CN101298609A - 一种多功能生物降解酶制剂(ave制剂) - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用一种分离于土壤的微生物，革兰氏阴性棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)和磷酸盐、铁盐、钼酸盐等发酵产出的一种多功能生物降解酶制剂(AVE制剂)。其方法是在一定温度、pH值下，将AVE制剂直接撒入脂肪、蛋白、果胶、纤维、淀粉液中或将脂肪、蛋白、果胶、淀粉直接侵入AVE制剂中进行催化水解、降解。其特征是：利用棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)在培养基中发酵制成的AVE制剂，具有催化水解脂肪、蛋白、果胶、纤维、淀粉的多功能生物酶制剂。

Description

一种多功能生物降解酶制剂(AVE制剂)

生物降解酶制剂(AVE制剂)是通过分离于土壤的微生物-棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)发酵制成的一种生物酶制剂。AVE制剂可体现蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素、淀粉酶活性，为生物技术、医药科技、基础科学研究提供了一新的应用材料。

一、所属领域

本发明属于一种生物酶，其具有不同功能的水解催化作用。具体涉及一种能对蛋白、脂肪、果胶、纤维素、淀粉进行水解催化活性的制剂。

二、技术背景

生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一，国内外生物固氮研究已进入一个新阶段，其特点是学科交叉，将基础研究和应用前景相结合。当前生物固氮研究正在分子和原子水平上展开^[13]。重点在固氮机理、突变株以及对该菌种产生的酶进行固定化的研究。但当固氮酶及其没有固氮活性以后酶的功能和在其他方面的应用未曾见报道。

固氮菌属中，Azotobacter vinelandii广泛存在于自然界的土壤和水中。固氮菌属细菌在有氧存在的时，能够独立地将空气中的氮固定下来。由于固氮菌Azotobacter属在所有已发现固氮微生物中的较优特性，众多研究者将其作为研究固氮菌及其酶的首选菌属^[1，2]。棕色固氮菌Azotobacter vinelandii是有鞭毛游动性革兰氏阴性固氮菌，属于固氮菌中Azotobacteraceae科中的Azotobacter属，是一种典型性的固氮菌。

在固氮菌中起固氮作用的是固氮酶，棕色固氮菌是产含钼铁固氮酶的菌种之一，由两种独立的氧敏感蛋白组成：钼铁蛋白(MoFe蛋白，组分I)和铁蛋白(Fe蛋白，组分II)。1965年首次以巴氏梭菌(Cp)为材料，分离纯化得到了固氮酶的两个蛋白组分^[3]，即铁蛋白(Fe蛋白)和钼铁蛋白(MoFe蛋白)，铁蛋白分子量约60KD，是由两个相同的亚基组成的二聚体，含一个4Fe-4S簇，桥联于两个亚基之间。钼铁蛋白分子量约220KD，由α₂β₂组成四聚体，含2个Mo约32个Fe和等量的S^2-原子。这些金属形成两个特殊的4F-4S簇(称P-簇对)和两个铁钼辅因子(FeMo2co)^[4]。上述两个蛋白组分单独存在时不呈现固氮活性，只有组合在一起时，在一定条件下才有固氮功能。

固氮酶两组分蛋白都对氧极敏感，并随纯度的提高而更加敏感。在空气中铁蛋白的半衰期为30～45秒，钼铁蛋白的半衰期为10分钟^[5]。离体研究固氮酶时为保持活性需在严格厌氧条件下进行。不同固氮生物之间对氧的敏感性略有差异，并都具有不同的防氧保护方式^[6]。在根瘤中固氮酶存在于类菌体中。而根瘤的特殊结构和生理环境，不但保护了固氮酶而且还提供了合适的固氮条件，其中豆血红蛋白起着重要的输氧作用。固氮酶对冷敏感，一般在0℃左右易失活。其中铁蛋白对冷最敏感，但不同固氮生物之间存在差异。然而，所有的固氮酶在-200℃下都是稳定的，故纯化的固氮酶均可保存在液氮中^[7]。

在自然条件下，N₂和质子是固氮酶的底物。固氮酶每还原一分子N₂就要释放一分子H₂。当没有任何其它底物时，固氮酶的全部电子都用于氢离子的还原而释放氢。固氮酶的放氢也需要腺苷三磷酸(ATP)，这则区别于氢酶^[8]。除上述天然底物外，固氮酶是生物中分离出来的唯一能还原三键化合物的酶。其底物多数是具有三键或潜在三键的分子，如H-S-C≡N、CH₂-N⁺≡C-S，N≡C-C＝N，CH₂＝CH-N-C，以及最近刚得到证明的氧硫化碳(COS)和CO₂也是固氮酶的底物，然而其类似物CS₂则是抑制剂^[9]。在底物中引起人们广泛应用的是乙炔，因乙炔还原被人们用来作为测定固氮酶活性的简便而灵敏的方法(使用气相色谱)。

固氮酶的腺苷三磷酸和还原剂^[10]。固氮生物能将空气中的氮还原成氨，是因其体内存在生物催化剂固氮酶。生物固氮也是一个耗能的反应，为了还原上述底物，则需要有ATP和还原剂(电子)。在完整固氮有机体中一般ATP与Mg²⁺是以1∶1的复合物形式存在，大量实验表明固氮酶每提供一个电子给N₂需要水解2个分子的ATP(生成产物ADP和无机磷)，即ATP/e^-比为2。因此，固氮酶催化N₂还原的反应式可写作：

N₂+8H⁺+8e^-+16MgATP→2NH₃+H₂+16MgAD+16Pi。

方程式中：

ATP：腺苷三磷酸，是由呼吸、厌氧呼吸、发酵、或光合作用所提供的；

ADP：腺苷二磷酸；

Pi：无机磷酸盐。

固氮酶催化作用机理。固氮酶作用机理包括电子的传递、底物的络合和还原两部分。通过固氮酶系统的电子流，由铁蛋白进入，而以被还原了的底物形式由钼铁蛋白放出。从固氮酶两组分蛋白结构分析的结果推测，固氮酶系统内电子传递的顺序是：

Fe蛋白→MoFe蛋白的P₂簇对→FeMo2co→底物

MgATP的水解是与电子传递的第一步偶联，而当底物与FeMo2co络合时，电子和质子传递给底物^[11]。

动力学研究也表明，铁蛋白一次传递一个电子给钼铁蛋白，这种一个电子传递过程又包含着铁蛋白和钼铁蛋白之间偶联和解偶联的循环过程，而解偶联也是决定酶促反应速率的限制步骤^[12]。因此，了解固氮酶两组分之间的关系，电子的传递以及底物的络合和还原，是了解固氮酶作用机理所必须。固氮酶的固氮机理有一个复杂的电子传递路径，其没有固氮能力后的铁蛋白和钼铁蛋白组合体在其他催化功能方面给研究她的人们留下了很大的研究空间。

三、发明内容

名称：一种多功能生物降解酶制剂(AVE制剂)：通过分离于土壤的革兰氏阴性棕色固氮菌(Azotobactre vinelandii)发酵、离心分离得到的一种具有蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶活性的多功能生物酶制剂(AVE制剂)。其使用条件：温度，0-40℃，最佳温度，30℃；pH值，4.5-8.5；时间，0.5小时以上。

功能：生物酶制剂(AVE制剂)具有同时或单独作用具有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶活性。在生物技术、医药医疗技术、基础科学研究上有广泛的应用和研究前景。

适用范围：蛋白、脂肪、淀粉、果胶、纤维素的水解、降解。

AVE制剂性能测试本实验过程中的AVE制剂含酶蛋白质量为28g/L。

1.固氮活性测试^[14]

野生株棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)发酵最初产出的AVE制剂，能催化乙炔还原为乙烯，其气相色谱分析如附图1所示：

2.蛋白酶活性测试

蛋白酶活性实验是通过AVE制剂催化水解酪蛋白为酪氨酸进行测试的。

2.1蛋白酶活的测定方法^[15]

根据蛋白酶催化蛋白质水解生成的含酚基的氨基酸(色氨酸、酪氨酸)与福林-酚试剂反应，生成蓝色复合物。蓝色深浅与含酚氨基酸的量成正比，可以以此测定蛋白酶的活力。采用福林-酚法测定AVE制剂酶活。

取AVE制剂溶液10mL，在25℃时加入预热的2％酪蛋白溶液1mL，反应10min，反应结束时加入10％三氯醋酸溶液2mL，立即摇匀。静置10min后过滤。取滤液1mL，按照标准曲线制作时相同的步骤测定OD值。空白试验时，先加三氯醋酸溶液，后加底物和酶液，测量OD值。

活力计算：按照上述条件下，每分钟催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位。

公式2-1

式中：

OD-在合适波长下测定样品与空白样品的吸光度之差；

K-常数，由标准曲线得出，数值上等于ΔOD为1时相当酪氨酸的微克数；

n-酶液稀释倍数；

10-反应时间，min；

4-酶促反应试管内溶液的体积(酶液1mL+酪蛋白溶液1mL+三氯醋酸2mL)。

本实验中，K为100，n取发酵出的酶溶液，不进行稀释，取1。

2.2酪氨酸标准曲线的绘制

标准曲线的制作：将标准酪氨酸溶液配制成0-100μg/mL的各种不同溶液。分别吸取1mL，各加入0.5mol/LNa₂CO₃溶液5mL及福林-酚试剂1mL，置于402水浴中显色15min，分别测定OD，以酪氨酸的浓度为横坐标，OD为纵坐标，绘制标准曲线。

按照表2-2-1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液

表2-2-1酪氨酸的浓度

每个样品测三次，取平均值。将1～6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线，如附图2所示。

表2-2-2酪氨酸的浓度与OD值的关系

水解蛋白酶性能的测试

取发酵生产的AVE制剂，在温度为25℃，pH值为7.0。其中k为100，n为1，OD值为：0.046。

根据公式2-1可得：

实验结果显示AVE制剂具有水解蛋白质的活性。

3.脂肪酶活的测试

3.1脂肪酶酶活的测量方法^[15]

脂肪酶在一定条件下，可以将甘油三脂水解并释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，水解的脂肪酸可以用标准碱液滴定，从而测定酶活力。在25℃，pH为7.0的条件下，每分钟催化脂肪水解生成的1μmol脂肪酸的酶量定义为一个酶活力单位。

测试方法：向100ml三角烧瓶中，分别加入PVA橄榄油乳化液4ml和pH为7.5的磷酸缓冲溶液5ml，至于37℃水浴锅中预热5min，加入酶20ml，立即计时，反应40min。加入95％乙醇终止反应。加入酚酞3滴，用0.05％的氢氧化钠溶液滴定红色。在作空白对照实验时，在加入酶液之前加入95％的乙醇。

活力计算方法：

公式2-2

式中：A-样品滴定耗碱液的mL数；

      B-空白滴定耗碱液的mL数；

      t-反应时间，min；

      N-每mL碱液中含NaOH的微摩尔数。

取发酵的AVE制剂溶液体积20mL，在AVE制剂溶液里加入磷酸缓冲溶液5mL，再加入分析纯橄榄油0.5mL，在25℃水浴锅恒温反应40min，再取10mL乙醇用于终止实验。将此过程与10mL乙醇先加入溶液做对比，研究AVE制剂在反应过程中催化水解的橄榄油量。按照2.3.2方法进行试验。

表3-3测定A.v酶活时NaOH消耗的体积

脂肪酶活计算如下式所示：

$\mathrm{IU}=\frac{48.9\×(2.23-1.72)}{40}=0.6235(\mathrm{\μmol}\·\mathrm{mL}/\min )$

实验结果显示AVE制剂有水解脂肪的活性。

4.果胶酶活性测试^[15]

果胶酶包括果胶酯酶(PE)、聚半乳糖醛酸(PG)和聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)等多种，他们的作用方式和产物各不相同，无法找到一种适用于所有果胶酶的活力测定方法，故采用混合果胶酶一般采用的次碘酸钠法。

次碘酸钠法测定原理：果胶酶对果胶质起解酯、裂解、水解作用，产生半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸等，它们均含有醛基，因此具有一定的还原性。在一定条件下，可以和具有氧化性的物质发生反应。因此可以通过次碘酸钠进行半乳糖醛酸的定量测定，从而间接的定果胶酶的活力。

按照国标GB-601配制标准配制并标定硫代硫酸钠溶液。(浓度为0.05216mol/L)。

实验方法：在100ml的碘量瓶中，加入10ml的10％的果胶溶液，在50℃的水浴条件下恒温，加入预先在水浴锅中恒温的酶也20ml，酶解40min。40min后煮沸灭活。加入浓度为0.1mol/L的碘标准溶液10ml，加上瓶盖，在暗处反应30min，用浓度为0.05mol/L的硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄，加入3ml的淀粉指示剂，滴定至无色，消耗的硫代硫酸钠的体积为V₁ml。同样，以培养酶的培养基代替酶，用硫代硫酸钠滴定，消耗体积为V₀ml

酶活的计算方法：

生成的半乳糖醛酸质量(mg)＝(V₀-V₁)*c*194.14

果胶酶活力[mg/(g·h)]＝生成的半乳糖醛酸质量(mg)*N/(W₂·t)

式中：

V₀-滴定空白液消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积(ml)

V₁-滴定酶液消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积(ml)

C-硫代硫酸钠标准溶液的浓度(mol/L)

194.14-半乳糖醛酸的摩尔质量，(g/mol)

N-果胶酶制剂的量

W₂-试验中加入的酶制剂的量，(g)

t-酶解反应的时间，(h)N

本研究采用工艺参数为：

	酶溶液(V0:mL)	培养基空白样(V1:mL)	V0-V1
				硫代硫酸钠	19.36	18.78	0.58

生成的半乳糖醛酸的质量(mg)＝0.58*0.05216*194.14＝5.8733

果胶酶活力[mg/(g*h)]＝5.8733/(20*2.2420*0.67)＝0.1955

实验显示AVE制剂具有果胶酶活性。

5.淀粉酶活性测试

5.1淀粉酶活的测定方法^[15]

采用D⁶⁰⁰ _60’消色法与蓝值法相结合的方法来测量的AVE制剂的淀粉酶活性。这是测量淀粉酶活力的普遍方法。1个酶活力单位为在最佳条件下，60min催化1g淀粉水解为糊精的酶量。该方法根据淀粉遇碘变蓝的原理，可以在淀粉溶液中加入不同量的AVE制剂，一定时间后，可选则不出现蓝色的酶制剂用量最小的那个试液可以被认为是刚好将淀粉全部分解，可以根据酶制剂的用量，淀粉的用量以及反应时间来计算淀粉酶的活力。同时采用蓝值法来确定AVE制剂的酶体积。如附图3淀粉酶酶活的测量方法(蓝值法反应流程)。

淀粉遇碘会产生蓝色，可以在一定量的淀粉中加入不同量的淀粉酶制剂，不同体积的AVE制剂溶液与淀粉反应，将逐渐由紫色变为棕橙色，直到与标准比色液颜色相同时，即为反应终点，认为AVE制剂将淀粉全部分解。可根据酶制剂的用量，淀粉的用量及反应时间来计算代淀粉酶的活力。

淀粉酶活力＝(60/t)×20×1％×n/B

式中：t-反应时间

      n-酶液的稀释倍数

      B-反应中酶液的体积

AVE制剂淀粉酶活计算

淀粉酶活力(mg/(g.h))＝W₁/(W₂*V₁)＝1000/10.8*13＝7.12*10^-3

实验结果显示AVE制剂具有淀粉酶活性。

经过实验发现AVE制剂不仅可以单独显现上述的性质，而且可以水解、降解上述底物的混合物，如水解蛋白和脂类的结合物等。

四、AVE制剂构成材料

本生物AVE制剂是由酶蛋白、水、少量无机盐构成；

主要酶：经过性能测试及电泳分析，得知其酶蛋白组分是Fe蛋白和MoFe蛋白。

构成法：棕色固氮菌和钼酸盐，磷酸盐，铁盐等发酵、离心分离提取。

五、具体实施方式

将AVE制剂直接撒入脂肪、蛋白、果胶、淀粉液中或将脂肪、蛋白、果胶、淀粉直接侵入AVE制剂中，进行水解。

六、附图说明

图1是棕色固氮菌产出的固氮酶还原乙炔实验的气相色谱图；其中，(1)乙炔与乙烯单体气相色谱图；(2)乙炔及AVE制剂还原产物气相色谱图。

图2是酪氨酸与OD值的关系；

图3是淀粉酶酶活的测量方法。

参考文献

[1]陈娜丽，固定化固氮菌的制备及其性能的研究，西北师范大学，2003，6：39-40.

[2]井上圭三等.《生物化学辞典》(第三版).东京化学同人.1998：37.

[3]John Postgate.Nitrogen Fixation.The institute of Biology’s Studies in Biology.1978(92)：45-50.

[4]李佳格，徐继.生物固氮作用机理.Chinese Bulletin of Botany.1997，14：1-13.

[5]边少敏.棕色固氮菌变株DJ中钼铁蛋白和HBP59蛋白的研究-纯化、特性及晶体生长.中国科学院研究生院博士研究生学位论文.2005：1-4.

[6]Shah，V.K，etal.Proc Natl A cad.Sci.USA.1999，74：3249-3253.

[7]Evans，H.J.etc.Biological Nitrogen Fixation.Chapm an and Hall.New York.1997：1-42.

[8]Papasani V.Subbaiah，Peter Horvath etal.Regulation of the Activity and Fatty Acid Specificity ofLecithin-Cholesterol Acyltransferase by Sphingomyelin and Its Metabolites，Ceramide and Ceramide Phosphate.Biochemistry.2006，45：5029-5038.

[9]尤崇杓.生物固氮.北京：科学出版社.1987：71-80.

[10]Seefeldt，L.C.etal.Biochemistry.1995，34：5382-5389.

[11]Burgess，B.K.Molybdenum.Enzyme.Wiley-Interscience.1985：161-219.

[12]Ress，D.C.et.al.Biological Chemistry.1999，269：2876-28083.

[13]Howard，J.B.Biochemistry.1994，63：2798-2808.

[14]Wei Hao.Nitrogen Fixation and Ammonia production by Nitrogenase.Thesis of Graduate School of TayamaUniversity.2000：1-48.

[15]周文龙.酶在纺织中的应用.北京：中国纺织出版社.2002：352-354.

Claims (5)

1.一种多功能生物降解酶制剂(AVE制剂)是利用分离于土壤的微生物，革兰氏阴性棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)和磷酸盐、铁盐、钼酸盐等发酵产出的生物酶制剂。其方法是在一定温度、pH值下，将AVE制剂直接撒入脂肪、蛋白、果胶、纤维、淀粉液中或将脂肪、蛋白、果胶、淀粉直接侵入AVE制剂中进行水解、降解。其特征是：利用棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)在培养基中发酵制成的AVE制剂，具有催化水解脂肪、蛋白、果胶、纤维、淀粉的多功能生物酶制剂。

2.根据权利要求1所述的一种多功能生物降解酶制剂(AVE制剂)，其特征是：棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)在培养基中发酵制成AVE制剂的温度是0-40℃，pH值是4.5-8.5；对脂肪、蛋白、果胶、纤维、淀粉底物具有进行催化水解功效时间0.5小时以上。

3.根据权利要求2所述的一种多功能生物降解酶制剂(AVE制剂)，其特征是：AVE制剂的多功能水解作用，在温度25-35℃，pH值是7.0左右；对脂肪、蛋白、果胶、纤维、淀粉底物水解效果较好。

4.根据权利要求1所述的一种多功能生物降解酶制剂(AVE制剂)，其特征在于：AVE制剂是棕色固氮菌在培养基中发酵制得。

5.根据权利要求4所述的一种多功能生物降解酶制剂(AVE制剂)，其特征在于：AVE制剂是棕色固氮菌在培养基中发酵制成AVE制剂或棕色固氮菌和培养基构成的生物材料，对脂肪、蛋白、果胶、纤维、淀粉底物有水解性能。

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