CN101315359A - 一种水溶性高聚物生物降解率的测定方法 - Google Patents

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岳红雨
孙波
王菁
师慈
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一种水溶性高聚物生物降解率的测定方法，采用三组瓶－培养瓶、中性瓶、毒性瓶－液体培养法，在特定条件下对培养瓶和毒性瓶的液体进行28天培养，分别检测并计算各样液总有机碳的含量，根据培养前后总有机碳的变化值计算确定其降解率。本发明的优点是：该方法科学合理、简单实用；由于采用直接测定溶液中的有机物的方法，提高了测定结果的准确性；在检测各处理液的总碳和无机碳的含量前，采用超声波细胞破碎法是基于完全生物降解理论进行的，此处理方法可以将高聚物不完全降解转化成的中间代谢产物保留在处理液中，测定的降解率仅涉及完全转化为CO2和H2O的部分高聚物，因此本测定方法更为科学、严密。

Description

一种水溶性高聚物生物降解率的测定方法
(一)技术领域
本发明涉及利用微生物降解水溶性高聚物的技术领域，特别是一种水溶性高聚物生物降解率的测定方法。
(二)背景技术
近年来，高聚物的降解是国内外研究的热点问题，已经开展将微生物应用于水溶性高聚物的生物降解研究，通过微生物对水溶性高聚物的吸收利用，使高聚物对环境的危害降低到最小程度。目前利用微生物对水溶性高聚物的生物降解性测定评价方法较多，包括：检测降解过程中所产生的CO2，以其为度量指标，来评价生物降解能力，如STURM法；以BOD/COD为度量指标，测试生物降解过程中O2的消耗量，如MITI法等。对于水溶性聚合物的生物降解而言，由于上述方法均采用间接方法测定，方法不严密，因此准确性低、误差较大，特别是用不同的方法对同一样品进行测试所得出的结论有时相差很大。
(三)发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一种科学合理、简单实用、准确性高且具有良好重复性和稳定性的水溶性高聚物生物降解率的测定方法。
本发明的技术方案：
一种水溶性高聚物生物降解率的测定方法，其特征在于：采用三组瓶液体培养法完成高聚物的生物降解过程，然后分别检测并计算总有机碳的含量，根据培养前后总有机碳的变化值计算确定其降解率，具体方法如下：
(1)三组瓶液体培养法及总有机碳的检测：
在三组瓶液体培养法中，所用水的纯度最低为双蒸水且可溶性有机碳少于1mg/L；所用试剂的纯度最低为分析纯；检测用玻璃容器均用洗液洗涤干净并确保容器壁内不含有含碳化合物；微生物菌种来源于从污水处理厂生化池取得且经过滤去除杂质的新鲜活性污泥滤液，接种菌液的活菌浓度为1.0×104～1.0×105CFU/mL；无机盐基础培养基溶液是由以下组分构成的水溶液，各组分的含量按g/1000mL水溶液计分别为KH2PO4 0.34、Na2HPO40.15、(NH4)28O4 0.40、MgSO4·7H2O 0.07、FeCl3·6H2O 0.0025、酵母粉0.001，余量为水，培养基的pH值为7.2～7.6，以水溶性高聚物作为微生物生长的碳源；
1)样品瓶液体培养：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，加入总有机碳量为50mg的水溶性高聚物，灭菌后接种上述微生物菌种即活性污泥滤液50mL，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，培养温度为30℃±1℃，于170～200r/min条件下避光振荡培养28天，培养结束后取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r培养表示；
2)毒性瓶液体培养：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，加入总有机碳量为50mg的水溶性高聚物，灭菌后加入0.03M HgCl2溶液10.0mL，以抑制溶液中杂菌的生长，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，培养温度为30℃±1℃，于170～200r/min条件下避光振荡培养28天，培养结束后取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r毒性表示；
3)中性瓶样品配制：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，灭菌后接种上述微生物菌种即活性污泥滤液50mL，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，然后立即取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r中性表示；
对上述三组瓶液体样品进行的超声波细胞破碎操作必须同时进行，相应的取样和检测操作亦分别同时进行；
(2)通过计算确定降解率：
降解率计算公式：
Figure A20081005391200041
本发明的优点是：在水溶性高聚物的生物可降解测试中首次采用三组瓶测定方法，该方法科学合理、简单实用；在降解方案及过程中，毒性瓶仅接入高聚物而不接入菌液，培养瓶则接入了高聚物和菌液，中性瓶的作用是扣除因加入菌液所致的总有机碳值的增加，从而减少了实验误差，使得本方法逻辑性更加严密；由于采用直接测定溶液中的有机物的方法，提高了测定结果的准确性；在检测各处理液的总碳和无机碳的含量前，采用超声波细胞破碎法是基于最终生物降解理论进行的，此处理方法可以将高聚物不完全降解转化成的中间代谢产物保留在处理液中，测定的降解率仅涉及完全转化为CO2和H2O的部分高聚物，因此本测定方法更为科学、严密。
(四)具体实施方式
实施例1：聚天冬氨酸的生物降解率的测定，聚天冬氨酸样品的分子量约为2300。
(1)三组瓶液体培养法及总有机碳的检测：
在三组瓶液体培养法中，所用水的纯度最低为双蒸水且可溶性有机碳少于1mg/L；所用试剂的纯度最低为分析纯；检测用玻璃容器均用洗液洗涤干净并确保容器壁内不含有含碳化合物；微生物菌种来源于从某污水处理厂生化池取得且经过滤去除杂质的新鲜活性污泥滤液，其优势菌为动胶菌属(Zoogloea)、丛毛单胞菌属(Comamonas)，假单胞菌属(Pseudomonas)和微球菌属(Micrococcus)等，接种菌液的活菌浓度为1.0×104～1.0×105CFU/mL；无机盐基础培养基溶液是由以下组分构成的水溶液，各组分的含量按g/1000ml水溶液计分别为KH2PO4 0.34、Na2HPO4 0.15、(NH4)28O4 0.40、MgSO4·7H2O 0.07、FeCl3·6H2O0.0025、酵母粉0.001，余量为水，培养基的pH值为7.2～7.6，以聚天冬氨酸作为微生物生长的碳源；
1)样品瓶液体培养：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，加入聚天冬氨酸119.0mg(相当于5.17×10-5mol)，折算为总有机碳的量为50mg，灭菌后接种上述微生物菌种50mL，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，培养温度为30℃，于180r/min条件下避光振荡培养28天，培养结束后取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r培养表示；
2)毒性瓶液体培养：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，加入总有机碳量为50mg的水溶性高聚物，灭菌后加入0.03M HgCl2溶液10.0mL，以抑制溶液中杂菌的生长，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，培养温度为30℃，于180r/min条件下避光振荡培养28天，培养结束后取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r毒性表示；
3)中性瓶样品配制：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，灭菌后接种上述微生物菌种50mL，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，然后立即取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r中性表示；
对上述三组瓶液体样品进行的超声波细胞破碎操作必须同时进行，相应的取样和检测操作亦分别同时进行；
(2)通过计算确定降解率：
降解率计算公式：
Figure A20081005391200051
三组瓶检测结果及通过计算确定的降解率如下表所示：
Figure A20081005391200052
注：表中三组瓶数据为降解后各瓶中总有机碳的含量，以mg/1000mL计。
表中显示：该微生物对聚天冬氨酸的降解能力最大为67.19％，平行测定的最大误差为1.53％，检测数据具有较好的重复性和稳定性；按照OECD301提供的对水溶性物质生物降解性的评价标准判断，此高聚物属于可生物降解有机物。
实施例2：聚丙烯酸的生物降解率的测定，聚丙烯酸样品的分子量约为2100。除了在样品液体培养基配制中改为加入聚丙烯酸100.0mg(相当于4.76×10-5mol)，折算为总有机碳的量为50mg外，其他如三组瓶液体培养法及总有机碳的检测、通过计算确定降解率的方法和步骤与实施例1完全相同，三组瓶检测结果及通过计算确定的降解率如下表所示：
Figure A20081005391200061
注：表中三组瓶数据为降解后各瓶中总有机碳的含量，以mg/1000mL计。
表中显示：该微生物对聚丙烯酸的降解能力最大为21.53％，平行测定的最大误差为1.84％，检测数据具有较好的重复性和稳定性；按照OECD301提供的对水溶性物质生物降解性的评价标准判断，此高聚物属于可生物降解有机物。
实施例3：聚天冬氨酸壳聚糖共聚物的生物降解率的测定，聚天冬氨酸与脱乙酰壳聚糖共聚生成聚合度为17％～19％的聚天冬氨酸壳聚糖共聚物，分子量约为2500。除了在样品液体培养基配制中改为加入共聚物108.7mg(相当于4.34×10-5mol)，折算为总有机碳的量为50mg外，其他如三组瓶液体培养法及总有机碳的检测、通过计算确定降解率的方法和步骤与实施例1完全相同，三组瓶检测结果及通过计算确定的降解率如下表所示：
Figure A20081005391200062
注：表中三组瓶数据为降解后各瓶中总有机碳的含量，以mg/1000mL计。
表中显示：该微生物对聚丙烯酸的降解能力最大为57.43％，平行测定的最大误差为4.19％，检测数据具有较好的重复性和稳定性；按照OECD301提供的对水溶性物质生物降解性的评价标准判断，此高聚物属于可生物降解有机物。

Claims (1)

1.一种水溶性高聚物生物降解率的测定方法，其特征在于：采用三组瓶液体培养法完成高聚物的降解过程，然后分别检测并计算总有机碳的含量，根据培养前后总有机碳的变化值计算确定其降解率，具体方法如下：
(1)三组瓶液体培养法及总有机碳的检测：在三组瓶液体培养法中，所用水的纯度最低为双蒸水且可溶性有机碳少于1mg/L；所用试剂的纯度最低为分析纯；检测用玻璃容器均用洗液洗涤干净并确保容器壁内不含有含碳化合物；微生物菌种来源于从污水处理厂生化池取得且经过滤去除杂质的新鲜活性污泥滤液，接种菌液的活菌浓度为1.0×104～1.0×105CFU/mL；无机盐基础培养基溶液是由以下组分构成的水溶液，各组分的含量按g/1000mL水溶液计分别为KH2PO4 0.34、Na2HPO4 0.15、(NH4)2SO4 0.40、MgSO4·7H2O 0.07、FeCl3·6H2O 0.0025、酵母粉0.001，余量为水，培养基的pH值为7.2～7.6，以水溶性高聚物作为微生物生长的碳源；
1)样品瓶液体培养：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，加入总有机碳量为50mg的水溶性高聚物，灭菌后接种上述微生物菌种即活性污泥滤液50mL，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，培养温度为30℃±1℃，于170～200r/min条件下避光振荡培养28天，培养结束后取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r培养表示；
2)毒性瓶液体培养：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，加入总有机碳量为50mg的水溶性高聚物，灭菌后加入0.03M HgCl2溶液10.0mL，以抑制溶液中杂菌的生长，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，培养温度为30℃±1℃，于170～200r/min条件下避光振荡培养28天，培养结束后取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r毒性表示；
3)中性瓶样品配制：取900mL上述无机盐基础培养基溶液，灭菌后接种上述微生物菌种即活性污泥滤液50mL，再用上述无机盐基础培养基溶液定容至1000mL，然后立即取样品10.0mL进行超声波细胞破碎，破碎时间为2.0min，然后检测其总碳和无机碳的含量，由于总有机碳的含量等于总碳的含量减去无机碳的含量，即可获得总有机碳的含量，用r中性表示；
对上述三组瓶液体样品进行的超声波细胞破碎操作必须同时进行，相应的取样和检测操作亦分别同时进行；
(2)通过计算确定降解率：
降解率计算公式：
Figure A2008100539120002C1
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