BRPI0618060A2 - método para produzir um ácido, seqüência de ácido nucleico isolado, proteìna, construção de genes, vetor, e, brassicacea ou linacea transgênicas - Google Patents

Abstract

<B>MéTODO PARA PRODUZIR UM áCIDO, SEQUêNCIA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADO, PROTEìNA, CONSTRUçãO DE GENES, VETOR, E, BRASSICACEA OU LINACEA TRANSGêNICAS,D> A invenção diz respeito à produção de ácido y-linolênico (18:3<>^ 6^, ^ 9^, ^ 12^) ou ácido estearidónico (18:4<>^ 6^, ^ 9^,^ 12^,^ 15^) ou ácido y-linolênico (18:3<>^ 6^, ^ 9^, ^ 12^) ou ácido estearidónico (18:4<>^ 6^, ^ 9^, ^ 12^ ,^ 15^) em plantas transgênicas da família das brassicaceae, referidas plantas transgênicas contendo pelo menos 10 por cento em peso de ácido oleico em relação à concentração total de ácido graxo e sendo fornecido com uma concentração aumentada de ácido graxo <>6-C~ 18~ como um resultado da atividade das <>-6 dessaturases usadas no método. A invenção também diz respeito a novas sequências de ácido nucleico codificando para as <>-6 dessaturases usadas no método, as construções de genes contendo as referidas sequências de ácido nucleico, um vetor e plantas transgênicas contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico ou uma construção de genes.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UM ÁCIDO, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDONUCLEICO ISOLADO, PROTEÍNA, CONSTRUÇÃO DE GENES,VETOR, E, BRASSICACEA OU LINACEA TRANSGÊNICAS"DESCRIÇÃO

A presente invenção diz respeito à produção de ácido γ-linolênico (18:3a6'9'12) ou ácido estearidônico (18:4Δ6'9'12'15) ou ácido γ-linolênico (18:3a6'9'12) e ácido estearidônico (18:4Δ6'9'12'15) em plantastransgênicas da família das Brassicaceae, em que as plantas transgênicascompreendem pelo menos 10% em peso de ácido oleico com base noconteúdo total de ácido graxo e, como um resultado da atividade das Δ6-dessaturases usadas no método, têm um conteúdo de ácido graxo Δό-Cigaumentado.

A invenção, além disso, diz respeito a novas seqüências deácido nucleico que codificam para as Δό-dessaturases usadas no método, asconstruções de genes compreendendo estas seqüências de ácido nucleico\, umvetor e plantas transgênicas compreendendo pelo menos uma seqüência deácido nucleico ou uma construção de genes.

Os ácidos graxos e os triglicerídeos têm uma multiplicidade deaplicações na indústria de alimentos, na nutrição animal, em cosméticos e nosetor farmacológico. Dependendo do fato de serem eles ácidos graxos outriglicerídeos livres saturados ou insaturados com um conteúdo de ácidosgraxos saturados ou insaturados aumentados, eles são adequados para umaampla faixa de aplicações.

Os ácidos graxos co3 poliinsaturados de cadeia longa, taiscomo o ácido eicosapentanóico (EPA) ou o ácido docosaexanóico (DPA), sãocomponentes importantes da nutrição humana como o resultado dos diferentespapéis que eles desempenham na saúde, os quais incluem aspectos tais comoo desenvolvimento do cérebro das crianças, a funcionalidade dos olhos, asíntese dos hormônios e outras substâncias de sinal, e a prevenção dasenfermidades cardiovasculares, do câncer e do diabete (Poulos, A. Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, L. A. e Yeo, Υ. K. PharmacolRes 40: 211-225, 1999).Este é o porquê de existir uma demanda para a produção de ácidos graxospoliinsaturados de cadeia longa e, especificamente, ácidos graxos co3.

Assim, por exemplo, os ácidos graxos poliinsaturados sãoadicionados ao alimento de bebês para aumentar o valor nutritivo e para odesenvolvimento sem problemas da criança. Os vários ácidos graxos etriglicerídeos são obtidos na maior parte de microorganismos tais como aMortierella ou de plantas produtoras de óleo tais como a soja, a colza, ogirassol e outros, em que eles são usualmente gerados na forma de seustriacilglicerídeos. Entretanto, nenhum ácido graxo insaturado de cadeia longaé encontrado nas plantas superiores. Os ácidos graxos de cadeia longa sãoderivados na maior parte de óleo de peixe ou da fermentação de algasadequadas (por exemplo a Thraustochytrium) ou de fungos (por exemplo aMortierella). Os ácidos graxos livres são vantajosamente preparados porhidrólise.

Quer se prefira óleos com ácidos graxos saturados ou comácidos graxos insaturados, depende da finalidade pretendida; na nutriçãohumana, por exemplo lipídeos com ácidos graxos insaturados, ácidos graxosespecificamente poliinsaturados, são preferidos, desde que eles tenham umefeito positivo sobre o nível de colesterol no sangue e, portanto, sobre apossibilidade de doença cardíaca. Eles são empregados em uma variedade degêneros alimentícios dietéticos ou em medicamentos.

Os dois ácidos γ-linolênico e estearidônico de ácidos graxos,em particular o ácido estearidônico, têm efeitos positivos sobre ometabolismo da pele (por exemplo a acne, os danos solares) e sobre o retardonos processos de envelhecimento da pele até um efeito preventivo e curativoem uma ampla faixa de processos inflamatórios no corpo; estes efeitospositivos têm sido descritos extensivamente. Eles são também usados naterapia concomitante do câncer prostático e intestinal e na terapia e prevençãodos distúrbios neurológicos (por exemplo a dispraxia, a esquizofrenia). Este éo porquê do fato de que estes ácidos graxos também desempenham umimportante papel na indústria de cosméticos e nos aditivos alimentares. Atéhoje, o óleo que é rico nos ácidos γ-linolênico e estearidônico éprincipalmente obtido do gênero Echium.

Como resultado de suas características positivas, não houvenenhuma falta de tentativas no passado para produzir genes disponíveis queestivessem envolvidos na síntese dos ácidos graxos ou triglicerídeos para aprodução de óleos nos vários organismos com um conteúdo modificado deácidos graxos insaturados. Assim, a WO 91/13972 e sua equivalente U.S.descrevem uma A9-dessaturase. Uma delta 15-dessaturase é reivindicada naWO 93/11245 e uma A12-dessaturase, na WO 94/11516. Outras dessaturasessão descritas por exemplo nas EP-A-O 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582,WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-O 794 250, Stukey et al, J. Biol. Chem.,265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 ou Huanget al., Lipids 34, 1999: 649-659. Entretanto, as várias dessaturases foram atéhoje apenas insuficientemente caracterizadas em termos bioquímicos, tendoem vista que as enzimas, sendo proteínas ligadas à membrana, podem apenasser isoladas e caracterizadas com grande dificuldade (McKeon et al., Methodsin Enzymol. 71, 1981: 12141 -12147, Wang et al, Plant Physiol. Biochem., 26,1988: 777-792). Por via de regra, as dessaturases ligadas à membrana sãocaracterizadas por serem introduzidas em um organismo adequado que ésubseqüentemente estudado quanto à atividade enzimática mediante análisedos materiais e produtos de partida. As Δβ-dessaturases são descritas nas WO93/06712, U.S. 5.614.393, WO 96/21022, WO 0021557 e WO 99/27111, etambém o uso para a produção nos organismos transgênicos é descrito, talcomo nas WO 9846763, WO 9846764, WO 9846765. Aqui, a expressão dasvárias dessaturases, tais como na WO 9964616 ou na WO 9846776, e aformação de ácidos graxos poliinsaturados são descritas e reivindicadas.

Existe ainda uma grande demanda por novos e mais adequadosgenes que codifiquem para enzimas que estejam envolvidas na biossíntese dosácidos graxos insaturados e que tornem possível a produção específica decertos ácidos graxos em uma escala industrial sem que produtos secundáriosindesejáveis sejam gerados. Quando da escolha dos genes da biossíntese,existem principalmente dois aspectos que são de importância particular.Primeiramente, ainda existirá a necessidade de métodos melhorados de seobter os conteúdos mais elevados possível de ácidos graxos poliinsaturados.Em segundo lugar, as enzimas empregadas devem ser altamente específicaspara um substrato particular, desde que, tanto quanto isto seja possível,nenhum produto secundário indesejável deva ser gerado que possa ter efeitosfisiológicos adversos, ou até agora não pesquisados na aplicação para gênerosalimentícios.

Para tornar possível um fortalecimento do alimento e danutrição com estes ácidos graxos poliinsaturados especificamente produzidos,existe, portanto, uma grande demanda de um método simples e barato deproduzir estes ácidos graxos poliinsaturados com o auxílio de enzimas queestejam envolvidas na biossíntese dos ácidos graxos e que sejam tãoespecíficos quanto possível.

Foi, portanto, um objeto desenvolver um novo método deproduzir ácido γ-linolênico e/ou ácido estearidônico em uma planta, métodoeste que torne possível a síntese destes ácidos graxos de uma maneira sãoespecífica quanto possível. Este objeto foi alcançado pelo presente método deproduzir o ácido γ-linolênico (18:3a6'9'12) ou o ácido estearidônico(18:4a6,9'12'15) o ácido γ-linolênico (18:3Δ6'9'12) e o ácido estearidôniconas plantas transgênicas das famílias das Brassicaceae ouLinaeeae, em que as plantas trangênicas compreendam pelo menos 10% empeso do ácido oleico com base no conteúdo total de ácido graxo e quecompreendam as seguintes etapas do processo:

a) introduzir uma seqüência de ácido nucleico na plantaoleosa que codifique para uma Δό-dessaturase de uma espécie de Prímula eque de preferência utilize, como substrato, o ácido α-linolênico como o ácidolinolênico, e

b) expressão, na planta transgênica, da Δό-dessaturasecodificada pelo ácido nucleico, e

c) cultivar e colher as plantas.

As plantas oleosas transgênicas das famílias Brassicaceae ouLinaeeae vantajosamente compreendem pelo menos 11, 12, 33, 14 ou 15%em peso de ácido oleico, vantajosamente pelo menos 16, 17, 18, 19 ou 20%em peso de ácido oleico com base no conteúdo total de ácido graxo,especialmente vantajoso pelo menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60% empeso de ácido oleico com base no conteúdo total de ácido graxo, muitoespecialmente vantajoso pelo menos 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70%em peso de ácido oleico, com base no conteúdo de ácido graxo, ou mais. Asplantas que são vantajosas para o método de acordo com a invenção, alémdisso, têm um conteúdo preferido de ácido palmítico, de pelo menos 9, 10, 11,12, 13, 14 ou 15% em peso, vantajosamente de 20, 21, 22, 23, 24 ou 25% empeso, especialmente vantajoso de 26, 27, 28, 29 ou 30% em peso, com baseno conteúdo total de ácido graxo. Outras plantas vantajosas têm um conteúdode ácido linoleico de pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% em peso,vantajosamente de 55, 60, 65, 70 ou 75% em peso, com base no conteúdototal de ácido graxo. Outras plantas vantajosas têm um conteúdo de ácido a-linolênico de pelo menos 10, 15, 20, 25 ou 30% em peso, vantajosamente de35, 40, 45 ou 50% em peso, especialmente vantajoso de 55, 60, 65 ou 70% empeso, com base no conteúdo total de ácido graxo. As plantas vantajosaspodem também conter combinações dos ácidos graxos acima mencionados, oconteúdo total de ácido graxo sendo de 100% em peso.As plantas transgênicas das famílias das Brassicaceae ouLinaeeae que são usadas no método vantajosamente têm um conteúdo total deóleo na semente de pelo menos 20, 25 ou 30% em peso, vantajosamente aoredor de pelo menos 35 ou 40% em peso, especialmente vantajoso ao redor depelo menos 45 ou 50% em peso, muito especialmente vantajoso de pelomenos 55% em peso, com base no peso total da semente.

As plantas oleosas de colheita que são preferidas no métodoproduzem óleos, lipídeos e/ou ácidos graxos livres, que compreendem menosdo que 4, 3, 2 ou 1% em peso, vantajosamente menos do que 0,9, 0,8, 0,7, 0,61ou 0,5% em peso, especialmente vantajoso menos do que 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 ou0,09% em peso ou menos, de ácido mirístico. Outras plantas oleosas decolheita vantajosas compreendem menos do que 5, 4 ou 3% em peso de ácidopalmítico e/ou menos do que 2, 1,5 ou 1% em peso de ácido esteárico.

Além de um conteúdo elevado de óleo na semente, as plantasoleosas vantajosas devem também ter um baixo conteúdo de proteínas nasemente. Este conteúdo de proteínas deve, se possível, ser menor do que 30,25 ou 20% em peso, vantajosamente menor do que 19, 18, 17, 16 ou 15% empeso.

As plantas que são adequadas para o método de acordo com ainvenção são, em princípio, todos os gêneros da família da Brassieaeeae(aproximadamente 380 gêneros em todo o mundo) com as subfamíliasArabideae, Brassieeae, Chamireae, Cremolobeae, Heliophileae, Hesperideae,Lepidieae, Prynglea, Sehizopetaleaee, Sisymbrieae, Stenopetaleae eThelypodieae ou da família da Linaceae (9 gêneros em todo o mundo). Asplantas que são preferidas para o método de acordo com a invenção são dosgêneros das famílias das Brassicaceae ou Linaceae selecionadas do grupoconsistindo de Alliaria, Alyssoides, Arabis, Armoraeia, Barbarea, Berteroa,Brassiea, Camelina, Capsella, Cardamine, Cardaria, Cheiranthus, Crambe,Dentaria, Diplotaxis, Erophila, Erysimum, Iberis, Lepidium, Lunaria,Nasturtium, Raphanus, Rorippa, Schivereckia, Sinapis, Sisymbrium1 Thlaspi,Turritis, Anisadenia, Cliococca, Durandea, Hebepetalum, Hesperolinon,Hugonia, Indorouchera, Linum, Philbornea, Radiola, Reimvardtia,Roucheria, Sclerolinon e Tirpitzia.

As plantas que são especialmente preferidas para o método deacordo com a invenção são os gêneros e espécies selecionadas do grupoconsistindo de Alliaria petiolata, Alyssoides utriculata, Arabis caucasica,Arabis procurrens, Arabis turrita, Armoracia rusticana, Barbareaintermedia, Barbaraea vulgaris, Berteroa incana, Brassica napus, Brassicanapus ssp. rapifera, Brassiea napus ssp. napus, Brassiea nigra, Brassieaoleracea, Brassica rapa, Brassiea rapa ssp. oleífera, Brassiea rapa ssp. rapa,Brassiea sativus, Camelina sativa, Capsella bursa-pastoris, Cardamineamara, Cardamine bulbifera, Cardamine hirsuta, Cardamine pratensis,Cardaria draba, Cheiranthus eheiri, Crambe abyssiniea, Dentaria bulbifera,Diplotaxis tenuifolia, Erophila verna, Erophila verna agg, Erysimum bicolor,Erysimum eheiranthoides, Iberis spee, Lepidium eampestre, Lepidiumsativum, Lepidium virginicum, Lunaria annua, Lunaria rediviva, Nasturtiumoffteinale, Raphanus raphanistrum, Rorippa pyrenaiea, Schivereckiapodolica, Sinapis alba, Sinapis arvensis, Sisymbrium officinale, Thlaspiarvense, Thlaspi perfoliatum, Turritis glabra, Linumalpinum, Linumaustriacum, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Linumhirsutum, Linum leonii, Linum maritimum, Linum ockendonii, Linum perenne,Linum tenuifolium, Linum viscosum and Linum usitatissimum.

Plantas que são em especial vantajosamente usadas no métodosão as plantas selecionadas entre o grupo das plantas oleosas selecionadas dogrupo consistindo dos gêneros e espécies de Brassica campestris, Brassicanapus, Brassica rapa, Brassica juneea, Camelina sativa, Crambe abyssiniea eLinum usitatissimum. Plantas que são muito especialmente preferidas nométodo de acordo com a invenção são os gêneros e espécies de Brassieacampestris, Brassica napus, Brassica rapa, Brassiea juncea, Camelina sativae Linum usitatissimum.

As seqüências de ácido nucleico que são vantajosamenteusadas no método de acordo com a invenção são aquelas que codificam parauma Δ6-dessaturase das espécies da Prímula, selecionadas do grupoconsistindo de:

a)n uma seqüência de ácido nucleico com a seqüênciaapresentada nas SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3,

b) seqüências de ácidos nucleicos que, como oresultado da degeneração do código genético, podem ser derivadas daseqüência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4,

ou

c) derivados da seqüência de ácido nucleicoapresentada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, que codificam para ospolipeptídeos que têm pelo menos 40% de homologia no nível de aminoácidocom a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO: 4 e que têm uma atividade de Δ6-dessaturase.

No método de expressar as seqüências de ácido nucleicomencionadas sob (a), (b) e (c), estas seqüências de ácido nucleico sãovantajosamente ligadas de forma operável com um promotor ou terminadorou promotor e terminador.

No método de acordo com a invenção para a produção doácido γ-linolênico e/ou do ácido estearidônico em uma planta transgênica dafamília das Brassieaeeae ou Linaeeae, o conteúdo de ácido graxo Δ6-C18 é,como um resultado da atividade da enzima Δό-dessaturase, aumentada acimada planta inicial não transgênica (tipo selvagem). O termo "aumentada" éentendido como significando, para os fins da invenção, que o conteúdo deácido graxo Δ6-C18 (conteúdo de ácido γ-linolênico e/ou ácido estearidônico)é aumentado em relação ao tipo selvagem em pelo menos 25, 30, 35, 40, 45ou 50%, vantajosamente em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou100%, em especial vantajosamente em pelo menos 105, 110, 115, 120, 125,130, 135, 140, 145 ou 150% ou mais.

A Δό-dessaturase usada no método vantajosamente tem umaespecificidade de substrato para o ácido α-linolênico que é mais do que 20vezes, vantajosamente mais do que 25, 30, 35 ou 40 vezes, mais elevada doque a especificidade do substrato para o ácido linoleico. Em uma forma derealização especialmente vantajosa da invenção, a Δό-dessaturase tem umaespecificidade de substrato exclusiva para o ácido α-linolênico, o queeqüivale a dizer que a enzima apenas reconhece o ácido α-linolênico, mas nãoo ácido linoleico, como seu substrato. Isto resulta em uma síntese vantajosados ácidos graxos insaturados da via ω3-sintética, enquanto o ácido linoleico,sendo o substrato de partida da via ωό-sintética, não é convertido peladessaturase.

No método, o ácido γ-linolênico e/ou o ácido estearidônico,sendo produtos da atividade enzimática da enzima Δό-dessaturase, sãovantajosamente acumulados na semente das plantas oleosas.

Os ácidos graxos ácido γ-linolênico e/ou ácido estearidônico,que são produzidos no método, são vantajosamente gerados como ácidosgraxos livres ou, preferivelmente, na forma de ésteres, preferivelmente naforma de triglicerídeos.

Uma outra matéria objeto da invenção é um método deproduzir triglicerídeos com um conteúdo aumentado nos ácidos graxosinsaturados o ácido γ-linolênico e/ou o ácido estearidônico, por incubação dostriglicerídeos com ácidos graxos saturados ou insaturados e saturados ouinsaturados com pelo menos a proteína que é codificada pela seqüência SEQID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3. O método é vantajosamente realizado napresença de compostos que são capazes de aceitar ou doar equivalentes deredução. Depois disso, os ácidos graxos podem ser liberados dostriglicerídeos.

As plantas que são vantajosamente usadas no método deacordo com a invenção são plantas transgênicas da família das Brassicaceaeou das Linaeeae. Estas plantas compreendem os ácidos graxos poliinsaturadosácido γ-linolênico e/ou ácido estearidônico, que são sintetizados no método deacordo com a invenção, e podem vantajosamente ser comercializados sem quesejam necessários para os óleos, lipídeos ou ácidos graxos que tenham sidosintetizados para serem isolados. As plantas no método de acordo com ainvenção são plantas intactas e todas as plantas, órgãos de plantas ou partesdas plantas tais como folhas, pedúnculos, sementes, raízes, tubérculos,anteras, fibras, pelos das raízes, troncos, embriões, calos, cotilédones,pecíolos, material de colheita, tecidos das plantas, tecidos reprodutivos,culturas celulares que sejam derivadas das plantas transgênicas e/ou quepossam ser usadas para gerar as plantas transgênicas. Neste contexto, asemente compreende todas as partes da semente, tais como as cascas dassementes, as células epidérmicas e as células das sementes, o endosperma outecido embriônico. Entretanto, os compostos produzidos no método de acordocom a invenção também podem ser isolados das plantas na forma de seusóleos, gorduras, lipídeos e/ou ácidos graxos livres. Os ácidos graxospoliinsaturados produzidos por este método podem ser colhidos pela colheitadas plantas ou da cultura em que eles se desenvolvam, ou do campo. Isto podeser realizado através de pressão ou extraindo-se as partes das plantas,preferivelmente as sementes das plantas. Neste contexto, os óleos, gorduras,lipídeos e/ou ácidos graxos livres podem ser obtidos pelo que é conhecidocomo batimento a frio ou pressão a frio, sem fornecimento de calor. As partesda planta, especificamente as sementes, são de antemão fragmentadas,tratadas por vapor ou tostadas de modo a facilitar o seu rompimento. Assementes que tenham sido pré-tratadas assim podem subseqüentemente serprensadas ou mesmo extraídas com solventes tais como hexano quente. Osolvente é subseqüentemente removido. Desta maneira, mais do que 96% doscompostos produzidos no método podem ser isolados. Os produtos resultantessão subseqüentemente processados ainda, isto é, refinados. Aqui, porexemplo, as mucilagens das plantas e a matéria túrbida são primeiroremovidas. O que é conhecido como desengomadura pode ser realizadoenzimaticamente ou, por exemplo, químico-fisicamente pela adição de ácidotal como o ácido fosfórico. Os ácidos graxos livres são subseqüentementeremovidos pelo tratamento com uma base, por exemplo solução de hidróxidode sódio. O produto resultante é completamente lavado com água pararemover o álcali remanescente no produto e depois secado. Para remover amatéria colorante que ainda permaneça no produto, os produtos sãodescorados, por exemplo com o uso de terra descorante ou carvão vegetalativo. No final, o produto é desodorizado, por exemplo pelo uso de vapor.

Os PUFAs produzidos no método são vantajosamente geradosnas plantas na forma de seus óleos, lipídeos ou ácidos graxos ou fraçõesdestes.

Uma outra forma de realização de acordo com a invenção é ouso do óleo, lipídeo, os ácidos graxos e/ou a composição de ácidos graxos quetenha sido preparada pela mistura dos óleos, lipídeos ou ácidos graxosproduzidos com outros óleos animais, microbianos ou vegetais nos gênerosalimentícios, nos alimentos, cosméticos ou produtos farmacêuticos.

Os termos "óleo", "lipídeo" ou "gordura" são entendidos comosignificando uma mistura de ácidos graxos que compreende ácido(s) graxo(s)preferivelmente esterificado(s), insaturado(s), saturado(s). E preferível que oóleo, o lipídeo ou a gordura tenham um alto conteúdo de ácido(s) graxo(s)poliinsaturado(s) livre(s) ou, vantajosamente, esterificado(s), em particular oácido linoleico, o ácido α-linolênico, o ácido γ-linolênico e/ou o ácidoestearidônico. A quantidade de ácidos graxos esterificados insaturados épreferivelmente de aproximadamente 30% em peso, com uma quantidade de50% em peso sendo a mais preferida e uma quantidade de 60, 70, 80% empeso ou mais sendo ainda mais preferida. Para fins de identificação, épossível, por exemplo, determinar a quantidade de ácido graxo mediantecromatografia gasosa após converter-se os ácidos graxos nos ésteres metílicospor meio de transesterificação. O óleo, o lipídeo ou a gordura podemcompreender vários outros ácidos graxos saturados ou insaturados, porexemplo o ácido palmítico, o ácido palmitoleico, o ácido esteárico, o ácidooleico e outros. A quantidade dos vários ácidos graxos no óleo ou na gordurapode variar, em particular como uma função do organismo inicial.

Os ácidos graxos poliinsaturados produzidos no método são,por exemplo, esfingolipídeos, fosfoglicerídeos, lipídeos, glicolipídeos,fosfolipídeos, monoacilglicerol, diacilglicerol, triacilglicerol ou outros ésteresde ácidos graxos.

Os ácidos graxos presentes podem ser liberados dos ácidosgraxos poliinsaturados produzidos no método de acordo com a invenção, porexemplo através do tratamento com álcalis, por exemplo KOH ou NaOHaquosos, ou hidrólise de ácido, vantajosamente na presença de um álcool talcomo o metanol ou o etanol, ou através de clivagem enzimática, e isoladoatravés, por exemplo, de separação de fase e subseqüente aplicação com, porexemplo, H2SO4. Entretanto, os ácidos graxos também podem ser liberadosdiretamente sem o processamento acima descrito.

Os óleos, lipídeos ou ácidos graxos podem ser obtidos damaneira costumeira das plantas, após elas terem sido cultivadas. Para este fim,as plantas e/ou suas sementes podem, após a colheita, primeiro ser rompidasou mesmo usadas diretamente. Os óleos, lipídeos e/ou ácidos graxos sãovantajosamente extraídos com solventes adequados, tais como os solventesapolares tais como o hexano ou etanol, isopropanol ou misturas tais como ahexano/isopropanol, álcool fenol/clorofórmio/isoamílico, em temperaturasentre 0°C a 80°C, preferivelmente entre 20°C a 50°C. Por via de regra, abiomassa é extraída com um excedente de solvente, por exemplo em umexcedente de 1:4 de solvente em relação à biomassa. O solvente ésubseqüentemente removido, por exemplo através de destilação. A extraçãotambém pode ser realizada com o uso de CO2 supercrítico. Após a extração, oremanescente da biomassa pode ser removido, por exemplo, por filtração.

O óleo bruto assim obtido pode, subseqüentemente, serpurificado ainda, por exemplo pela remoção da turbidez através de tratamentocom solventes polares tais como a acetona ou o clorofórmio, seguido porfiltração ou centrifugação. Uma purificação adicional através de colunas étambém possível.

Para se obter os ácidos graxos livres dos triglicerídeos, estesúltimos são hidrolisados da maneira costumeira, conforme foi descrito.

Os óleos, lipídeos e/ou ácidos graxos livres assim obtidos nométodo, ou os triglicerídeos com um conteúdo aumentado de ácido γ-linolênico e/ou ácido estearidônico, que tenham sido produzidos nos métodosacima mencionados, podem ser usados para preparar gêneros alimentícios,alimentos, cosméticos ou produtos farmacêuticos. Com esta finalidade, elessão adicionados aos gêneros alimentícios, aos alimentos, aos cosméticos ouaos produtos farmacêuticos nas quantidades costumeiras. Em outra forma derealização, os óleos, lipídeos e/ou ácidos graxos livres ou os triglicerídeoscom um conteúdo aumentado de ácido γ-linolênico e/ou ácido estearidônico,são misturados com outros óleos, lipídeos ou ácidos graxos animais,microbianos ou vegetais, para dar composições de ácidos graxos. As últimaspodem ser adicionadas nas quantidades costumeiras aos gêneros alimentícios,aos alimentos, aos cosméticos ou aos produtos farmacêuticos.

Os métodos acima mencionados vantajosamente tornampossível a síntese dos ácidos graxos ou triglicerídeos com um conteúdoaumentado de ácidos graxos com ligações Δό-duplas, vantajosamente ácidosgraxos C18.O método acima mencionado vantajosamente torna possível asíntese de ácidos graxos ou triglicerídeos com um conteúdo aumentado deácidos graxos com ligações Δό-duplas, em que, preferivelmente, o ácidolinoleico e/ou o ácido α-linolênico, vantajosamente apenas o ácido a-linolênico, são utilizados como o substrato para a reação da enzima Δ6-dessaturase. Assim, o método acima mencionado vantajosamente tornapossível, em particular, a síntese do ácido γ-linolênico e/ou do ácidoestearidônico, preferivelmente do ácido estearidônico sozinho. Assim, aespecificidade específica do substrato da Δό-dessaturase de acordo com ainvenção, difere vantajosamente das especificidades do substrato das Δ6-dessaturases da técnica anterior.

A invenção portanto, além disso, diz respeito a seqüências deácido nucleico isolado que codificam para polipeptídeos com atividade de Δ6-dessaturases e em que a Δό-dessaturase preferivelmente utiliza ácido α-linolênico a ácido linoleico, selecionado do grupo consistindo de:

a) uma seqüência de ácido nucleico com a seqüênciaapresentada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3,

b) seqüências de ácido nucleico que, como resultadoda degeneração do código genético, podem ser derivadas da seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou na SEQ ID NO: 4, ou

c) derivados da seqüência de ácido nucleicoapresentada na SEQ ID NO: 1, que codifica para polipeptídeos que tenhampelo menos 95% de homologia ao nível de aminoácidos com a SEQ ID NO: 2ou derivados da seqüência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 3que codifica para os polipeptídeos que tenham pelo menos 80% de homologiaao nível de aminoácido com a SEQ ID NO: 4, e que tenham uma atividade deΔό-dessaturase.

As Δό-dessaturases encontradas diferem das Δό-dessaturasesdescritas por seqüências muito diferentes de nucleotídeos e aminoácidos. Aseqüência de Prímula dos P. cortusoides tem 78% de similaridade ao nível deaminoácidos com as seqüências Δ6-dessaturases da técnica anterior. Aseqüência de Δ-dessaturase de P. Iutoides de acordo com a invenção, tem 92%de similaridade ao nível de aminoácidos com as seqüências da técnicaanterior.

As seqüências de ácido nucleico de acordo com a invençãovantajosamente se originam de uma planta, preferivelmente de uma planta dafamília das Primulaceae, especialmente preferível do gênero Primula, muitoespecialmente preferível dos gêneros e espécies Primula cortusoides ouPrimula lutoides.

Para os fins da invenção, o termo "A6-dessaturase"compreende proteínas que são envolvidas na dessaturação dos ácidos graxos,vantajosamente dos ácidos graxos que têm uma ligação dupla na posição 9 dacadeia de ácidos graxos, e de seus homólogos, derivados ou análogos.

Em uma outra forma de realização, os derivados da moléculade ácido nucleico de acordo com a invenção, representados na SEQ ID NO: 1ou na SEQ ID NO: 3, codificam para as proteínas com pelo menos 80%, 81%,82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90%, vantajosamente pelomenos 91% ou 92%, preferivelmente pelo menos 93% ou 94% e maispreferível pelo menos 95% ou 96%, e o mais preferível pelo menosaproximadamente 97%, 98%, 99% ou mais de homologia (= identidade) coma seqüência de amino completa SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Ahomologia foi calculada através da região da seqüência inteira de aminoácidosou de ácido nucleico. Os programas usados para os alinhamentos dasseqüências foram o programa PileUp {J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987,Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit[Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) e Smith e Waterman(Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que fazem parte do pacote deprogramas do GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Os valores para as homologias de seqüênciasque são estabelecidos acima em percentuais foram calculados com oprograma GAP através da região de seqüência inteira, com os seguintesajustes: Gap Weight: 8, Length Weight: 2, Average Match: 2,912 e AverageMismatch: -2,003.

A invenção além disso compreende moléculas de ácidonucleico que diferem de uma seqüência de ácido nucleico apresentada nasSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 (e partes destas) como o resultado dadegeneração do código genético, e que assim codificam para a mesma Δ6-dessaturase como aquela codificada pela seqüência de nucleotídeosapresentada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3.

Além da seqüência de nucleotídeos da Δ6-dessaturaseapresentada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, o técnico habilitadoreconhece que os polimorfismos da seqüência de DNA podem existir em umapopulação que leve a modificações nas seqüências de aminoácidos da Δ6-dessaturase. Estes polimorfismos genéticos no gene da Δ6-dessaturase podemexistir entre indivíduos dentro de uma população, como o resultado devariação natural. Estas variantes naturais usualmente ocasionam uma variaçãode 1 a 5% na seqüência de nucleotídeos do gene da Δ6-dessaturase. Todasestas variações de nucleotídeos, e os polimorfismos de aminoácidosresultantes, na Δ6-dessaturase, que são o resultado da variação natural e quenão modificam a atividade funcional da Δ6-dessaturase, devem ser cobertospelo escopo da invenção.

A seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção (ouos fragmentos desta) podem vantajosamente ser usada para isolar outrasseqüências genômicas mediante triagem da homologia.

Os derivados acima mencionados podem ser isolados, porexemplo, de outros organismos eucarióticos tais como plantas como,especificamente, musgos, dinoflagelados ou fungos. Os ácidos nucleicos deacordo com a invenção e derivados podem vantajosamente ser isolados dasplantas.

As variantes alélicas compreendem, em particular, variantesfuncionais que são obteníveis da seqüência apresentada na SEQ DD NO: 1 ouna SEQ ID NO: 3 mediante deleção, inserção ou substituição de nucleotídeos,a atividade enzimática das proteínas derivadas que sejam sintetizadas sendomantidas.

Iniciando-se das seqüências de DNA descritas nas SEQ IDNO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou partes destas seqüências, tais seqüências de DNApodem ser isoladas de outros eucariotas, tais como, por exemplo, aquelesmencionados acima, por exemplo com o uso dos métodos de hibridizaçãocostumeiros ou da tecnologia de PCR. Estas seqüências de DNA hibridizam-se sob condições padrão com as seqüências acima mencionadas. Para ahibridização, é feito vantajosamente o uso de, por exemplo, oligonucleotídeoscurtos das regiões conservadas que possam ser determinadas por comparaçõescom outros genes de dessaturase de uma maneira conhecida daqueleshabilitados na técnica. As seqüências de caixa de histidina são vantajosamenteempregadas. Entretanto, os fragmentos mais longos dos aminoácidos deacordo com a invenção ou as seqüências completas podem também ser usadaspara hibridização. Dependendo do ácido nucleico empregado:oligonucleotídeo, fragmento mais longo ou seqüência completa, oudependendo de qual tipo de ácido nucleico, DNA ou RNA, é usado para ahibridização, estas condições padrão variam. Assim, por exemplo, astemperaturas de fusão dos híbridos de DNA:DNA são aproximadamente 100Cmenores do que aquelas dos híbridos de DNA:RNA do mesmo comprimento.Por condições padrão denota-se, por exemplo, dependendo do ácido nucleicoem questão, temperaturas entre 42°C e 58°C em uma solução tampão aquosatendo uma concentração entre 0,1 e 5 χ SSC (1 χ SSC = 0,15 M de NaCl, 15mM de citrato de sódio, pH 7,2), ou adicionalmente na presença de 50% deformamida, tal como por meio de exemplo, 42°C em 5 χ SSC, 50% deformamida. As condições de hibridização para os híbridos de DNArDNA sãovantajosamente 0,1 χ SSC e temperaturas entre aproximadamente 20°C e45°C, preferivelmente entre aproximadamente 30°C e 45°C. Quanto aoshíbridos de DNA:RNA, as condições de hibridização são vantajosamente 0,1χ SSC e temperaturas entre aproximadamente 30°C e 55°C, preferivelmenteentre aproximadamente 45°C e 55°C. Estas temperaturas especificadas para ahibridização são valores de temperatura de fusão calculados por meio deexemplo para um ácido nucleico tendo um comprimento aproximadamente de100 nucleotídeos, e um conteúdo de G + C de 50% na ausência de formamida.As condições experimentais para a hibridização de DNA são descritas emlivros de texto de genética importantes, tais como, por exemplo, Sambrook etal., iiMolecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, e podem sercalculadas mediante fórmulas conhecidas daqueles habilitados na técnica, porexemplo como uma função do comprimento dos ácidos nucleicos, da naturezados híbridos ou do conteúdo de G + C. Aqueles versados na técnica podemextrair dos seguintes livros de texto para informações adicionais sobre ahibridização: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, New York; Hames e Higgins (eds), 1985,Nueleic Aeids Hybridization: A Praetieal Approaeh, IRL Press na OxfordUniversity Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: APractical Approaeh, IRL Press na Oxford University Press, Oxford.

Além disso, por derivados, denota-se homólogos dasseqüências SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, por exemplo homólogoseucarióticos, seqüências truncadas, DNA de filamento único da seqüência deDNA codificadora e não codificadora ou RNA da seqüência de DNAcodificadora e não codificadora.

Além disso, por homólogos das seqüências SEQ ID NO: 1 eSEQ ID NO: 3 denotam-se derivados tais como, por meio de exemplo ,variantes promotoras. Estas variantes podem ser modificadas por uma ou maistrocas de nucleotídeos, por inserção(ões) e/ou deleção(ões), sem, no entanto,afetar negativamente a funcionalidade ou a eficiência dos promotores. Alémdisso, os promotores podem ter sua eficiência aumentada mediante alteraçãode sua seqüência, ou ser completamente substituídos por promotores maiseficazes mesmo de organismos estranhos.

Por derivados também denota-se vantajosamente variantescuja seqüência de nucleotídeos tenha sido alterada na região de -1 a -2000 amontante do códon de partida, de uma maneira tal que a expressão dos genese/ou a expressão protéica sejam modificadas, preferivelmente aumentadas.Além do mais, por derivados também se denotam variantes que tenham sidomodificadas na extremidade 3'.

As seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção,que codificam para uma Δό-dessaturase, podem ser produzidas por síntese ouobtidas naturalmente, ou compreender uma mistura de componentes de DNAsintéticos e naturais, bem como consistir de vários segmentos de genes de Δό-dessaturase heterólogos de diferentes organismos. Em geral, as seqüências denucleotídeos sintéticos são produzidas com códons que são preferidos pelosorganismos hospedeiros correspondentes, plantas por exemplo. Istousualmente resulta em expressão ótima dos genes heterólogos. Estes códonspreferidos pelas plantas podem ser determinados dos códons que têm afreqüência protéica mais elevada, que são expressos em muitas das espéciesde plantas de interesse. Um exemplo concernente à Corynebacteriumglutamicum é fornecido em: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118. A realização de tais experiências pode ser realizada usando-se métodospadrão e que são conhecidos de uma pessoa experiente neste campo.

Seqüências funcionalmente equivalentes que codificam para ogene de Δό-dessaturase são aquelas derivadas da seqüência de acordo com ainvenção, as quais, a despeito de uma seqüência diferente de nucleotídeos,ainda possui as funções desejadas, em outras palavras, a atividade enzimáticaessencial e a seletividade específica das proteínas. Assim, equivalentesfuncionais incluem variantes de ocorrência natural das seqüências descritasneste relatório, bem como aquelas artificiais, por exemplo as seqüências denucleotídeos artificiais adaptadas ao uso do códon de uma planta que tenhasido obtida por síntese química.

Além disso, as seqüências de DNA artificiais são adequadas,contanto que, como descrito acima, elas medeiem a propriedade desejada, porexemplo um aumento no conteúdo de ligações Δό-duplas nos ácidos graxos,óleos ou lipídeos na planta, mediante superexpressão do(s) gene(s) de Δ6-dessaturase em plantas de colheitas. Tais seqüências de DNA artificiaispodem apresentar atividade de A6-dessaturase, por exemplo mediantetranslação de retorno das proteínas construídas por meio de modelagemmolecular, ou ser determinada por seleção in vitro. Técnicas possíveis para aevolução in vitro do DNA para modificar ou melhorar as seqüências de DNA,são descritas em Patten, P. A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8,724-733 (1997) ou em Moore, J. C. et al., Journal of Molecular Biology 272,336-347 (1997). Particularmente adequadas são as seqüências de DNAcodificadoras que são obtidas por translação de retorno de uma seqüência depolipeptídeos de acordo com o uso de códons específicos para a plantahospedeira. Uma pessoa habilitada na técnica, que seja familiar com osmétodos de genética das plantas, pode facilmente determinar o uso de códonespecífico por análise de computador de outros genes conhecidos da planta aser transformada.

Outras seqüências equivalentes adequadas de ácido nucleicoque podem ser mencionadas são as seqüências que codificam proteínas defusão, um componente da proteína de fusão sendo o polipeptídeo da Δ6-dessaturase ou uma sua parte funcionalmente equivalente. A segunda parte daproteína de fusão pode ser, por exemplo, outro polipeptídio tendo atividadeenzimática ou uma seqüência antigênica de polipeptídeos por meio da qualseja possível detectar a expressão da Δό-dessaturase (por exemplo, rótulo mycou rótulo his). Preferivelmente, entretanto, esta é uma seqüência de proteínasreguladoras, tais como, por exemplo, uma seqüência de sinal para o ER, quedirige a proteína de Δό-dessaturase ao ponto de ação desejado.

As seqüências de ácido nucleico isolado de acordo com ainvenção são vantajosamente originadas de uma planta tal como uma plantamonocotiledônea ou dicotiledônea. As seqüências de ácido nucleico são depreferência originadas da família das Primulaceae, como descrito acima.

Vantajosamente, os genes da Δό-dessaturase no método deacordo com a invenção podem ser combinados com outros genes para abiossíntese do ácido graxo. Exemplos de tais genes são as aciltransferases,outras dessaturases ou elongases. Quanto à síntese in vivo e especialmente invitro, a combinação com, por exemplo, as NADH citocromo B5 redutases quepodem aceitar ou doar equivalentes de redução, é vantajosa.

Em princípio, todos os genes da metabolismo de ácido graxoou de lipídeos pode ser combinado com as Aó-dessaturase(s) de acordo com ainvenção (para os fins do presente pedido, o plural deve incluir o singular evice-versa) para preparar o ácido γ-linolênico e/ou o ácido estearidônico nométodo. Vantajosamente, os genes do metabolismo do ácido graxo ou dolipídeo são selecionados do grupo consistindo de acil-CoA desidrogenase(s),acil-ACP (= proteínas portadoras de acila) dessaturase(s), acil-ACPtioestetase(s), ácidos graxos aciltransferase(s), acil-CoA:lisofosfolipídeosaciltransferases, ácido graxo sintase(s), ácido graxo hidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s), ácido graxodesturase(s), ácido graxo acetilenases, lipoxigenases, triacilglicerol lipases,óxido de aleno sintases, hidroperóxido liases ou ácido graxo elongase(s).Especialmente preferível, os genes são selecionados do grupo consistindo de△4-dessaturases, △5-dessaturases, △9-dessaturases, △12-dessaturases, Δ6-elongases ou A5-elongases em combinação com os genes acima mencionadospara as Aó-dessaturase(s), sendo possível usar genes individuais ou umapluralidade de genes em combinação.

A invenção, além disso, diz respeito a proteínas que sejamcodificadas pelas seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção.

Pelas proteínas (= seqüências de polipeptídeos ou deaminoácidos) de acordo com a invenção, deve ser entendido proteínas quecompreendam uma seqüência de aminoácidos apresentada nas seqüênciasSEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, ou uma seqüência delas obteníveis porsubstituição, inversão, inserção ou supressão de um ou mais grupos deaminoácidos, as atividades enzimáticas das proteínas apresentadas nas SEQID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 sendo retidas ou não substancialmente reduzidas.Por "não substancialmente reduzidas" denota-se todas as enzimas que aindaapresentem pelo menos 10%, preferivelmente 20%, particularmente preferível30%, da atividade enzimática da enzima inicial. Assim procedendo, porexemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros que tenhampropriedades psicoquímicas semelhantes (enchimento de espaço, basicidade,hidrofobicidade etc.). Por exemplo, os resíduos de arginina são trocados porresíduos de lisina, resíduos de valina, por resíduos de isoleucina ou resíduosde ácido aspártico, por resíduos de ácido glutâmico. Entretanto, um ou maisaminoácidos podem também ser trocados na seqüência, adicionados ouremovidos, ou uma pluralidade destas medidas pode ser combinadas entre si.

Por derivados, denotam-se equivalentes funcionais que, emparticular, também contêm mutações naturais ou artificiais de uma seqüênciaoriginalmente isolada codificando Δό-dessaturase que continua a apresentar afunção desejada, isto é, cuja atividade enzimática e seletividade do substratonão sejam substancialmente reduzidas. As mutações compreendemsubstituições, adições, supressões, trocas ou inserções de um ou mais resíduosde nucleotídeos. Assim, por exemplo, a presente invenção também incluiaquelas seqüências de nucleotídeos que são obtidas por modificação daseqüência de nucleotídeos da Δό-dessaturase. O objetivo de uma talmodificação pode ser, por exemplo, delimitar ainda a seqüência codificadoranela contida ou também, por exemplo, introduzir outros sítios de clivagempara as enzimas de restrição.

Equivalentes funcionais são também aquelas variantes cujafunção por comparação com o gene inicial ou fragmento de gene éenfraquecida (= não substancialmente reduzida) ou reforçada (= atividadeenzimática mais elevada do que a atividade da enzima inicial, isto é, aatividade é mais elevada do que 100%, preferivelmente mais elevada do que110%, particularmente preferível mais elevada do que 130%).

Aqui, a seqüência de ácido nucleico pode, por exemplovantajosamente, ser uma seqüência de DNA ou de cDNA. As seqüênciascodificadoras que são para inserção em uma construção de genes de acordocom a invenção são, por exemplo, aquelas que codificam para uma Δό-dessaturase com as seqüências descritas acima e proporcionam ao hospedeiroa capacidade de superproduzir ácidos graxos, óleos ou lipídeos tendo ligaçõesduplas na posição Δ6, isso sendo vantajoso quando os ácidos graxos <x>3,tendo pelo menos quatro ligações duplas, são produzidos durante esteprocesso. Estas seqüências podem ser de origem homóloga ou heteróloga.

A construção de genes (= cassete de expressão, construção oufragmento de ácido nucleico) de acordo com a invenção é consideradasignificar as seqüências especificadas nas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3, asquais resultam do código genético e as quais foram operavelmente ligadascom um ou mais sinais reguladores vantajosamente para aumentar a expressãodos genes e as quais controlam a expressão da seqüência codificadora nacélula hospedeira. Estas seqüências reguladoras devem permitir a expressãoseletiva dos genes e a expressão protéica. Dependendo da planta hospedeira,isto pode significar, por exemplo, que o gene é expresso e/ou superexpressoapenas após a indução, ou que ele é expresso e/ou superexpressoimediatamente. Exemplos destas seqüências reguladoras são as seqüências àsquais os indutores ou repressores se ligam e desta maneira regulam aexpressão do ácido nucleico. Além destas novas seqüências de regulação, ouao invés destas seqüências, a regulação natural destas seqüências à frente dosgenes estruturais reais pode ainda estar presente e opcionalmente ter sidogeneticamente modificada de modo que a regulação natural tenha sidodesligada e a expressão dos genes tenha sido aumentada. Entretanto, aconstrução de genes também pode ser mais simples na construção, isto é,nenhum sinal adicional de regulação tenha sido introduzido à frente daseqüência de ácido nucleico ou de seus derivados e o promotor natural comsua regulação não tenha sido removido. Ao invés, a seqüência reguladoranatural tenha sido transformada de uma tal maneira que nenhuma outraregulação decorra e/ou a expressão de genes seja intensificada. Estespromotores modificados na forma de seqüências parciais (= promotorcontendo partes das seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção)podem também ser colocados por si próprios à frente do gene natural paraaumentar a atividade. Além disso, a construção de genes pode vantajosamentetambém compreender uma ou mais assim chamadas seqüênciasintensificadoras operavelmente ligadas ao promotor o qual possibilite umaexpressão acentuada da seqüência de ácido nucleico. Na extremidade 3' dasseqüências de DNA, seqüências adicionais vantajosas podem também serintroduzidas, tal como outros elementos reguladores ou terminadores. O geneda Δ6-dessaturase pode estar presente em uma ou mais cópias no cassete deexpressão (= construção de genes).

Como descrito acima, as seqüências ou fatores reguladorespodem preferivelmente influenciar de forma positiva, e assim aumentar aexpressão dos genes dos genes introduzidos. Assim, a intensificação doselementos reguladores vantajosamente sobre o nível da transcrição pode serefetuada pelo uso de sinais de transcrição fortes, tais como promotores e/ouintensificadores. Entretanto, além da forte intensificação da translação, étambém possível, por exemplo pelo melhoramento da estabilidade do mRNA.

Promotores adequados no cassete de expressão são, emprincípio, todos os promotores que possam controlar a expressão de genesestranhos nos organismos, vantajosamente em plantas ou fungos.Preferivelmente é feito uso, em particular, de promotores de plantas oupromotores originados de um vírus de planta. Seqüências reguladoresvantajosas para o método de acordo com a invenção são encontradas, porexemplo, nos promotores tais como cos, tac, trp, tet, trpptet, lpp, lac, ipp-lac,laclq", T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, X-Pr ou nos promotores X-Pl que sãoempregados vantajosamente nas bactérias Gram-negativas. Outras seqüênciasreguladoras vantajosas se acham presentes, por exemplo, nos promotoresGram-positivos amy e SP02, nos promotores de levedura ou fungicos ADC1,MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH ou nos promotores deplantas CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], SSU, OCS, lib4,STLS1, B33, nos (= Promotor da Nopalina Sintase) ou no promotor daubiquitina. O cassete de expressão pode também compreender um promotorquimicamente indutível por meio do qual a expressão do gene exógeno da Δ6-dessaturase nos organismos pode ser vantajosamente controlada nas plantasem um período de tempo específico. Promotores de plantas vantajosos destetipo são, por exemplo, o promotor PRPl [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366], um promotor indutível pela benzenossulfonamida (EP388186), um promotor indutível pela tetraciclina (Gatz et al., (1992) Plant J.2, 397-404), um promotor indutível pelo ácido salicílico (WO 95/19443), umpromotor indutível pelo ácido abscísico (EP 335528) e um promotor indutívelpelo etanol ou pela cicloexanona (WO 93/21334). Outros exemplos depromotores de plantas são o promotor da FBPase citossólica da batata, opromotor ST-LSI da batata (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), opromotor da fosforribosil pirofosfato amidotransferase da Glicina max (vertambém o número de acesso do banco de genes U87999) ou um promotorespecífico dos nós como descrito na EP249676, podendo vantajosamente serusados. Particularmente vantajosos são especialmente aqueles promotores deplantas que garantem a expressão nos tecidos ou partes/órgãos de plantas nosquais a biossíntese do ácido graxo ou os seus estágios precursores ocorrem,como no endosperma ou no desenvolvimento do embrião, por exemplo.Particularmente dignos de nota são os promotores vantajosos que garantem aexpressão específica da semente, tal como, por exemplo, o promotor USP ouseus derivados, o promotor LEB4, o promotor de faseolina ou o promotornapin. O promotor USP, que é particularmente vantajoso e é citado de acordocom a invenção, ou seus derivados, medeiam muito prematuramente aexpressão do gene no desenvolvimento da semente (Baeumlein et ai., MolGen Genet, 1991, 225 (3): 459-467). Outros promotores vantajososespecíficos da semente que podem ser usados para plantas monocotiledôneasou dicotiledôneas são os promotores adequados para as dicotiledôneas, taiscomo os promotores dos genes napin, da mesma forma citados comoexemplo, do óleo de colza (U.S. 6.608.152), o promotor da oleosina daArabidopsis (WO 98/45461), o promotor da faseolina da Phaseolus vulgaris(U.S. 5.504.200), o promotor Bce4 da Brassica (WO 91/13980) ou opromotor B4 de leguminosas (LeB4, Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239) ou os promotores adequados para as monocotiledôneas, tais comoos promotores do gene Ipt2 ou Iptl na cevada (WO 95/15389 e WO95/23230) ou os promotores do gene da hordeína da cevada, o gene daglutelina do arroz, o gene da orizina do arroz, o gene da prolamina do arroz, ogene da gliadina do trigo, o gene da glutelina do trigo, o gene da zeína domilho, o gene da glutelina da aveia, o gene da casirina do sorgo ou o gene dasecalina do centeio, os quais são descritos na WO 99/16890.

Além disso, particularmente preferidos são aqueles promotoresque garantem a expressão nos tecidos ou partes das plantas, em que abiossíntese dos ácidos graxos, óleos e lipídeos ou seus estágios precursorestem lugar. Particularmente dignos de nota são os promotores que garantemuma expressão específica da semente. Dignos de nota são o promotor do genenapin do óleo de colza (U.S. 5.608.152), o promotor USP da Viciafava (USP= proteína de semente desconhecida, Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991,225 (3): 459-467), o gene da oleosina da Arabdopsis (WO 98/45461), opromotor da faseolina (U.S. 5.504.200) ou o promotor do gene B4 dalegumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-239).Outros promotores a serem mencionados são aqueles dos genes Ipt2 ou Iptlda cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230), os quais medeiam a expressãoespecífica das sementes nas plantas monocotiledôneas.

Outros promotores que são adequados para a expressão nasplantas foram descritos (Rogers et al. (1987) Method in Enzymol 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl AeadSei USA 86: 8402-8406).

Como descrito acima, a construção de genes (= cassete deexpressão, construção de ácido nucleico) pode compreender ainda outrosgenes que devam ser introduzidos nos organismos. Estes genes podem sertema para separar a regulação ou ser tema para a mesma região de regulaçãoconforme o gene de A6-dessaturase. Estes genes são, como exemplo, outrosgenes de biossíntese, vantajosamente para a biossíntese de ácido graxo, talcomo os genes de biossíntese do metabolismo do ácido graxo ou do lipídeo, oque possibilita uma síntese aumentada selecionada do grupo consistindo deacil-CoA desidrogenase(s), acil-ACP (= proteína portadora da acila)dessaturase(s), acil-ACP tioesterase(s), ácido graxo aciltransferase(s), acil-CoA:lisofosfolipídeos aciltransferase(s), ácido graxo sintase(s), ácido graxohidroxilase(s), acetil-coenzima A carboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s),ácido graxo dessaturase(s), ácido graxo acetilenases, lipoxigenases,triacilglicerol lipases, óxido de aleno sintases, hidroperóxido liases ou ácidograxo elongase(s). Exemplos que podem ser mencionados são os genes paraas enzimas Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ6-, A5-dessaturase, β-cetoacil redutases, β-cetoacil sintases, elongases ou as várias hidroxilases ou acil-ACP tioesterases.Os genes da dessaturase e da elongase são vantajosamente usados naconstrução de ácido nucleico. Genes que são em especial vantajosamenteusados na construção são selecionados do grupo consistindo de Δ4-dessaturase, A5-dessaturase, Δδ-dessaturase, A9-dessaturase, Δ12-dessaturase, A5-elongase, Δό-elongase ou A9-elongase.

Em princípio, todos os promotores naturais com suasseqüências de regulação podem ser usados como aqueles citados acima para ocassete de expressão de acordo com a invenção e o método de acordo com ainvenção, como descrito abaixo. Além disto, os promotores sintéticos podemtambém vantajosamente ser usados.

Na preparação de um cassete de expressão, vários fragmentosde DNA podem ser manipulados a fim de se obter uma seqüência denucleotídeos que convenientemente seja conduzida na direção correta e sejaequipada com a matriz de leitura correta. Para ligar os fragmentos de DNA (=ácidos nucleicos de acordo com a invenção) entre si, adaptadores ou ligadorespodem ser ligados aos fragmentos.

O promotor e as regiões terminadoras convenientementepodem ser fornecidas na direção da transcrição com um ligador ou poliligadorcompreendendo um ou mais sítios de restrição para a introdução destaseqüência. Geralmente, o ligador tem de 1 a 10, principalmente 1 a 8,preferivelmente 2 a 6, sítios de restrição. Em geral, o tamanho do ligadordentro da região reguladora é menor do que 100 pares de base,freqüentemente menor do que 60 pares de base, porém pelo menos 5 pares debase. O promotor pode ser tanto nativo quanto homólogo, assim comoestranho ou heterólogo ao organismo hospedeiro, por exemplo à plantahospedeira. Na direção de 5'-3' da transcrição, o cassete de expressãocompreende o promotor, uma seqüência de DNA que codifica para um geneda Δό-dessaturase e uma região para a terminação da transcrição. Regiões determinação diferentes podem ser substituídas por uma outra em qualquerforma desejada.

Além disso, as manipulações que fornecem sítios de clivagemde restrição adequados ou que removem o DNA em excesso ou os sítios declivagem de restrição, podem ser empregadas. Quando as inserções, assupressões ou as substituições, tais como as transições e as transversões, sãolevadas em consideração, a mutagênese in vitro, o reparo, a restrição ou aligação do iniciador podem ser usados. No caso de manipulações adequadastais como a restrição, o retorno da mastigação ou o enchimento das projeçõespara as extremidades embotadas, as extremidades complementares dosfragmentos podem ser fornecidas para a ligação.

Para uma alta expressão vantajosa, a ligação do sinal SEKDELde retenção de ET específica inter alia pode ser de importância (Schouten, A.et ai., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792); desta maneira, o nível médio deexpressão é triplicado ou quadruplicado. Outros sinais de retenção queocorrem naturalmente nas proteínas de plantas ou de animais localizadas noER podem também ser empregados para a construção do cassete.

Sinais de poliadenilação preferidos são os sinais depoliadenilação de plantas, de preferência aqueles que essencialmentecorrespondam aos sinais de poliadenilação de T-DNA de Agrobacteriumtumefaciens, em particular o gene 3 do T-DNA (octopina sintase) doplasmídeo Ti, o pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J.3 (1984), 835 e seguintes)ou os equivalentes funcionais correspondentes.

Um cassete de expressão é produzido por fusão de umpromotor adequado com uma seqüência de DNA de Δό-dessaturase adequadajunto com um sinal de poliadenilação por recombinação comum e técnicas declonagem descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY (1989) e em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et ai., Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987).

Na preparação de um cassete de expressão, vários fragmentosde DNA podem ser manipulados de modo a obter-se uma seqüência denucleotídeos que convenientemente seja interpretada na direção correta e sejaequipada com uma matriz de leitura correta. Para ligar os fragmentos de DNAentre si, adaptadores ou ligadores podem ser ligados aos fragmentos.

Os promotores e as regiões terminadoras convenientementepodem ser fornecidas na direção da transcrição com um ligador ou poliligadorcompreendendo um ou mais sítios de restrição para a introdução destaseqüência. Geralmente, o ligador tem de 1 a 10, principalmente 1 a 8,preferivelmente 2 a 6, sítios de restrição. Em geral, o tamanho do ligadordentro da região reguladora é menor do que 100 pares de base,freqüentemente menor do que 60 pares de base, porém pelo menos 5 pares debase. O promotor pode ser tanto nativo quanto homólogo, assim comoestranho ou heterólogo à planta hospedeira. Na direção de 5'-3' datranscrição, o cassete de expressão compreende o promotor, uma seqüência deDNA que codifica para um gene da Δό-dessaturase e uma região para aterminação da transcrição. Regiões de terminação diferentes podem sersubstituídas por uma outra em qualquer forma desejada.

Na preparação de um cassete de expressão, vários fragmentosde DNA podem ser manipulados a fim de se obter uma seqüência denucleotídeos que convenientemente seja interpretada na direção correta e sejaequipada com uma matriz de leitura correta. Para ligar os fragmentos de DNA(= ácidos nucleicos de acordo com a invenção) entre si, adaptadores ouligadores podem ser ligados aos fragmentos.

O promotor e as regiões terminadoras convenientementepodem ser fornecidas na direção da transcrição com um ligador ou poliligadorcompreendendo um ou mais sítios de restrição para a introdução destaseqüência. Geralmente, o ligador tem de 1 a 10, principalmente 1 a 8,preferivelmente 2 a 6, sítios de restrição. Em geral, o tamanho do ligadordentro da região reguladora é menor do que 100 pares de base,freqüentemente menor do que 60 pares de base, porém pelo menos 5 pares debase. O promotor pode ser tanto nativo quanto homólogo, assim comoestranho ou heterólogo à planta hospedeira. Na direção de 5'-3' datranscrição, o cassete de expressão compreende o promotor, uma seqüência deDNA que codifica para um gene da Δό-dessaturase e uma região para aterminação da transcrição. Regiões de terminação diferentes podem sersubstituídas por uma outra em qualquer forma desejada.

As seqüências de DNA codificando para duas Δό-dessaturasesdas Primula cortusoid.es ou Primula lutoides compreendem todas ascaracterísticas de seqüência necessárias para se obter a localização correta dosítio da biossíntese de ácido graxo, lipídeo ou óleo. Conseqüentemente,nenhuma outra seqüência alvo é necessária por si. Entretanto, uma tallocalização pode ser desejável e vantajosa e, daí, artificialmente modificadaou intensificada de modo que tais construções de fusão sejam também umaforma de realização vantajosa preferida da invenção.

Especialmente preferidas são as seqüências que garantem oalvejamento dentro dos plastídeos. Sob certas circunstâncias, o alvejamentodentro de outros compartimentos (relatado em: Kermode, Crit. Rev. Plant Sei.15,4 (1996), 285-423) pode também ser desejável, por exemplo dentro dovacúolo, do mitocôndrio, do retículo endoplasmático (ER), dos peroxissomos,estruturas lipídicas ou, por causa da falta de seqüências operativascorrespondentes, a retenção no compartimento de origem, o citossol.Vantajosamente, as seqüências de ácido nucleico de acordocom a invenção, junto com pelo menos um gene repórter, são clonadas dentrode um cassete de expressão, o qual é introduzido no organismo através de umvetor ou diretamente no genoma. Este gene repórter deve permitir fácilpossibilidade de detecção através de um cultivo, fluorescência, química,bioluminescência ou ensaio de resistência ou através de uma mediçãofotométrica. Exemplos de genes repórteres que podem ser mencionados sãoos genes de resistência a antibióticos ou a herbicidas, os genes de hidrolase,os genes proteicos de fluorescência, os genes de bioluminescência, os genesmetabólicos do açúcar ou nucleotídeos, ou os genes da biossíntese tais como ogene Ura3, o gene Ilv2, o gene da luciferase, o gene da α-galactosidade, ogene gfp, o gene da 2-desoxiglicose-6-fosfato fosfatase, o gene da β-glicuronidase, o gene da β-lactamase, o gene da neomicina fosfotransferase, ogene de higromicina fosfotransferase ou o gene BASTA (= resistência aglifosinato). Estes genes permitem fácil medição e quantificação da atividadede transcrição e, daí, da expressão dos genes. Desta maneira, podem seridentificadas as posições dos genomas que apresentem produtividadediferente.

Em uma forma de realização preferida um cassete deexpressão compreende a montante, isto é na extremidade 5' da seqüênciacodificadora, um promotor, e a jusante, isto é, na extremidade 3', um sinal depoliadenilação e, opcionalmente, outros elementos reguladores que sejamoperavelmente ligados à seqüência codificadora interveniente para aseqüência de Δό-dessaturase e/ou DNA Δό-dessaturase. Por uma ligaçãooperável denota-se a disposição seqüencial do promotor, da seqüênciacodificadora, do terminador e, opcionalmente, outros elementos reguladoresde uma maneira tal que cada um dos elementos reguladores possa preenchersua função na expressão da seqüência codificadora na maneira devida. Asseqüências preferidas para a ligação operável são as seqüências dealvejamento para garantir a localização subcelular nos plastídeos. Entretanto,se necessário, as seqüências de alvejamento para garantir a localizaçãosubcelular no mitocôndrio, no retículo endoplasmático (= ER), no núcleo, noscorpos oleosos ou em outros compartimentos, podem também serempregadas, como o podem os promotores de translação tais como aseqüência condutora de 5' do vírus mosaico do tabaco (Gallie et al., Nucl.Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Um cassete de expressão pode, por exemplo, compreender umpromotor constitutivo (preferivelmente o promotor USP ou napin), o gene aser expresso e o sinal de retenção de ER. Quanto ao sinal de retenção de ER, aseqüência de aminoácidos KDEL (lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico,leucina) é preferivelmente empregada.

Quanto à expressão em um organismo hospedeiro procarióticoou eucariótico, por exemplo um microorganismo tal como um fungo ou umaplanta, a construção de genes é vantajosamente introduzida em um vetor talcomo, por exemplo, um plasmídeo, um fago ou outro DNA que torne possívela expressão ótima dos genes no organismo hospedeiro. Exemplos deplasmídeos adequados são: em E. coli pLG338, pACYC184, série pBR talcomo, por exemplo, pBR322, série pUC tal como pUC18 ou pUC19, sérieM113mp, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200,pUR290, pIN-III113-B 1, λgtll ou pBdCI, em Streptomyees pIJlOl, pIJ364,pIJ702 ou pIJ361, em Baeillus pUBllO, pC194 ou pBD214, emCorynebaeterium pSA77 ou pAJ667; em fungos pALSl, pIL2 ou pBB116;outros vetores fungicos vantajosos são descritos por Romanos, M. A. et ai.,[(1992) uForeign gene expression inyeast: a review", Yeast 8: 423-488] e porvan den Hondel, C. A. M. J. J. et al. [(1991) iiHeterologous gene expressionin filamentous fungf e em More Gene Manipulations in Fungi [J. W. Bennete L. L. Lasure, eds., pp. 396-428: Academic Press: San Diego] e em iiGenetransfer systems and veetor development for filamentous fungf [van denHondel5 C. Α. Μ. J. J. e Punt, Ρ. J. (1991) em: Applied Molecular Genetics ofFungi, Peberdy, J. F. et ai., eds., pp. 1-28, Cambridge University Press:Cambridge]. Exemplos de promotores vantajosos de levedura são os 2μΜ,pAG-1, YEp6, YEp 13 ou pEMBLYe23. Exemplos de promotores algáceos oude plantas são os pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pVKH ou pDH51(ver Schmidt, R. e Willmitzer, L., 1988). Os vetores identificados acima ouderivados dos vetores identificados acima, são uma pequena seleção dosplasmídeos possíveis. Outros plasmídeos são bem conhecidos daqueleshabilitados na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, no livroCloning Vectors (Eds. Pouwels Ρ. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018). Vetores de plantas adequados sãodescritos, inter alia, em iiMethods in Plant Molecular Biology andBiotechnology" (CRC Press), Ch. 6/7, pp. 71-119. Vetores vantajosos sãoconhecidos como vetores de transporte ou vetores binários, os quais replicamem E. coli e Agrobacterium.

Por vetores denotam-se, com exceção dos plasmídeos, todos osoutros vetores conhecidos daqueles habilitados na técnica, tais como, porexemplo, fagos, vírus tais como SV40, CMV, baculovírus, adenovírus,transpósons, elementos IS, fasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, DNA linear oucircular. Estes vetores podem ser replicados autonomamente no organismohospedeiro ou ser cromossomicamente replicados, a replicação cromossômicasendo a preferida.

Em uma outra forma de realização do vetor, o cassete deexpressão de acordo com a invenção pode também vantajosamente serintroduzido nos organismos na forma de um DNA linear e ser integrado nogenoma do organismo hospedeiro por meio de recombinação heteróloga ouhomóloga. Este DNA linear pode ser composto de um plasmídeo linearizadoou apenas do cassete de expressão como vetor ou das seqüências de ácidonucleico de acordo com a invenção.Em uma outra forma de realização vantajosa, a seqüência deácido nucleico de acordo com a invenção também pode ser introduzida em umorganismo por si própria.

Se, além da seqüência de ácido nucleico de acordo com ainvenção, outros genes tiverem de ser introduzidos no organismo, todospodem ser introduzidos no organismo conjuntamente com um gene repórterem um vetor único, ou cada gene único com um gene repórter em um vetor,em cada caso sendo possível para diferentes vetores serem introduzidossimultaneamente ou em sucessão.

O vetor vantajosamente compreende pelo menos uma cópiadas seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção e/ou a construçãode genes de acordo com a invenção.

Como exemplo, o cassete de expressão da planta pode serinstalado no vetor de transformação pRT [(a) Toepfer et al., 1993, MethodsEnzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 eseguintes).

Alternativamente, um vetor recombinante (= vetor deexpressão) pode também ser transcrito e transladado in vitro, por exemplopelo uso do promotor T7 e da RNA T7 polimerase.

Os vetores de expressão empregados nos procariotasfreqüentemente fazem uso dos sistemas indutíveis com e sem proteínas defusão ou oligopeptídeos de fusão, em que estas fusões podem resultar tanto namaneira N-terminal e C-terminal ou em outros domínios úteis de umaproteína. Tais vetores de fusão usualmente têm as seguintes finalidades: i.)aumentar o índice de expressão do RNA; ii.) aumentar o índice da sínteseprotéica que pode ser obtida; iii.) aumentar a solubilidade da proteína; iv.) ousimplificar a purificação por meio de uma seqüência de ligação que possa serusada para cromatografia de afinidade. Os sítios de clivagem proteolítica sãotambém freqüentemente introduzidos através das proteínas de fusão quepossibilitam a clivagem de uma porção da proteína de fusão e purificação.Tais seqüências de reconhecimento para as proteases reconhecidas são, porexemplo, o fator Xa, a trombina e a enterocinase.

Vetores típicos de fusão e de expressão vantajosos são opGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. e Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia,Piscataway, NJ) que contém glutationa S-transferase (GST), proteína deligação da maltose ou proteína A.

Outros exemplos de vetores de expressão de E. coli são o pTrc[Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315] e os vetores pET [Studier et al.,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,San Diego, Califórnia (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Países Baixos].

Outros vetores vantajosos para uso na levedura são oρYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan eHerskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene54: 113-123), e derivados de pYES (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).Vetores para uso em fungos filamentosos são descritos em: van den Hondel,C. A. M. J. J. e Punt, P. J. (1991) iiGene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungf\ em: Applied Molecular Genetics ofFungi, J. F. Peberdy et al., eds., pp. 1-28, Cambridge University Press:Cambridge.

Alternativamente, os vetores de expressão de células de insetospodem também ser vantajosamente utilizados, por exemplo para expressão emcélulas Sf 9. Estes são, por exemplo, os vetores da série pAc (Smith et al.(1983) Mol Cell Biol. 3: 2156-2165) e da série pVL (Lucklow e Summers(1989) Virology 170: 31-39).

Além disso, as células de plantas ou as células algais podemvantajosamente ser usadas para expressão de genes. Exemplos de vetores deexpressão de plantas podem ser encontrados em Becker, D. et al. (1992) "Newplant binary vectors with selectable markers located. proximal to the Ieftborder", Plant Mol Biol. 20: 1195-1197 ou em Bevan, M. W. (1984) iiBinaryAgrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Aeid. Res. 12: 8711-8721.

Outros sistemas de expressão procariótica e eucariótica são

mencionados nos Capítulos 16 e 17 em Sambrook et ai, Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY5 1989.

A introdução dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção,do cassete de expressão ou do vetor nos organismos, por exemplo nas plantas,pode, em princípio, ser realizada por todos os métodos conhecidos daqueleshabilitados na técnica.

No caso dos microorganismos, aqueles habilitados na técnicapode encontrar métodos apropriados nos livros de texto por Sambrook, J. etal. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, por F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols inmolecular biology, John Wiley and Sons, por D. M. Glover et al., DNACloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), por Kaiser et al.(1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ouGuthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods inEnzymology, 1994, Academic Press.

A transferência dos genes estranhos no genoma de uma plantaé denominada de transformação. Para este fim, os métodos descritos para atransformação e regeneração das plantas a partir dos tecidos das plantas oudas células das plantas, são utilizados para transformação transiente ouestável. Métodos adequados são a transformação de protoplasto por absorçãode DNA induzida por poli(etileno glicol), o método biolístico com o uso dapistola de genes - referido como método de bombardeamento de particular,eletroporação, a incubação dos embriões secos em DNA - compreendendosolução, microinjeção e transferência de genes mediada pela Agrobaeterium.Referidos métodos são descritos como exemplos em B. Jenes et al,Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineeringand Utilization, eds. S. D. Kung e R. Wu5 Academic Press (1993) 128-143 eem Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225.A construção a ser expressa é preferivelmente clonada em um vetor que sejaadequado para transformar a Agrobacterium tumefaeiens, por exemplopBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). A Agrobaeteriatransformada por um tal vetor pode então ser usada de uma maneiraconhecida para a transformação das plantas, em particular de plantas decolheita como, por exemplo, plantas de tabaco, por exemplo banhando-se asfolhas socadas ou os segmentos de folhas em uma solução agrobacteriana edepois cultivando-os em meios adequados. A transformação das plantas pormeio da Agrobacterium tumefaeiens é descrita, por exemplo, por Hõfgen eWillmitzer em Nuel Aeid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida inter alia de F.F. White, Veetors for Gene Transfer nas eds. S. D. Kung e R. Wu, AcademicPress, 1993, pp. 15-38.

Nas plantas, os métodos descritos para a transformação eregeneração das plantas a partir dos tecidos das plantas ou das células dasplantas, são usados para transformação transiente ou estável. Métodosadequados são, como descrito acima, principalmente a transformação deprotoplasto por absorção de DNA induzida por poli(etileno glicol), o métodobiolístico com o uso da pistola de genes conhecido como o método de"bombardeamento de partículas", eletroporação, a incubação dos embriõessecos em solução compreendendo DNA, e microinjeção.

Além destas técnicas de transformação "direta", umatransformação pode também ser realizada por infecção bacteriana por meio daAgrobaeterium tumefaeiens ou Agrobaeterium rhizogenes e transferência dosplasmídeos Ti recombinantes adequados ou plasmídeos Ri, ou por infecçãocom os vírus de plantas transgênicas. A transformação mediada pelaAgrobacterium é mais bem adequada às células de plantas dicotiledôneas. Osmétodos são descritos, por exemplo, em Horsch, R. B. et ai. (1985) Science225: 1229 e seguintes.

Se as agrobactérias forem usadas, o cassete de expressão deveser integrado em plasmídeos específicos, ou em um vetor de transporte, ouintermediário, ou em um vetor binário. Se um plasmídeo Ti ou Ri deva serusado para a transformação, pelo menos o bordo direito, mas na maioria doscasos os bordos direito e esquerdo, do T-DNA do plasmídeo Ti ou Ri, sãoligados com o cassete de expressão a ser introduzido na região de flanqueio.

E preferível usar vetores binários. Os vetores binários sãocapazes de replicar tanto em E. coli quanto em Agrobacterium. Por via deregra, eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligador oupoliligador flanqueado pela seqüência de bordo de T-DNA direito e esquerdo.Eles podem ser transformados diretamente na Agrobacterium [Holsters et al.(1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). O gene marcador de seleção permiteuma seleção das agrobactérias transformadas e é, por exemplo, o gene nptll, oqual medeia a resistência à canamicina. A Agrobacterium que atua neste casocomo organismo hospedeiro deve já compreender um plasmídeo com a regiãovir. Esta região é necessária para a transferência do T-DNA para a célula dasplantas. Uma Agrobacterium transformada assim pode ser usada para atransformação das células das plantas. O uso do T-DNA para a transformaçãodas células das plantas foi estudado e descrito amplamente [EP 120 516;Hoekema, em: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam, Capítulo V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287). Váriosvetores binários são conhecidos, e alguns deles acham-se comercialmentedisponíveis, tais como, por exemplo, pBI101.2 ou pBIN19 (ClontechLaboratories, Inc. USA).

As agrobactérias transformadas por um vetor de expressão deacordo com a invenção podem, da mesma forma, ser usadas de uma maneiraconhecida para a transformação das plantas, tais como as plantas de testecomo a Arabidopsis ou as plantas de colheita tais como a canola, o linho ou acolza, por exemplo banhando-se as folhas socadas ou os segmentos de folhasem uma solução agrobacteriana e depois cultivando-os em meios adequados.Plantas que são especialmente adequadas para a produção do ácido γ-linolênico e/ou ácido estearidônico são plantas das famílias Brassicaceae ouLinaceae. Os gêneros Brassica, Camelina ou Linum são em especialvantajosamente adequados para a produção de ácido γ-linolênico e/ou ácidoestearidônico com as seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção,vantajosamente em combinação com outras dessaturases e elongases.

As técnicas de transformação direta são adequadas paraqualquer organismo e tipo celular. No caso de injeção ou eletroporação doDNA ou RNA nas células de plantas, o plasmídeo usado não necessita atendera qualquer exigência particular. É possível usar plasmídeos simples, tais comoaqueles da série pUC. Se plantas intactas tiverem de ser regeneradas a partirdas células transformadas, é necessário que um gene marcador selecionáveladicional seja localizado no plasmídeo.

As células estavelmente transformadas, isto é, aquelas quecompreendem o DNA introduzido, integrado no DNA da célula hospedeira,podem ser selecionadas das células não transformadas quando um marcadorselecionável faça parte do DNA que tenha sido introduzido. Qualquer genepode atuar como marcador que, por exemplo, seja capaz de conferir umaresistência aos antibióticos ou herbicidas (tais como a canamicina, o G418, ableomicina, a higromicina ou a fosfinotricina e outros) (ver acima). As célulastransformadas que expressam um tal gene marcador são capazes de sobreviverna presença de concentrações de um antibiótico ou herbicida correspondentesque exterminem um tipo selvagem não transformado. Exemplos sãomencionados mais acima e compreendem, preferivelmente, o gene bar queconfere resistência ao herbicida fosfinotricina (Rathore, K. S. et al. (1993)Plant Mol Biol 21(5): 871-884), o gene nptll, que confere resistência àcanamicina, o gene hpt, que confere resistência à higromicina, ou o geneEPSP, que confere resistência ao herbicida glifosato. O marcador de seleçãopermite a seleção de células transformadas das células não transformadas(McCormick et ai. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). As plantas obtidaspodem ser produzidas e hibridizadas da maneira costumeira. Duas ou maisgerações devem ser cultivadas de modo a garantir que a integração genômicaseja estável e hereditária.

Os métodos acima mencionados são descritos, por exemplo,em Jenes, B. et ai. (1993) Techniques for Gene Transfer, em: TransgenicPlants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung e R. Wu,Academic Press, pp. 128-143, e Potrykus (1991) Annu Rev Plant PhysiolPlant Molec Biol 42: 205-225. A construção a ser expressa é de preferênciaclonada em um vetor que seja adequado para transformar a Agrobacteriumtumefaciens, por exemplo pBinl9 (Bevan et ai. (1984) Nucl Acids Res 12:8711 e seguintes).

Uma vez uma célula de planta transformada tenha sidoproduzida, é possível obter-se uma planta completa com o uso de métodosconhecidos daqueles habilitados. O material de partida, aqui, é, por exemplo,as culturas de calos. O desenvolvimento dos rebentos e da raiz destes, atéagora biomassas de células não diferenciadas, pode ser induzido da maneiraconhecida. As plantinhas obtidas podem ser transplantadas e cultivadas.

O técnico habilitado conhece tais métodos para regenerarpartes das plantas e plantas intactas das células de plantas. Os métodos quesão usados para estes fins são, por exemplo, os métodos descritos por Fennellet al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep.14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533. Outrosmétodos adequados podem ser encontrados nas publicações acimamencionadas por S. D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hõfgen e Willmitzer.

Os organismos transgênicos ou organismos hospedeiros para oácido nucleico de acordo com a invenção, as construções de genes ou o vetor,que sejam adequados em princípio, são, vantajosamente, todas as plantas dasfamílias Brassicaceae ou Linaeeae, que são capazes de sintetizar ácidosgraxos, ácidos graxos especificamente insaturados, e/ou que sejam adequadospara a expressão dos genes recombinantes. Exemplos que podem sermencionados são plantas tais como a Arabidopsis, a colza, Camelina,mostarda ou linho. Plantas que são naturalmente capazes de sintetizarquantidades substanciais de óleos são preferidas.

Uma planta transgênica para os fins da invenção é entendidacomo significando que os ácidos nucleicos usados no método não se achamem sua localização natural no genoma da planta, sendo possível quanto aosácidos nucleicos serem expressos homóloga ou heterologamente. Entretanto,transgênico também significa que, enquanto os ácidos nucleicos de acordocom a invenção estão em sua posição natural no genoma da planta, aseqüência foi modificada com respeito à seqüência natural, e/ou que asseqüências reguladoras das seqüências naturais foram modificadas.Transgênico é preferivelmente entendido como significando a expressão dosácidos nucleicos de acordo com a invenção em uma localização não naturalno genoma, isto é, a expressão homóloga ou, preferivelmente, a heterólogados ácidos nucleicos ocorre.

"Transgênico", assim, significa, por exemplo, com respeito auma seqüência de ácido nucleico, uma construção de genes ou um vetorcompreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifique para Δ6-dessaturase ou seus derivados, ou um organismo transformado com estaseqüência de ácido nucleico, um cassete de expressão ou um vetor, todasaquelas construções que tenham passado como o resultado dos métodos daengenharia genética, nos quais oua) a seqüência de ácido nucleico de Δό-dessaturase, ou

b) uma seqüência de controle genético que sejaoperavelmente ligada à seqüência de ácido nucleico de Δ6-dessaturase, porexemplo um promotor, ou

c) (a) e (b)

não sejam localizados em seu ambiente genético natural outenham sido modificados pelos métodos da engenharia genética, sendopossível quanto à modificação ser, por exemplo, uma substituição, adição,supressão, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeos.Ambiente genético natural significa a localização cromossômica natural noorganismo de origem, ou a existência em uma biblioteca genômica. No casode uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da seqüência deácido nucleico é preferivelmente retido pelo menos em parte. O ambienteflanqueia a seqüência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem umcomprimento de seqüência de pelo menos 50 pares de base, preferivelmentede pelo menos 500 pares de base, especialmente preferível de pelo menos1000 pares de base, muito especialmente preferível de pelo menos 5000 paresde base.

A invenção além disso diz respeito ao uso de um cassete deexpressão compreendendo seqüências de DNA codificando para um gene deΔό-dessaturase, ou seqüências de DNA a ele hibridizando, para atransformação de células de plantas, tecidos de plantas ou partes de plantas. Afinalidade do seu uso é aumentar o conteúdo de ácidos graxos, óleos oulipídeos com um conteúdo aumentado de ligações duplas na posição Δ6.

Neste contexto, e dependendo da escolha do promotor, aexpressão do gene de Δ6-dessaturase pode ser efetuada especificamente nasfolhas, nas sementes, nos tubérculos, ou em outras partes da planta. Apresente invenção além disso diz respeito a plantas transgênicas tais quesobreproduzem ácidos graxos, óleos ou lipídeos com ligações duplas Δ6, aseu material de propagação, e às suas células de plantas, tecido de plantas oupartes da planta. Uma matéria objeto preferida de acordo com a invenção sãoplantas transgênicas das famílias Brassicaceae ou Linaeeae contendo umaseqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção, uma construção degenes de acordo com a invenção, ou um vetor de acordo com a invenção.

Dentro do escopo da presente invenção, o aumento doconteúdo de ácidos graxos, óleos ou lipídeos com ligações duplas Δ6,significa, por exemplo, a capacidade artificialmente adquirida de umdesempenho biossintético aumentado mediante a sobrexpressão funcionaldo(s) gene(s) da Δό-dessaturase (para os fins da invenção, o singular tambéminclui o plural, e vice-versa) nas plantas transgênicas de acordo com ainvenção através das plantas iniciais que não tenham sido o objeto demodificação pela engenharia genética, pelo menos pela duração de pelomenos uma geração da planta.

A localização da biossíntese dos ácidos graxos, óleos oulipídeos, por exemplo, é geralmente a semente ou camadas celulares dasemente, de modo que uma expressão específica da semente do gene de Δ6-dessaturasse seja significativa. No entanto, é óbvio que a biossíntese dosácidos graxos, óleos ou lipídeos não necessita ser restrita ao tecido dasemente, mas pode também ter lugar de uma maneira específica do tecido emtodas as partes remanescentes da planta, por exemplo nas células epidérmicasou nos tubérculos.

Além disso, a expressão constitutiva do gene exógeno da Δ6-dessaturase é vantajosa. Entretanto, a expressão indutível pode tambémparecer desejável, por outro lado.

A eficácia da expressão do gene de Δό-dessaturase pode serdeterminada, por exemplo in vitro, pela propagação do meristema do broto.Além disso, uma expressão do gene de Δό-dessaturase que seja modificadaem termos de nível e extensão, e o efeito de uma tal expressão sobre odesempenho biossintético do ácido graxo, óleo ou lipídeo, pode ser testadoem experiências de estufas, com o uso de plantas de teste.

A invenção, além disso, diz respeito a:métodos de transformar uma planta das famíliasBrassicaceae ou Linaeeae, os quais compreendem introduzir cassetes deexpressão de acordo com a invenção compreendendo a seqüência de genes deΔ6-dessaturase da Primulaeeae, ou seqüências de DNA a ela hibridizando, emuma célula de planta, em tecido de calo, em uma planta intacta ou emprotoplastos da planta.

O uso de uma seqüência de genes de DNA de Δό-dessaturase, ou de seqüências de DNA a ela hibridizando, para a geração deplantas com um conteúdo aumentado de ácidos graxos, óleos ou lipídeos comligações duplas Δ6 como o resultado da expressão desta seqüência de DNA deΔ6-dessaturase nas plantas.

Proteínas compreendendo as seqüências de aminoácidosapresentadas nas SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

O uso das proteínas com as seqüências SEQ ID NO: 2 ouSEQ ID NO: 4 para a produção de ácidos graxos insaturados.

A invenção é ilustrada em maiores detalhes pelos exemplos

que seguem:

Exemplos

Exemplo 1: Métodos gerais de clonagem

Os métodos de clonagem, tais como, por exemplo, asclivagens de restrição, a eletroforese em gel de agarose, a purificação defragmentos de DNA, a transferência de ácidos nucleicos para a nitrocelulose eas membranas de náilon, articulação dos fragmentos de DNA, transformaçãodas células de Eseheriehia eoli, cultura de bactérias e análise de seqüências doDNA recombinante, foram realizados como descrito em Sambrook et ai.(1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).Exemplo 2: Análise de seqüências de DNA recombinante

A seqüenciação das moléculas recombinantes de DNA foi feitacom o uso de um seqüenciador de DNA de fluorescência a laser da ABI, pelométodo de Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467). Os fragmentos resultantes de uma reação em cadeia da polimeraseforam seqüenciados e conferidos para prevenir erros da polimerase nasconstruções a serem expressas.

Exemplo 3: Clonagem das dessaturases específicas de pufa da Primulacortusoides e Prímula lutóides.

Embora a maioria das plantas superiores (Angiospermae,Gymnospermaé) não sintetizem os ácidos graxos de Δό-dessaturados, osprecursores para a síntese de PUFA, as famílias Borafinaceae, Sacifragaceaee Primulaeeae compreendem espécies que acumulam este ácido graxo. Este éo porquê de os membros destas espécies serem material bruto para identificaras Δό-dessaturases.

Primula cortusoides e Primula lutóides (Eucariotas; Plantae,Traeheophyta, Angiospermae, Primulales, Primulaeeae) foram selecionadasposteriormente nos produtos A6-dessaturados da espécie, e aquiprincipalmente 18:4a6'9'12'15, o precursor do EPA, se acumula na semente. Paraisolar o DNA, as sementes foram obtidas da Chiltern Seeds, Cumbria, ReinoUnido, e cultivadas sob as seguintes condições:

Antes da semeadura, as sementes foram embebidas por pelomenos 3 horas em água fria. As sementes foram semeadas sobre adubo devaso com 20% de areia, espaçadas em pelo menos 1 cm. Sob o adubo, foicolocada uma camada de Perlita (1/3 em volume em relação ao adubo). Apósa semeadura, as sementes foram cobertas com Perlita, regadas generosamentepor cima e mantidas sob condições o dia inteiro (16 horas de luz, 100 μΕιη-2s-l, 21°C, 8 horas da noite, 17°C).

O RNA total foi extraído como descrito em Sayanova et al.1997, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 4211-4216. O cDNA de primeirofilamento foi sintetizado partindo-se do RNA total por meio do Kit deAmplificação de cDNA SMART RACE (Clontech) seguindo-se as instruçõesdo fabricante.

Para identificar novos genes da dessaturase, os seguintesiniciadores degenerados foram empregados para a amplificação:Degl:

5'- GGITCA(C/T)GA(T/C) (T/G/A)(C/G)IGGICA(C/T)TA-3'Deg2:

5'-CC(A/G)TCIGT(A/G)T(T/G)IA(G/A)IGC(T/C)TCCCA-3'

As seguintes condições foram usadas para a amplificação:2 minutos a 95°C, seguidos por 30 ciclos de 30 segundos em94°C, 30 segundos em 55 a 72°C. Finalmente, o alongamento foi realizadopor 10 minutos em 72°C. Amplicons de PCR foram clonados em pGEM-T(Promega) seguindo-se as instruções do fabricante, e seqüenciados. Para estefim, os iniciadores que eram específicos dos genes nas extremidades 5' e 3'foram sintetizados e amplificados iniciando-se do cDNA. Em cada caso, umaseqüência com similaridade aos genes da dessaturase foi identificada.

<table>table see original document page 48</column></row><table>

Exemplo 4: Clonagem dos plasmídeos de expressão para a expressãoheteróloga dos P. cortusoides e P. Iutoides nas leveduras

Para a expressão heteróloga nas leveduras, as seqüênciascorrespondentes foram amplificadas através de PCR, usando-se iniciadoresespecíficos adequados, e clonadas no vetor de expressão de levedura pYES2(Invitrogen) através de KpnI-SacI. Assim procedendo, exclusivamente asmatrizes de leitura aberta dos genes que codificaram para as proteínas PUFAforam amplificadas. Além disso, uma seqüência de restrição para KpnI e umaseqüência Kozak (Cell 1986, 44: 283-292) foi ligada na extremidade 5' e umaseqüência de restrição para Sacl foi ligada na extremidade 3'.<table>table see original document page 49</column></row><table>

Composição da mistura de PCR (50 μl):

5,00 μl de cDNA gabarito.

5,00 μl IOx tampão (polimerase Advantage) + MgCl2 25 mM

5,00 μl dNTP 2 mM

1,25 μl de cada iniciador (10 pmoles/μl do iniciador 5'-ATG edo 3' - Stopp)

0,50 μl da polimerase Advantage

A polimerase Advantage da Clontech é empregada.

Condições da reação de PCR:

Temperatura de recozimento: 1 minuto a 55°C

Temperatura de desnaturação: 1 minuto a 94°C

Temperatura de alongamento: 2 minutos a 72°C

Número de ciclos: 35

Os produtos da PCR e o vetor pYES2 foram incubados poruma hora em 37°C com as enzimas de restrição Kpnl e Saci, e a reação deligação foi realizada por meio do Kit de Ligação Rápida (Roche), seguindo-seas instruções do fabricante. As reações de incubação foram entãotransformadas nas células DH5a de E. coli (Invitrogen), seguindo-se asinstruções do fabricante. Os clones positivos foram identificados por PCR(ver a reação acima), e o DNA plasmídeo foi isolado (Qiagen Dneasy). Osplasmídeos resultantes pYCortó e pYLutó foram verificados por seqüenciaçãoe transformados a cepa W303-1A de Saccharomyces por meio do método deacetato de lítio. O pYES2 (vetor em branco) foi transformado em paralelopara fins de controle. As leveduras transformadas foram selecionadas emplacas de ágar de meio mínimo completo (CMdum) suplementadas com 2%de glicose, porém sem uracil.

Quanto à expressão dos genes de P. cortusoides e P. lutoides,as pré-culturas, em cada caso, de 5 ml de meio líquido CMdum suplementadocom 2% (p/v) de rafinose, mas sem uracil, foram primeiro inoculadas, emcada caso, com um transformante selecionado e incubadas por 2 dias a 30°C,200 rpm.

Depois, 5 ml de meio líquido CMdum (sem uracil)suplementado com 2% de rafinose e 300 μΜ dos vários ácidos graxos, foraminoculados com as pré-culturas a uma ODgoo de 0,05. A expressão foiinduzida pela adição de 2% (p/v) de galactose. As culturas foram incubadasem 22°C por outras 96 horas.

Exemplo 5: Clonagem de plasmídeos de expressão para expressão nas plantas

Quanto à transformação das plantas, outros vetores detransformação com base nos vetores de Agrobacterium Binários pBIN19-35S(Bevan, M. (1984) Binary Agrobacterium veetors for plant transformation.Nucl. Aeids Res. 18: 203) foram gerados. Para este fim, os sítios de clivagemBamHl-Xbal foram introduzidos nas extremidades 5' e 3' da seqüência decodificação, usando-se os seguintes pares de iniciadores:

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Composição da mistura da PCR (50 μl):

5,00 μl de cDNA gabarito.

5,00 μl IOx tampão (polimerase Advantage) + MgCl2 25 mM

5,00 μl dNTP 2 mM

1,25 μl de cada iniciador (10 pmoles/μl)0,50 μl da polimerase AdvantageA polimerase Advantage da Clontech é empregada.Os produtos da PCR e o vetor pBinl9-35S foram incubadospor uma hora a 37°C com as enzimas de restrição BamHl e Xbal, e a reaçãode ligação foi realizada por meio do Kit de Ligação Rápida (Roche) seguindo-se as instruções do fabricante. As rações de incubação foram entãotransformadas nas células DH5a de E. coli (Invitrogen) seguindo-se asinstruções do fabricante. Os clones positivos foram identificados por PCR(ver a reação acima), e o DNA plasmídeo foi isolado (Qiagen Dneasy). Osplasmídeos resultantes pBIN-Cortó e pBIN-Lutó foram então transformadosna Agrobacterium tumefaciens GC3101 por eletroporação e plaqueados sobreplacas de ágar com 2% de meio YEB + canamicina. As células tolerantes àcanamicina foram selecionadas e empregadas para a transformação daArabidopsis thaliana.Exemplo 6: Expressão dos genes P. cortusoides e P. Iutoides nas leveduras

As leveduras que haviam sido transformadas com o plasmídeopYES ou os plasmídeos pYES-Cortó e pYES-Lutó, conforme o Exemplo 4,foram analisadas como segue:

As leveduras originárias das culturas principais foram colhidaspor centrifugação (100 χ g, 5 minutos, 20°C) e lavadas com NaHCO3 100mM, pH 8,0 a fim de remover o meio residual e os ácidos graxos. Os ésteresmetílicos de ácidos graxos (FAMEs) foram preparados dos sedimentoscelulares da levedura mediante metanólise ácida. Para este fim, os sedimentoscelulares foram incubados por 1 hora em 80°C com 2 ml de um ácidosulfurico metanólico INe 2% (v/v) de dimetoxipropano. Os FAMEs foramextraídos por duas extrações com éter de petóleo (PE) (benzina). Pararemover ácidos graxos não derivados, as fases orgânicas foram lavadas emcada caso uma vez com 2 ml de NaHCO3 100 mM, pH 8,0, e 2 ml de águadestilada. Depois disso, as fases PE foram secadas com Na2SO4, evaporadassob argônio e absorvidas em 100 μΐ de PE. As amostras foram separadas emuma coluna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 μηι, Agilent) em umcromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6850 equipado comdetector deionização a chama. As condições para a análise de GLC foram as seguintes: atemperatura do forno foi programada de 50°C a 250°C com uma velocidadede 5°C/minuto e, finalmente, por 10 minutos a 250°C (contenção).

Os sinais foram identificados por comparação dos tempos deretenção com os padrões correspondentes de ácidos graxos (Sigma). Ametodologia é descrita, por exemplo, em Napier e Michaelson, 2001, Lipids.36(8): 761-766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany.52(360): 1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch Biochem. Biophys. 388(2):293-298 e Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3): 215-218.

Exemplo 7: Caracterização funcional

A atividade e a especificidade do substrato dos genesindividuais foram determinadas pela expressão e alimentação dos váriosácidos graxos. A especificidade do substrato das dessaturases pôde serdeterminada após expressão nas leveduras pela alimentação por meio devários ácidos graxos. As descrições para a determinação das atividadesindividuais podem ser encontradas nas WO 93/11245, WO 94/11516, WO93/06712, U.S. 5.614.393, U.S. 5.614.393, WO 96/21022, WO 0021557 eWO 99/27111, Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 para as Δ4-dessaturases, Hong et al. 2002, Lipids 37, 863-868 para as A5-dessaturases.

a) Caracterização de Cort6:

A construção pYES-Cort6 foi testada em levedura pelaalimentação de vários ácidos graxos. Surpreendentemente, foi possíveldemonstrar nesta experiência que novos ácidos graxos foram formados apósalimentação com os ácidos graxos 18:2Δ9'12 e 18:3a9'12'15 (figura 1).

Figura 1: Análise cromatográfica gasosa das leveduras quecompreendem o plasmídeo pYCortó e que foram alimentados a 18:2. O ácidograxo recém-formado é γ18:3Δ6'9'12 (ácido γ-linolênico = GLA).

Como o resultado do ácido graxo recém-formado, umaatividade de Δό-dessaturase foi detectada para Cortó. Aqui, a enzima foicapaz de utilizar 18:2 e 18:3 como seu substrato.

b) Caracterização de Lut6:

Surpreendentemente, foi demonstrado, após a alimentação de18:3, que Lut6 tem uma atividade de Δό-dessaturase (figura 2).

Figura 2: O padrão do ácido graxo das leveduras foitransformado com a construção pYLutó e alimentação do ácido graxo18:3a9'12'15. Os ácidos graxos correspondentes foram identificados. O DAS(ácido estearidônico) corresponde a 18:4a6'9'12'15.

Assim, a atividade de Lutó corresponde à atividade de umaΔό-dessaturase.

Exemplo 8: Geração das plantas transgênicasa) Geração das plantas de colza transgênicas (modificadas de acordo comMoloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8: 238-242)

Para gerar plantas de colza transgênicas, os vetores binárioscomo os plasmídeos pBIN-35S gerados no exemplo 5 foram transformadosdentro da Agrobacterium tumefaciens GC3101 (Deblaere et al., 1984, Nucl.Aeids. Res. 13, 4777-4788). Para transformar as plantas de colza (cv. Drakkar,NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemanha), uma diluição a1:50 de uma cultura noturna de uma colônia agrobacteriana positivamentetransformada em meio de Murashige-Skoog (Murashige e Skoog 1962Physiol. Plant. 15, 473) suplementada com 3% de sacarose (meio 3MS) foiusada. Pecíolos ou hipocotilédones das plantas de colza estéreis recém-germinadas (cada uma de aproximadamente 1 cm ) foram incubados em umaplaca de Petri com uma diluição agrobacteriana a 1:50 por 5 a 10 minutos.Isto foi seguido por co-incubação de 3 dias no escuro em 25 0C em meio 3 MSsuplementado com 0,8% de ágar Bacto. Após 3 dias, o cultivo continuou com16 horas de luz/8 horas de escuridão e em um ciclo semanal no meio MSsuplementado com 500 mg/l de Claforan (cefotaxima sódica), 50 mg/l decanamicina, 20 microM de benzilaminopurina (BAP) e 1,6 g/l de glicose. Osbrotos em cultivo foram transferidos para meio MS suplementado com 2% desacarose, 250 mg/l de Claforan e 0,8% de ágar Bacto. Se nenhuma raiz tivessesido formada após 3 semanas, o ácido 2-indolbutírico era adicionado ao meiocomo hormônio de crescimento para promover o enraizamento.

Os brotos regenerados foram obtidos no meio 2MSsuplementado com canamicina e Claforan, transferidos para o solo após oenraizamento e, após o cultivo, desenvolvidos por 2 semanas em uma câmarade ambiente controlado, levados à floração, as sementes maduras foramcolhidas e estudadas para expressão dos genes da dessaturase ou da elongasepor meio de análises de lipídeos conforme descrito, como exemplo, em Qiu etai. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566.b) Geração das plantas de linhaça transgênicas

As plantas de linhaça transgênicas podem ser geradas, porexemplo, pelo método de Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant.35(6): 456-465 por meio de bombardeamento de partículas. Astransformações mediadas pelas agrobactérias podem ser geradas, porexemplo, conforme descrito por Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report13: 282-285.

Exemplo 9: Extração do lipídeo das folhas

O efeito da modificação genética nas plantas, fungos, algas,ciliados ou na produção de um composto desejado (tal como um ácido graxo)pode ser determinado pelo cultivo dos microorganismos modificados ou daplanta modificada sob condições adequadas (tais como aquelas aqui descritasmais abaixo) e analisando-se o meio e/ou os componentes celulares quanto àprodução aumentada do produto desejado (isto é, dos lipídeos ou de um ácidograxo). Estas técnicas analíticas são conhecidas do técnico habilitado ecompreendem espectroscopia, cromatografia de camada fina, vários tipos demétodos de coloração, métodos enzimáticos e microbiológicos ecromatografia analítica, tal como a cromatografia líquida de alto desempenho(ver, por exemplo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2,pp. 89-90 e pp. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. et al., (1987)"Applications of HPLC in Biochemistry" em: Laboratory Teehniques inBioehemistry and Molecular Biology, Vol. 17; Rehm et al. (1993)Bioteehnology, Vol. 3, Capítulo III: iiProduct recovery and purification", pp.469-714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al. (1988) Bioseparations:downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. e Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, JohnWiley and Sons; Shaeiwitz, J. A. e Henry, J. D. (1988) BiochemicalSeparations, em: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3;Capítulo 11, pp. 1-27, VCH: Weinheim; e Dechow, F. J. (1989) Separationand purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Além dos métodos acima mencionados, os lipídeos das plantassão extraídos do material das plantas conforme descrito por Cahoon et al.(1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, e Browse et al.(1986) Analytic Biochemistry 152: 141-145. A análise qualitativa equantitativa dos lipídeos ou ácidos graxos é descrita em Christie, William W.,Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press LipidLibrary·, 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. APractical Guide - Ayr5 Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, p. 307{Oily Press Lipid Library·, 1); iiProgress in Lipid Research, Oxford:Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) sob o título: Progress in the Chemistryof Fats and Other Lipids CODEN.

Um exemplo é a análise de ácidos graxos (abreviaturas:FAME: éster metílico de ácido graxo; GC-MS, cromatografia gasosa-líquida/espectrometria de massa; TAG, triacilglicerol; TLC, cromatografia decamada fina).

A detecção não ambígua quanto à presença de produtos deácidos graxos, pode ser obtida pela análise de organismos recombinantes como uso de métodos analíticos padrão: GC, GC-MS ou TLC5 como descrito emvárias ocasiões por Christie e pelas referências nele citadas (1997, em:Advances on Lipid Methodology, Quarta Edição: Christie, Oily Press,Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren [Métodos de cromatografia gasosa/espectrometria de massa],Lipide 33: 343-353).

O material a ser analisado pode ser rompido por sonicação,moagem em um moinho de vidro, nitrogênio líquido e moagem ou através deoutros métodos aplicáveis. Após o rompimento, o material deve sercentrifugado. O sedimento é recolocado em suspensão em água destilada,aquecido por 10 minutos em 100°C, esfriado sobre gelo e re-centrifugado,seguido por extração por uma hora a 90°C em ácido sulfurico 0,5 M emetanol com 2% de dimetoxipropano, o que leva aos compostos de óleo elipídeo hidrolisados, o que resulta em lipídeos transmetilados. Estes ésteresmetílicos de ácido graxo são estraídos em éter de petróleo e finalmentesubmetidos a uma análise de GC usando-se uma coluna capilar (Chrompack,WCOTFused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mícrons, 0,32 mm) em um gradientede temperatura entre 170°C e 240°C por 20 minutos, e 5 minutos em 240°C.A identidade dos ésteres metílicos de ácido graxo deve ser definida com o usode padrões que estejam disponíveis em fontes comerciais (isto é, Sigma).

O material de plantas é inicialmente homogeneizado por meiosmecânicos mediante fragmentação com um almofariz e pilão para torná-lomais suscetível de extração. Isto é seguido por aquecimento a 100°C por 10minutos e após o resfriamento sobre gelo por re-sedimentação. O sedimentocelular é hidrolisado por uma hora a 90°C com ácido sulfurico metanólico 1M e 2% de dimetoxipropano, e os lipídeos são transmetilados. Os ésteresmetílicos de ácido graxo resultantes (FAMEs) são extraídos em éter depetróleo. Os FAMEs extraídos são analisados por cromatografia líquidagasosa com o uso de uma coluna capilar (Chrompack, WCOT Fused Silica,CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) e um gradiente de temperatura de 170°C a240°C em 20 minutos e 5 minutos a 240°C. A identidade dos ésteres metílicosde ácido graxo é confirmada por comparação com os padrões FAMEcorrespondentes (Sigma). A identidade e a posição da ligação dupla pode seranalisada ainda por derivação química adequada das misturas de FAME, porexemplo para dar derivados de 4,4-dimetoxioxazolina (Christie, 1998) pormeio de GC-MS.

Análise de plantas de Arabidopsis transgênicas que expressam Cort6:

As plantas que haviam sido transformadas como no exemplo 5com os plasmídeos pBIN-Cort6 e pBIN-Lut6 foram analisadas quanto aosácidos graxos modificados. O material inicial empregado consistiu nas folhasque haviam sido extraídas e analisadas por cromatografia gasosa como aquimais acima descrito.

A geração de novos ácidos graxos foi demonstrada para ambosos plasmídeos (figuras 3 e 4). Neste contexto, foi demonstrado que a enzimaCort6 preferivelmente transforma o ácido graxo 18:2a9'12, o qual se achaendogenamente presente, enquanto o Lut6, surpreendentemente, depreferência transforma o 18:3a9'12'15 em SDA (18:4Δ6'9'12'15). Disto, pode-seconcluir que as duas enzimas podem ser empregadas em um segundo plano daplanta, preferivelmente para a produção de GLA ou SDA, precursores doPUFA ARA e EPA, respectivamente.

Figura 3: Análise cromatográfica gasosa dos ácidos graxos domaterial de folhas das plantas de Arabidopsis, que haviam sido transformadascom o plasmídeo pBIN-Cortó.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Rothamsted Research Ltd.

<120> MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO GAMA-LINOLENICOE/OU ÁCIDO ESTEARIDÔNICO EMBRASSICACEAE EUNACEAETRANS GÊNICOS.

<13G> 2005/1053

<140> PF 57260<141>

<160> 12

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> Primula lutoides

<220>

<221> CDS

<Z2Z> (1),.(1350)

<223> Delta-6-desaturase

<400> 1

atg gct aac aaa tct caa aca ggt tac ata acg age tca gaa ctg gaa 48

Met Ala Asn Lys Ser Gln Thr Gly Tyr He Ths Ser Ser Glu Leu Glu1 5 10 15

acç cac aac aag gea gga gac cta tgg ate tca ata cac ggg cag gtc 96

Thr His Asn Lys Ala Gly Asp Leti Trp Ile Ser Ile His Gly Gln Val20 25 30

tac gac gtg tcc tcg tgg gcc gge ctfe cat ccg ggg gçc acc gcc ccc 14435 40 45

ctt ttg gcc ttc gca ggs cac gac gtg acc gat gct ttc ctc gcc tac 192

Leu Leu Ala Leu Ala Gly His Asp Val Thr Asp Ala Phe Leu Ala Tyr50 55 60

cat ccc cct tcc acc gcc cgc ctc ctc cct ccc ctt tcc acc cac ctc 240

His Pro Pro Sar Thr Ala Arg Leu Leu Pro Pro Leu Ser Thr Bis Leu65 70 75 80

ctc ctt caa cac cac tcc gtc tcc ccc acc tcc tcc gac tac cgc tcc 288

Leu Leu Gln His His Ser Val Ser Pro Thr Ser Ser Asp Tyr Arg Ser85 90 95

ctc ctt gac aac ttc cat aaa ctt ggc ctt ttc egc gcc agg ggc cac 336

Leu Leu Asp Asn Phe His Lys Leu Gly Leu Phe Arg Ala Arg Gly His100 105 110

act gct tac gcc acg ttc gtc ate atg ata gcg atg ttt cta gcg agt 384

Thr Ala Tyr Ala Thr Phe Val Ile Met Ile Ala Met Phe Leu Ala Ser115 120 125

gtg acc gga gtc ctc tgc age gac aaa gca tgg gtc cat ctg gct age 432

Val Thr Gly Val Leu Cys Ser Asp Lys Ala Trp Val His Leu Ala Ser130 135 140

ggt ggg gca atg ggg ttc gcc tgg ate cag tgc gga tgg ata ggt cac 480

Gly Gly Ala Met Gly Phe Ala Trp Ile Gln Cys Gly Trp Ile Gly His145 150 155 160

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Asp Ser Gly His Tyr Arg lie Met Ser Gly Glu Lys Trp Asn Arg Phe165 170 175

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Ala Gln Ile Leu Ser Thr Asn Cys Leu Gln GIy Ile Ser Ile Gly Trp180 185 190

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Trp Lys Trp Asn His Asn Ala His His Ile Ala Cys Asn Ser Leu Asp195 200 205

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Tyr Asp Pro Asp Leu Gln Tyr Ile Pro Leu Leu Val Val Sex Pro Lys210 215 220

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ttg acg ctt atg acg ctg aga aat aca gcc gtt gag gct cgg gac ctc 1296Leu Thr Leu Met Thr Leu Arg Asn Thr Ala Val Glu Ala Arg Asp Leu420 425 430

tct aat ccg ate ccg aag aat atg gtg tgg gaa gct gtt caa act ctc 134 4Ser Asn Pro Ile Pro Lys Asn Met Val Trp Glu Ala Val Gln Thr Leu435 440 445

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Gly

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> Primula lutoides

<400> 2

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Leu Leu Ala Leu Ala Gly His Asp Val Thr Itsp AXa Phe Leu Ala Tyr50 55 60

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Leu Leu Gln Hls His Ser Val Ser Pro Thr Ser Ser Asd Tyr Arg Ser85 90 " 95

Leu Leu Asp Asn Phe Wis Lys JLeu Gly Leu Phe Arg Ala Arg Gly His100 105 110

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Gly Leu Ala Val Phe Trp Val Trp Phe Pro Leu Leu Leu Ser Cys Leu290 295 300

Pro Asn Trp Gly Glu Arg Ile Met Phe Leu Leu Ala Ser Tyr Ser Val305 310 315 320

Thr Gly Ile Gln His Val Gln Phe Ser Leu Asn His Phe Ser Ser Asp325 330 335

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Ala Gly Thr Leu Asn Ile Ser Cys Pro Ala Trp Het Asp Trp Phe His355 360 365

Gly Gly Leu Gln Phe Gln Val Glu His His Leu Phe Pro Arg Met Pro370 375 360

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Leu Thr Leu Met Thr Leu Arg Asn Thr Ala Val Glu Ala Arg Asp Leu420 425 430

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Gly

<210> 3<211> 1353<212> DNA

<213> Priraula cortusoides<220>

<221> CDS

<222> (1).,(1353)

<223> Delta-6-desaturase

<400> 3

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Leu Leti Ser His Phe Asp Asn Leu Gly Leu Phe His Thr Lys Gly His100 105 110

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aaa aaa cat aac ttg cct tac aag ate gcg tct ttt aca acg gcc aat 1248Lys Lys His Asn Leu Pro Tyr Lys Ile Ala Ser Phe Thr Thr Ala Asn405 410 415

gtg ttg atg ctt agg act ctg aga aat gtt gct att aag gct cgg gac 1296Val Leu Met Leu Arg Thr Leu Arg Asn Val Ala Ile Lys Ala Arg Asp420 425 430

ctt tct aat ccg ate ccg aag aat ttg gtg tgg gaa gcc ttc cac aca 1344Leu Ser Asn Pro Ile Pro Lys Asn Leu Val Trp Glu Ala Phe His Thr435 440 445

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<210> 4

<211> 450

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Leu Cys Gly Ile Phe Leu Ser Thr Ser Phe Trp V&1 Hls Leu Ala Ser130 135 140

Gly Val Leu Ile Gly Phe Ala Trp Ile Gln Cys Gly Trp Leu Gly His145 150 155 160

Asp Ser Gly His Tyr Lys IXe Thr Ser Gly Lys Lys Ser Asn Arg Phe165 170 175

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Trp Lys Trp Asn His Asn Ala His His Thr Ser Cys Asn Ser Leu Asp195 200 205

His Asp Pro Asp Leo Gln Tyr Ile Pro Phe Leu Val Val Ser Ser Lys210 215 220

Phe Phe Thr Ser Met Ile Thr Ser Arg Phe Tyr Asn Lys Lys Leu Asn225 230 235 240

Phe Asn Ala Met Ser Arg Phe Ley Val Ser Tyr Gln His Trp Ser Phe245 250 255

Tyr Pro Val Met Cys Leu Ala Arg Val Asn Wet Phe Leu Gln Ser Leu260 265 270

Val Phe Leu Phe Phe Asn Lys Glu Val Gln Asn Arg Val Gln Glu Ile275 280 285

Leu Gly Ile Ala Val Phe Trp Val Trp Phe Pro Leu Val Val Ser Ser290 295 300

Leu Pro Asn Trp Gly Glu Arg Ile Met Phe Leu Val Ala Ser Phe Ser30S 310 315 320

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<21Q> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> desconhecido

<220>

<223> Seqüência artificial

<220>

<221> misc_featuKe

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<210> 6

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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Claims (21)

1. Método para produzir um ácido sendo ácido γ-linolênico(18:3a6'9'12) ou ácido estearidônico (18:4Δ6'9'12'15) ou ácido γ-linolênico(18:3δ6'9'12) e ácido estearidônico (18:4a6'9'12'15) em plantas transgênicas dafamília das Brassicaceae ou Linaceae, caracterizado pelo fato de que asplantas transgênicas compreendem pelo menos 10% em peso de ácido oleicocom base no conteúdo total de ácido graxo, o qual compreende as seguintesetapas do processo:a) introduzir uma seqüência de ácido nucleico na plantaoleosa que codifique para uma Δό-saturase de uma espécie de Prímula e quede preferência utilize, como substrato, o ácido α-linolênico como o ácidolinolênico, eb) expressão, na planta transgênica, da Δό-dessaturasecodificada pelo ácido nucleico, ec) cultivar e colher as plantas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a seqüência de ácido nucleico, que codifica para uma Δό-dessaturase de uma espécie de Primula, é selecionada do grupo consistindode:a) uma seqüência de ácido nucleico com a seqüênciaapresentada nas SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3,b) seqüências de ácidos nucleicos que, como o resultado dadegeneração do código genético, podem ser derivadas da seqüência deaminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ouc) derivados da seqüência de ácido nucleico apresentada naSEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, que codificam para os polipeptídeos quetêm pelo menos 40% de homologia no nível de aminoácido com a SEQ IDNO: 2 ou a SEQ ID NO: 4 e que têm uma atividade de Δό-dessaturase.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que expressam as seqüências de ácido nucleico deacordo com a reivindicação 1 (a), (b) e (c), as últimas sendo ligadasoperavelmente com um promotor ou terminador, ou promotor e terminador.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que a atividade da Δό-dessaturase leva a umconteúdo aumentado de ácido graxo Δό-C18 nas plantas.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que a Δό-dessaturase tem uma especificidade desubstrato para o ácido α-linolênico que é mais do que 20 vezes mais elevadado que a especificidade de substrato para o ácido linoleico.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que, como a Δό-dessaturase aceita apenas o ácidoα-linolênico como seu substrato, o ácido linoleico não é transformado.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6,caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos insaturados, o ácido γ-linolênico (18:3a6'9'12) ou (18:4a6'9'12'15) ou o ácido γ-linolênico (18:3a6'9'12) e(18:4a6'9'12'15), são aumentados na semente da planta oleosa.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7,caracterizado pelo fato de que as sementes são isoladas das plantascolhidas.

9. Método de acordo com as reivindicações 1 a 8,caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos insaturados, o ácido γ-linolênico (18:3Δ6'9'12) ou (18:4a6'9'12'15) ou ácido γ-linolênico (18:3Δ6'9'12) e(18:4a6'9'12'15), são isolados na forma de um óleo, lipídeo ou na forma dosácidos graxos livres das plantas transgênicas da família Brassicaceae ou suassementes.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que os ácidos graxos insaturados que se acham presentes no óleoou nos lipídeos, são isolados na forma dos ácidos graxos livres.

11. Método de acordo com as reivindicações 1 a 10,caracterizado pelo fato de que os óleos, lipídeos ou ácidos graxos livres sãomisturados com outros óleos, lipídeos ou ácidos graxos de animais,microbianos ou de plantas para dar composições de ácidos graxos.

12. Método de acordo com as reivindicações 1 a 11,caracterizado pelo fato de que os óleos, lipídeos ou ácidos graxos livres oucomposições de ácidos graxos são adicionados aos gêneros alimentícios,alimentos, cosméticos ou produtos farmacêuticos.

13. Seqüência de ácido nucleico isolado, caracterizada pelofato de que codifica para um polipeptídeo com atividade de Δό-dessaturase eem que a Δό-dessaturase codificada preferivelmente utiliza como substrato, oácido α-linolênico para ácido linoleico, selecionado do grupo consistindo de:a) uma seqüência de ácido nucleico com a seqüênciaapresentada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3,b) seqüências de ácido nucleico que, como o resultado dadegeneração do código genético, podem ser derivadas da seqüência deaminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ouc) derivados da seqüência de ácido nucleico apresentada naSEQ ID NO: 1, a qual codifica para polipeptídeos que tenham pelo menos-95% de homologia no nível de aminoácido com a SEQ ID NO: 2 ou derivadosda seqüência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 3, a qual codificapara polipeptídeos que tenham pelo menos 80% de homologia no nível deaminoácidos com a SEQ ID NO: 4 e que tenham uma atividade de Δό-dessaturase.

14. Seqüência de ácido nucleico isolado de acordo com areivindicação 13, caracterizada pelo fato de que deriva de uma planta.

15. Seqüência de ácido nucleico isolado de acordo com asreivindicações 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que deriva da família daPrimulaceae.

16. Proteína, caracterizada pelo fato de que é codificada poruma seqüência de ácido nucleico isolado como definida em qualquer dasreivindicações 13 a 15.

17. Construção de genes, caracterizada pelo fato de quecompreende um ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma dasreivindicações 13 a 15, o ácido nucleico sendo ligado operavelmente com umou mais sinais reguladores.

18. Construção de genes de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que a construção de ácido nucleico compreendegenes biossintéticos adicionais do metabolismo do ácido graxo ou lipídeoselecionados do grupo consistindo de acil-CoA desidrogenase(s), acil-ACP[=proteína portadora da acila] dessaturase(s), acil-ACP tiodessaturase(s),aciltransferase(s) de ácido graxo, acil-CoA:lisofosfolipídeo aciltransferases,ácido graxo sintase(s), ácido graxo hidroxilase(s), acetil-coenzima Acarboxilase(s), acil-coenzima A oxidase(s), ácido graxo dessaturase(s), ácidograxo acetilenases, lipoxigenases, triacilglicerol lipases, óxido de alenosintases, hidroperóxido liases ou ácido graxo elongase(s).

19. Construção de genes de acordo com as reivindicações 17ou 18, caracterizada pelo fato de que a construção de ácido nucleicoadicionalmente compreende os genes biossintéticos do metabolismo de ácidograxo ou lipídeos selecionados do grupo consistindo das A4-dessaturases, Δ5-dessaturases, A8-dessaturases, A9-dessaturases, A12-dessaturases, Δ5-elongases, Δό-elongases ou A9-elongases.

20. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende umácido nucleico como definido nas reivindicações 13 a 15 ou uma construçãode genes como definidos nas reivindicações 17 a 19.

21. Brassicacea ou Linaeea transgênicas, caracterizadas pelofato de que compreendem pelo menos uma seqüência de ácido nucleico comodefinidas nas reivindicações 13 a 15, uma construção de genes como definidanas reivindicações 17 a 19, ou um vetor como definido na reivindicação 20.