CN101320023B

CN101320023B - 一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法

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Publication number: CN101320023B
Application number: CN2007101001586A
Authority: CN
Inventors: 王金花; 徐超一; 陈广全; 卢晓宇; 张朝晖; 黄梅; 吴瑑
Original assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Current assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Priority date: 2007-06-05
Filing date: 2007-06-05
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2027-06-05
Also published as: CN101320023A

Abstract

本发明公开了一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，属于食品安全检验技术领域。一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，包括如下步骤：(一)样品前处理；(二)液相色谱-串联质谱(LC/MS-MS)法测定处理后的待测样品中矮壮素和缩节胺残留量；(三)制定标准曲线及结果判定。本发明的优点在于：建立了简便的样品前处理方法，开发了先进色谱分离技术，借助先进的仪器，建立了检测速度快、灵敏度高(检出限<0.005mg/kg)的检测方法。本方法能满足应对欧盟、美国和日本对相关产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)快速定性定量测定蔬菜和水果及其制品、土壤、肥料中残留的矮壮素和缩节胺含量的方法，属于食品安全检验技术领域。

背景技术

随着我国对农产品质量要求的提高和对外贸易量的大幅增加，对其中农药残留的检测要求也更加严格，面临的国际食品安全检验及国外技术壁垒的考验和挑战也愈加严峻。而且越是大宗的出口产品，遭受技术壁垒和贸易制裁的可能性就越大。以2006年日本食品安全检验“肯定列表制度”和欧盟食品安全新法规的实施为代表，使我国的食品、农产品出口面临更为严峻的形势。日本“肯定列表制度”，规定了进口食品安全检测限量多达5万多项，如没有被包括在内的，一律执行“一律标准”，即一律规定安全限量为0.01mg/kg。欧盟禁止使用的农药逐年增加，并对133种农药制定了17000多条限量标准。其中就都包括了矮壮素和缩节胺。我国对蔬菜和水果中的矮壮素和缩节胺残留限量没有明确的规定，更缺乏相应的检测标准。

矮壮素(Chlormequat chloride，通用名：Clormequat)是2-氯乙基三甲铵氯化物的商品名称，缩节胺(Mepiquat chloride，通用名：Mepiquat)也叫助壮素，是1，1-二甲基哌啶氯化物的商品名称，二者均是高效、低毒、广谱的植物生长调节剂，使用后能阻碍内源赤霉素的合成，延缓细胞伸长，使植物植株矮化，茎杆粗壮，增加叶绿素含量，叶片加厚，根系发达，有效防止植物徒长倒状，并有利于提高植物的抗逆性，如抗旱、抗寒、抗盐碱及抗病能力，大幅增加产量。

矮壮素(A)和缩节胺(B)分子结构式

我国早在上世纪五、六十年代就开始施用矮壮素，那时主要用于小麦、玉米和棉花上，使越冬阶段麦苗和玉米茎秆高度受到控制，麦苗、玉米茎秆粗壮，叶片光合速率提高，增产；使棉花叶片提高光合速率，增加光合产物积累，减少蕾铃脱落。目前，矮壮素已被广泛地施用于蔬菜、水果。如蔬菜，用于番茄可有效防止苗徒长，增加坐果率；棚室的白菜、萝卜上，能有效地抑制抽薹、开花，提高蔬菜品质；对有徒长趋势的辣椒植株，可于初花期喷洒，抑制茎、叶生长，使植株矮化粗壮、叶色浓绿，增强抗寒和抗旱能力。花期用矮壮素，能促进早熟，壮苗增产；对无限生长类型的黄瓜品种，用矮壮素进行土壤浇灌，可使茎生长减缓，促使叶片加厚，有利于开花结果，增加植株抗寒抗旱力。水果上，用于番石榴，除了可适当抑制生长，还可在天气转冷时，用矮壮素促花保花，可有效防止小花受冷害，确保来年的坐果率；对于二次结果的葡萄植株，喷施矮壮素，可减缓夏芽萌发和新梢生长速度，增加二次果的产量。西瓜上适时喷施矮壮素，可提高西瓜坐瓜率。

矮壮素和缩节胺大鼠急性经口LD50值分别为966和464mg/kg，属低毒农药。矮壮素可通过食道引起中毒，表现为严重头晕、乏力、口唇及四肢麻木、瞳孔缩小、流涎、恶心、呕吐，重者出现抽搐和昏迷甚至死亡。我国制定了小麦、玉米和棉籽油中矮壮素残留的限量标准，分别为：5、5、0.5mg/kg，对蔬菜、水果中没有明确的规定。欧盟规定矮壮素在梨果类水果如苹果、梨、柚等中的限量为0.05mg/kg。日本规定矮壮素在番茄中的残留限量为0.05mg/kg，在粮谷、蔬菜和水果及动物组织中的残留限量为0.04-10mg/kg，而对缩节胺在番茄中的限量没有明确规定，在粮谷、水果中规定为2mg/kg，动物组织中为0.1mg/kg，牛奶中为0.05mg/kg，其他未注明的均归属于“一律标准”，即0.01mg/kg。

检测农产品中矮壮素残留的方法，国内外常用的有化学法(水剂HG2-818-75)、电位滴定法(CIPAC手册，1988，D，39)以及碱热离子检测器或高灵敏度氮磷检测器的气相色谱法，定量限仅为0.1mg/kg。国外有报道，通过离子肼(ion trap)为质量分析器的LC/MS/MS法检测水果中矮壮素残留量，样品净化使用C18固相萃取小柱；或者，采用LC/MS和LC/MS/MS进行矮壮素和缩节胺残留检测，样品用甲醇和水2：1提取。应用超高压液相色谱—串联质谱(UPLC/ESI-MS/MS)检测的方法未见报道。

为配合相关农产品产区矮壮素和缩节胺残留污染调查工作，开发土壤中和肥料中矮壮素和缩节胺残留检测方法，可以有效地协助相关生产和管理部门查清了污染源，对今后产区矮壮素和缩节胺残留监控提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是：通过采用高效液相色谱-串联质谱建立蔬菜和水果及其制品、土壤、肥料中矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，以提高蔬菜和水果及其制品、土壤、肥料中矮壮素和缩节胺残留量测定方法的灵敏度、准确度及检测速度，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

矮壮素和缩节胺不溶于无水乙醇、乙醚、苯、二甲苯，微溶于二氯乙烷、异丙醇，极易溶于水，所以本方法的提取溶剂采用纯水；因其属于季铵盐类化合物，故采用HILIC(Hydrophilic interaction chromatography)色谱柱进行分离，并采用电喷雾电离正离子(ESI+)、多反应监测(MRM)模式检测，外标法定量。

一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，包括如下步骤：

(一)样品前处理：准确称取经充分混匀的样品1份(g)，加二次水定容至适当体积(ml)，2500r/min以上旋涡混匀1min，超声波提取20-30min，8500-10000r/min离心10min，取上清过孔径为0.2μm的滤膜，待测；

(二)液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)法测定处理后的待测样品中矮壮素和缩节胺残留量：100％乙腈：含0.1％甲酸的5～15mM乙酸铵溶液＝60：40、经HILIC液相色谱柱分离；电喷雾正离子(ESI+)、多反应监测模式(MRM)为定量离子和定性离子进行MS测定；MRM分析参数：针对矮壮素，监测离子对为121.87>57.86和121.87>62.74，驻留时间均为0.1secs，碰撞能量分别为25和20V，锥孔电压均为30V；针对缩节胺，监测离子对为113.96>57.84和113.96>97.81，驻留时间均为0.1secs，碰撞能量均为20V，锥孔电压均为42V。

(三)制定标准曲线及结果判定：

1.标准曲线：准确称取经充分混匀的空白样品1份(g)，加二次水定容至适当体积(ml)，通过前处理步骤制备基质溶液，然后将标准中间溶液用此溶液稀释至一系列标准溶液，不过原点做标准工作曲线，以所得响应值(峰面积)Y与浓度x进行回归分析，建立矮壮素和缩节胺的回归曲线，线性相关系数要求均≥0.995；用二次水直接稀释标准中间溶液建立标准曲线，同样可以符合实验要求；

2.定性标准：样品溶液按照液相色谱-串联质谱条件分别进行测定，进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准中矮壮素和缩节胺相一致，并且所选择的对应的两对离子对的丰度比相一致，则可判定为样品中存在矮壮素和缩节胺。

3.定量标准：采用外标校准曲线法。用空白样提取液或纯水来配制所使用的一系列基质标准工作溶液，然后分别进样绘制标准工作曲线，并且应保证所测样品中农药的响应值均在线性范围以内；用外标法计算定量结果：

X = C \times \frac{V}{m}

式中：

X——试样中矮壮素或缩节胺残留量，单位为μg/kg；

C——从标准曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为ng/mL；

V——样品溶液定容体积，单位为mL；

m——样品溶液所代表试样的质量，单位为g。

所述乙酸铵溶液的浓度为10mM。

所述液相色谱的条件是：色谱柱：ACQUITY，UPLCTM，BEH HILIC，1.7μm，2.1mm×150mm；流动相及流速：流动相：100％乙腈：0.1％甲酸10mmol/L乙酸铵溶液＝60:40；流速：0.25mL/min；柱温：30℃；进样量：3.0μL；样品室温度：5℃。

所述质谱的条件是：电离方式：ESI+；检测方式：MRM；毛细管电压：3.50kV；氮吹气流量：400L/Hr；锥孔气流量：48L/Hr；反溶剂气温度：400℃；放大器电压：650V；离子源温度：110℃。

本发明的优点在于：(1)建立了简便的样品前处理方法，直接用水提取，无需净化、耗时少、无有机溶剂污染；(2)开发了先进的色谱分离技术，应用针对强极性碱化合物的HILIC色谱柱，有效地分离了矮壮素和缩节胺两种植物生长调节剂组分；(3)借助先进的仪器，建立了检测速度快、灵敏度高的检测方法，以ESI+和MRM模式进行超高压液相色谱或高效液相色谱-串联质谱定性定量测定分析，方法检出限<0.005mg/kg，检测仅需几分钟。本方法能满足应对欧盟、美国和日本对相关产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

下面结合附图和较佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。

附图说明

图1为实施例1中矮壮素和缩节胺的标准工作曲线。

图2为矮壮素(左，保留时间1.86分钟)和缩节胺(右，保留时间2.02分钟)的以番茄酱为基质、浓度均为10.0ng/mL的多反应监测色谱图(对应实施例1)。

图3为矮壮素和缩节胺的番茄酱空白样品的多反应监测色谱图(对应实施例1)。

图4为矮壮素(左，保留时间1.83分钟)和缩节胺(右，保留时间1.98分钟)的以苹果为基质、浓度均为20.0ng/mL的多反应监测色谱图(对应实施例2)。

图5为矮壮素和缩节胺的苹果空白样品的多反应监测色谱图(对应实施例2)。

图6为矮壮素(左，保留时间1.83分钟)和缩节胺(右，保留时间1.98分钟)的以西瓜为基质、浓度均为20.0ng/mL的多反应监测色谱图(对应实施例3)。

图7为矮壮素和缩节胺的西瓜空白样品的多反应监测色谱图(对应实施例3)。

图8为矮壮素(左，保留时间1.98分钟)和缩节胺(右，保留时间2.14分钟)的肥料为基质、浓度均为10.0ng/mL的多反应监测色谱图(对应实施例5)。

图9为矮壮素和缩节胺的肥料空白样品的多反应监测色谱图(对应实施例5)。

具体实施方式

以下实施例中使用的仪器和试剂：

电子天平：AND，HF-400，Max＝401g，d＝0.001g，Japan；

离心机：Hettich，UNIVERSAL32R，Germany；

离心管：具塞，50mL，USA；

旋涡混匀器：MS2，Minishaker，中国；

超声波振荡器：KQ-250E，中国；

玻璃进样瓶:Waters，12mm×32mm，1.5ml，UPLC-MS-MS专用，USA；

针头过滤膜：Waters，13mm GHP0.2μm，双相通用，USA；

色谱柱：ACQUITY，UPLCTM，BEH HILIC，1.7μm，2.1mm×150mm，USA；

一次性使用无菌注射器：BD，3mL/5mL，Spain；

超高压液相色谱—串连质谱仪(UPLC-MS-MS)：Waters，AcquityTM UPLC-QuattroPremier XE MS/MS，具有ESI+电离源。

二次水：纯净水经过Milli-Q再次净化；

甲醇：Fisher，HPLC级，美国；

乙腈：Fisher，HPLC级，美国；

甲酸：TEDIA，HPLC级，美国；

乙酸铵：TEDIA，HPLC级，美国；

流动相中水相：0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液。准确称取192.6mg乙酸铵，用二次水定容至250mL容量瓶中，加入250μL甲酸。现用现配，使用前超声脱气2min。

标准物质：Labor Dr.Ehrenstorfer-Schaefers，Augsburg，Germany；纯度：99±0.5％；规格：0.25g。

标准储备液的配制：准确称取标准品10±0.1mg，用少量甲醇溶解，然后在10mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，配置成1000.0μg/mL，-18℃保存。

标准中间液的配制：用二次水将标准储备液稀释至10.0μg/mL，再用二次水将其稀释至0.1μg/mL，2～8℃保存。

测定条件与仪器参数：

色谱条件：

色谱柱：ACQUITY，UPLCTM，BEH HILIC，1.7μm，2.1mm×150mm；

流动相及流速：流动相：100％乙腈：0.1％甲酸10mmol/L乙酸铵溶液＝60:40；流速：0.25mL/min；

柱温：30℃；

进样量：3.0μL；

样品室温度：5℃。

质谱条件：

电离方式：ESI+；

检测方式：MRM；

毛细管电压：3.50kV；

氮吹气流量：400L/Hr；

锥孔气流量：48L/Hr；

反溶剂气温度：400℃；

放大器电压：650V；

离子源温度：110℃；

MRM分析参数：针对矮壮素，监测离子对为121.87>57.86和121.87>62.74，驻留时间均为0.1secs，碰撞能量分别为25和20V，锥孔电压均为30V；针对缩节胺，监测离子对为113.96>57.84和113.96>97.81，驻留时间均为0.1secs，碰撞能量均为20V，锥孔电压均为42V；

实施例1：UPLC/MS-MS法快速分析测定番茄和番茄酱中矮壮素和缩节胺残留量

1.制备标准曲线：准确称取5.0g空白样品并准确称量20mL二次水，2500r/min以上旋涡混匀1min，超声波提取20-30min，8500-10000r/min离心10min，取上清过孔径为0.2μm的滤膜，制得待测基质溶液；用该溶液将标准中间溶液分别稀释至1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、50.0ng/mL，不过原点做标准工作曲线，以所得响应值(峰面积)Y与浓度x进行回归分析。矮壮素和缩节胺的回归曲线分别为Y＝81.7x-47.6和Y＝107.0x+8.2，线性相关系数分别为0.995和0.999，它们的标准工作曲线如图1所示。

2.样品前处理：样品混匀，准确称取样品5.00g，加水定容至20mL，2500转/min以上旋涡混匀1min，超声波提取30min，8500转/min离心10min，取上清液过0.2μm滤膜(Waters，13mm GHP，USA)，供LC/MS/MS检测。

3.方法的回收率与精密度：在三组各6个空白番茄酱样品中分别加入250、500和1000uL的100.0ng/mL的矮壮素和缩节胺混合标准溶液，按样品前处理步骤进行处理测定，计算回收率和精密度。测定结果表明，两种组分平均回收率分别为78.5-90.1％及80.0-104.0％；6次平行测定的相对标准偏差分别为9.5-11.3％及10.5-13.2％，均满足定量分析要求，结果见表1。

表1：回收率及精密度测定结果(n＝6)

回收试验结果说明，本方法简便，灵敏，可靠。需要注意的是处理后的样品应在1-2天内上机检测，且每20～30个样品中间须加入一个标准系列，以保证定量结果的准确性。

以本发明为基础，制定了蔬菜、水果及其制品中矮壮素和缩节胺残留测定方法—高效液相色谱—串联质谱法(定性定量法)，对962个实际样品(番茄和番茄酱)的检测结果进行统计，结果见表2。

表2：2006年8月至2007年3月番茄和番茄酱样品检测统计结果

检测项目	矮壮素	缩节胺
			检测样品总数	962	413
未检出	451	283
			阳性	511	130
阳性率	53.12％	31.48％
			超标(50μg/kg)	347	106
超标率	36.07％	25.67％
			最大结果	9.9mg/kg	0.62mg/kg

实例2：UPLC/MS-MS法快速分析测定苹果中矮壮素和缩节胺残留量

标准曲线的制备、样品前处理步骤及添加试验方法均同实例1，所建立标准工作曲线方程为84.3383x+5.09253，相关系数0.9989。添加回收试验结果见表3，同样地，本实例说明，本方法简便，灵敏，可靠。

表3：苹果基质的回收率及精密度测定结果(n＝3)

实例3：UPLC/MS-MS法快速分析测定西瓜中矮壮素和缩节胺残留量

标准曲线的制备、样品前处理步骤及添加试验方法均同实例1，所建立标准工作曲线方程为168.01x+13.9386，相关系数0.9979。添加回收试验结果见表4，同样地，本实例说明，本方法简便，灵敏，可靠。

表4：西瓜基质的回收率及精密度测定结果(n＝3)

实例4：UPLC/MS-MS法快速分析测定土壤中矮壮素和缩节胺残留量

标准曲线用二次水配制，方法同实例1。

样品前处理步骤及添加试验方法均同实例1。所建立标准工作曲线方程为77.6528x-6.3626，相关系数0.9993。添加水平为5.0、10.0、20.0μg/kg时，平均回收率介于70～98％之间；3次平行测定的相对标准偏差均<20％。同样地，本实例说明，本方法简便，灵敏，可靠。

实例5：UPLC-MS-MS法快速分析测定肥料中矮壮素和缩节胺残留量

标准曲线用二次水配制，方法同实例1。

样品前处理：样品混匀，准确称取样品1.00g，加水定容至100mL，2500转/min以上旋涡混匀1min，超声波提取30min，8500转/min离心10min，取上清液1mL用水稀释至100mL，过0.2μm滤膜(Waters，13mm GHP，USA)，供LC/MS/MS检测。若未检出，则直接用上清液过膜(同上)测定。检出限为100μg/kg。添加水平为5.0、10.0、20.0μg/kg时，平均回收率介于60～85％之间；3次平行测定的相对标准偏差均<20％。同样地，本实例说明，本方法简便，灵敏，可靠。

本发明建立了简便的样品前处理方法，开发了先进色谱分离技术，借助先进的仪器，建立了检测速度快、灵敏度高(检出限<0.005mg/kg＝的检测方法。本方法能满足应对欧盟、美国和日本对相关产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Claims

1.一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，包括如下步骤：

(一)样品前处理：准确称取经充分混匀的样品1份，加二次水定容至适当体积，2500r/min以上旋涡混匀1min，超声波提取20-30min，8500-10000r/min离心10min，取上清过孔径为0.2μm的滤膜，待测；

(二)液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)法测定处理后的待测样品中矮壮素和缩节胺残留量：100％乙腈：含0.1％甲酸的5～15mM乙酸铵溶液＝60∶40、经HILIC液相色谱柱分离；电喷雾正离子(ESI+)、多反应监测模式(MRM)为定量离子和定性离子进行MS测定；MRM分析参数：针对矮壮素，监测离子对为121.87＞57.86和121.87＞62.74，驻留时间均为0.1secs，碰撞能量分别为25和20V，锥孔电压均为30V；针对缩节胺，监测离子对为113.96＞57.84和113.96＞97.81，驻留时间均为0.1secs，碰撞能量均为20V，锥孔电压均为42V；

(三)制定标准曲线及结果判定：

a.标准曲线：准确称取经充分混匀的空白样品1份，加二次水定容至适当体积，通过前处理步骤制备基质溶液，然后将标准中间溶液用此溶液稀释至一系列标准溶液，不过原点做标准工作曲线，以所得响应值Y与浓度x进行回归分析，建立矮壮素和缩节胺的回归曲线，线性相关系数要求均≥0.995；用二次水直接稀释标准中间溶液建立标准曲线，同样可以符合实验要求；

b.定性标准：样品溶液按照液相色谱-串联质谱条件分别进行测定，进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准中矮壮素和缩节胺相一致，并且所选择的对应的两对离子对的丰度比相一致，则可判定为样品中存在矮壮素和缩节胺；

c.定量标准：采用外标校准曲线法，用空白样提取液或纯水来配制所使用的一系列基质标准工作溶液，然后分别进样绘制标准工作曲线，并且应保证所测样品中农药的响应值均在线性范围以内；用外标法计算定量结果：

X = C \times \frac{V}{m}

式中：

X——试样中矮壮素或缩节胺残留量，单位为μg/kg；

C——从标准曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为ng/mL；

V——样品溶液定容体积，单位为mL；

m——样品溶液所代表试样的质量，单位为g。

2.根据权利要求1所述的一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，其特征在于：所述乙酸铵溶液的浓度为10mM。

3.根据权利要求1所述的一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，其特征在于：所述液相色谱的条件是：色谱柱：ACQUITY，UPLCTM，BEH HILIC，1.7μm，2.1mm×150mm；流动相及流速：流动相：100％乙腈：含0.1％甲酸的10mmol/L乙酸铵溶液＝60∶40；流速：0.25mL/min；柱温：30℃；进样量：3.0μL；样品室温度：5℃。

4.根据权利要求1所述的一种矮壮素和缩节胺残留量的测定方法，其特征在于：所述质谱的条件是：电离方式：ESI+；检测方式：MRM；毛细管电压：3.50kV；氮吹气流量：400L/Hr；锥孔气流量：48L/Hr；反溶剂气温度：400℃；放大器电压：650V；离子源温度：110℃。