CN101300357A

CN101300357A - 在转基因芸苔科和亚麻科植物中生产γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸的方法

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Publication number: CN101300357A
Application number: CNA2006800407721A
Authority: CN
Inventors: J·A·内皮尔; O·萨亚诺娃; M·贝内加斯·加勒隆
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2006-10-30
Publication date: 2008-11-05
Anticipated expiration: 2026-10-30
Also published as: CN101300357B; AU2006310729A1; AU2006310729B2; DE102005052551A1; DK1945775T3; US8013216B2; DE502006009070D1; AR056170A1; US20080229454A1; CA2625505A1; CN102816775A; WO2007051577A2; CA2625505C; ATE501261T1; EP1945775B1; ZA200804660B; WO2007051577A3; EP1945775A2; BRPI0618060A2

Abstract

本发明涉及在芸苔科转基因植物中生产γ－亚麻酸(18∶3^Δ6，9，12)或十八碳四烯酸(18∶4^{Δ6，9，12，15})或者γ－亚麻酸(18∶3^Δ6，9，12)和十八碳四烯酸(18∶4^{Δ6，9，12，15})，其中所述转基因植物包含基于总脂肪酸含量的至少10％重量的油酸，并且由于方法中所用的Δ6－去饱和酶的活性，所述转基因植物具有增加的Δ6－C₁₈－脂肪酸含量。本发明还涉及编码方法中所用的Δ6－去饱和酶的新核酸序列、包含所述核酸序列的基因构建体、包含至少一个核酸序列或基因构建体的载体和转基因植物。

Description

在转基因芸苔科和亚麻科植物中生产γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸的方法

描述

本发明涉及在芸苔科(Brassicaceae)的转基因植物中生产γ-亚麻酸(18:3^Δ6，9，12)或十八碳四烯酸(stearidonic acid)(18:4^{Δ6，9，12，15})或γ-亚麻酸(18:3^Δ6，9，12)和十八碳四烯酸(18:4^{Δ6，9，12，15})，其中转基因植物基于总脂肪酸含量包含至少10％重量的油酸，并且作为本方法中所用的Δ6-去饱和酶的活性的结果，转基因植物具有增加的Δ6-C₁₈-脂肪酸含量。

本发明还涉及编码本方法所用的Δ6-去饱和酶的新核酸序列、包含这些核酸序列的基因构建体、载体和包含至少一个核酸序列或基因构建体的转基因植物。

脂肪酸和甘油三酯在食品业、动物营养、化妆品和制药领域中有许多应用。取决于它们是否为具有饱和或不饱和脂肪酸含量增加的游离饱和或不饱和脂肪酸或甘油三酯，它们适于广泛的应用。

由于在健康中发挥的不同作用，多不饱和长链ω3-脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DPA)为人类营养的重要成分，其中所述的健康包括这样一些方面，如儿童大脑的发育、眼的功能、激素和其它信号物质的合成和预防心血管疾病、癌症和糖尿病(Poulos，A Lipids 30：1-14，1995；Horrocks，LA和Yeo YK，Pharmacol Res 40：211-225，1999)。这就是为什么需要生产多不饱和长链脂肪酸的原因，并且尤其是ω3-脂肪酸。

因此，例如在婴儿食品中加入多不饱和脂肪酸以提高营养价值和婴儿的无障碍发育。多种脂肪酸和甘油三酯大多从微生物如被孢霉属(Mortierella)或产油植物如大豆、油菜籽、向日葵以及其它产油植物中获得，其中它们通常以其三酰甘油酯的形式产生。然而，在高等植物中尚未发现长链不饱和脂肪酸。长链脂肪酸大多衍生自鱼油或适当藻类例如破囊壶菌(Thraustochytrium)或真菌例如被孢霉属的发酵。游离脂肪酸有利地通过水解制备。

优选具有饱和脂肪酸或具有不饱和脂肪酸的油取决于所需目的；在人类营养中，例如具不饱和脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸的脂类是优选的，因为它们对血液中的胆固醇水平，并因此对心脏病的可能性具有有利作用。它们用于多种食疗食品或药物。

两种脂肪酸γ-亚麻酸和十八碳四烯酸，尤其是十八碳四烯酸，对皮肤代谢(例如痤疮、日照损伤)和延缓皮肤老化过程具有有利作用，以及在很多身体炎性过程中具有预防和治疗作用；已经广泛描述了这些有利作用。它们也用于前列腺癌和肠癌的伴随疗法以及神经疾病(例如运动障碍和神经分裂症)的治疗和预防。这就是为何这些脂肪酸也在化妆品业和食品添加剂中发挥重要作用的原因。到目前为止，γ-亚麻酸和十八碳四烯酸含量高的油主要从蓝蓟属(Echium)获得。

由于它们的有利特性，过去有很多人尝试获得参与脂肪酸或甘油三酯合成的基因用于生产不饱和脂肪酸含量改变的多种生物的油。因此，WO 91/13972及其美国等同专利描述了Δ9-去饱和酶。WO 93/11245中公开了Δ15-去饱和酶，WO 94/11516中公开了Δ12-去饱和酶。其它去饱和酶在EP-A-0 550 162、WO 94/18337、WO 97/30582、WO 97/21340、WO 95/18222、EP-A-0 794 250；Stukey等人，J.Biol.Chem.，265，1990：20144-20149；Wada等人，Nature 347，1990：200-203或者Huang等人，Lipids 34，1999：649-659中描述。然而，至今多种去饱和酶还没有用生化术语充分描述，因为这些酶作为膜结合蛋白难以分离和表征(McKeon等人，Methods in Enzymol.71，1981：12141-12147；Wang等人，Plant Physiol.Biochem.，26，1988：777-792)。作为一个规则，通过将膜结合的去饱和酶引入合适的生物体，随后通过分析起始物和产物来表征膜结合的去饱和酶。Δ6-去饱和酶在WO 93/06712、US 5,614,393、US5614393、WO 96/21022、WO0021557和WO 99/27111中描述，并且在如WO9846763、WO9846764和WO9846765中也描述了用于在转基因生物中生产的用途。如WO9964616或WO9846776描述和公开了多种去饱和酶的表达和多不饱和脂肪酸的形成。

还非常需要新的、更合适的基因，其编码参与不饱和脂肪酸生物合成的酶并可能在工业规模上特异生产某些脂肪酸而不产生不需要的次级产品。当选择生物合成基因的时候，特别重要的主要是两个特征。首先，还需要获得最高可能的多不饱和脂肪酸含量的改进方法。其次，所用的酶应该对特定底物高度特异，因为只要这是可能的，就肯定不会产生可能在食品应用中具有不利或者未研究的生理作用的不需要的次级产品。

为了可能强化含这些特异生产的多不饱和脂肪酸的食品或饲料，因此非常需要在参与脂肪酸生物合成并尽可能特异的酶的辅助下生产这些多不饱和脂肪酸的简便廉价的方法。

因此一个目标就是开发在植物中生产γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸的新方法，此方法使得以尽可能特异的方式合成这些脂肪酸成为可能。这个目标通过在芸苔科或亚麻科的转基因植物中生产γ-亚麻酸(18:3^Δ6，9，12)或十八碳四烯酸(18:4^{Δ6，9，12，15})或者γ-亚麻酸(18:3^Δ6，9，12)和十八碳四烯酸(18:4^{Δ6，9，12，15})的本发明方法实现，其中转基因植物基于总脂肪酸含量包含至少10％重量的油酸并包括下列过程步骤：

a)向油料植物中引入核酸序列，所述核酸序列编码报春花属(Primula)物种的Δ6-去饱和酶，并且所述Δ6-去饱和酶优先利用α-亚麻酸而非亚油酸作为底物，

b)在转基因植物中表达核酸编码的Δ6-去饱和酶，

c)生长并收获植物。

芸苔科或亚麻科的转基因油料植物基于总脂肪酸含量有利地包含至少11％、12％、33％、14％或15％重量的油酸，基于总脂肪酸含量有利地包含至少16％、17％、18％、19％或20％重量的油酸，基于总脂肪酸含量特别有利地包含至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％重量的油酸，基于总脂肪酸含量非常特别有利地包含至少61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％重量的油酸或者更高。有利地用于根据本发明的方法的植物基于总脂肪酸含量还具有优选的至少9％、10％、11％、12％、13％、14或15％重量的棕榈酸含量，有利地20％、21％、22％、23％、24％或25％重量的棕榈酸含量，尤其有利地26％、27％、28％、29％或30％重量的棕榈酸含量。其它有利的植物基于总脂肪酸含量具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％重量的亚油酸含量，有利地具有55％、60％、65％、70％或75％重量的亚油酸含量。其它有利的植物基于总脂肪酸含量具有至少10％、15％、20％、25％或30％重量的α-亚麻酸含量，有利地具有35％、40％、45％或50％重量的α-亚麻酸含量，尤其有利地具有55％、60％、65％或70％重量的α-亚麻酸含量。有利的植物也可包含上述脂肪酸的组合，总脂肪酸含量为100％重量。

用于本方法的芸苔科或亚麻科的转基因植物基于种子的总重量具有至少20％、25％或30％重量的种子总油含量，有利地具有大约至少35％或40％重量的种子总油含量，特别有利地具有大约至少45％或50％重量的种子总油含量，非常特别有利地具有至少55％重量的种子总油含量。

本方法中优选的油料作物产生油、脂类和/或游离脂肪酸，其包含低于4％、3％、2％或1％重量的肉豆蔻酸，有利地包含低于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％重量的肉豆蔻酸，特别有利地包含低于0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0.09％或者更低重量的肉豆蔻酸。其它有利的油料作物包含低于5％、4％或3％重量的棕榈酸和/或低于2％、1.5％或1％重量的硬脂酸。

除了种子中油含量高以外，有利的油料植物也应该在种子中具有低的蛋白质含量。此蛋白质含量如果可能的话应该低于30％、25％或20％重量，有利地低于19％、18％、17％、16％或15％重量。

适于根据本发明的方法的植物原则上是芸苔科亚科的所有属(全世界大约380个属)，为南芥属(Arabideae)、芸苔属(Brassiceae)、Chamireae、Cremolobeae、Heliophileae、香花芥属(Hesperideae)、独行菜属(Lepidieae)、Prynglea、Schizopetaleaee、大蒜芥族(Sisymbrieae)、Stenopetaleae和Thelypodieae，或者亚麻科(Linaceae)的所有属(全世界9个属)。根据本发明的方法优选的植物为芸苔科或亚麻科的以下属，其选自葱芥属(Alliaria)、木庭芥属(Alyssoides)、南芥属(Arabis)、辣根属(Armoracia)、山芥属(Barbarea)、团扇芥属(Berteroa)、芸苔属(Brassica)、亚麻芥属(Camelina)、芥属(Capsella)、碎米芥属(Cardamine)、碎心菜属(Cardaria)、桂竹香属(Cheiranthus)、两节芥属(Crambe)、石芥花属(Dentaria)、二行芥属(Diplotaxis)、绮春属(Erophila)、糖芥属(Erysimum)、蜂室花属(Iberis)、独行菜属(Lepidium)、锻花属(Lunaria)、豆瓣菜属(Nasturtium)、萝卜属(Raphanus)、蔊菜属(Rorippa)、裂瓣芥属(Schivereckia)、白芥属(Sinapis)、大蒜芥属(Sisymbrium)、遏蓝菜属(Thlaspi)、旗杆菜属(Turritis)、异腺草属(Anisadenia)、Cliococca、Durandea、Hebepetalum、Hesperolinon、Hugonia、Indorouchera、亚麻属(Linum)、Philbornea、豆瓣属(Radiola)、石海椒属(Reinwardtia)、Roucheria、青篱柴属(Sclerolinon)和青篱菜属(Tirpitzia)。

根据本发明的方法尤其优选的植物是选自葱芥(Alliaria petiolata)、Alyssoides utriculata、壁南芥(Arabis caucasica)、Arabis procurrens、Arabisturrita、辣根(Armoracia rusticana)、羽裂叶山芥(Barbarea intermedia)、欧洲白芥(Barbaraea vulgaris)、团扇芥(Berteroa incana)、欧洲油菜(Brassica napus)、欧洲油菜rapifera亚种(Brassica napus ssp.Rapifera)、欧洲油菜napus亚种(Brassica napus ssp.Napus)、黑芥(Brassica nigra)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜青(Brassica rapa)、芜青oleifera亚种(Brassicarapa ssp.Oleifera)、芜青rapa亚种(Brassica rapa ssp.Rapa)、Brassicasativus、亚麻荠(Camelina sativa)、荠(Capsella bursa-pastoris)、Cardamineamara、Cardamine bulbifera、碎米荠(Cardamine hirsuta)、草甸碎米荠(Cardamine pratensis)、群心菜(Cardaria draba)、桂竹香(Cheiranthuscheiri)、地中海芥菜(Crambe abyssinica)、Dentaria bulbifera、细叶十二行荠(Diplotaxis tenuifolia)、春绮春(Erophila verna)、Erophila vernaagg、Erysimum bicolor、小花糖芥(Erysimum cheiranthoides)、屈曲花(Iberis spec)、绿独行菜(Lepidium campestre)、家独行菜(Lepidiumsativum)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、缎英(Lunaria annua)、宿根缎花(Lunaria rediviva)、豆瓣菜(Nasturtium officinale)、野萝卜(Raphanus raphanistrum)、Rorippa pyrenaica、Schivereckia podolica、欧洲白芥(Sinapis alba)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、钻果大蒜芥(Sisymbriumofficinale)、菥

(Thlaspi arvense)、杠板归(Thlaspi perfoliatum)、旗杆芥(Turritis glabra)、高山亚麻(Linum alpinum)、奥地利亚麻(Linumaustriacum)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linum flavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、毛亚麻(Linum hirsutum)、Linum leonii、海滨亚麻(Linum maritimum)、Linum ockendonii、宿根亚麻(Linumperenne)、细叶亚麻(Linum tenuifolium)、Linum viscosum和亚麻(Linumusitatissimum)的属和种。

尤其有利地用于本方法的植物为选自油料植物的植物，所述的油料植物选自芸苔(Brassica campestris)、欧洲油菜、芜青、芥菜(Brassicajuncea)、亚麻荠、地中海芥菜和亚麻的属和种。根据本发明的方法中非常特别优选的植物为芸苔、欧洲油菜、芜青、芥菜、亚麻荠和亚麻的属和种。

有利地用于根据本发明的方法的核酸序列为编码报春花属物种的Δ6-去饱和酶的核酸序列，其选自

a)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列的核酸序列，

b)由于遗传密码的简并性，可衍生自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的核酸序列，

c)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核酸序列的衍生物，其编码在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少40％同源性并具有Δ6-去饱和酶活性的多肽。

在表达(a)、(b)和(c)中提到的核酸序列的方法中，这些核酸序列有利地与启动子或终止子或者启动子和终止子有效连接。

在芸苔科或亚麻科转基因植物中生产γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸的根据本发明的方法中，Δ6-C₁₈-脂肪酸含量由于Δ6-去饱和酶活性的原因比非转基因起始植物(野生型)增加。术语“增加”理解为是指为本发明的目的Δ6-C₁₈-脂肪酸含量(γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸含量)比野生型增加至少25％、30％、35％、40％、45％或50％，有利地增加至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，特别有利地增加至少105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％或者更高。

本发明方法所用的Δ6-去饱和酶有利地具有比亚油酸底物特异性高多于20倍，有利地高多于25、30、35或40倍的α-亚麻酸的底物特异性。在本发明特别有利的实施方案中，Δ6-去饱和酶具有对α-亚麻酸的专一底物特异性，也就是说酶仅识别α-亚麻酸而非亚油酸作为底物。这引起ω3合成通路的不饱和脂肪酸的有利合成，而去饱和酶不转化作为ω6合成通路起始底物的亚油酸。

在本方法中，作为Δ6-去饱和酶的酶促活性产物的γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸有利地在油料植物的种子中积累。

本方法中生产的脂肪酸γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸有利地以游离脂肪酸的形式产生，或者优选地以酯的形式产生，优选地以甘油三酯形式产生。

本发明的另一个主题是通过将具有饱和或不饱和的或者饱和和不饱和的脂肪酸的甘油三酯至少与序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3编码的蛋白质孵育生产不饱和脂肪酸γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸含量增加的甘油三酯的方法。该方法有利地在存在能接受或提供还原等价物的化合物的条件下进行。此后，脂肪酸可从甘油三酯中释放。

有利地用于根据本发明的方法的植物为芸苔科或亚麻科的转基因植物。这些植物包含根据本发明的方法合成的多不饱和脂肪酸γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸并且可以不必需分离已合成的油、脂类或脂肪酸而直接销售。根据本发明的方法的植物为完整的植物和所有的植物植物、植物器官或植物部分，如叶、茎、种子、根、块茎、花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、作物材料、植物组织、生殖组织、衍生自转基因植物和/或可用于产生转基因植物的细胞培养物。在本文中，种子包含种子的所有部分，如种皮、表皮细胞和种子细胞、胚乳或胚组织。然而，根据本发明的方法产生的化合物也可以其油、脂肪、脂类和/或游离脂肪酸的形式从植物中分离。通过此方法产生的多不饱和脂肪酸可通过从植物生长的培养物中或从田地收获植物而收获。这可通过压榨或提取植物部分，优选地是植物种子来完成。在本文中，油、脂肪、脂类和/或游离脂肪酸可通过已知的冷打碎或冷压而不提供热量来获得。植物部分尤其是种子预先捣碎、蒸汽处理或烘烤以利于其破碎。这样经预处理的种子可随后进行压榨或用溶如温己烷提取。随后去除溶剂。以这种方式可分离96％以上的本方法产生的化合物。随后进一步加工得到的产物，即精制。在本文中，例如首先去除植物粘质物质和浑浊物质。可酶促进行或者例如通过添加酸如磷酸物理化学地进行所称的脱胶。随后通过用碱例如氢氧化钠溶液处理去除游离脂肪酸。用水彻底洗涤得到的产物以去除产物中残留的碱，然后干燥。例如用漂白土或活性炭漂白产物以去除仍在产物中残留的有色物质。最后，例如通过使用蒸汽进行产物除臭。

本方法产生的PUFA有利地在植物中以其油、脂类、脂肪酸或这些物质的部分的形式产生。

根据本发明的另一个实施方案是油、脂类、脂肪酸和/或通过将产生的油、脂类或脂肪酸与其它动物、微生物或植物的油混合制备的脂肪酸组合物在食品、饲料、化妆品或药物中的用途。

术语“油”、“脂类”或“脂肪”理解为是指包含不饱和的、饱和的脂肪酸、优选地酯化的脂肪酸的脂肪酸混合物。优选的是油、脂类或脂肪具有高含量的多不饱和游离脂肪酸或有利地具有高含量的酯化脂肪酸，尤其是亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸。不饱和酯化脂肪酸的量优选地为大约30％重量，更优选的量是50％重量，甚至更优选的量是60％、70％、80％重量。为鉴定目的，可能例如在通过转酯方法将脂肪酸转变成甲酯之后通过气相色谱测定脂肪酸的量。油、脂类或脂肪可包含多种其它饱和或不饱和脂肪酸，例如棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和油酸等等。油或脂肪中多种脂肪酸的量尤其可根据起始生物而改变。

本方法产生的多不饱和脂肪酸为例如鞘酯、磷酸甘油酯、脂类、糖脂、磷脂、单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其它脂肪酸酯。

存在的脂肪酸可通过有利地在存在醇(如甲醇或乙醇)的条件下用碱(例如KOH或NaOH水溶液)或酸解处理，或者通过酶促切割和由例如分相和随后用例如H₂SO₄的酸化作用分离而释放根据本发明的方法生产的多不饱和脂肪酸。然而，也可不经上述加工直接释放脂肪酸。

油、脂类或脂肪酸可在培养植物之后以常规方式从植物获得。为此目的，植物和/或其种子可在收获之后首先破碎或直接使用。油、脂类和/或脂肪酸有利地在0-80℃，优选地在20-50℃用合适的溶剂提取，如非极性溶剂，如己烷或乙醇、异丙醇、或其混合物如己烷/异丙醇、酚/氯仿/异戊醇。作为规则，用过量的溶剂提取生物质，例如对生物质以1∶4过量的溶剂提取。随后例如通过蒸馏去除溶剂。提取也可以使用超临界CO₂完成。提取之后可通过例如过滤去除残余生物质。

这样获得的粗油随后可例如通过经极性溶剂(如丙酮或氯仿)处理然后过滤或离心去除混浊物进一步纯化。经柱的进一步纯化也是可能的。

甘油三酯如所述以常规方式水解以从甘油三酯中获得游离脂肪酸。

在本发明方法中这样获得的油、脂类和/或游离脂肪酸或者上述方法产生的γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸含量增加的甘油三酯可用于制备食品、饲料、化妆品或药物。为此目的，将它们以常规量加到食品、饲料、化妆品或药物中。在另一个实施方案中，将γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸含量增加的油、脂类和/或游离脂肪酸或甘油三酯与其它动物、微生物或植物的油、脂类或脂肪酸混合以得到脂肪酸组合物。后者可以常规量加到食品、饲料、化妆品或药物中。

上面提到的方法有利地使得可能合成具有Δ6双键的脂肪酸或具有Δ6双键的脂肪酸有利地是C18脂肪酸含量增加的甘油三酯。

上面提到的方法有利地使得可能合成具有Δ6双键的脂肪酸或者具有Δ6双键的脂肪酸含量增加的甘油三酯，其中优选地用亚油酸和/或α-亚麻酸作为Δ6-去饱和酶反应的底物，有利地只用α-亚麻酸作为Δ6-去饱和酶反应的底物。因此，上面提到的方法有利地使得可能合成尤其是γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸，优选地仅合成十八碳四烯酸。根据本发明的Δ6-去饱和酶的这种特异的底物特异性有利地与现有技术中的Δ6-去饱和酶的底物特异性不同。

本发明因此还涉及这样的经分离的核酸序列，其编码具有Δ6-去饱和酶活性的多肽并且其中编码的Δ6-去饱和酶优先利用α-亚麻酸而非亚油酸，所述的核酸序列选自：

a)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列的核酸序列，

b)由于遗传密码的简并性，可衍生自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的核酸序列，或者

c)SEQ ID NO：1所示的核酸序列的衍生物，其编码在氨基酸水平与SEQ ID NO：2具有至少95％同源性并具有Δ6-去饱和酶活性的多肽；或者SEQ ID NO：3所示核酸序列的衍生物，其编码在氨基酸水平与SEQ ID NO：4具有至少80％同源性并具有Δ6-去饱和酶活性的多肽。

所发现的Δ6-去饱和酶与已描述的Δ6-去饱和酶在核苷酸序列和氨基酸序列上非常不同。报春花属指叶报春(P.Cortusoides)的序列在氨基酸水平与现有技术中的Δ6-去饱和酶序列具有78％的相似性。根据本发明的黄叶报春(P.Lutoides)Δ6-去饱和酶序列在氨基酸水平与现有技术中的序列具有92％的相似性。

根据本发明的核酸序列有利地来源于植物，优选地来源于报春花科的植物，尤其优选地来源于报春花属，非常优选地来源于指叶报春或黄叶报春。

为本发明的目的，术语“Δ6-去饱和酶”包含参与脂肪酸去饱和作用的蛋白质，有利地包含参与在脂肪酸链的第9位具有双键的脂肪酸及其同源物、衍生物或类似物发挥去饱和作用的蛋白质。

在另一个实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的根据本发明的核酸分子的衍生物编码与完整的氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％，有利地具有至少91％或92％，优选地具有至少93％或94％，更优选地具有至少95％或96％，最优选地具有至少大约97％、98％、99％或者更高同源性(＝同一性)的蛋白质。同源性针对全部氨基酸序列区域或核酸序列区域计算。用于序列比对的程序为PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，51989：151-153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970))以及Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981)]，其构成了GCG软件包的一部分(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991))。上述以百分数表示的序列同源性值是使用GAP程序对全部序列区域计算的，参数如下：缺口权重：8，长度权重：2，平均匹配：2.912，平均不匹配：-2.003。

本发明还包含这样的核酸分子，其由于遗传密码的简并性与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3(和其部分)所示的核酸序列不同并因此编码与SEQID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码的Δ6-去饱和酶相同的Δ6-去饱和酶。

除了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的Δ6-去饱和酶核苷酸序列之外，技术人员认为群体中可存在造成Δ6-去饱和酶氨基酸修饰的DNA序列多态性。由于天然变异，群体中的个体间可存在Δ6-去饱和酶基因的这些遗传多态性。这些天然变体通常引起Δ6-去饱和酶基因核苷酸序列中1-5％的差异。天然变异引起的并且不改变Δ6-去饱和酶功能活性的Δ6-去饱和酶的所有这些核苷酸变异和因此产生的氨基酸多态性属于本发明的范围。

根据本发明的核酸序列(或其片段)可有利地用于通过同源性筛选而分离其它的基因组序列。

上面提到的衍生物可例如从其它真核生物中分离，如植物，如尤其是藓类植物、沟鞭藻(dinoflagellates)或真菌。根据本发明的核酸和衍生物可有利地从植物中分离。

等位变体尤其包括可通过删除、插入或替换核苷酸从SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的序列获得的功能变体，同时保留合成的衍生蛋白质的酶促活性。

从SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所述的DNA序列或这些序列的部分开始，使用常规的杂交方法或PCR技术可从其它真核生物分离此类DNA序列，如上文提到的真核生物。这些DNA序列在标准条件下与上述序列杂交。为杂交用途有利地例如由保守区域的短寡核苷酸构成，其可通过以本领域技术人员已知的方式与其它去饱和酶基因比较来确定。有利地使用组氨酸盒序列。然而，根据本发明的核酸的更长片段或完整序列也可用于杂交。取决于所用的核酸是寡核苷酸、较长片段或完整序列，或者根据用于杂交的核酸类型是DNA还是RNA，这些标准条件变化。因此，例如DNA:DNA杂化物的解链温度大约比相同长度的DNA:RNA杂化物的解链温度低10℃。

取决于所讨论的核酸，标准条件是指例如温度42-58℃，含水缓冲液，浓度0.1-5×SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)或者额外地存在50％甲酰胺，如以举例方式为42℃，5×SSC，50％甲酰胺。DNA:DNA杂化物的杂交条件有利地为0.1x SSC和温度大约20-45℃，优选地大约30-45℃。对DNA:RNA杂化物来说，杂交条件有利地为0.1×SSC和温度大约30-55℃，优选地大约45-55℃。这些杂交温度为以举例方式计算的长度大约100个核苷酸并且G+C含量为50％的核酸在无甲酰胺条件下的解链温度值。DNA杂交的实验条件在相关的遗传学教科书中(例如Sambrook等人，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)描述，并可通过本领域技术人员已知的公式计算，例如作为核酸长度、杂化物性质或G+C含量的函数计算。本领域技术人员可参考下列教科书了解有关杂交的其它信息：Ausubel等人(编辑)，1985，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，纽约；Hames和Higgins(编辑)，1985，Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press，牛津；Brown(编辑)，1991，Essential MolecularBiology：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，牛津。

此外，衍生物是指SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3序列的同源物，例如真核同源物、截短序列、单链、编码和非编码DNA序列的单链DNA或者编码和非编码DNA序列的RNA。

此外，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3序列的同源物是指衍生物，例如启动子变体。这些变体可由一个或多个核苷酸交换、插入和/或删除而改变，但不对启动子的功能和效率有不利影响。此外，可通过改变启动子序列或完全由甚至是外源生物的更有效的启动子替代来提高其效率。

衍生物也有利地指起始密码子上游-1到-2000区域的核苷酸序列以修饰(优选地提高)基因表达和/或蛋白质表达的方式改变的变体。此外，衍生物也指3’末端修饰的变体。

编码Δ6-去饱和酶的根据本发明的核酸序列可通过合成产生或者天然地获得或者包含合成DNA和天然DNA成分的混合物以及由来自不同生物的多种异源Δ6-去饱和酶的基因片段组成。通常，合成的核苷酸序列用相应宿主生物(例如植物)偏好的密码子生产。这通常使异源基因最佳表达。可从在大多数目的植物物种中表达的具有最高蛋白质频率的密码子来确定被植物优选的这些密码子。有关谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的实例在Wada等人，(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118中提供。此类实验可用本领域的标准方法和技术人员已知的方法进行。

编码Δ6-去饱和酶基因的功能等同序列为根据本发明的序列的衍生物，其中尽管核苷酸序列不同，仍具有所需功能，也就是说必需的酶促活性和蛋白质的特异选择性。因此，功能等同物包括天然存在的本文所述序列的变体以及人工变体，例如通过化学合成获得的适应植物密码子选择的人工核苷酸序列。

此外，人工DNA序列是合适的，条件是：如上文所述，它们介导了所需特性，例如通过在农作物中过量表达Δ6-去饱和酶基因增加植物中脂肪酸、油、脂类的Δ6双键含量。此类人工DNA序列可表现Δ6-去饱和酶活性，例如通过借助于分子模建所构建的蛋白质的回译或者通过体外选择确定。DNA体外进化以修饰或改进DNA序列的可能技术在Patten，P.A.等人，Current Opinion in Biotechnology 8，724-733(1997)或Moore，J.C.等人，Journal of Molecular Biology 272，336-347(1997)中描述。尤其合适的是通过根据宿主植物的密码子选择而特异性回译多肽序列获得的编码DNA序列。了解植物遗传学方法的本领域技术人员可容易地通过计算机分析待转化植物的已知其它基因确定特定的密码子选择。

可提到的其它合适的等同核酸序列为编码融和蛋白的序列，融合蛋白的一个组分为Δ6-去饱和酶多肽或其功能等同部分。融合蛋白的第二个部分可为例如具有酶促活性的另一多肽或者通过其可检测Δ6-去饱和酶表达的抗原性多肽序列(例如myc标签或组氨酸标签)。然而，优选的是指导Δ6-去饱和酶蛋白质到达目的作用位点的调节蛋白质序列，例如ER的信号序列。

根据本发明的分离核酸序列有利地来源于植物，如单子叶植物或双子叶植物。如上文所述，核酸序列优选地来自报春花科。

有利地，根据本发明的方法中的Δ6-去饱和酶基因可与脂肪酸生物合成的其它基因组合。此类基因的实例为酰基转移酶、其它去饱和酶或延伸酶。对于在体内、尤其是在体外合成，例如与能接受或提供还原等价物的NADH细胞色素B5还原酶的组合是有利的。

原则上，所有脂肪酸或脂类代谢的基因可与根据本发明的Δ6-去饱和酶基因组合(为本发明的目的，复数也包含其单数形式，并且反之亦然)以制备本方法中的γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸。有利地，脂肪酸或脂类代谢的基因选自：酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP(＝酰基载体蛋白)去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-CoA：溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔化酶(acetylenase)、脂肪氧化酶、三酰甘油酯脂肪酶、氧化丙二烯合成酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。尤其优选地选自Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ9-去饱和酶、Δ12-去饱和酶、Δ6-延伸酶或Δ5-延伸酶的基因与上文提到的Δ6-去饱和酶基因组合，可以使用单个基因或多个基因的组合。

本发明还涉及由根据本发明的核酸序列编码的蛋白质。

根据本发明的蛋白质(＝多肽或氨基酸序列)理解为包含序列SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或者通过替换、倒位、插入或删除一个或多个氨基酸基团获得的序列的蛋白质，其中SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4所示蛋白质的酶促活性不变或基本不降低。“基本不降低”是指仍显示起始酶的至少10％，优选地20％，尤其优选地至少30％的酶促活性的所有酶。在这么做的时候，例如特定氨基酸序列可由其它具有相似物理化学性质(空间填满、碱度、疏水性等等)的氨基酸替代。例如，精氨酸残基替换为赖氨酸残基，缬氨酸残基替换为异亮氨酸残基，或者天冬氨酸残基替换为谷氨酸残基。然而，也可在序列中交换、添加或去除一个或多个氨基酸，或者将这些方法中的多种方法互相组合。

衍生物也指功能等同物，其尤其也包含编码仍然表现所需功能的Δ6-去饱和酶的最初分离序列的天然或人工突变，也就是其酶促活性和底物特异性基本不降低。突变包含替换、添加、删除、交换或插入一个或多个核苷酸序列。因此，例如本发明也包括可通过修饰Δ6-去饱和酶核苷酸序列获得的核苷酸序列。此修饰的目的可为例如进一步限定其中包含的编码序列或者也可为例如插入限制性酶的其它切割位点。

功能等同物也为与起始基因或基因片段相比功能弱化(＝基本不降低)或者强化(＝酶活性高于起始酶的活性，也就是活性高100％，优选地高110％，尤其优选地高130％)的变体。

在本文中，核酸序列可例如有利地为DNA或cDNA序列。用于插入根据本发明的基因构建体中的编码序列为例如编码具有上述序列的Δ6-去饱和酶的编码序列并赋予宿主超量产生在Δ6位点具有双键的脂肪酸、油或脂类的能力，当在这个过程中产生具有至少四个双键的ω3脂肪酸时是有利的。这些序列可为同源来源的或异源来源的。

根据本发明的基因构建体(表达盒、核酸构建体或片段)是指SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3所述的序列，其衍生自遗传密码并且有效地与一个或多个调节信号连接以有利地增强基因表达并控制宿主细胞中编码序列的表达。这些调节序列应允许基因的选择性表达和蛋白质表达。取决于宿主植物，这可指例如基因仅在诱导后表达和/或过量表达或者立即表达和/或过量表达。这些调节序列的实例为诱导物或阻抑物结合的并以这种方式调节核酸表达的序列。除了这些新的调节序列之外或者取代这些序列的是：仍可以存在实际的结构基因之前的这些序列的天然调节并任选地经遗传修饰以关闭天然调节并增强基因表达。然而，基因构建体也可简单构建，也就是在核酸序列或其衍生物前不插入其它调节信号并且不去除具有调节功能的天然启动子。取而代之的是，天然调节序列以不再继续调节和/或提高基因表达的方式突变。这些部分序列形式(＝含部分根据本发明的核酸序列的启动子)的经修饰的启动子也可单独放于天然基因之前以增强活性。此外，基因构建体也可有利地包含一个或多个所谓的增强子序列，其有效地与允许增强核酸序列表达的启动子连接。也可在DNA序列的3’末端插入其它有利序列，如其它调节元件或终止子。Δ6-去饱和酶基因可以一个或多个拷贝存在于表达盒(＝基因构建体)中。

如上所述，调节序列或调节因子可优选地具有有利影响并从而增强所引入基因的基因表达。因此，可通过使用强转录信号(如启动子和/或增强子)有利地在转录水平上增强调节元件。然而，此外也可以增强翻译，例如通过提高mRNA的稳定性增强翻译。

表达盒中的适当启动子原则上为能控制生物体中(有利地为植物或真菌中)外源基因表达的所有的启动子。尤其优选地使用植物启动子或衍生自植物病毒的启动子。根据本发明的方法的有利调节序列可在如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacI^q-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-P_R的启动子中找到或有利地在革兰氏阴性细菌中使用的λ-P_L启动子中找到。其它有利的调节序列存在于例如革兰氏阳性细菌启动子amy和SPO2，酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或植物启动子CaMV/35S(Franck等人，Cell 21(1980)285-294)、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、nos(＝胭脂氨酸合成酶启动子)或者泛素启动子。表达盒也可包含化学诱导型启动子，其中可在特定时间在植物中有利地控制生物体中外源Δ6-去饱和酶基因的表达。这种类型的有利植物启动子为例如PRP1启动子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)，361-366)、可由苯磺酰胺诱导的启动子(EP 388186)、可由四环素诱导的启动子(Gatz等人，(1992)Plant J.2，397-404)、可由水杨酸诱导的启动子(WO 95/19443)、可由脱落酸诱导的启动子(EP335528)和可由乙醇或环己酮诱导的启动子(WO93/21334)。其它植物启动子的实例为马铃薯胞质FBP酶的启动子、马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)2445-245)、大豆磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的启动子(也见于genebank登录号U87999)或者可有利地使用EP 249676中所述的结节特异性启动子。特别有利的尤其为确保在脂肪酸生物合成或者其前体阶段发生的组织或植物部分/器官中(例如胚乳中或发育的胚中)表达的启动子。特别值得提到的是确保种子特异性表达的有利启动子，例如USP启动子或其衍生物、LEB4启动子、菜豆蛋白启动子或napin启动子。本发明引用的尤其有利的USP启动子或其衍生物介导了种子发育中非常早期的基因表达(Baeumlein等人，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)。可用于单子叶植物或双子叶植物的其它有利的种子特异性启动子为适于双子叶植物的启动子，如同样以实例方式引用的油菜籽的napin基因启动子(US 5,608,152)、拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆的菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、芸苔的Bce4启动子(WO 91/13980)或legume B4启动子(LeB4，Baeumlein等人，Plant J.，2，2，1992：233-239)或者适于单子叶植物的启动子，如大麦中lpt2或lpt1基因的启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或者大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻oryzin基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、sorghum kasirin基因或黑麦的黑麦碱基因的启动子，其在WO99/16890中描述。

此外，特别优选的是确保在例如脂肪酸、油类、脂类生物合成或其前体阶段发生的组织或植物部分中表达的那些启动子。特别值得提到的是确保种子特异性表达的启动子。值得提到的是油菜籽napin基因的启动子(US 5,608,152)、蚕豆的USP启动子(USP＝未知种子蛋白质，Baeumlein等人，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)或者legumin B4基因的启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)。其它欲提到的启动子为介导单子叶植物中种子特异性表达的大麦lpt2或lpt1基因的启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)。

已经描述了其它适于在植物中表达的启动子(Rogers等人，(1987)Method in Enzymol 153：253-277；Schardl等人，(1987)Gene 61：1-11；Berger等人，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：8402-8406)。

如上所述，基因构建体(＝表达盒、核酸构建体)还可包含需要引入生物体的其它基因。这些基因可单独调节或受到Δ6-去饱和酶基因的相同调节区域的调节。这些基因以实例方式为其它生物合成基因，有利地为脂肪酸生物合成的基因，如允许合成增加的脂肪酸或脂类代谢的生物合成基因，所述的生物合成基因选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP(＝酰基载体蛋白)去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-CoA：溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔化酶、脂肪氧化酶、三酰甘油酯脂肪酶、氧化丙二烯合成酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。可提到的实例为Δ15-、Δ12-、Δ9-、Δ6-、Δ5-去饱和酶、β-酮酰还原酶、β-酮酰合成酶、延伸酶或各种羟化酶或者酰基-ACP硫酯酶的基因。去饱和酶和延伸酶基因有利地用于核酸构建体中。特别有利地用于构建体的基因选自Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ9-去饱和酶、Δ12-去饱和酶、Δ5-延伸酶、Δ6-延伸酶或Δ9-延伸酶的基因。

原则上，带有其调节序列的所有天然启动子如下文所述可像上文根据本发明的表达盒和根据本发明的方法中提到的启动子一样使用。除此之外，也可有利地使用合成启动子。

在制备表达盒过程中，可以操作多种DNA片段以获得以正确方向有利地阅读并带有正确阅读框的核苷酸序列。衔接子或接头可与片段连接以将DNA片段(＝根据本发明的核酸)与另一个DNA片段连接。

启动子和终止子区域可与包含用于插入此序列的一个或多个限制性位点的接头或多接头一起在转录方向有利地提供。通常，接头具有1-10个，大多1-8个，优选地2-6个限制性位点。大体上，调节区域中的接头的大小低于100bp，经常低于60bp，但至少为5bp。启动子对宿主生物(例如植物)来说可为内源或同源的以及外源或异源的。表达盒在5’-3’的转录方向包含启动子、编码Δ6-去饱和酶基因的DNA序列和转录终止的区域。不同的终止区域可以所需方式互相替代。

此外，可进行提供适当限制性切割位点或去除额外DNA或限制性切割位点的操作。如果考虑插入、删除或替换，如转换和颠换，可使用体外诱变、引物修复、限制性酶切或连接。在如限制性酶切、在平端的切除或填补突出端的适当操作的情况中可通过片段的互补末端进行连接反应。

为进行有利的高水平表达，连接特异的ER停留信号SEKDEL尤其重要(Schouten，A.等人，Plant Mol.Biol.30(1996)，781-792)；以这种方式，平均表达水平为三倍或四倍。位于内质网的植物和动物蛋白质中天然存在的其它停留信号也可用于构建表达盒。

优选的多腺苷酸化信号为植物多腺苷酸化信号，优选地为主要对应于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA多腺苷酸化信号、尤其是Ti质粒pTiACH5的T-DNA的基因3(章鱼氨酸合成酶)(Gielen等人，EMBO J.3(1984)，835 et seq.)或相应的功能等同物的多腺苷酸化信号。

通过常规重组和克隆技术将合适的启动子与适当Δ6-去饱和酶DNA序列以及多腺苷酸化信号融合产生表达盒，如例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，使用基因融合进行实验(Experiments with Gene Fusions)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience(1987)中所述。

在制备表达盒过程中可操作多种DNA片段以获得在正确方向有利阅读并带有正确阅读框的核苷酸序列。可将衔接子或接头与片段连接以将DNA片段互相连接。

启动子和终止子区域可与包含用于插入此序列的一个或多个限制性位点的接头或多接头一起在转录方向有利地提供。通常，接头具有1-10个，大多1-8个，优选地2-6个限制性位点。大体上，调节区域中的接头的大小低于100bp，经常低于60bp，但至少为5bp。启动子对宿主植物来说可为内源或同源的以及外源或异源的。表达盒在5’-3’的转录方向包含启动子、编码Δ6-去饱和酶基因的DNA序列和转录终止的区域。不同的终止区域可以所需方式互相替代。

在制备表达盒过程中，可以操作多种DNA片段以获得以正确方向有利阅读并带有正确阅读框的核苷酸序列。衔接子或接头可与片段连接以将DNA片段互相连接。

启动子和终止子区域可与包含用于插入此序列的一个或多个限制性位点的接头或多接头一起在转录方向有利地提供。通常，接头具有1-10个，大多1-8个，优选地2-6个限制性酶切位点。大体上，调节区域中的接头的大小低于100bp，经常低于60bp，但至少为5bp。启动子对宿主植物来说可为内源或同源的以及外源或异源的。表达盒在5’-3’的转录方向包含启动子、编码Δ6-去饱和酶基因的DNA序列和转录终止的区域。不同的终止区域可以所需方式互相替代。

编码指叶报春或黄叶报春的两种Δ6-去饱和酶的DNA序列包含获得脂肪酸、脂类或油生物合成位置正确定位所需的所有序列特征。因此，本身不需要其它靶向肽。然而，这样的定位是需要的并且有利的，因而人工修饰或改进此类融合构建体也是本发明的优选有利的实施方案。

尤其优选的是确保靶向到质体中的序列。在某些情况下靶向到其它区室中(Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423中报道)也可以是需要的，例如靶向到液泡中、线粒体中、内质网中、过氧化物酶体中、脂质结构中，或者由于缺少相应的可操作序列而停留在原始区室(胞质)中。

有利地，根据本发明的核酸序列与至少一个报告基因一起克隆到通过载体引入生物体中或直接引入基因组中的表达盒中。此报告基因应该允许通过生长、荧光、化学的、生物发光或者抗性测定法或者通过光度测量容易地检测。可提到的报告基因的实例为抗生素抗性基因或除草剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代谢基因或生物合成基因，如Ura3基因、Ilv2基因、萤光素酶基因、α-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖苷酸酶基因、β-内酰胺基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因或BASTA(＝草丁膦抗性)基因。这些基因允许简易地测量和定量转录活性并因此容易地测量和定量基因表达。可以这种方式鉴定表现不同产量的基因组位置。

在优选的实施方案中，表达盒包括上游(即在编码序列的5’末端)的启动子和下游(即在3’末端)的多腺苷酸化信号并任选地包括有效地与Δ6-去饱和酶和/或Δ6-去饱和酶DNA序列的间插编码序列连接的其它调节元件。有效的连接是指启动子、编码序列、终止子和任选地其它调节元件以每一个调节元件能以合适的方式完成表达编码序列中的功能的方式依次排列。有效的连接优选的序列为确保质体中亚细胞定位的靶向序列。然而，如果需要的话也可使用确保线粒体、内质网(＝ER)、细胞核、油体或其它区室亚细胞定位的靶向序列，其可以是翻译启动子，如烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等人，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。

表达盒可例如包含组成型启动子(优选地为USP启动子或napin启动子)、待表达的基因和ER停留信号。KDEL氨基酸序列(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)优选地用于ER停留信号。

为在原核宿主生物或真核宿主生物(例如微生物如真菌或植物)中表达，基因构建体有利地插入至例如可能在宿主生物中最佳表达基因的质粒、噬菌体或其它DNA的载体中。适当质粒的实例为：大肠杆菌(E.Coli)的pLG338、pACYC184、pBR系列(如pBR322)、pUC系列(如pUC18或pUC19)、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11或pBdCI；链霉菌(Streptomyces)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；芽孢杆菌属(Bacillus)的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌属(Corynebacterium)的pSA77或pAJ667；真菌的pALS1、pIL2或pBB116；其它有利的真菌载体在Romanos，M.A.等人，[(1992)“酵母中的外源基因表达：综述”，Yeast 8：423-488]和van denHondel，C.A.M.J.J.等人[(1991)“在丝状真菌中的异源基因表达”]和更多在真菌中的基因操作(More Gene Manipulations in Fungi)[J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，396-428页：Academic Press：San Diego]和“用于丝状真菌的基因转移系统和载体研发”[van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)，在Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.等人编辑的1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]中描述。有利的酵母启动子的实例为2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子的实例为pLGV23、pGHlac⁺、pBIN19、pAK2004、pVKH或pDH51(见Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988)。上文鉴定的载体或者上文鉴定的载体衍生物构成了可能质粒的一小部分选择。其它质粒为本领域技术人员所熟知并可在例如Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)中找到。合适的植物载体尤其为“Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”(CRC Press)，第6/7章，71-119页中所述。有利的载体为已知的在大肠杆菌和农杆菌中复制的穿梭载体或双元载体。

载体是指除质粒之外本领域技术人员已知的其它所有载体，例如噬菌体、病毒(如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒)、转座子、IS元件、噬菌粒、噬粒、粘粒、线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物体中自主复制或者在染色体复制，染色体复制是优选的。

在载体的其它实施方案中，根据本发明的表达盒也可有利地以线性DNA形式引入生物体并以异源或同源重组的方式整合到宿主生物体的基因组中。此线性DNA可由线性化质粒组成或者仅由作为载体的表达盒或者根据本发明的核酸序列组成。

在其它有利的实施方案中，根据本发明的核酸序列也可单独引入生物体中。

如果除了根据本发明核酸序列之外还需要在生物体中引入其它基因，那么所有基因可在同一个载体中与报告基因一起引入到生物中，或者每一个基因与报告基因在一个载体中引入生物中，每一种情况中不同的载体可能同时引入或者依次引入。

载体有利地包含至少一个拷贝的根据本发明的核酸序列和/或根据本发明的基因构建体。

例如植物表达盒可装配到pRT转化载体中((a)Toepfer等人，1993，Methods Enzymol.，217：66-78；(b)Toepfer等人，1987，Nucl.Acids.Res.15：5890 ff.)。

备选地，也可例如使用T7启动子和T7 RNA聚合酶在体外转录和翻译重组载体(＝表达载体)。

原核生物中所用的表达载体经常利用带有或不带有融合蛋白或融合寡肽的诱导系统，其中这些融合物可以N端和C端方式连接或者与蛋白质的其他有用结构域连接。此类融合载体通常具有下列目的：i.)提高RNA表达速率；ii.)提高可获得的蛋白质合成速率；iii.)增加蛋白质的溶解性；iv.)或者通过可用于亲和层析的结合序列的方法简化纯化过程。也经常通过融合蛋白引入蛋白酶剪切位点，其允许切割融合蛋白部分和纯化。此类蛋白酶识别序列为例如因子Xa、凝血酶和肠激酶。

典型的有利融合和表达载体为pGEX[Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40]、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白或蛋白A。

大肠杆菌表达载体的其它实例为pTrc[Amann等人，(1988)Gene69：301-315]和pET载体[Studier等人，基因表达技术(Gene ExpressionTechnology)：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；Stratagene，Amsterdam，The Netherlands]。

用于酵母的其它有利载体为pYepSec1(Baldari等人，(1987)Embo J.6：229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，(1987)Gene 54：113-123)和pYES衍生物(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。用于丝状真菌的载体在van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)“用于丝状真菌的基因转移系统和载体”；在Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy等人编辑的1-28页，Cambridge University Press：Cambridge中描述。

备选地，也可有利地使用昆虫细胞表达载体，例如在Sf 9细胞中表达。这些载体为例如pAc系列载体(Smith等人，(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列载体(Lucklow和Summers(1989)Virology170：31-39)。

此外，植物细胞或藻类细胞可有利地用于基因表达。植物表达载体的实例可在Becker，D.，等人，(1992)“具有位于邻近左边界的选择性标记的新的植物双元载体”，Plant Mol.Biol.20：1195-1197，或Bevan，M.W.(1984)“用于植物转化的双元农杆菌载体”，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721中找到。

其它原核和真核表达系统在Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的第16章和第17章提到。

原则上，向例如植物中引入根据本发明的核酸、表达盒或载体可通过本领域技术人员已知的所有方法完成。

在微生物的情况中，本领域技术人员可以在Sambrook，J.等人，(1989)分子克隆：实验手册(Molecular cloning：A laboratory manual)，ColdSpring Harbor Laboratory Press；F.M.Ausubel等人(1994)，最新分子生物学方法(Current protocols in molecular biology)，John Wiley andSons；D.M.Glover等人，DNA Cloning，第1卷，(1995)，IRL Press(ISBN019-963476-9)；Kaiser等人，(1994)酵母遗传学中的方法(Methods in YeastGenetics)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；或者Guthrie等人，酵母遗传学和分子生物学指导(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，Methods in Enzymology，1994，Academic Press的教科书中找到合适的方法。

将外源基因转移入植物基因组中称为转化。为此目的，使用所述的转化和从植物组织或植物细胞再生植物体的方法进行瞬时或者稳定转化。合适的方法为聚乙二醇诱导DNA摄入的原生质体转化、使用基因枪的生物弹射击法(称为粒子轰击方法)、电穿孔、在含DNA的溶液中孵育干燥胚、显微注射和农杆菌介导的基因转移。所述的方法以实例方式在B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer；Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press(1993)128-143；和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225中描述。待表达的构建体优选地克隆到适于转化根癌农杆菌的载体中，例如pBin19(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后此种载体转化的农杆菌可以已知方式(例如在农杆菌溶液中浸泡捣碎的叶片或叶片部分，然后在合适的培养基种培养它们)用于转化植物，尤其是作物，如烟草。通过根癌农杆菌的方法转化植物在例如

and Willmitzer in Nucl.Acid Res.(1988)16，9877种描述或者尤其从F.F.White，Vectors for GeneTransfer，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，15-38页已知。

在植物中，所述的转化方法和从植物组织或植物细胞再生植物体的方法用于瞬时或稳定转化。如上文所述的适当方法主要是聚乙二醇诱导DNA摄入的原生质体转化、使用基因枪的生物弹射击法(称为“粒子轰击”方法)、电穿孔、在含DNA的溶液中孵育干燥的胚和显微注射。

除了这些“直接”转化技术之外，转化也可通过使用根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的细菌感染方法和通过用转基因植物病毒感染转移适当的重组Ti质粒或Ri质粒完成。农杆菌介导的转化最适于双子叶植物细胞。此方法在Horsch RB等人，(1985)Science 225：1229f中描述。

如果使用农杆菌，那么将表达盒整合到特定质粒中，或者是穿梭载体，或者是中间载体或者是双元载体中。如果使用Ti质粒或Ri质粒进行转化，那么至少将Ti质粒或Ri质粒T-DNA的右边界(但大多数情况下是右边界和左边界)作为侧翼区域与待引入的表达盒连接。

使用双元载体是优选的。双元载体能在大肠杆菌和农杆菌中复制。作为规则，它们包含侧翼为T-DNA左边界或右边界序列的选择标记基因和接头或多接头。它们可以直接转化到农杆菌中(Holsters等人，(1978)Mol GenGenet 163：181-187)。选择标记基因允许选择转化的农杆菌并且例如是介导卡那霉素抗性的nptII基因。在这种情况下作为宿主生物发挥作用的农杆菌应该已经包含带有vir区域的质粒。这个区域是将T-DNA转移到植物细胞中所需的。这样转化的农杆菌可用于转化植物细胞。用T-DNA转化植物细胞已经得到广泛的研究和描述(EP 120516；Hoekema，The Binary PlantVector System，Offsetdrukkerii Kanters B.V.，Alblasserdam，第五章；An等人(1985)EMBO J 4：277-287)。已知多种双元载体，它们中的一些可以商业购买，如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。

本发明的表达载体转化的农杆菌同样可以已知的方式用于转化植物，如实验植物(像拟南芥)或作物植物(如芥花籽(canola)、亚麻籽或油菜籽)，例如将捣碎的叶或叶部分浸入农杆菌溶液然后在合适的培养基中培养它们。特别适于生产γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸的植物为芸苔科或亚麻科的植物。芸苔属、亚麻芥属或亚麻属特别有利地适于用本发明的核酸序列有利地与其它去饱和酶和延伸酶联合生产γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸。

直接转化技术适于任何生物和细胞类型。在将DNA或RNA注射或电穿孔到植物细胞的情况中，所用的质粒不需要满足任何特殊需要。可以使用简单质粒，如pUC系列的质粒。如果需要从转化的细胞再生完整植物，那么质粒上必需存在其它的可选择标记基因。

当可选择标记为所引入DNA的一部分时可从未转化细胞中选择稳定转化的细胞，即包含整合到宿主细胞的DNA中的引入DNA的转化细胞。任何基因都可能作为标记，例如其能赋予对抗生素或除草剂的抗性(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素等等)(见上文)。表达此标记基因的转化细胞能在存在杀死未转化野生型的相应抗生素或除草剂浓度下存活。实例在上文提到并且优选地包含赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(Rathore KS等人(1993)Plant Mol Biol 21(5)：871-884)赋予卡那霉素抗性的nptII基因、赋予潮霉素抗性的hpt基因或者赋予除草剂草甘磷抗性的EPSP基因。选择标记允许从未转化细胞中选择转化的细胞(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84)。所获得的植物可以常规方式繁育和杂交。应培养两代或两代以上以确保基因组整合是稳定且可遗传的。

上述方法例如在Jenes B等人(1993)Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization，SD Kung和R Wu编辑，Academic Press，第128-143页；以及Potrykus(1991)Annu Rev PlantPhysiol Plant Molec Biol 42：205-225中描述。待表达的构建体优选地克隆到适于转化根癌农杆菌的载体中，例如pBin19(Bevan等人(1984)Nucl AcidsRes 12：8711f)。

一旦产生转化的植物细胞，那么就可能用技术人员已知的方法获得完整的植物。起始材料在本文中是例如愈伤组织培养物。可以已知的方式诱导这些未分化细胞生物质发育出枝条和根。所获得的小植株可以生长和繁殖。

技术人员已知此类从植物细胞再生植物部分和完整植物的方法。用于这些目的的方法为例如Fennell等人(1992)Plant Cell Rep.11：567-570；Stoeger等人(1995)Plant Cell Rep.14：273-278；Jahne等人(1994)TheorAppl Genet 89：525-533中所述。其它合适的方法可在上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者

和Willmitzer的出版物中找到。

适用于本发明的核酸、基因构建体或载体的转基因生物或宿主生物原则上有利地为能合成脂肪酸(尤其是不饱和脂肪酸)和/或适于表达重组基因的芸苔科或亚麻科的所有植物。可提到的实例为如拟南芥、油菜籽、亚麻芥、芥菜或亚麻的植物。优选的是天然能合成大量油的植物。

用于本发明目的的转基因植物理解为是指用于本方法的核酸在植物基因组中不在其天然位置，核酸可能同源表达或异源表达。然而，转基因也指根据本发明的核酸在植物基因组中位于其天然位置，但是此序列已经根据天然序列修饰和/或天然序列的调节序列已经修改。转基因优选地理解为是指在基因组中的非天然位置表达根据本发明的核酸，即同源表达或者优选地异源表达核酸。

因此，“转基因”指例如包含编码Δ6-去饱和酶或其衍生物的核酸序列的核酸序列、基因构建体或载体，或者用此核酸序列、表达盒或载体转化的生物，作为基因工程方法的结果所产生的所有构建体，其中

a)Δ6-去饱和酶核酸序列，或者

b)有效地与Δ6-去饱和酶核酸序列连接的遗传控制序列，例如启动子，或者

c)(a)和(b)

不位于其天然遗传环境或者已经通过遗传工程方法修饰，修饰可能为例如替换、添加、删除、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然的遗传环境是指来源生物中的天然染色体位置或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况中，优选地至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。此环境至少在一侧与核酸序列相邻并且序列长度为至少50bp，优选地至少500bp，特别优选地至少1000bp，非常特别优选地至少5000bp。

本发明还涉及包含编码Δ6-去饱和酶基因的DNA序列或与其杂交的DNA序列的表达盒用于转化植物细胞、植物组织或植物部分的用途。使用它们的目的是增加Δ6-位置的双键含量增加的脂肪酸、油类或脂类的含量。

在本文中并且取决于所选启动子，可在植物的叶、种子、块茎或其它部分特异地表达Δ6-去饱和酶基因。本发明还涉及过量产生带有Δ6-双键的脂肪酸、油或脂类的此类转基因植物，涉及其繁殖材料，涉及其植物细胞、植物组织或植物部分。本发明的优选主题是芸苔科和亚麻科的转基因植物，其包含根据本发明的核酸序列、根据本发明的基因构建体或根据本发明的载体。

在本发明的范围中，增加具有Δ6-双键的脂肪酸、油类或脂类的含量是指与没有经基因工程修饰的起始植物相比较，在根据本发明的转基因植物中人工地获得Δ6-去饱和酶基因功能性过量表达的生物合成特性增强的能力[为了本发明目的，单数形式理解为包含复数，并且反之亦然]，至少持续至少一个植物世代。

生物合成脂肪酸、油或脂类的位置通常为例如种子或种子的细胞层，这样Δ6-去饱和酶基因的种子特异性表达是有意义的。然而，脂肪酸、油或脂类的生物合成显然不需要局限于种子组织中，也可以组织特异性方式发生在植物的所有其它部分，例如表皮细胞或块茎。

此外，组成型表达外源Δ6-去饱和酶基因是有利的。然而，另一方面诱导型表达也是需要的。

可例如在体外通过枝条-分生组织繁殖确定Δ6-去饱和酶基因的表达效率。此外，可用测试植物在温室实验中检测Δ6-去饱和酶基因在水平和程度方面受到的修饰和此种表达对脂肪酸、油或脂类生物合成能力的影响。

本发明还涉及：

-转化芸苔科或亚麻科的植物的方法，其包括在植物细胞、愈伤组织、完整植物体或植物原生质体中引入根据本发明的表达盒，所述的表达盒包含报春花科的Δ6-去饱和酶基因序列或与其杂交的DNA序列。

-Δ6-去饱和酶DNA基因序列或者与其杂交的DNA序列用于产生由于在植物中表达此Δ6-去饱和酶DNA序列而使具有Δ6-双键的脂肪酸、油或脂类含量增加的植物的用途。

-包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示序列的蛋白质。

-具有序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的蛋白质用于生产不饱和脂肪酸的用途。

本发明通过下列实施例进一步详细描述。

实施例

实施例1：常规克隆方法：

如Sambrook等人(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6)所述进行克隆方法，例如限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、将核酸转移到硝酸纤维素膜上和尼龙膜上、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、培养细菌和重组DNA的序列分析。

实施例2：重组DNA的序列分析

通过Sanger的方法(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)用ABI的激光荧光DNA测序仪进行重组DNA分子的测序。聚合酶链式反应得到的片段进行测序并检验以防止待表达的构建体中的聚合酶所致错误。

实施例3：从指叶报春和黄叶报春克隆PUFA特异性去饱和酶

虽然大多数高等植物(被子植物，裸子植物)不合成Δ6-去饱和脂肪酸(合成PUFA的前体)，但是紫草科(Boraginaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)和报春花科包括积累这种脂肪酸的种类。这就是为什么这些种类的成员是鉴定Δ6-去饱和酶的原料的原因。

选择指叶报春和黄叶报春(真核生物(Eukaryota)；植物界(Plantae)，维管植物门(Tracheophyta)，被子植物亚门(Angiospermae)，报春花目(Primulales)，报春花科(Primulaceae))，因为这些物种中Δ6-去饱和产物(在此主要为18:4^{Δ6，9，12，15}，EPA前体)在种子中积累。为分离DNA，从Chiltern Seeds，Cumbria，UK获得种子并在下列条件下生长：

播种前将种子在冷水中浸泡至少3小时。将种子播种到含20％沙的盆装堆肥上，间隔至少1厘米。堆肥下是一层珍珠岩(1/3堆肥体积)。播种后，用珍珠岩覆盖种子，从上面足量浇水并保持长日照条件(16小时光照，100μEm-2s-1，21℃，8小时黑暗，17℃)。

如Sayanova等人，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4211-4216所述提取总RNA。根据制造商的说明通过SMART RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)从总RNA开始合成第一链cDNA。

用下列简并引物进行扩增以鉴定新的去饱和酶基因：

Deg1：

5’-GGITCA(C/T)GA(T/C)(T/G/A)(C/G)IGGICA(C/T)TA-3’

Deg2：

5’-CC(A/G)TCIGT(A/G)T(T/G)IA(G/A)IGC(T/C)TCCCA-3’

使用下列条件进行扩增：95℃2分钟，之后是30个循环的94℃30秒，55-72℃30秒，72℃2分钟。最后，在72℃进行延伸10分钟。根据制造商的说明将PCR扩增子克隆到pGEM-T(Promega)中并测序。用所获得的序列数据制备全长克隆。为此目的，合成5’末端和3’末端的基因特异性引物并从cDNA开始扩增。

在每一种情况中鉴定与去饱和酶基因具有相似性的一个序列。

基因	物种	核苷酸	SEQ ID NO：
基因	物种	核苷酸	SEQ ID NO：	Cort6	指叶报春	1353bp	3
Lut6	黄叶报春	1350bp	1	Cort6	指叶报春	1353bp	3

实施例4：克隆在酵母中异源表达指叶报春和黄叶报春基因的表达质粒

为在酵母中进行异源表达，用合适的特异引物通过PCR扩增相应的序列并通过KpnI-SacI克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen)中。在进行过程中，仅扩增编码PUTA蛋白质的基因的开放阅读框。此外，将KpnI的限制性序列和Kozak序列(Cell 1986，44：283-292)连接到5’末端，将SacI的限制性序列连接到3’末端。

基因	碱基对	引物	SEQ ID NO：
基因	碱基对	引物	SEQ ID NO：	Cort6	1353	正向：GGTACCATGGCCAACCCATCAAAAAAC反向：3’CCTTCCACACACACGGATAAGAGCTCC	56
Lut6	1350	正向：GGTACCATGGCTAACAAATCTCAAAC	7	Cort6	1353		56

反向：3’CTGTTCAAACTCTCGGGTGAGGAGCT

8

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10×缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl₂

5.00μl 2mM dNTP

每一种引物1.25μl(10pmol/μl的5’-ATG和3’-Stopp引物)

0.50μl Advantage聚合酶

使用Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

退火温度：55℃1分钟

变性温度：94℃1分钟

延伸温度：72℃2分钟

循环数：35

将PCR产物和载体pYES2与限制性酶KpnI和SacI于37℃孵育1小时，根据制造商的说明通过Rapid Ligation Kit(Roche)进行连接反应。然后根据制造商的说明将孵育反应物转化到大肠杆菌DH5α细胞中(Invitrogen)。通过PCR鉴定阳性克隆(见上文的反应)并分离质粒DNA(Qiagen Dneasy)。通过测序验证得到的质粒pYCort6和pYLut6并通过醋酸锂方法转化到酵母菌株W303-1A中。为对照目的平行转化pYES2(空载体)。在补充有2％葡萄糖但不含尿嘧啶的完全基本培养基(CMdum)琼脂板上选择转化的酵母。

为表达指叶报春和黄叶报春基因，首先将每一种情况5ml CMdum液体培养基(添加2％(w/v)的棉子糖，但不含尿嘧啶)的预培养物用每一种情况的一种所选转化体接种并在30℃以200转/分孵育2天。

然后将5ml添加2％棉子糖和300μM各种脂肪酸的CMdum液体培养基(不含尿嘧啶)用预培养物接种至OD₆₀₀为0.05。加入2％(w/v)半乳糖诱导表达。将培养物于22℃再孵育96小时。

实施例5：克隆用于在植物中表达的表达质粒

建立基于pBIN19-35S(Bevan M.(1984)，用于植物转化的双元农杆菌载体(Binary Agrobacterium vectors for plant transformation)，Nucl.Acids Res.18：203)的其它转化载体以进行植物转化。为此目的，在编码序列的5’和3’末端引入BamHI-xbaI切割位点，其中使用下列引物对：

基因	碱基对	引物	SEQ ID NO
基因	碱基对	引物	SEQ ID NO	Cort6	1353bp	Fwd：GGATCCACCATGGCCAACCCATCAAAAAACRvs：3’CCTTCCACACACACGGATAAGGTCTAGA	910
Lut6	1350bp	Fwd：GGATCCACCATGGCTAACAAATCTCAAACRvs：3’CTGTTCAAACTCTCGGGTGAGGTCTAGA	1112	Cort6	1353bp		910

PCR混合物的组分(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10×缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl₂

5.00μl 2mM dNTP

每一种引物1.25μl(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用Clontech的Advantage聚合酶。

将PCR产物和载体pBin19-35S与限制性酶BamHI和XbaI于37℃孵育1小时，根据制造商的说明通过Rapid Ligation Kit(Roche)进行连接反应。然后根据制造商的说明将孵育反应物转化到大肠杆菌DH5α细胞中(Invitrogen)。通过PCR鉴定阳性克隆(见上文的反应)并分离质粒DNA(Qiagen Dneasy)。然后通过电穿孔将得到的质粒pBIN-Cort6和pBIN-Lut6转化到根癌农杆菌GC3101中并且涂布到含2％YEB培养基+卡那霉素的琼脂板上。选择耐受卡那霉素的细胞并用于转化拟南芥。

实施例6：在酵母中表达指叶报春和黄叶报春基因

如下分析用质粒pYES2和实施例4制备的质粒pYES-Cort6和pYES-Lut6转化的酵母：

通过离心(100×g，5分钟，20℃)从主培养物中收获酵母并用100mMNaHCO₃，pH 8.0洗涤以去除残余的培养基和脂肪酸。通过酸甲醇分解从酵母细胞沉淀制备脂肪酸甲酯(FAME)。为此目的，于80℃将细胞沉淀与2ml 1N的硫酸甲醇和2％(v/v)二甲氧基丙烷孵育1小时。通过用石油醚(PE)提取两次来提取FAME。每一种情况的有机相用2ml 100mMNaHCO₃，pH 8.0和2ml蒸馏水洗涤一次以去除非衍生脂肪酸。之后用Na₂SO₄干燥PE相，在氩环境下蒸发并收集于100μl PE中。将样品在装有火焰离子化检测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪中的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)上分离。GLC分析的条件如下：炉温计划为从50℃向250℃推进，速率为5℃/分钟，并且最后在250℃10分钟(维持在此温度)。

通过比较相应脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间鉴定信号。此方法在例如Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等人，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585；Sperling等人，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298；以及Michaelson等人，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述。

实施例7：功能特征

通过表达和喂饲各种脂肪酸确定各个基因的活性和底物特异性。在酵母中表达后可通过喂饲各种脂肪酸确定去饱和酶的底物特异性。有关确定各种活性的描述可在WO 93/11245、WO 94/11516、WO 93/06712、US 5,614,393、US5614393、WO 96/21022、WO0021557和WO 99/27111中找到；有关Δ4-去饱和酶的描述可在Qiu等人，2001，J.Biol.Chem.276，31561-31566中找到，有关Δ5-去饱和酶的描述可在Hong等人，2002，Lipids 37，863-868中描述。

a)描述Cort6的特征：

通过喂饲各种脂肪酸在酵母中检测构建体pYES-Cort6。令人惊奇的是，能在这个实验中证明喂饲脂肪酸18:2^Δ9，12和18:3^{Δ9，12，15}之后形成了新的脂肪酸(图1)。

图1：包含质粒pYCort6并已喂饲18:2的酵母的气相色谱分析。新形成的脂肪酸是γ18:3^Δ6，9，12(γ-亚麻酸＝GLA)。

由于新合成了脂肪酸，检测了Cort6的Δ6-去饱和酶活性。在本文中，此酶能利用18:2和18:3作为其底物。

b)描述Lut6的特征：

令人惊奇的是，证明了喂饲18:3之后Lut6具有Δ6-去饱和酶活性(图2)。

图2：已用构建体pYLut6转化并喂饲了脂肪酸18:3^{Δ9，12，15}的酵母的脂肪酸模式。鉴定了相应的脂肪酸。SDA(十八碳四烯酸)对应于18:4^Δ6， ^9，12，15。

因此，Lut6的活性对应于Δ6-去饱和酶活性。

实施例8：产生转基因植物

a)产生转基因油菜籽植物(根据Moloney等人，1992，Plant CellReports，8：238-242改进)。

将实施例5中构建的双元载体(像pBIN-35S质粒)转化到根癌农杆菌GC3101中以产生转基因油菜籽植物(Deblaere等人，1984，Nucl.Acids.Res.13，4777-4788)。使用1∶50稀释于添加3％蔗糖的Murashige-Skoog培养基(Murashige and Skoog 1962 Physiol.Plant.15，473)的阳性转化的农杆菌克隆的过夜培养物(3MS培养基)转化油菜籽植物(cv.Drakkar，NPZNordeutsche Pflanzenzucht，Hohenlieth，Germany)。将新萌发的无菌油菜植物的叶柄或下胚轴(每一种大约1cm²)在培养皿中与1∶50的农杆菌稀释物孵育5-10分钟。之后在添加0.8％细菌用琼脂的3MS培养基上于黑暗条件下在25℃共孵育3天。3天后，在添加500mg/l凯福隆(claforan)(头孢噻肟钠)、50mg/l卡那霉素、20微摩尔/升苄氨基嘌呤(BAP)和1.6g/l葡萄糖的MS培养基上以16小时光照/8小时黑暗和一周为周期继续培养。将生长的枝条转移到添加2％蔗糖、250mg/l凯福隆和0.8％细菌用琼脂的MS培养基上。如果3周后没有形成根，在培养基中加入2-吲哚丁酸作为生长激素以促进生根。

从添加卡那霉素和凯福隆的2MS培养基上获得再生枝条，生根后转移到土壤中，在控制环境的小室中培养、生长2周后开花，收获成熟的种子并如Qiu等人，2001，J.Biol.Chem.276，31561-31566中所述通过脂类分析研究去饱和酶或延伸酶基因的表达。

b)产生转基因亚麻子植物

转基因植物可例如用微粒轰击方法通过Bell等人，1999，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant.35(6)：456-465的方法产生。农杆菌介导的转化可例如如Mlynarova等人，(1994)，Plant Cell Report 13：282-285所述实施。

实施例9：自叶提取脂类

植物、真菌、藻类、纤毛虫中遗传修饰对所需化合物(如脂肪酸)的产量的影响可通过在适当条件下(如下文所述的条件)生长经修饰的微生物或经修饰的植物并分析增加所需产物(即脂类或脂肪酸)的产量的培养基和/或细胞成分确定。这些分析技术为技术人员已知并包括光谱学、薄层层析、各种类型的染色方法、酶促方法和微生物学方法以及分析层析(如高效液相色谱)(见例如Ullman，Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第89-90页和第443-613页，VCH：Weinheim(1985)；Fallon，A.，等人，(1987)“生物化学中HPLC的应用”，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等人，(1993)Biotechnology，第3卷，第III章：“产物回收和纯化”，第469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.，等人，(1988)生物分离：用于生物技术的下游加工(Bioseparations：downstream processing for Biotechnology)，JohnWiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)生物物质的回收方法(Recovery processes for biological Materials)，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化学分离(BiochemicalSeparations)，在Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第B3卷，第11章，第1-27页，VCH：Weinheim和Dechow，F.J.(1989)生物技术中的分离和纯化技术(Separation and purification techniques inbiotechnology)，Noyes Publications)。

除了上述方法以外，植物脂类如Cahoon等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22)：12935-12940和Browse等人，(1986)Analytic Biochemistry152：141-145所述从植物材料中提取。脂类或脂肪酸的定性分析和定量分析在Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology，Ayr/Scotland：Oily Press(Oily Press Lipid Library；2)；Christie，William W.，气相色谱和脂类：实践指导(Gas Chromatography and Lipids.A Practical Guide)-Ayr，Scotland：Oily Press，1989，Repr.1992，IX，307页(Oily Press LipidLibrary；1)；“Progress in Lipid Research，Oxford：Pergamon Press，1(1952)-16(1977)，标题为脂肪和其它脂类化学方面的进展(Progress in theChemistry of Fats and Other Lipids)CODEN中描述。

一个例子是分析脂肪酸(缩写：FAME：脂肪酸甲酯；GC-MS：气液色谱/质谱；TAG：三酰甘油；TLC：薄层层析)。

明确检测存在脂肪酸产物可在多种情况中如Christie和其中的参考文献中所述(1997，Advances on Lipid Methodology，第4版：Christie，OilyPress，Dundee，119-169；1998，Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren[气相色谱/质谱法]，Lipide 33：343-353)通过用分析学标准方法(GC、GC-MS或TLC)分析重组生物完成。

待分析的材料可通过超声处理、在玻璃研磨器中研磨、液氮和研磨或者通过其它可用方法破碎。破碎之后材料必需离心。将沉淀重悬于蒸馏水中，100℃加热10分钟，在冰上冷却并再次离心，然后在90℃于含2％二甲氧基丙烷的甲醇中的0.5M硫酸溶液中提取1小时，得到经水解的油和脂类化合物，得到转甲基脂类。在石油醚中提取这些脂肪酸甲酯，最后用毛细管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52 CB，25微米，0.32mm)以170-240℃的温度梯度20分钟和240℃ 5分钟进行GC分析。必需用商业购买的(即Sigma)的标准品确定得到的脂肪酸甲酯的身份。

最初植物材料通过用研杵和研体研细进行机械匀浆以使其更易于提取。之后于100℃加热10分钟，在冰上冷却后再次沉淀。将细胞沉淀在90℃用1M甲醇硫酸和2％二甲氧基丙烷水解1小时，然后对脂类进行转甲基化。在石油醚中提取得到的脂肪酸甲酯(FAME)。通过使用毛细管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52 CB，25m，0.32mm)以及170-240℃的温度梯度20分钟和240℃ 5分钟的气液色谱分析提取的FAME。通过与相应的FAME标准品(Sigma)比较证实脂肪酸甲酯的身份。身份和双键的位置可进一步通过FAME混合物的适当化学衍生分析，例如通过GC-MS得到4，4-二甲氧基噁唑啉衍生物(Christie，1998)。

分析表达Cort6的转基因拟南芥植物：

分析如实施例5用质粒pBIN-Cort6和pBIN-Lut6转化的植物中的经修饰的脂肪酸。所用的起始材料为如上文所述提取和通过气相色谱分析的叶。

证明了两个质粒都产生新的脂肪酸(图3和图4)。在本文中，证明了Cort6酶优先转化内源存在的脂肪酸18:2^Δ9，12，而Lut6令人惊奇地优先将18:3^{Δ9，12，15}转化成SDA(18:4^{Δ6，9，12，15})。由此可以得出结论：两种酶可优选地在植物背景中使用以生产分别为PUFA ARA和EPA的前体的GLA或SDA。

图3：来自已用质粒pBIN-Cort6转化的拟南芥植物叶材料中的脂肪酸的气相色谱分析。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司

<120>在转基因芸苔科和亚麻科植物中生产γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸的方法

<130>2005/1063

<140>PF 57260

<141>

<160>12

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>1350

<212>DNA

<213>黄叶报春(Primula lutoides)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1350)

<223>Δ6-去饱和酶

<400>1

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<212>PRT

<213>黄叶报春

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<210>3

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<220>

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<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>

<400>12

ctgttcaaac tctcgggtga ggtctaga 28

Claims

1.在芸苔科(Brassicaceae)或亚麻科(Linaceae)转基因植物中生产γ-亚麻酸(18:3 ^Δ6，9，12)或十八碳四烯酸(18:4 ^{Δ6，9，12，15})或者γ-亚麻酸(18:3^Δ6，9，12)和十八碳四烯酸(18:4 ^{Δ6，9，12，15})的方法，其中转基因植物基于总脂肪酸含量包含至少10％重量的油酸，并且所述方法包括下列步骤：

b)在转基因植物中表达该核酸编码的Δ6-去饱和酶，

c)生长并收获植物。

2.根据权利要求1的方法，其中编码报春花属物种的Δ6-去饱和酶的核酸序列选自：

a)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列的核酸序列，

b)由于遗传密码的简并性，可衍生自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列，

3.根据权利要求1或2的方法，其中为了表达权利要求1(a)、(b)和(c)的核酸序列，将权利要求1(a)、(b)和(c)的核酸序列有效地与启动子或终止子或者启动子和终止子连接。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中Δ6-去饱和酶活性导致植物中增加的Δ6-C₁₈-脂肪酸含量。

5.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中Δ6-去饱和酶具有对α-亚麻酸的底物特异性，其比对亚油酸的底物特异性高出大于20倍。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中Δ6-去饱和酶仅接受α-亚麻酸作为其底物并且不转化亚油酸。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中不饱和脂肪酸γ-亚麻酸(18:3 ^Δ6，9，12)或(18:4 ^{Δ6，9，12，15})或者γ-亚麻酸(18:3 ^Δ6，9，12)和(18:4 ^{Δ6，9，12，15})在油料植物的种子中增加。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中从收获的植物中分离种子。

9.根据权利要求1-8的方法，其中不饱和脂肪酸γ-亚麻酸(18:3 ^Δ6，9，12)或(18:4 ^{Δ6，9，12，15})或者γ-亚麻酸(18:3 ^Δ6，9，12)和(18:4 ^{Δ6，9，12，15})以油、脂类的形式或者以游离脂肪酸的形式从芸苔科转基因植物或它们的种子中分离。

10.根据权利要求9的方法，其中油或脂类中存在的不饱和脂肪酸以游离脂肪酸的形式分离。

11.根据权利要求1-10的方法，其中油类、脂类或游离脂肪酸与其它动物、微生物或植物的油类、脂类或脂肪酸混合以得到脂肪酸组合物。

12.根据权利要求1-11的方法，其中将油类、脂类或游离脂肪酸或者脂肪酸组合物添加至食品、饲料、化妆品或药物。

13.经分离的核酸序列，其编码具有Δ6-去饱和酶活性的多肽并且其中编码的Δ6-去饱和酶优先利用α-亚麻酸而非亚油酸作为底物，所述核酸序列选自：

a)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列的核酸序列，

b)由于遗传密码的简并性，可衍生自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列，或者

c)SEQ ID NO：1所示核酸序列的衍生物，其编码在氨基酸水平上与SEQ ID NO：2具有至少95％同源性并具有Δ6-去饱和酶活性的多肽；或者SEQ ID NO：3所示核酸序列的衍生物，其编码在氨基酸水平上与SEQ IDNO：4具有至少80％同源性并具有Δ6-去饱和酶活性的多肽。

14.根据权利要求13的经分离的核酸序列，该序列来源于植物。

15.根据权利要求13或14的经分离的核酸序列，该序列来源于报春花科(Primulaceae)。

16.蛋白质，其由根据权利要求13-15中任意一项所述的经分离的核酸序列编码。

17.基因构建体，其包含权利要求13-15中任意一项所述的经分离的核酸序列，该核酸序列有效地与一个或多个调节信号连接。

18.根据权利要求17的基因构建体，其中该核酸构建体包含脂肪酸或脂类代谢的其它生物合成基因，所述其它生物合成基因选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP(＝酰基载体蛋白)去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-CoA：溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔化酶、脂肪氧化酶、三酰甘油酯脂肪酶、氧化丙二烯合成酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶的基因。

19.根据权利要求17或18的基因构建体，其中该核酸构建体还包含脂肪酸或脂类代谢的生物合成基因，所述脂肪酸或脂类代谢的生物合成基因选自Δ4-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ9-去饱和酶、Δ12-去饱和酶、Δ5-延伸酶、Δ6-延伸酶或Δ9-延伸酶的基因。

20.载体，其包含根据权利要求13-15的核酸或者根据权利要求17-19的基因构建体。

21.转基因芸苔科或亚麻科植物，其包含至少一个根据权利要求13-15的核酸序列、根据权利要求17-19的基因构建体或根据权利要求20的载体。