Nat Med，2006，12：557-567)治疗下肢严重缺血患者获得了短期疗效，但其长期疗效仍未得到临床证实(Jin et al.，Nat Med，2006，12：557-567)。组织损伤常伴随着血管再生微环境的破坏，使得损伤部位周围或外源性的成血管祖细胞(Progenitor cells)难以顺利进入损伤部位促进血管发生和新血管形成。越来越多的证据表明，骨髓中的成血管祖细胞能被动员并趋化至缺血部位启动血管新生过程，从而及时快速的促进血管发生和新血管形成(Rafii and Lyden，Nat Med，2003，9：702-712)。

自体骨髓来源的细胞能够迁移至缺血部位并分化成内皮细胞、促进新血管形成，通过动员以增加外周血中可直接迁移至缺血部位的成血管细胞的数量是一种很有前景的治疗策略(Broxmeyer，Curr Opin Hematol，2008，15：49-58；Petit et al.，Trends Immunol，2007，28：299-307；Shireman，J Vasc Surg，2007，45 Suppl A：48-56)。近年，SDF-1(Stromal cell derived factor-1)的成血管细胞动员和血管生成效应受到广泛的关注(Broxmeyer，Curr Opin Hematol，2008，15：49-58；Petit et al.，Trends Immunol，2007，28：299-307)。全身或局部注射SDF-1均能动员EPCs、趋化EPCs至缺血部位，显著促进血流恢复和血管生成(Carr et al.，Cardiovasc Res，2006，69：925-935；Hiasa et al.，Circulation，2004，109：2454-2461；Tan et al.，Cardiovasc Res，2007，73：823-832)。然而，由于SDF-1/CXCR4轴具有复杂、重要的生理功能，很难直接在临床上利用SDF-1动员成血管细胞促进缺血性血管再生，比如SDF-1不但能动员和趋化正常的干细胞，而且也能趋化CXCR4+的肿瘤细胞和肿瘤干细胞，促进肿瘤血管的形成和肿瘤转移(Kryczeket al.，Am J Physiol Cell Physiol，2007，292：987-995；Wang et al.，Cancer Metastasis Rev，2006，25：573-587)。最近研究发现，利用特异性拮抗剂拮抗CXCR4能有效动员造血干细胞从骨髓进入外周血而不会激活CXCR4介导的下游信号通路(Broxmeyer et al.，J Exp Med，2005，201：1307-1318；Liles et al.，Blood，2003，102：2728-2730)，这为利用CXCR4特异性拮抗剂动员成血管细胞治疗局部缺血等外周血管疾病成为可能。

通过单剂量注射CXCR4的拮抗剂AMD3100(Broxmeyer et al.，J Exp Med，2005，201：1307-1318；Liles et al.，Blood，2003，102：2728-2730)或T-140(Abraham et al.，Stem Cells，2007，25：2158-2166)急性阻断SDF-1和CXCR4间的相互作用能显著促进造血干细胞的瞬时外周动员。在正常小鼠下肢缺血模型中(Capoccia et al.，Blood，2006，108：2438-2445)和糖尿病(Jiao et al.，Diabetologia，2006，49：2786-2789)，短期少量(2-3剂量)注射AMD3100能显著促进急性缺血期(缺血后7天内)血流恢复和新生血管形成。我们的研究结果(图3&4)也证实了AMD3100能够促进正常小鼠下肢急性缺血期(缺血后7天内)血流恢复和血管再生。但是，长期注射AMD3100并不能持续促进血流恢复(每天1次、注射14天)；文献报道中每天2次、注射21天(Jin et al.，Nat Med，2006，12：557-567)。这种长期给药的副效应可能应归因于AMD3100对成血管细胞(Yin et al.，J Cardiovasc Pharmacol，2007，50：61-67)和其他器官的毒性作用(Hendrix et al.，JAcquir Immune Defic Syndr，2004，37：1253-1262；Rusconi etal.，Curr Top Med Chem，2007，7：1273-1289)。正是由于长期、多次用药的毒性作用，AMD3100作为抗HIV-1感染的特效药物的临床试验已经于数年前终止(Hendrix et al.，J Acquir ImmuneDefic Syndr，2004，37：1253-1262；Rusconi et al.，Curr Top Med Chem，2007，7：1273-1289)。因此，开发高效、低毒的CXCR4特异性拮抗剂迫在眉睫。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种CXCR4拮抗剂重组蛋白SDF-1βP2G的cDNA和由此推断的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供上述SDF-1βP2G的cDNA的表达载体。

本发明的第三个目的在于提供利用上述表达载体制备重组蛋白SDF-1βP2G的方法。

本发明的第四个目的在于提供上述SDF-1βP2G6重组蛋白在制备治疗缺血性疾病、恢复缺血器官的功能、促进造血重建、抑制恶性肿瘤的生长和转移或抑制风湿性关节炎等疾病的药物中的应用。

本发明通过如下技术方案来实现：以人SDF-1β基因为模板，利用定点突变和基因重组技术研制一种CXCR4的特异性拮抗剂重组蛋白SDF-1βP2G。

SDF-1βP2G cDNA的核苷酸序列为：5’ aagggcgt cagcctgagc tacagatgcc catgccgatt cttcgaaagccatgttgcca gagccaacgt caagcatctc aaaattctca acac tccaaa ctgtgccctt cagattgtag cccggctgaa gaacaacaacagacaagtgt gcattgaccc gaagctaaag tggattcagg agtacc

由此推断的氨基酸序列为：

Lys Gly Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val

Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn

Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Arg

Phe Lys Met。

本发明用特异性引物以SDF-1βcDNA为模板经PCR扩增获得直接扩增SDF-1βN末端第二位氨基酸残基由脯氨酸突变成甘氨酸的突变体SDF-1βP2G的cDNA，并将其连接入pET30a(+)载体，构建得到表达载体SDF-1βP2G/pET-30a(+)；测序鉴定序列正确后转化至BL21(DE3)表达菌株，利用IPTG进行诱导表达，经分离包涵体、复性、纯化、酶切标签蛋白和高效液相色谱分离等常规分子生物学技术处理后，得到SDF-1βP2G重组蛋白。然后利用MOLT-4细胞株鉴定SDF-1βP2G拮抗CXCR4的活性，利用小鼠下肢缺血模型考察SDF-1βP2G拮抗CXCR4、动员成血管前体细胞、促进缺血下肢血管再生和血流恢复的治疗效应。

本发明的重组蛋白完全可以应用于制备治疗缺血性疾病、恢复缺血器官的功能、促进造血重建、抑制恶性肿瘤的生长和转移或抑制风湿性关节炎等疾病的药物。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：SDF-1βP2G的cDNA以CXCR4的天然配体SDF-1β为模板进行PCR扩增得到，具有易于合成、生物利用度高、不激活受体信号通路和低免疫源性等优势；同时长期用药未观察到SDF-1βP2G重组蛋白对心脏、肝脏、肾脏和睾丸等脏器的急性和慢性毒性效应(包括形态学改变、细胞凋亡、特异性细胞增殖等)；SDF-1βP2G对于动员成血管细胞、促进缺血性血管再生具有重要的临床意义，开发CXCR4特异性肽类拮抗剂用于此目的是一种较理想的选择。

附图说明

图1是重组质粒SDF-1βP2G/pET-30a(+)的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。

其中：M为蛋白质分子量标准；1为KpnI酶切后的质粒；2为SacI酶切后的质粒；3为KpnI和SacI双酶切后的质粒。

图2是SDF-1βP2G/pET-30a(+)的测序结果。

图3是大肠杆菌表达SDF-1βP2G重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

其中：M为蛋白质分子量标准；1、2、3、4代表不同的克隆的细胞裂解液。

图4是变性条件下利用ProBond^TMResin亲和层析SDF-1βP2G/His-tag图谱；

其中：I为上样峰；II为过柱峰；III为洗脱峰。

图5是SDF-1βP2G/His-tag利用ProBond^TM Resin亲和层析的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

其中：

1为SDF-1βP2G/His-tag IBs溶液；

2为SDF-1βP2G/His-tag IBs过ProBond^TM Resin柱后的溶液；

3为洗涤ProBond^TM Resin柱后的变性结合缓冲液(Denaturing Binding Buffer)；

4为洗涤ProBond^TM Resin柱后的变性洗涤缓冲液(Denaturing Binding Buffer)；

5为洗涤ProBond^TM Resin柱后的变性洗涤缓冲液含80mM咪唑(Denaturing BindingBuffer)。

图6显示了EKMax^TM在不同的酶切时间下对SDF-1βP2G/His-tag切割效果

其中：

M为蛋白质分子量标准；1-10依次表示超滤浓缩后SDF-1βP2G/His-tag蛋白在的酶切时间分别为0.5hr、1.0hr、2.0hr、3.0hr、4.0hr、5.0hr、6.0hr、8.0hr、10.0hr和12.0hr后的产物；11.为SDF-1βP2G/His-tag未经EKMax^TM酶切放置2.0hr后的产物；12.为SDF-1βP2G/His-tag未经EKMax^TM酶切放置12.0hr后的产物。

图7是RP-HPLC分离SDF-1βP2G和His-tag的层析图谱；

其中：I是His-tag；II是SDF-1βP2G。

图8是SDF-1βP2G和SDF-1β对MOLT-4细胞的趋化活性比较。

图9显示了SDF-1βP2G预处理对SDF-1β对MOLT-4细胞的趋化活性的抑制效应。

图10显示了SDF-1βP2G丧失对MOLT-4细胞Ca²⁺内流的诱导效应。

图11显示了SDF-1βP2G诱导MOLT-4细胞表明CXCR4内在化。

图12显示了SDF-1βP2G动员成血管前体细胞(单核细胞、中性粒细胞和巨噬细)从骨髓进入外周血。

其中：

A是根据流式细胞仪FSC和SSC区分成熟巨噬细胞(R1)，中性粒细胞(R2)和单核细胞(R3)的代表图；

B是单核细胞动员效应的统计结果；

C是中性粒细胞动员效应的统计结果；

D是成熟巨噬细胞动员效应的统计结果。

图13显示了SDF-1βP2G能显著促进小鼠缺血下肢的血流恢复。

其中：A是激光多普勒血流扫描结果；B是缺血下肢血流恢复统计结果。

图14.显示了SDF-1βP2G能显著促进小鼠缺血下肢毛细血管增生。

其中：

A是缺血下肢腓肠肌冰冻切片CD31免疫组化染色结果；

B和C分别是缺血后第7天和第14天缺血下肢腓肠肌毛细血管增生的统计结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步详细说明。

实施例1

SDF-1βP2G cDNA的克隆及其原核表达系统的构建

1.引物设计：根据Genebank数据库提供的人SDF-1β的cDNA序列按照一般引物设计原则和PET30a(+)克隆的要求，采用primer5.0以编码区为模板设计RT-PCR引物SDF-1βP2G-F/SDF-1βP2G-R，直接扩增SDF-1βN末端第二位氨基酸残基由脯氨酸突变成甘氨酸的突变体SDF-1βP2G。

引物SDF-1βP2G-F为：5’-ggGGTACCgacgacgacgacaagaagggcgtcagcctgagctacagat-3’；

引物SDF-1β-R为：5’-acgGAGCTCacatcttgaacctcttgtt-3’

2.总RNA的提取：自液氮中取出骨髓样品约0.25ml，立即加入0.75ml TRIZOL LSReagent，待样品解冻后，用吸管反复吹打裂解骨髓细胞。裂解的细胞匀浆在15～30℃条件下保温5min以便核蛋白复合体的解离。然后加入0.2ml氯仿，用力振荡15s并在15～30℃条件下保温2～15min。12,000×g、2～8℃离心15min。离心后的样品分为三层，RNA即存在于上层无色清液中(总体积约为TRIZOL LS Reagent的70％)。取上层清液于新的EP管中，加入0.5ml异丙醇混匀，15～30℃保温10min，12,000×g，2～8℃离心10min。去上清，用1ml 70％的乙醇涡旋洗涤沉淀，7,500×g，2～8℃离心5min。去上清，室温挥发残余乙醇5-10min，然后将沉淀溶解于20ul DEPC处理的水中，检测A260/A280比值，保存于-70℃备用。(RNA提取过程中的所有器皿、溶液和水均经DEPC处理)。

3.反转录合成单链cDNA：单链cDNA的合成按SuperScriptTM First Strand SynthesisSystem for RT-PCR(Invitrogen life technologies，Cat.No.11904-018)所提供的方法采用oligo(dT)primer进行，概述如下：

a.按如下顺序加入各组份到已编号的0.2ml的PCR薄壁管中混匀，65℃保温5min，然后置于冰上至少1min。

Components	Sample RNA	No RT Control	Control RNA
				up to 5μgtotal RNA.	4μl	4μl	-
Control RNA(50ng/μl)			1μl
				10mMdNTPmix	1μl	1μl	1μl

Oligo(dT)12-18(0.5μg/μl)	1μl	1μl	1μl
				DEPC-treated water	to 10μl	to 10μl	to 10μl

b.按如下顺序准备反应混合液。

Components10X RT buffer                    Each Reaction2μl    4Reactions 8μl

25mM MgCl2                                 4μl                 16μl

0.1M DTT                                   2μl                 8μl

RNaseOUT^TM Recombinant RNase Inhibitor     1μl                 4μl

c.向a步中的每管加入一份9μl的反应混合液，轻轻混匀，低速离心收集。

d.42℃保温2min。

e.除No RT Control外，每管加入1μl(50units)SuperScript II，混匀，42℃保温50min。

f.70℃保温15min终止反应，置于冰上冷却。

g.每管加入1μl RNase H，37℃保温20min，然后保存于-20℃备用。

4.SDF-1βP2G cDNA的PCR扩增

利用引物SDF-1βP2G-F/SDF-1βP2G-R以反转录合成的cDNA为模板PCR扩增SDF-1βP2G。PCR热循环程序：94℃5min；94℃10S，51.5℃10S，72℃5S，30个循环；72℃，5min。

5.SDF-1βP2G/PET30a(+)的构建

SDF-1βP2G cDNA的PCR产物经胶回收后，与预先制备PET30a(+)质粒载体按照下表进行双酶切：

Components	pET-30a(+)	SDF-1βP2G
			pET-30a(+)Plasmid，100ng/μl，μl	50
PCR Product，30-50ng/μl，μl		50
			KpnI，10U/μl，μl	5	5
SacI，10U/μl，μl		5
			10xM Buffer，μl	7	7
Autoclaved ddH2O，μl	4.5	3

酶切产物全部上样到1×TAE配制的1.5％琼脂糖凝胶(含EB1μg/ml)上进行电泳。紫外透射反射分析仪检测条带分离开后，凝胶成像系统照相。根据DNA Marker判断目标条带所在的位置，分别用手术刀片准确切下目标带所在的凝胶块，转入干净的1.5ml eppendorf管中。用

Gel Extraction Kit回收目标片段，回收过程按试剂盒说明书进行。pET-30a(+)的酶切产物最后用20μl灭菌ddH2O洗脱，浓度约为0.05pmol/μl；PCR产物的酶切产物最后用40μl灭菌ddH2O洗脱，浓度约为0.2-0.6pmol/μl。

质粒载体和PCR产物的双酶切回收产物的连接按下面的反应体系进行：10μl连接反应体系如下：16℃连接反应0.5h以上。

Components	SDF-1βP2G
		pET-30a(+)/KpnI+SacI，0.05pmol/μl，μl	1.0
SDF-1βP2G/KpnI+SacI，0.25pmol/μl，μl	2.0
		Autoclaved ddH2O，μl	2.0
Solution I，μl	5.0
		Final Volume，μl	10.0

上述连接体系采用热休克方法直接转化至感受态JM109菌株。

阳性克隆的筛选：PCR法作初步鉴定：挑取单个菌落，接种于盛有500μlLB(含有50μg/mlKanamycin)液体培养基的1.5mlEP管中，37℃，250r/min振荡培养4h，以此菌液为模板，PCR法确认pET-30a(+)载体中插入片段的大小。PCR体系同前，只是PCR模板为各自的阳性菌落培养液，PCR循环中的退火温度比进行PCR基因扩增时相应降低1-2℃。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，有PCR产物且产物DNA片段与用于克隆连接的外源DNA片段大小相同的初步确定为阳性克隆。

质粒提取及酶切鉴定：从PCR筛选出的阳性克隆中挑取一个单菌落接种5mL LB液体培养基(50μg/ml Kanamycin)，37℃，过夜培养(约12-14h)。次日，10000g，1min离心，收集细胞。按

Plasmid Miniprep Kit I说明书提取质粒，质粒经KpnI/SacI单双酶切，再次验证是否有外源片段插入。经PCR和酶切筛选的重组质粒进一步测序鉴定。

酶切鉴定结果表明，SDF-1βP2G基因已经成功插入PET30a(+)载体(图1)，测序结果表明，SDF-1βP2G克隆成功，序列完全正确(图2)。

实施例2

重组蛋白SDF-1βP2G的原核表达和纯化

经确证的SDF-1βP2G/pET-30a(+)重组质粒约200ng加入200μl感受态大肠杆菌BL21(DE3)(NOVAGEN)细胞中(氯化钙法制备)，轻轻混匀，在冰上放置30min，然后在42℃热休克90s，立即转到冰上放置2min，随后加入800μl LB培养液在37℃条件下振荡培养45min，取200l铺到含50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜(约12hr)，随机挑取5个阳性菌落分别接种于50ml的LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)37℃振荡培养约12hr，然后分别取50μl上述培养液转接于50ml的LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)37℃振荡培养约3hr，当OD600＝0.5时，分别加入终浓度为0.75mM的IPTG 37℃诱导表达3hr，3000×g离心15min收获细胞。然后按ProBond^TM resin For Purification of 6xHis-Tagged Proteins(镍固相亲和层析树脂)(Invitrogen，Catalog nos.R801-01，R801-15)的操作说明进行纯化，具体操作如下：

1)Guanidinium(盐酸胍)裂解缓冲液(6M盐酸胍，20mM NaPO₄，pH 7.8 500mM NaCl)至37℃。

2)重悬菌体于8ml盐酸胍裂解缓冲液中。

3)在冰上超声处理细胞裂解液5s，间隔5s，重复4次。

4)在60℃条件下缓慢振荡30min以保证菌体全部裂解。

5)3,000×g离心15min，将上清转入干净的试管中，取5μl裂解液上清用作SDS-PAGE检测样品。

6)加2mlProBond^TM resin(树脂)到8ml上清液中。

7)室温下轻微振荡结合30min，800×g离心15min，去除上清液。

8)用4ml Denaturing(变性)结合缓冲液(8M尿素(Urea)，20mM NaPO₄，pH 7.8，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复一次。

9)用4ml变性洗涤缓冲液(8M Urea，20mM NaPO₄，pH 6.0，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复一次。

10)用8ml非变性洗涤缓冲液(20mM imidazole(咪唑)，20mM NaPO₄，pH 8.0，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复三次。

11)用8ml溶出缓冲液(500mM咪唑，20mM NaPO₄，pH 8.0，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤15min，800×g离心15min，小心吸取上清于干净的试管中，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品，其余保存于-80℃。

SDS-PAGE检测结果表明，SDF-1βP2G/pET-30a(+)重组体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中正常表达(图3)，Ni亲和纯化出约14KD的目标蛋白带，与理论分子量一致，纯度至少在80％以上(图4和图5)。

12)在4℃用复性缓冲液A(3M尿素，20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇(2-Mecaptoethanol)，135mM NaCl)透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液B(1.5M尿素，20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇，135mM NaCl)继续透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液C(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，135mM NaCl，0.1mM GSH(还原型谷胱甘肽)，0.01mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))继续透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液D(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，135mM NaCl)继续透析上述样品16～24hr。

13)超滤浓缩后按说明书提供的条件用肠激酶EnterokinaseMax^TM(EKMa x^TM)(Invitrogen，Catalog nos.E180-01，E180-02)切除His-Tag，结果见图6。

14)反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离SDF-1βP2G，His-Tag和肠激酶(Enterokinase)，最后得纯化的SDF-1βP2G，纯度在95％以上，结果见图7，储存于-80℃备用。

实施例3

SDF-1βP2G拮抗CXCR4的活性

1、趋化活性

取24孔板，每孔加入预定终浓度(0，0.001，0.01，0.1，0.5，1，10，100nmol/L等浓度梯度)的SDF-1β、SDF-1βP2G的RPMI1640稀释液，然后轻轻的用镊子放上底部带有5μm孔径滤膜的趋化小室(Chemotaxic chamber with pore size of 5μm)，注意避免产生气泡，随即在趋化小室中加入1×10⁷Cells/ml的MOLT-4细胞悬液200μL；5％CO2孵箱中、37℃孵育2-3hr，然后轻轻的一次性取出趋化小室，在显微镜下计数细胞培养板每孔中的细胞数。相对趋化活性(Relative Chemotaxic Activity)＝跨膜细胞数/上载细胞总数×100％。每处理重复三次，数据用DPSv5.02处理，结果以Mean±S表示，DUNCAN新复极差法多重比较。

结果表明，SDF-1βP2G对MOLT-4细胞的趋化活性几乎完全丧失(图8)。

2、SDF-1βP2G对SDF-1β趋化活性的抑制效应

按规定的SDF-1βP2G的终浓度梯度、在5％CO2孵箱中、37℃预处理MOLT-4细胞2-3hr；然后按上述趋化活性的测定方法检测10nmol/L的SDF-1β对预处理MOLT-4细胞的趋化效应。结果及统计方法同趋化活性实验。

实验结果表明，SDF-1βP2G预处理MOLT-4细胞能显著抑制SDF-1β对MOLT-4细胞的趋化活性(图9)

3、钙内流

CXCR4属G蛋白耦联受体家族成员，SDF-1结合并激活CXCR4，通过其耦联的G蛋白异源三聚体启动下游信号通路，引起胞内Ca²⁺浓度的瞬时升高。MOLT4特异性高表达CXCR4，SDF-1及其突变体诱导MOLT4细胞后，通过检测MOLT4胞内Ca²⁺浓度的变化评价它们对CXCR4的激活效应。

方法概述如下：a、Fluo-3/AM储存液的配制根据产品说明书进行；b、向1×107cells/ml的MOLT4细胞的RPMI1640(含10％FBS)悬液中加入适量的Fluo-3/AM储存液，使其终浓度为4μmol/L，混匀并在暗处室温下保温45min；然后用Hank’s(含20mmol/L Hepes，0.2％BSA，不含酚红)液洗涤细胞二次，然后用上述Hank’s液重悬细胞，使其终浓度为1×106cells/ml，保存于暗处备用；C、将流式细胞仪Coulter图的横轴设为时间(Time)，纵轴设为荧光强度(FL1)，取400μl细胞悬液于流式专用管中，上机检测基线水平40sec，然后取下流式专用管，立即加入预定浓度的诱导剂混匀上机，持续检测荧光强度的变化4～8min。数据用CellQuestsoftware(BectonDickinson)处理。

结果表述：Fluo-3在与Ca²⁺结合之前不会发出强荧光，当与Ca²⁺结合后荧光强度增加40倍以上，并且荧光强度的变化与Ca²⁺浓度成正比，因此可以利用诱导后MOLT4荧光强度的变化间接的描述胞内Ca²⁺浓度的变化。

实验结果表明，SDF-1βP2G完全丧失对MOLT-4细胞Ca²⁺内流的诱导效应(图10)。

4、细胞表面CXCR4的内在化

先用拮抗剂与MOLT4细胞表面的CXCR4结合，然后用CXCR4的单克隆抗体检测MOLT4细胞表面CXCR4的表达情况。方法概述如下：a、取MOLT4细胞悬液(2.5×10⁶cells/ml)400μl一份，各加入SDF-1β或其突变体蛋白至预定浓度混匀，在5％CO2孵箱中、37℃孵育MOLT4细胞2-3hr；b、用PBS洗涤细胞2次，将细胞悬于50μl的PBS中，均分成两份，其中一份加入50μg/ml的小鼠抗人CXCR4单克隆抗体12G510μl，混匀后在冰上孵育30min，另一份不加单抗；C、用PBS洗涤细胞3次，重悬细胞于25μl的PBS中，两份分别同时加入50μg/ml的羊抗小鼠IgG-FITC 10μl，混匀后在冰上孵育30min；d、用PBS洗涤细胞2次，重悬细胞于300μl的PBS中，以其中未加CXCR4单克隆抗体12G5者为对照检测MOLT4细胞表面的荧光强度。

结果表述：以SDF-1β及其突变体蛋白SDF-1βP2G不同浓度处理后MOLT4细胞表面荧光强度的高低反应SDF-1β及SDF-1βP2G促使CXCR4内在化的能力。

实验结果表明，SDF-1βP2G与SDF-1β一样，具有正常的CXCR4结合能力，并诱导CXCR4内在化(图11)。

实施例4

SDF-1βP2G对成血管前体细胞的动员效应

FVB小鼠(雄性、8周龄)进行随机分组，分析尾静脉注射1小时后，SDF-1βP2G动员成血管细胞的效应。SDF-1βP2G和AMD3100用PBS溶解稀释，SDF-1βP2G按5mg/kg的剂量静脉注射给药，以AMD3100(5mg/kg，皮下)和PBS分别作为阳性和阴性对照；1小时后处死小鼠，用肝素化抗凝管(BD)收集外周血，BD FACS lysing solution裂解红细胞，血细胞计数器分析白细胞的数量，流式细胞仪分析单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞数量。

实验结果表明，SDF-1βP2G能显著动员单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞从骨髓进入外周血(图12)。

实施例5

SDF-1βP2G促小鼠下肢缺血后血管再生和血流恢复的治疗效应

FVB小鼠(雄性、8周龄)，利用Ketamine(100mg/kg)和Xylazine(10mg/kg)充分麻醉小鼠后，备皮、剪开腹股沟皮肤，用6-0线结扎股浅动脉和静脉(从深股动脉下到腘动脉和静脉)，然后剪断并分离，保持伴行神经不受损伤，然后用4-0线缝合皮肤，即建成小鼠下肢缺血模型。将下肢缺血FVB小鼠随机分组，在手术前1天及手术后每天1次静脉注射SDF-1βP2G(5mg/kg)，仍以AMD31005mg/Kg(皮下)和PBS分别作为阳性和阴性对照，在手术后第0(手术当天)、1、3、5、7、14天利用LDPI监测小鼠下肢血流恢复情况，在第14天处死小鼠，分离缺血和非缺血下肢小腿腓肠肌，用OCT包埋备冰冻切片，新生毛细血管密度将采用抗CD31抗体免疫组化检测。

激光多普勒血流成像分析(LDPI)：小鼠经Ketamine(100mg/kg)和Xylazine(10mg/kg)充分麻醉后，腹部朝上固定在软木板上，后肢脱毛后用激光多普勒分析仪(Periscan PIM IILaser Doppler Perfusion Imager，Perimed AB，Sweden)检测下肢血流，然后用LDPIwin 2.5软件进行定量分析，为了减小个体差异，LDPI血流数据表示为缺血(左)/正常(右)的比值。

实验结果表明，SDF-1βP2G能显著促进缺血小鼠下肢血流快速恢复(图13)。

毛细血管密度：利用缺血下肢腓肠肌冰冻切片(5μm)和抗CD31单克隆抗体(RatAnti-Mouse CD31antibody，BD)进行免疫组化染色，并用苏木精对染，然后在高倍光镜下观察，每实验组取7-10张切片，每张切片取10-15个高倍视野(400x)计数CD31阳性细胞数(毛细血管)和肌纤维数量，毛细血管密度表示为每根肌纤维上的CD31阳性细胞数量。

实验结果表明，SDF-1βP2G显著促进了缺血下肢腓肠肌毛细血管的增生(图14)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>温州医学院

<120>一种CXCR4拮抗剂重组蛋白SDF-1βP2G及其制备方法和应用

<130>1

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>216

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(216)

<223>SDF-1βP2G重组蛋白的核苷酸编码序列

<400>1

aag ggc gtc agc ctg agc tac aga tgc cca tgc cga ttc ttc gaa agc    48

Lys Gly Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

cat gtt gcc aga gcc aac gtc aag cat ctc aaa att ctc aac act cca    96

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

aac tgt gcc ctt cag att gta gcc cgg ctg aag aac aac aac aga caa    144

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

gtg tgc att gac ccg aag cta aag tgg att cag gag tac ctg gag aaa    192

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

gct tta aac aag agg ttc aag atg                                    216

Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met

65                  70

<210>2

<211>72

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Lys Gly Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met

65                  70

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>根据Genebank数据库提供的人SDF-1β的cDNA序列设计的5’-末端引物，用以

     克隆SDF-1βP2G的cDNA

<400>3

ggggtaccga cgacgacgac aagaagggcg tcagcctgag ctacagat          48

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>根据Genebank数据库提供的人SDF-1β的cDNA序列设计的3’-末端引物，用以

    克隆SDF-1βP2G的cDNA

<400>4

acggagctca catcttgaac ctcttgtt                                28

Claims (1)

1.对SDF-1β趋化活性有抑制效应的SDF-1βP2G作为唯一有效成分在制备治疗下肢缺血后血管再生和血流恢复的药物中的应用，其中SDF-1βP2G的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

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