CN101298474A - Sec2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法 - Google Patents

Sec2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101298474A
CN101298474A CNA2007100111771A CN200710011177A CN101298474A CN 101298474 A CN101298474 A CN 101298474A CN A2007100111771 A CNA2007100111771 A CN A2007100111771A CN 200710011177 A CN200710011177 A CN 200710011177A CN 101298474 A CN101298474 A CN 101298474A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sec2
gene
sequence
table seq
sequence table
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007100111771A
Other languages
English (en)
Inventor
张成刚
王小刚
张惠文
陈艳
徐明恺
常迪
苏振成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHENYANG KEJIAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
SHENYANG KEJIAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHENYANG KEJIAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical SHENYANG KEJIAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CNA2007100111771A priority Critical patent/CN101298474A/zh
Publication of CN101298474A publication Critical patent/CN101298474A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程肽的基因克隆和异源表达，具体说是一系列具有SEC2超抗原活性的基因工程肽、及其编码基因的制备和异源表达，SEC2－1～SEC2－14分别具有序列表SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和SEQ ID NO：28中氨基酸序列。克隆的核苷酸序列可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，其表达的分别所对应的蛋白SEC2－1～SEC2－14经检验具有超抗原的生物学活性。

Description

SEC2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法
技术领域
本发明涉及基因工程肽的基因克隆和异源表达，具体说是一系列具有SEC2超抗原活性的基因工程肽、及其编码基因的制备和异源表达。
背景技术
超抗原(superantigen，SAg)是一组由细菌或病毒编码的蛋白质分子，可以极低浓度(1～10ng/mL)刺激大部分T细胞增生，具有超强的增强机体免疫反应功能和一定的抗肿瘤活性。因此，超抗原是一种极好的免疫调节剂和增效剂，可望被开发成潜在的新型抗肿瘤药物，用于肿瘤治疗。
金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是一类具有代表性的微生物外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型微生物超抗原，受到人们的广泛重视。近年来，人们在对金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)结构、免疫学功能及其抗肿瘤等进行了大量研究工作，其中主要集中在对SEA\SEB等的研究方面。我所在世界上首次对SEC2的基因进行了克隆、测序并在靶向融合蛋白研究方面取得了开创性成果，为进一步开展肠毒素C2(SEC2)分子改造及其靶向融合蛋白的研发奠定了基础。
实验肿瘤学研究显示利用SEC2作为肿瘤治疗的超抗原药物具有其它药物不可比拟的优点：SEC2较能抗消化并且耐热以及只需使用很小的剂量就可引发T细胞应答和明显的肿瘤抑制效应。尽管如此，在临床使用过程中还不完全尽如人意。1)作为潜在肠胃毒素可引起伴随着呕吐和严重腹泻等毒副作用；2)SEC2超抗原对肿瘤细胞作用位点缺乏靶向性，在增强机体免疫功能抑制肿瘤细胞生长的同时，可能对人体正常细胞产生细胞毒作用；剂量过大或应用不当亦可产生免疫耐受；3)作为潜在的临床开发药物，超抗原SEC2分子量过大(约为27.6kD)，不易于静脉注射和人体吸收。这些问题限制了其在临床上的应用。因此，如何避免不利义素因素，充分利用其强大的免疫功能，对于探索SEC2在抗肿瘤、甚至抗病毒中的作用，具有非常重要的意义。
针对超抗原SEC2实际临床应用中所面临的毒性效应、缺乏靶向性以及分子量偏大等问题，本发明根据金黄色葡萄球菌基因组、生物信息学等理论，利用现代分子生物学技术实现SEC2蛋白分子的定向改造，以获得一系列具有超抗原活性的基因工程多肽，这种经遗传改造的超抗原基因工程肽对于扩大其临床应用范围，改善疗效、降低毒副作用具有重要的实践意义，具有潜在的开发应用前景。
发明内容
本发明涉及SEC2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法，其为一系列具有超抗原活性的基因工程肽，利用本发明可以在人工控制的条件下，大量获得高纯度的具有超抗原活性的基因工程肽。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
SEC2超抗原基因工程肽分别为下列任意氨基酸序列之一，
SEC2-1具有序列表SEQ ID NO：2中氨基酸序列；
SEC2-2具有序列表SEQ ID NO：4中氨基酸序列；
SEC2-3具有序列表SEQ ID NO：6中氨基酸序列；
SEC2-4具有序列表SEQ ID NO：8中氨基酸序列；
SEC2-5具有序列表SEQ ID NO：10中氨基酸序列；
SEC2-6具有序列表SEQ ID NO：12中氨基酸序列；
SEC2-7具有序列表SEQ ID NO：14中氨基酸序列；
SEC2-8具有序列表SEQ ID NO：16中氨基酸序列；
SEC2-9具有序列表SEQ ID NO：18中氨基酸序列；
SEC2-10具有序列表SEQID NO：20中氨基酸序列；
SEC2-11具有序列表SEQ ID NO：22中氨基酸序列；
SEC2-12具有序列表SEQID NO：24中氨基酸序列；
SEC2-13具有序列表SEQID NO：26中氨基酸序列；
或SEC2-14具有序列表SEQ ID NO：28中氨基酸序列。
所述基因工程肽的编码基因分别对应于下列核苷酸序列之一，
SEC2-1对应的基因具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列；
SEC2-2对应的基因具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列；
SEC2-3对应的基因具有序列表SEQ ID NO：5中碱基序列；
SEC2-4对应的基因具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列；
SEC2-5对应的基因具有序列表SEQ ID NO：9中碱基序列；
SEC2-6对应的基因具有序列表SEQ ID NO：11中碱基序列；
SEC2-7对应的基因具有序列表SEQ ID NO：13中碱基序列；
SEC2-8对应的基因具有序列表SEQ ID NO：15中碱基序列；
SEC2-9对应的基因具有序列表SEQ ID NO：17中碱基序列；
SEC2-10对应的基因具有序列表SEQ ID NO：19中碱基序列；
SEC2-11对应的基因具有序列表SEQ ID NO：21中碱基序列；
SEC2-12对应的基因具有序列表SEQ ID NO：23中碱基序列；
SEC2-13对应的基因具有序列表SEQ ID NO：25中碱基序列；
或SEC2-14对应的基因具有序列表SEQ ID NO：27中碱基序列。
SEC2超抗原基因工程肽的异源表达方法：
将编码这一系列SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列sec2-1、sec2-2、sec2-3、sec2-4、sec2-5、sec2-6、sec2-7、sec2-8、sec2-9、sec2-10、sec2-11、sec2-12、sec2-13或sec2-14分别克隆入表达载体pET-28a，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，构建成异源表达超抗原活性基因工程肽的基因工程菌，在培养基中异源表达有超抗原活性的SEC2-1、SEC2-2、SEC2-3、SEC2-4、SEC2-5、SEC2-6、SEC2-7、SEC2-8、SEC2-9、SEC2-10、SEC2-11、SEC2-12、SEC2-13或SEC2-14基因工程肽。
所述编码SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列的克隆方法如下，
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-1-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3’和sec2-1-R：5’gCCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3’通过PCR技术扩增出sec2-1基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-2-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTAC 3’和sec2-2-R：5’gCTCgAgTTAgTggTTTCCTTCATg 3’通过PCR技术扩增出sec2-2基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-3-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgA 3’和sec2-3-R：5’gCCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3’通过PCR技术扩增出sec2-3基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-4-F：5’GAATTCGAGAGTCAACCAGACCCTA 3’和sec2-4-R：5’gCTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCA 3’通过PCR技术扩增出sec2-4基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-5-F：5’gAATTCggTACgATgggTAATATg 3’和sec2-5-R：5’CTCgAgTTATCCATTCTTTgTTgTAAggT 3’通过PCR技术扩增出sec2-5基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-6-F：5’gAATTCggTACgATgggTAATATg 3’和sec2-6-R：5’CTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCAT 3’通过PCR技术扩增出sec2-6基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-7-F：5’gAATTCggTACgATgggTAATATg 3’和sec2-7-R：5’CgCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3’通过PCR技术扩增出sec2-7基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-8-F：5’gAATTCgCAAAgAAgTACAAAgATg 3’和sec2-8-R：5’CgCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3’通过PCR技术扩增出sec2-8基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-9-F：5’ggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3’和sec2-9-R：5’CgCTCgAgTTATCCATACACATCAAC 3’通过PCR技术扩增出sec2-9基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-10-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgAC 3’和sec2-10-R：5’CgCTCgAgTTAATCTTTgTACTTC 3’通过PCR技术扩增出sec2-10基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-11-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3’和sec2-11-R：5’CCCgCTCgAgTTAGTTTACATAgTAAT 3’通过PCR技术扩增出sec2-11基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-12-F：5’gAATTCAAATCAAgTgAgTTTACTg 3’和sec2-12-R：5’CgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAAT 3’通过PCR技术扩增出sec2-12基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-13-F：5’gAATTCggTACgATgggTAATAT 3’和sec2-13-R：5’CCgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAA 3’通过PCR技术扩增出sec2-13基因片段；
或，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-14-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3’和sec2-14-R：5’CgCTCgAgTTATAATAACTCTgTTTTCAC 3’通过PCR技术扩增出sec2-14基因片段。
本发明具有如下优点：
1. 本发明为人工构建的一系列编码超抗原基因工程肽的核苷酸序列，首次获知其基因全序列的组成。
2. 本发明利用PCR技术，克隆一系列编码超抗原基因工程肽的核苷酸基因，并在大肠杆菌中表达，表达的一系列超抗原基因工程肽经检验具有超抗原的生物学活性；应用本发明，可提供直接用于生产该一系列超抗原基因工程肽的基因工程菌株。
3. 本发明基因的异源表达提供了制备超抗原抗肿瘤生物制剂的一种新方法，具有产量高，生产稳定，方便纯化的特点。
附图说明
图1为sec2-1、sec2-2、sec2-3、sec2-4、sec2-5和sec2-6基因的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中：1为DL2000DNA分子量标准，2-7为sec2-1、sec2-2、sec2-3、sec2-4、sec2-5和sec2-6基因的PCR扩增产物；
图2为sec2-7、sec2-8、sec2-9、sec2-10、sec2-11、sec2-12、sec2-13和sec2-14基因的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中：1为DL2000DNA分子量标准，2-9为s sec2-7、sec2-8、sec2-9、sec2-10、sec2-11、sec2-12、sec2-13和sec2-14基因的PCR扩增产物；
图3为超抗原基因工程肽SEC2-1、SEC2-2、SEC2-3、SEC2-4、SEC2-5、SEC2-6、SEC2-7、SEC2-8、SEC2-9、SEC2-10、SEC2-11、SEC2-12、SEC2-13和SEC2-14的超抗原活性检测实验(外周血单个核细胞PBMC增殖实验)结果图。横坐标为阴性对照牛血清白蛋白(BSA)、系列超抗原基因工程肽和阳性对照肠毒素C2；纵坐标为酶标仪在OD570nm下的读数值。
具体实施方式
实施例1
(1)
(A)超抗原基因工程肽SEC2-1，具有序列表SEQ ID NO：2中的氨基酸系列：
e s q p d p t p d e l h k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k f l a
h d l Iy n I s d k k l k n y d k v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n
c y f s s k d n v g k v t g g k t c m y g g I t k h e g n h f d n g n l q n v l I r v y e n
k r n t I s f e v q t d k k s v t a q e l d I k
SEQ ID NO.2的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：162个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由4个完整的α螺旋和8个β折叠构成。其中氨基酸残基7-11，13-17，21-29，70-78，分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基32-39，47-53，62-68，81-87，108-118分别形成四个β折叠结构，129-154位氨基酸残基形成三个β折叠。除了7-11，13-17位两个α螺旋及残基129-154形成的三个β折叠外，其他α螺旋和β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域，构成一个“β-桶”状结构，而118位和122位组氨酸残基形成两个Zn原子结合位点。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
编码SEC2-1的基因sec2-1，具有序列表SEQ ID NO：1中核苷酸序列。
G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C
A C A A A T C A A G T G A G T T T A C T G G T A C G A T G G G T A A
T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T C A G
C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A
C A T G A T T T A A T TT A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T
A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A G T T A T T A
A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G
T A G T T G A T G T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C
T G C T A T T T T T C A T C C A A A G A T A A T G T A G G T A A A G T
T A C A G G T G G T A A A A C T T G T A T G T A T G G A G G A A T A
A C A A AA C A T G A A G G A A A C C A C T T T G A T A A T G G G A
A C T T A C A A A A T G T A C T T A T A A G A G T T T A T G A A A A T
A A A A G A A A C A C A A T T T C T T T T G A A G T G C A A A C T G
A T A A G A A A A G T G T A A C A G C T C A A G A A C T A G A C A T
A A A A
SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：486碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(B)超抗原基因工程肽SEC2-2，具有序列表SEQ ID NO：4中的氨基酸系列：
e s q p d p t p d e l h k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a
h d l iy n I s d k k l k n y d k v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n
c y f s s k d nv g k v t g g k t c m y g g I t k h e g n h
SEQ ID NO.4的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：122个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由4个完整的α螺旋和5个β折叠构成。其中氨基酸残基7-11，13-17，21-29，70-78，分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基32-39，47-53，62-68，81-87，108-118分别形成四个β折叠结构。除了7-11，13-17位两个α螺旋外，其他α螺旋和β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域，构成一个“β-桶”状结构，而118位和122位组氨酸残基形成两个Zn原子结合位点。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
编码SEC2-2的基因sec2-2，具有序列表SEQ ID NO：3中核苷酸序列。
G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C
A C A A A T C A A G T G A G T TT A C T G G T A C G A T G G G T A A T
A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T C A G C
A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A C
A T G A T T T A A T T T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T A
A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A G T T A T T A A
A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G T
A G T T G A T G T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C T
G C T A T T T T T C A T C C A A A G A T A A T G T A G G T A A A G T T
A C A G G T G G T A A A A C T T G T A T G T A T G G A G G A A T A A
C A A A A C A T G A A G G A A A C C A C
SEQ ID NO.3的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：366碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(C)超抗原基因工程肽SEC2-3，具有序列表SEQ ID NO：6中的氨基酸系列：
e s q p d p t p d e l h k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a
h d l iy n I s d k k l k n y d k v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n
c y f s s k d n v g k v t g g k t c m y g
SEQ ID NO.6的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：113个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由4个完整的α螺旋和4个β折叠构成。其中氨基酸残基7-11，13-17，21-29，70-78，分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基32-39，47-53，62-68，81-87分别形成四个β折叠结构。除了7-11，13-17位两个α螺旋外，其他α螺旋和β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
编码SEC2-3的基因sec2-3，具有序列表SEQ ID NO：5中核苷酸序列。
G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C A
C A A A T C A A G T G A G T TT A C T G G T A C G A T G G G T A A T A T
G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T C A G C A A C
T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A C A T G A
T T T A A T TT A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A
T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A G T T A T T A A A T G A A G
A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T
G T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C T G C T A T T T T
T C A T C C A A A G A T A A TG T A G G T A A A G T T A C A G G T G G
T A A A A C T T G T A T G T A T G G A
SEQ ID NO.5的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：339碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcos aureus)
(D)超抗原基因工程肽SEC2-4，具有序列表SEQ ID NO：8中的氨基酸系列：
e s q p d p t p d e l h k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a
h d l i y n I s d k k l k n y d k v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n
c y f s s k d nv g k v t g g k t c m y g g I t k
SEQ ID NO.8的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：117个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由4个完整的α螺旋和5个β折叠构成。其中氨基酸残基7-11，13-17，21-29，70-78，分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基32-39，47-53，62-68，81-87，108-117分别形成五个β折叠结构。除了7-11，13-17位两个α螺旋外，其他α螺旋和β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
编码SEC2-4的基因sec2-4，具有序列表SEQ ID NO：7中核苷酸序列。
G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C
A C A A A T C A A G T G A G T T T A C T G G T A C G A T G G G T A A
T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T C A G
C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A
C A T G A T T T A A T T T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T
A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G AG T T A T T A
A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G
T A G T T G A T G T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C
T G C T A T T T T T C A T C C A A A G A T A A T G T A G G T A A A G T
T A C A G G T G G T A A A A C T T G T A T G T A T G G A G G A A T A
A C A A A A
SEQ ID NO.7的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：351碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(E)超抗原基因工程肽SEC2-5，具有序列表SEQ ID NO：10中的氨基酸系列：
g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a h d l i y n I s d k k l k n y d k
v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n c y f s s k d n v g k v t g g k t
c m y g g I t k he g n h f d n g n l q n v l I r v y e n k r n t I s f e v q t d k k s v t a
q e l d I k a r n f l I n k k n l y e fn s s p y e t g y I k fI e n n g n t fw y d m m p
a p g d k fd q s k y l m m y n d n k t v d s k s v k I e v h l t t k n g
SEQ ID NO.10的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：221个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由4个完整的α螺旋和12个β折叠构成。其中氨基酸残基3-11，52-60，138-154，190-202分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基14-21，29-35，44-50，63-69，90-110，111-136，162-182，及204-207，210-219分别形成12个β折叠结构。其中138-154位形成的α螺旋和111-136，162-182，及204-207，210-219形成的七个β折叠，以及3-11，52-60，190-202形成的三个α螺旋和14-21，29-35，44-50，63-69，90-100所形成的β折叠在三维结构中分别形成两个独立的结构域。而100位和104位组氨酸残基形成两个Zn原子结合位点。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
编码SEC2-5的基因sec2-5，具有序列表SEQ ID NO：9中核苷酸序列。
G G T A C G A T G G G T A A T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A
T C A T T A T G T A T C A G CA A C T A A A G T T A T G T C T G T A G
A T A A A T T T T T G G C A C A T G A T T T A A T T T A T AA C A T T
A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A
A A A C A G A G T T A T T A A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A
G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T G T G T A T G G A T C A
A A T T A C T A T G T A A A C T G C T A T T T T T C A T C C A A A G A
T A A T G T A G G T A A A G T T A C A G G T G G T A A A A C T T G T
A T G T A T G G A G G A A T A A C A A A A C A T G A A G G A A A C C
A C T T T G A T A A T G G G A A C T T A C A A A A T G T A C T T A T A
A G A G T T T A T G A A A A T A A A A G A A A C A C A A T T T C T T T
T G A A G T G C A A A C T G A T A A G A A A A G T G T A A C A G C T
C A A G A A C T A G A C A T A A A A G C T A G G A A T T T T T T A A
T T A A T A A A A A A A A T T T G T A T G A G T T T A A C A G T T C A
C C A T A T G A A A C A G G A T A T A T A A A A T T T A T T G A A A
A T A A C G G C A A T A C T T T T T G G T A T G A T A T G A T G C C T
G C A C C A G G C G A T A A G T T T G A C C A A T C T A A A T A T T T
A A T G A T G T A C A A C G A C A A T A A A A C G G T T G A T T C T
A A A A G T G T G A A G A T A G A A G T C C A C C T T A C A A C A A
A G A A T G G A
SEQ ID NO.9的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：663碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(F)超抗原基因工程肽SEC2-6，具有序列表SEQ ID NO：12中的氨基酸系列：
g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k f l a h d l I y n I s d k k l k n y d k
v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n c y f s s k d n v g k v t g g k t
c m y g g I t k
SEQ ID NO.12的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：99个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由2个完整的α螺旋和5个β折叠构成。其中氨基酸残基3-11，52-60，分别形成两个完整的α螺旋结构；氨基酸残基14-21，29-35，44-50，63-69，90-99分别形成五个β折叠结构。所有α螺旋和β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域，形成一个“β-桶”状结构。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
编码SEC2-6的基因sec2-6，具有序列表SEQ ID NO：11中核苷酸序列。
G G T A C G A T G G G T A A T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A
T C A T T A T G T A T C A G C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G
A T A A A T T T T T G G C A C A T G A T T T A A T T T A T A A C A T T
A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A
A A A C A G A G T T A T T A A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A
G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T G T G T A T G G A T C A
A A T T A C T A T G T A A A C T G C T A T T T T T C A T C C A A A G A
T A A T G T A G G T A A A G T T A C A G G T G G T A A A A C T T G T
A T G T A T G G A G G A A T A A C A A A A
SEQ ID NO.11的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：297碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(G)超抗原基因工程肽SEC2-7，具有序列表SEQ ID NO：14中的氨基酸系列：
g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a h d l i y n I s d k k l k n y d k
v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n c y f s s k d n v g k v t g g k t
c m y g
SEQ ID NO.14的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：95个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由2个完整的α螺旋和4个β折叠构成。其中氨基酸残基3-11，52-60，分别形成两个完整的α螺旋结构；氨基酸残基14-21，29-35，44-50，63-69分别形成四个β折叠结构。两个α螺旋和四个β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
编码SEC2-7的基因sec2-7，具有序列表SEQ ID NO：13中核苷酸序列。
G G T A C G A T G G G T A A T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A
T C A T T A T G T A T C A G CA A C T A A A G T T A T G T C T G T A G
A T A A A T T T T T G G C A C A T G A T T T A A T T T A T A A C A T T
A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A
A A A C A G A G T T AT T A A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A
G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T G T G T A T G G A T C A
A A T T A C T A T G T A A A C T G C T A T T T T T C A T C C A A A G A
T A A T G T A G G T A A A G T T A C A G G T G G T A A A A C T T G T
A T G T A T G G A
SEQ ID NO.13的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：285碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(H)超抗原基因工程肽SEC2-8，具有序列表SEQ ID NO：16中的氨基酸系列：
a k k y k d e v v d v y g s n y y v n c y f s s k d n v g k v t g g k t c m y g g I t k h
e g n h fd n g n l q n v l I r v y e n k r n t I s f e v q t d k k s v t a q e l d I k
SEQ ID NO.16的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：89个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由2个α螺旋和5个β折叠构成。其中氨基酸残基1-5，83-89分别形成两个α螺旋结构；氨基酸残基8-14，35-45，56-64，66-77，79-81分别形成五个β折叠结构。两个α螺旋和五个β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。而45位和49位组氨酸残基形成两个Zn原子结合位点。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
编码SEC2-8的基因sec2-8，具有序列表SEQ ID NO：15中核苷酸序列。
G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T G T G T
A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C T G C T A T T T T T C A
T C C A A A G A T A A T G T A G G T A A A G T T A C A G G T G G T A
A A A C T T G T A T G T A T G G A G G A A T A A C A A A A C A T G A
A G G A A A C C A C T T T G A T A A T G G G A A C T T A C A A A A T
G T A C T T A T A A G A G T T T A T G A A A A T A A A A GA A A C A C
A A T T T C T T T T G A A G T G C A A A C T G A T A A G A A A A G T G
T A A C A G C T C A A G A A C T A G A C A T A A A A
SEQ ID NO.15的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：267碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(I)超抗原基因工程肽SEC2-9，具有序列表SEQ ID NO：18中的氨基酸系列：
e s q p d p t p d e l h k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a
h d l Iy n I s d k k l k n y d k v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g
SEQ ID NO.18的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：86个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由4个完整的α螺旋和4个β折叠构成。其中氨基酸残基7-11，13-17，21-29，70-78，分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基32-39，47-53，62-68，81-86分别形成四个β折叠结构。除7-11，13-17形成的两个α螺旋外，其他两个α螺旋和四个β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
编码SEC2-9的基因sec2-9，具有序列表SEQ ID NO：17中核苷酸序列。
G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C
A C A A A T C A A G T G A G T T T A C T G G T A C G A T G G G T A A
T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T C A G
C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A
C A T G A T T T A A T T T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T
A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A G T T A T T A
A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G
T A G T T G A T G T G T A T G G A
SEQ ID NO.17的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：258碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(J)超抗原基因工程肽SEC2-10，具有序列表SEQ ID NO：20中的氨基酸系列：
e s q p d p t p d e l h k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a
h d l iy n I s d k k l k n y d k v k t e l l n e d l a k k y k d
SEQ ID NO.20的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：79个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由4个完整的α螺旋和3个β折叠构成。其中氨基酸残基7-11，13-17，21-29，70-78，分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基32-39，47-53，62-68，分别形成三个β折叠结构。除7-11，13-17形成的两个α螺旋外，其他两个α螺旋和四个β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
编码SEC2-10的基因sec2-10，具有序列表SEQ ID NO：19中核苷酸序列。
G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C
A C A A A T C A A G T G A G T T T A C T G G T A C G A T G G G T A A
T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T C A G
C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A
C A T G A T T T A A T T T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T
A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G AG T T A T T A
A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T
SEQ ID NO.19的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：237碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
(K)超抗原基因工程肽SEC2-11，具有序列表SEQ ID NO：22中的氨基酸系列：
e s q p d p t p d e l h k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a
h d l iy n I s d k k l k n y d k v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n
SEQ ID NO.22的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：92个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由4个完整的α螺旋和4个β折叠构成。其中氨基酸残基7-11，13-17，21-29，70-78，分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基32-39，47-53，62-68，81-86分别形成四个β折叠结构。除7-11，13-17形成的两个α螺旋外，其他两个α螺旋和四个β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
编码SEC2-11的基因sec2-11，具有序列表SEQ ID NO：21中核苷酸序列。
G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C
A C A A A T C A A G T G A G T T T A C T G G T A C G A T G G G T A A
T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T C A G
C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A
C A T G A T T T A A T T T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T
A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A G T T A T T A
A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G
T A G T T G A T G T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C
SEQ ID NO.21的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：276碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
(L)超抗原基因工程肽SEC2-12，具有序列表SEQ ID NO：24中的氨基酸系列：
k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a h d l i y n I s d k k l
k n y dk v k t e l l n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n
SEQ ID NO.24的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：80个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由3个完整的α螺旋和4个β折叠构成。其中氨基酸残基1-5，9-17，58-66，分别形成三个完整的α螺旋结构；氨基酸残基20-27，35-41，50-56，69-74分别形成四个β折叠结构。除1-5形成的一个α螺旋外，其他两个α螺旋和四个β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
编码SEC2-12的基因sec2-12，具有序列表SEQ ID NO：23中核苷酸序列。
A A A T C A A G T G A G T T T A C T G G T A C G A T G G G T A A T A T
G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T C A G C A A
C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A C A T
G A T T T A A T T T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T A A A
A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A G T T A T T A A A T
G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G T A G
T T G A T G T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C
SEQ ID NO.23的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：240碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
(M)超抗原基因工程肽SEC2-13，具有序列表SEQ ID NO：26中的氨基酸系列：
g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a h d l i y n I s d k k l k n y d k
v k t e ll n e d l a k k y k d e v v d v y g s n y y v n
SEQ ID NO.26的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：74个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由2个完整的α螺旋和4个β折叠构成。其中氨基酸残基3-11，70-78，分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基14-21，29-35，44-50，63-68分别形成四个β折叠结构。两个α螺旋和四个β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
编码SEC2-13的基因sec2-13，具有序列表SEQ ID NO：25中核苷酸序列。
G G T A C G A T G G G T A A T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A
T C A T T A T G T A T C A G C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G
A T A A A T T T T T G G C A C A T G A T T T A A T T T A T A A C A T T
A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A
A A A C A G A G T T A T T A A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A
G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T G T G T A T G G A T C A
A A T T A C T A T G T A A A C
SEQ ID NO.25的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：222碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
(N)超抗原基因工程肽SEC2-14，具有序列表SEQ ID NO：28中的氨基酸系列：
e s q p d p t p d e l h k s s e ft g t m g n m k y l y d d h y v s a t k v m s v d k fl a
h d l Iy n I s d k k l k n y d k v k t e l l
SEQ ID NO.28的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：69个氨基酸
*类型：肽链
*链型：单链
*结构：二级结构由3个完整的α螺旋和3个β折叠构成。其中氨基酸残基7-11，13-17，21-29分别形成四个完整的α螺旋结构；氨基酸残基32-39，47-53，62-68分别形成三个β折叠结构。除7-11，13-17形成的两个α螺旋外，其他一个α螺旋和三个β折叠在三维结构中形成一个独立的结构域。
(b)分子类型：成熟肽链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
编码SEC2-14的基因sec2-14，具有序列表SEQ ID NO：27中核苷酸序列。
G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T
T G C A C A A A T C A A G T G A G T T T A C T G G T A C G A T
G G G T A A T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T
T A T G T A T C A G C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G
A T A A A T T T T T G G C A C A T G A T T T A A T T T A T A A C
A T T A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A T T A T G A C A
A A G T G A A A A C A G A G T T A T T A
SEQ ID NO.27的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：207碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：金黄色葡萄球菌(Stahylococcus aureus)
(2)编码超抗原基因工程肽的全基因sec2-1、sec2-2、sec2-3、sec2-4、sec2-5、sec2-6、sec2-7、sec2-8、sec2-9、sec2-10、sec2-11、sec2-12、sec2-13和sec2-14的PCR扩增
1)金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取
接种金黄色葡萄球菌单菌落于5ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养，取1.5ml的培养物离心收集菌体。提取金黄色葡萄球菌基因组DNA(基因组DNA提取操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley&Sons出版社1995年第三版P39-40)。
2)PCR引物设计及反应条件：
分别设计合成PCR引物用来扩增sec2-1、sec2-2、sec2-3、sec2-4、sec2-5、sec2-6、sec2-7、sec2-8、sec2-9、sec2-10、sec2-11、sec2-12、sec2-13和sec2-14的基因片断，引物序列如上述发明内容外所述；
PCR反应体系为：10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板金黄色葡萄球菌基因组DNA 0.1μg、ExTaq DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50μl。
各基因片断的PCR反应条件均为：
第一阶段95℃，5分钟；
第二阶段94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，60秒(除sec1-5片断，sec1-5片断采用90秒)；共30个循环；
第三阶段72℃，10分钟；
3)SEC2基因的鉴定：各片断PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见附图1、2所示)，切下相应大小的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；回收产物分别与pGEM-T克隆载体连接，构建成一系列超抗原基因工程肽的基因克隆载体pGEM-T-sec2-1、pGEM-T-sec2-2、pGEM-T-sec2-3、pGEM-T-sec2-4、pGEM-T-sec2-5、pGEM-T-sec2-6、pGEM-T-sec2-7、pGEM-T-sec2-8、pGEM-T-sec2-9、pGEM-T-sec2-10、pGEM-T-sec2-11、pGEM-T-sec2-12、pGEM-T-sec2-13和pGEM-T-sec2-14。连接反应按Promega公司产品pGEM-T试剂盒使用说明书。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)，筛选阳性克隆并以Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列。
实施例2
超抗原基因工程肽的表达
1)超抗原基因工程肽表达载体的构建：分别将基因克隆载体pGEM-T-sec2-1、pGEM-T-sec2-2、pGEM-T-sec2-3、pGEM-T-sec2-4、pGEM-T-sec2-5、pGEM-T-sec2-6、pGEM-T-sec2-7、pGEM-T-sec2-8、pGEM-T-sec2-9、pGEM-T-sec2-10、pGEM-T-sec2-11、pGEM-T-sec2-12、pGEM-T-sec2-13和pGEM-T-sec2-14质粒DNA以EcoRI、XhoI双酶切，胶回收试剂盒回收相应的超抗原基因工程肽的基因片段。以T4DNA连接酶分别连接入经同样双酶切的pET-28a表达载体，构建成表达载体pET-28a-sec2-1、pET-28a-sec2-2、pET-28a-sec2-3、pET-28a-sec2-4、pET-28a-sec2-5、pET-28a-sec2-6、pET-28a-sec2-7、pET-28a-sec2-8、pET-28a-sec2-9、pET-28a-sec2-10、pET-28a-sec2-11、pET-28a-sec2-12、pET-28a-sec2-13和pET-28a-sec2-14。转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经Sanger双脱氧末端终止法测序鉴定正确重组克隆。
2)超抗原基因工程肽的诱导表达和纯化：分别接种转化了各表达载体质粒的BL21(DE3)单菌落于含40μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1％接种量转接下一级，37℃摇床培养至OD600为0.6，加入终浓度1.0mmol/L的IPTG，30℃诱导表达6小时。
分别离心收集菌体，重悬于1/5体积的平衡缓冲液(20mMTirs-HCl，0.5M NaCl，20mM imidazole，pH7.9)，以0.5ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲和层析柱；以含50mM imidazole的平衡缓冲液洗涤10个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；最后以洗脱缓冲液(20mMTirs-HCl，0.5M NaCl，200mM imidazole，pH7.9)洗脱下目的产物既各超抗原基因工程肽SEC2-1、SEC2-2、SEC2-3、SEC2-4、SEC2-5、SEC2-6、SEC2-7、SEC2-8、SEC2-9、SEC2-10、SEC2-11、SEC2-12、SEC2-13和SEC2-14。
洗脱产物经透析法除盐浓缩。
实施例3
超抗原基因工程肽的超抗原活性
取正常新鲜人外周血抗凝后，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度，以1×105cells/well加到96孔板中，分别将经纯化的各超抗原基因工程肽SEC2-1、SEC2-2、SEC2-3、SEC2-4、SEC2-5、SEC2-6、SEC2-7、SEC2-8、SEC2-9、SEC2-10、SEC2-11、SEC2-12、SEC2-13和SEC2-14终浓度50ng/ml加入各孔，以BSA作为阴性对照，SEC2标准品作为阳性对照，每样3个复孔。按常规条件培养96h，加入50ul/well的MTT液。继续培养4h，1000r/min离心收集细胞，加入DMSO120ul/well，溶解15min后，酶标仪上以570nm测定各孔的吸光值(参见附图3所示，超抗原基因工程肽刺激外周血单个核细胞增殖实验)。
实验结果显示，微量的本发明中的超抗原基因工程肽即可有效的刺激人外周血单个核细胞(PBMC)产生增殖。其刺激能力与SEC2标准品相比未有较显著降低。其中SEC2-1、SEC2-4、SEC2-5和SEC2-8因未破坏超抗原主要功能区且分子量较SEC2有所减小，等同质量浓度下显示出与SEC2标准品相当的PBMC刺激增殖能力。该实验结果说明本发明中的一系列超抗原基因工程肽都具有一定的超抗原生物活性，其强大的体外刺激PBMC增殖能力显示出利用本发明中的系列超抗原基因工程肽作为新型抗肿瘤生物制剂，具有巨大的开发潜力。

Claims (4)

1.SEC2超抗原基因工程肽，其特征在于：分别为下列任意氨基酸序列之一，
SEC2-1具有序列表SEQ ID NO：2中氨基酸序列；
SEC2-2具有序列表SEQ ID NO：4中氨基酸序列；
SEC2-3具有序列表SEQ ID NO：6中氨基酸序列；
SEC2-4具有序列表SEQ ID NO：8中氨基酸序列；
SEC2-5具有序列表SEQ ID NO：10中氨基酸序列；
SEC2-6具有序列表SEQ ID NO：12中氨基酸序列；
SEC2-7具有序列表SEQ ID NO：14中氨基酸序列；
SEC2-8具有序列表SEQ ID NO：16中氨基酸序列；
SEC2-9具有序列表SEQ ID NO：18中氨基酸序列；
SEC2-10具有序列表SEQ ID NO：20中氨基酸序列；
SEC2-11具有序列表SEQ ID NO：22中氨基酸序列；
SEC2-12具有序列表SEQ ID NO：24中氨基酸序列；
SEC2-13具有序列表SEQ ID NO：26中氨基酸序列；
或SEC2-14具有序列表SEQ ID NO：28中氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述基因工程肽的编码基因，其特征在于：分别对应于下列核苷酸序列之一，
SEC2-1对应的基因具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列；
SEC2-2对应的基因具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列；
SEC2-3对应的基因具有序列表SEQ ID NO：5中碱基序列；
SEC2-4对应的基因具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列；
SEC2-5对应的基因具有序列表SEQ ID NO：9中碱基序列；
SEC2-6对应的基因具有序列表SEQ ID NO：11中碱基序列；
SEC2-7对应的基因具有序列表SEQ ID NO：13中碱基序列；
SEC2-8对应的基因具有序列表SEQ ID NO：15中碱基序列；
SEC2-9对应的基因具有序列表SEQ ID NO：17中碱基序列；
SEC2-10对应的基因具有序列表SEQ ID NO：19中碱基序列；
SEC2-11对应的基因具有序列表SEQ ID NO：21中碱基序列；
SEC2-12对应的基因具有序列表SEQ ID NO：23中碱基序列；
SEC2-13对应的基因具有序列表SEQ ID NO：25中碱基序列；
或SEC2-14对应的基因具有序列表SEQID NO：27中碱基序列。
3.一种权利要求1所述SEC2超抗原基因工程肽的异源表达方法，其特征在于：
将编码这一系列SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列sec2-1、sec2-2、sec2-3、sec2-4、sec2-5、sec2-6、sec2-7、sec2-8、sec2-9、sec2-10、sec2-11、sec2-12、sec2-13或sec2-14分别克隆入表达载体pET-28a，以大肠杆菌BL21为宿主菌，构建成异源表达超抗原活性基因工程肽的基因工程菌，在培养基中异源表达有超抗原活性的SEC2-1、SEC2-2、SEC2-3、SEC2-4、SEC2-5、SEC2-6、SEC2-7、SEC2-8、SEC2-9、SEC2-10、SEC2-11、SEC2-12、SEC2-13或SEC2-14基因工程肽。
4.按照权利要求3所述异源表达方法，其特征在于：
所述编码SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列的克隆方法如下，
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-1-F：  5’gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3’和sec2-1-R：5’gCCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3’通过PCR技术扩增出sec2-1基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-2-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTAC 3’和sec2-2-R：5’gCTCgAgTTAgTggTTTCCTTCATg 3’通过PCR技术扩增出sec2-2基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-3-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgA 3’和sec2-3-R：5’gCCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3’通过PCR技术扩增出sec2-3基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-4-F：5’GAATTCGAGAGTCAACCAGACCCTA 3’和sec2-4-R：5’gCTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCA 3’通过PCR技术扩增出sec2-4基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-5-F：5’gAATTCggTACgATgggTAATATg 3’和sec2-5-R：5’CTCgAgTTATCCATTCTTTgTTgTAAggT 3’通过PCR技术扩增出sec2-5基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-6-F：5’gAATTCggTACgATgggTAATATg 3’和sec2-6-R：5’CTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCAT 3’通过PCR技术扩增出sec2-6基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-7-F：5’gAATTCggTACgATgggTAATATg 3’和sec2-7-R：5’CgCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3’通过PCR技术扩增出sec2-7基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-8-F：5’gAATTCgCAAAgAAgTACAAAgATg 3’和sec2-8-R：5’CgCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3’通过PCR技术扩增出sec2-8基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-9-F：5’ggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3’和sec2-9-R：5’CgCTCgAgTTATCCATACACATCAAC 3’通过PCR技术扩增出sec2-9基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-10-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgAC 3’和sec2-10-R：5’CgCTCgAgTTAATCTTTgTACTTC 3’通过PCR技术扩增出sec2-10基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-11-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3’和sec2-11-R：5’CCCgCTCgAgTTAGTTTACATAgTAAT 3’通过PCR技术扩增出sec2-11基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-12-F：5’gAATTCAAATCAAgTgAgTTTACTg 3’和sec2-12-R：5’CgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAAT 3’通过PCR技术扩增出sec2-12基因片段；
以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-13-F：5’gAATTCggTACgATgggTAATAT 3’和sec2-13-R：5’CCgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAA 3’通过PCR技术扩增出sec2-13基因片段；
或，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-14-F：5’gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3’和sec2-14-R：5’CgCTCgAgTTATAATAACTCTgTTTTCAC 3’通过PCR技术扩增出sec2-14基因片段。
CNA2007100111771A 2007-04-30 2007-04-30 Sec2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法 Pending CN101298474A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2007100111771A CN101298474A (zh) 2007-04-30 2007-04-30 Sec2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2007100111771A CN101298474A (zh) 2007-04-30 2007-04-30 Sec2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101298474A true CN101298474A (zh) 2008-11-05

Family

ID=40078443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007100111771A Pending CN101298474A (zh) 2007-04-30 2007-04-30 Sec2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101298474A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102633867A (zh) * 2011-02-15 2012-08-15 中国科学院沈阳应用生态研究所 抗原性改变的肠毒素c2突变体及编码基因与制备和应用
CN102718847A (zh) * 2011-03-30 2012-10-10 沈阳协合集团有限公司 一种小分子超抗原改造体蛋白及其编码基因与制备和应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102633867A (zh) * 2011-02-15 2012-08-15 中国科学院沈阳应用生态研究所 抗原性改变的肠毒素c2突变体及编码基因与制备和应用
CN102718847A (zh) * 2011-03-30 2012-10-10 沈阳协合集团有限公司 一种小分子超抗原改造体蛋白及其编码基因与制备和应用
CN102718847B (zh) * 2011-03-30 2014-09-24 沈阳协合集团有限公司 一种小分子超抗原改造体蛋白及其编码基因与制备和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Isolation and characterization of a novel thermostable lectin from the wild edible mushroom Agaricus arvensis
CN102146413B (zh) 一种人重组白介素-3的表达纯化方法
CN101298474A (zh) Sec2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法
CN102199201B (zh) 灵芝属内重组的真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用
CN102633867A (zh) 抗原性改变的肠毒素c2突变体及编码基因与制备和应用
CN103710367A (zh) 一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法
CN101113165B (zh) Sec2超抗原基因工程肽及其编码基因和异源表达方法
CN101457219A (zh) 一种肠毒素c2蛋白的制备方法
CN102212541B (zh) 一种表达重组阳离子抗菌肽g13大肠杆菌基因工程菌的构建
CN101560248A (zh) 减毒肠毒素c2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用
CN1908015B (zh) 能抑制her2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽
CN102199202B (zh) 灵芝属间的重组真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用
CN101423834A (zh) 肠毒素c2超抗原突变蛋白基因的克隆和异源表达方法
CN102718846B (zh) 活性增强的sec2突变蛋白及编码基因与制备和应用
CN103923938A (zh) 藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达
CN102060916A (zh) 肠毒素c2超抗原突变蛋白和编码基因及其制备和应用
CN104178494A (zh) 一种人白介素2的制备工艺及其应用
CN108840934B (zh) 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法
CN103266105A (zh) 通过翻译暂停序列理性重设计改善蛋白质可溶性表达的方法
CN101045923B (zh) 生产一种白细胞介素类似物的方法
CN101597612A (zh) 一种超抗原活性增强的sec2突变基因及其制备方法
CN102168057B (zh) 表达多活性肽的工程菌及制备混合多肽的方法
CN104130308A (zh) 一种蛋白质定点peg修饰的方法及所得peg修饰的蛋白质
CN106188255B (zh) 一种真菌免疫调节蛋白FIP-dsq2及其应用
CN102337282A (zh) 一种溶栓蛋白酶基因nks1及用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20081105

C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned