CN101307040B - 一种分离制备紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种三尖杉宁碱化学衍生法在紫杉醇制备的应用，将具有α，β不饱和酮结构的三尖杉宁碱类似物通过加成反应转化为单卤单羟基或单卤单烷基产物，再经过柱分离获得紫杉醇，此工艺同样适宜于10-去乙酰三尖杉宁碱与10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰-7-木糖三尖杉宁碱与10-去乙酰-7-木糖紫杉醇的分离。本发明的优点在于，将NBS加成的方法成功应用到了紫杉醇与三尖杉宁碱(或两者类似物)的分离中。用常规、廉价的硅胶柱实现了紫杉醇和三尖杉宁碱的分离，达到纯化紫杉醇的目的。该方法适用于不同纯度的紫杉醇混合物，可用于其它三尖杉宁碱类化合物与类似物的分离，本发明工艺可获得纯度大于99％的紫杉醇，总收率可达80％，三尖杉宁碱加成产物的总收率高于90％。
Description
技术领域
本发明涉及紫杉醇原料药制备领域，特别提供了一种三尖杉宁碱化学衍生法在紫杉醇制备的应用。
背景技术
1967年紫杉醇首次从短叶红豆杉树皮中分离获得。目前，紫杉醇已先后被美国FDA批准用于治疗乳腺癌、卵巢癌以及非小细胞肺癌等实体癌的治疗(Lancet，2000，355，1176)。紫杉醇在红豆杉属植物提取物中的含量极低；共存杂质种类繁多、尤其是分子结构和理化性质与紫杉醇极为相近的类似物三尖杉宁碱(图1-1，2)。由于它们具有相同的母核，结构上的唯一区别是3’-酰胺上的取代基不同，紫杉醇是苯基，而三尖杉宁碱是2-丁烯基。结构的相似也决定了其相似的物理化学性质和色谱保留行为，所以通过传统手段很难将这两种化合物分离。从紫杉醇的发现至今，紫杉醇的分离制备一直在不断改善和进步中。目前分离这两种化合物的方法有：
1、色谱直接分离：1)反相色谱分离(J.Liq.Chromatogr.1993，16，3263)，这大大增加了生产成本；2)制备性TLC、HPLC以及HPLC与HSCCC(高速逆流色谱)相结合的方法分离紫杉醇与三尖杉宁碱。直接柱分离需要的填料相对多，由于反相填料造价昂贵以及处理量小等因素，以上两种方法都无法实现规模化生产。
2、对不饱和双键的结构修饰后分离
1)，溴化：Kingston等(J.Nat.Prod.1996，59，167于1996年用液溴、四丁基三溴铵或吡啶鎓过溴化物作为氧化剂，使三尖杉宁碱转化为2’，3’-二溴化三尖杉宁碱，而紫杉醇不受影响。Pandy等(US5807888，1998)在公开专利中用0.01-0.1M的溴溶液转化三尖杉宁碱。由于液溴的挥发性和强氧化性，这两种溴化方法都需要严格控制反应时间与液溴的加入量，增加了反应方向的不可控性，且产物在上柱前要经过多步处理，容易造成损失，同时还需处理带入盐的杂离子，会大大影响紫杉醇分离纯化的效率。
2)，氧化：Kingston等(J.Nat.Prod.，1992，55，259-261)使用OsO4快速且高选择性地氧化了三尖杉宁碱，使侧链上双键变成顺式双羟基的形式。然而，OsO4的强致癌性及其昂贵的价格决定了此工艺无法用于工业化生产紫杉醇原料药。
3)，臭氧化：Murray等(US Patent 5334732，1994)采用臭氧化的方法，臭氧化后加入吉拉德酞肼-乙酸混合物，与三尖杉宁碱氧化物形成复合物，然后通过选择性沉淀或乙酸乙酯-水萃取把紫杉醇分离出来。该方法要求严格控制臭氧流量和反应条件，否则会导致紫杉醇的降解。
发明内容
本发明的目的是提供了一种三尖杉宁碱化学衍生法在紫杉醇制备的应用。
本发明提供了一种用三尖杉宁碱化学衍生法分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：
以含有三尖杉宁碱类化合物的紫杉醇混合物为原料，在有机溶剂反应体系中通过加成反应将具有α，β不饱和酮结构的三尖杉宁碱极其类似物转化为单卤单羟基或单卤单烷基产物；再经过柱分离获得紫杉醇。
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述含有三尖杉宁碱类化合物的紫杉醇混合物中，三尖杉宁碱类化合物含量大于0.5％；或者
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述三尖杉宁碱化学衍生法适用于三尖杉宁碱和紫杉醇、10-去乙酰三尖杉宁碱与10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰-7-木糖三尖杉宁碱与10-去乙酰-7-木糖紫杉醇的分离。
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述的加成反应选用具有R2N-X结构的N-卤代酰胺类化合物作为加成试剂，用于加成三尖杉宁碱的侧链双键；X为卤素，包括F，Cl，Br，I。
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述的反应体系选择易溶解原料的有机溶剂，包括乙醇，甲醇，四氢呋喃，丙酮，乙酸乙酯，二氧六环，氯仿，二氯甲烷。
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述的三尖杉宁碱化学衍生法反应温度0-80℃；反应时间2-24小时。
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述的催化剂选用路易斯酸，能促进单卤单烷基加成产物的生成并加快反应速率，反应体系中加入水后能获得相应的单卤单羟基三尖杉宁碱加成产物。
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述的路易斯酸选自IIIB族金属元素的卤化物或硝酸盐或三氟甲基磺酸盐或它们的混合物，优选硝酸钪，硝酸镧，硝酸铈，氯化铈，氯化镧，溴化镧，溴化钕，三氟甲基磺酸镱，三氟甲基磺酸镧。
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述的柱分离中，紫杉醇与三尖杉宁碱衍生物的分离选用普通玻璃柱或金属柱，固定相能选择正相填料，样品与固定相质量比为1∶10-1∶40；也能选择反相填料，样品与固定相质量比为1∶150-1∶3000。
本发明分离制备紫杉醇的方法，所述正相柱分离的流动相可选择乙酸乙酯/正己烷、乙酸乙酯/石油醚、氯仿/甲醇、二氯甲烷/甲醇或二氯甲烷/乙醇、氯仿/乙醇之一；反相柱分离时流动相选择乙腈、甲醇、乙醇、丙酮之一与水的混合体系。
本发明所提出工艺是通过化学转化改变三尖杉宁碱的极性，从而实现三尖杉宁碱与紫杉醇的分离。具体实施是以NBS(N-溴代琥珀酰胺，见图1-2)为加成试剂，将具有α，β-不饱和酮结构的三尖杉宁碱(或其衍生物)C-13侧链上的碳碳双键进行化学修饰。化学转化后柱分离获得紫杉醇及三尖杉宁碱的加成产物。整套工艺操作简单，温和可控，适于规模化制备紫杉醇。
本发明的具体步骤：
1，原料选择：三尖杉宁碱(或其类似物)大于0.5％的紫杉醇样品(紫杉烷混合物)；
2，溶剂选择：选择易溶解紫杉醇的高极性或中等极性溶剂，可选择甲醇，乙醇，四氢呋喃，丙酮，乙酸乙酯，二氧六环，氯仿，二氯甲烷；
3，加成反应：将反应原料溶解于上述溶剂体系中，并加入1.5-10倍的NBS(以三尖杉宁碱的摩尔数为参考依据)，在搅拌状态下反应至三尖杉宁碱转化完全；
4，反应结束后，将反应混合物浓缩后干法上柱，采用正相或反相柱分离。
正相柱分离：硅胶粒径200-300目，色谱柱柱床高100-250mm，色谱柱直径20-40mm，反应后混合物与硅胶最佳质量比为1∶30。
反相柱分离：反相硅胶粒径10-50μm，色谱柱柱床高100-1000mm，色谱柱直径5-40mm，反应后混合物与硅胶最佳质量比为1∶300。
5，淋洗∶正相柱分离以乙酸乙酯/正己烷或乙酸乙酯/石油醚＝1∶1为流动相，反相分离以乙醇/水＝4∶1为流动相，收集各馏分并检测，将相似馏分合并。
6，结晶及重结晶：结晶操作选择甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈、丙酮之一为优溶剂；选择水、正己烷或环己烷之一为不良溶剂。待结晶物质全溶后，搅拌状态下滴加不良溶剂，至有白色微小颗粒析出为止。室温下放置24后滤出晶体。
本发明的优点：
本发明工艺中，我们将NBS加成的方法成功应用到了紫杉醇与三尖杉宁碱(或两者类似物)的分离中。用NBS对部分紫杉烷混合样品中的三尖杉宁碱进行化学转化，得到极性显著增大的衍生物，而紫杉醇并不受影响，从而用常规、廉价的硅胶柱实现了紫杉醇和三尖杉宁碱的分离，达到纯化紫杉醇的目的。该方法适用于不同纯度的紫杉醇混合物，在对4％的紫杉醇原料(含2％三尖杉宁碱)和37％的紫杉醇原料(含21％三尖杉宁碱)进行化学转化时均取得了成功，最终得到纯度大于99％紫杉醇晶体。同时本发明也可用于其它三尖杉宁碱类化合物与类似物的分离，如10-去乙酰三尖杉宁碱与10-去乙酰紫杉醇以及10-去乙酰-7-木糖三尖杉宁碱与10-去乙酰-7-木糖紫杉醇的分离。
本发明工艺可获得纯度大于99％的紫杉醇，总收率可达80％。此外，三尖杉宁碱加成产物的总收率高于90％。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为紫杉醇、三尖杉宁碱及10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰三尖杉宁碱的化学结构；
图2为三尖杉宁碱加成反应化学反应式；
图3为三尖杉宁碱加成产物的LC-MS定性分析谱图；
图4为紫杉醇的LC-MS定性分析谱图；
在图4中，1-2分别为化合物a的正负离子信号；[M+H]+ at m/z 928；[M-H]- at m/z 926；[M-Br]+ at m/z 848；3-4分别为化合物b的正负离子信号；[M+H]+ at m/z 928；[M-Br]+ at m/z 848；
图5为三尖杉宁碱加成反应前后的HPLC谱图(a，三尖杉宁碱；b，紫杉醇；c，三尖杉宁碱加成产物)；
摘要附图为三尖杉宁碱化学衍生法通过加成反应得到产物的结构图。
具体实施方式
实施例一：
称取1.0g紫杉烷样品(含37％紫杉醇，21％三尖杉宁碱)溶于20ml甲醇中，加入220mg NBS并加入路易斯酸，室温下反应，HPLC检测显示三尖杉宁碱转化率达95％后，料液减压蒸干。用乙酸乙酯-正己烷(1∶1)约8ml溶解后上样柱分离，乙酸乙酯/正己烷(1∶1)洗脱。分类收集各组分得紫杉醇(纯度＞90％)部分。所采用的各种路易斯酸及其用量，反应时间，紫杉醇收率列表如下：
表一.多种路易斯酸催化单溴单烷氧基加成
实施例二：
称取1.0g紫杉烷样品(含37％紫杉醇，21％三尖杉宁碱)溶于40ml甲醇∶水(3∶1)体系中，加入220mg NBS，35℃下反应12小时，HPLC检测显示三尖杉宁碱转化率达95％。加成反应后，产物用乙酸乙酯-正己烷(1∶1)萃取三次(40ml，10ml，10ml)，合并萃取相后浓缩。浓缩液用乙酸乙酯-正己烷(1∶1)约8ml溶解，后上样柱分离，乙酸乙酯/正己烷(5∶5)洗脱。分类收集各组分得紫杉醇部分378mg，纯度91％。收率93％。
实施例三：
称取5.00g紫杉烷样品(37％紫杉醇，21％三尖杉宁碱)溶于100ml甲醇中，加入10ml水及1g NBS，35℃下反应至三尖杉宁碱消失，产物用乙酸乙酯-正己烷(1∶1)萃取三次(80ml，40ml，20ml)，合并后浓缩。浓缩液用乙酸乙酯-正己烷(1∶1)40ml溶解后柱分离。选用乙酸乙酯/正己烷(5∶5)——乙酸乙酯/正己烷(4∶6)洗脱。分类收集后获得紫杉醇部分1.65g，纯度达90％。收率89％。
实施例四：
称取2.12g紫杉烷样品(含3.9％紫杉醇，2.0％三尖杉宁碱)溶于100ml甲醇中，加入10ml水及560mg NBS，35℃下反应12小时，三尖杉宁碱转化率达89％。继续反应2小时后，产物用乙酸乙酯-正己烷(1∶1)萃取三次(40ml，20ml，10ml)，合并萃取相，旋转蒸发浓缩后过反相柱。固体上样，乙醇∶水按一定比例洗脱。柱分离后获得0.36克纯度为20％紫杉醇，收率87％。
实施例五：
称取1.0g紫杉烷样品(含37％10-去乙酰紫杉醇，21％10-去乙酰三尖杉宁碱)溶于80ml甲醇∶水(1∶1)体系中，加入220mg NBS，35℃下反应12小时，HPLC检测显示三尖杉宁碱转化率达97％。反应结束后，产物浓缩后柱分离，用乙酸乙酯/正己烷(1∶1)洗脱。得10-去乙酰紫杉醇321mg，纯度85％。收率73％。
实施例六：
称取1.0g紫杉烷样品(含52％10-去乙酰-7-木糖紫杉醇，12％10-去乙酰-7-木糖三尖杉宁碱)溶于20ml甲醇中，加入120mg NBS，35℃下反应12小时，HPLC检测显示三尖杉宁碱转化率达98％。反应结束后，产物浓缩后柱分离，用乙酸乙酯/正己烷(1∶1)洗脱。得10-去乙酰-7-木糖紫杉醇482mg，纯度94％。收率87％。
实施例七：
称取1.0克柱分离后纯度为91％的紫杉醇样品，溶于10ml甲醇中，在搅拌状态下缓慢滴加2ml三蒸水，室温静置搅拌3小时后转移至-30℃冰箱中过夜，有大量白色晶体析出。过滤后冷冻干燥得纯度达98.6％的紫杉醇，该样品再次结晶可获得99％以上晶体。所得晶体与紫杉醇标准品对照，熔点、旋光度、HPLC保留时间、LC-MS及NMR均一致。
Claims (10)
1.一种分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：用三尖杉宁碱化学衍生法改造紫杉烷混合物中的三尖杉宁碱类化合物，在有机溶剂反应体系中通过加成反应将具有α，β不饱和酮结构的三尖杉宁碱类化合物转化为单卤单羟基或单卤单烷基产物；再经过柱分离获得紫杉醇；其中加成反应选用N-溴代琥珀酰胺作为加成试剂，三尖杉宁碱类化合物为三尖杉宁碱。
2.一种分离制备10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于：用三尖杉宁碱化学衍生法改造紫杉烷混合物中的三尖杉宁碱类化合物，在有机溶剂反应体系中通过加成反应将具有α，β不饱和酮结构的三尖杉宁碱类化合物转化为单卤单羟基或单卤单烷基产物；再经过柱分离获得10-去乙酰紫杉醇；其中加成反应选用N-溴代琥珀酰胺作为加成试剂；其中三尖杉宁碱类化合物为10-去乙酰三尖杉宁碱。
3.一种分离制备10-去乙酰-7-木糖紫杉醇的方法，其特征在于：用三尖杉宁碱化学衍生法改造紫杉烷混合物中的三尖杉宁碱类化合物，在有机溶剂反应体系中通过加成反应将具有α，β不饱和酮结构的三尖杉宁碱类化合物转化为单卤单羟基或单卤单烷基产物；再经过柱分离获得10-去乙酰-7-木糖紫杉醇；其中加成反应选用N-溴代琥珀酰胺作为加成试剂；其中三尖杉宁碱类化合物为10-去乙酰-7-木糖三尖杉宁碱。
4.按照权利要求1所述分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：原料选择同时含紫杉醇及三尖杉宁碱类化合物的紫杉烷混合物，且三尖杉宁碱类化合物含量大于0.5％，其中三尖杉宁碱类化合物为三尖杉宁碱。
5.按照权利要求1所述分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：所述的反应体系选择易溶解原料的有机溶剂，选自乙醇，甲醇，四氢呋喃，丙酮，乙酸乙酯，二氧六环，氯仿，二氯甲烷。
6.按照权利要求1所述分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：所述的三尖杉宁碱化学衍生法反应温度0-80℃；反应时间2-24小时。
7.按照权利要求1所述分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：催化剂选用路易斯酸，能促进单卤单烷基加成产物的生成并加快反应速率，反应体系中加入水后能获得相应的单卤单羟基三尖杉宁碱加成产物。
8.按照权利要求7所述的分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：所述的路易斯酸选自IIIB族金属元素的卤化物或硝酸盐或三氟甲基磺酸盐或它们的混合物。
9.按照权利要求1所述分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：所述的柱分离中，紫杉醇与三尖杉宁碱衍生物的分离选用普通玻璃柱或金属柱，固定相选择正相填料时，样品与固定相质量比为1∶10-1∶40；选择反相填料时，样品与固定相质量比为1∶150-1∶3000。
10.按照权利要求9所述分离制备紫杉醇的方法，其特征在于：正相柱分离的流动相选择乙酸乙酯/正己烷、乙酸乙酯/石油醚、氯仿/甲醇、二氯甲烷/甲醇或二氯甲烷/乙醇、氯仿/乙醇之一；反相柱分离时流动相选择乙腈、甲醇、乙醇、丙酮之一与水的混合体系。
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