CN101324581A - 半乳糖诊断/测定试剂盒及半乳糖浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定半乳糖浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、半乳糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400－700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出半乳糖浓度的大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种半乳糖诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定半乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术
牛奶在营养界素有“液体黄金”的美称，我国早在1992年由七部位联合提出：“一杯牛奶强壮一个民族”的口号。奶类除不含纤维素外，几乎含有人体所需要的各种营养素。牛奶中的乳糖进入人体后，经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是婴儿大脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。
牛奶虽好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人体不能很好的消化吸收牛奶中的营养素，还会造成钙、磷、钾、铁等元素的吸收障碍，影响婴幼儿的体格和智力发育，在老年人中，乳糖酶缺乏是造成骨质疏松的重要原因。中国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达86.7％，不耐受指数为0.9。
为了避免不适当饮奶对健康造成的损害，因此最好在饮奶前检查自己是否耐受乳糖，在饮用牛奶后，测试尿液中半乳糖的浓度，这是目前国外最常用的一种方法，更为简便、经济、可靠。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定半乳糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的半乳糖诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行半乳糖浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明半乳糖浓度测定方法原理如下：
半乳糖+氧半乳糖氧化酶半乳糖hexodialdose+过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这个方法应用半乳糖氧化酶(galactose oxidase；EC 1.1.3.9)偶联过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)酶促反应终点/速率比色法。半乳糖氧化酶酶解半乳糖反应产生过氧化氢，再通过偶联过氧化物酶的作用，，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料-吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光吸收大小；通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度/速度，得出半乳糖浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明半乳糖诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
还原型色原体组合 0.1--20mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
。
本发明的半乳糖诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。
试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、半乳糖氧化酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、半乳糖氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。
试剂3
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、半乳糖氧化酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、半乳糖氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的半乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测半乳糖样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出半乳糖的浓度大小。
实施例二
本实施例的半乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
4-氨基抗砒 0.6mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测半乳糖样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出半乳糖的浓度大小。
实施例三
本实施例的半乳糖诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
双甲基苯胺 2mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测半乳糖样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出半乳糖的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
Claims (7)
1.一种酶比色法及酶联法技术的半乳糖浓度测定方法，其方法原理如下：
半乳糖+氧半乳糖氧化酶半乳糖hexodialdose+过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出半乳糖浓度大小测定结果。
2.一种半乳糖诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-4000mmol/L
半乳糖氧化酶 1000-80000U/L
过氧化物酶 500-80000U/L
还原型色原体组合 0.1-20mmol/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、半乳糖氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合半乳糖氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于：所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2，苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
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| CNA2007100233853A CN101324581A (zh) | 2007-06-13 | 2007-06-13 | 半乳糖诊断/测定试剂盒及半乳糖浓度测定方法 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107741491A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-02-27 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定尿半乳糖的试剂盒及其制备使用方法 |
-
2007
- 2007-06-13 CN CNA2007100233853A patent/CN101324581A/zh active Pending
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN107741491A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-02-27 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定尿半乳糖的试剂盒及其制备使用方法 |
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Open date: 20081217 |