CN101297032A - 具有新切割特异性的I-CreI归巢核酸内切酶变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种改造出能够切割突变的I－CreI位点的I－CreI归巢核酸内切酶变体的方法，所述位点在±8到±10位有改变。本发明涉及可获得自所述方法的I－CreI归巢核酸内切酶变体、编码所述变体的载体、经所述载体修饰的细胞、动物或植物。所述I－CreI核酸内切酶变体及其衍生产物在遗传工程、基因组治疗和抗病毒治疗中的用途。

Description

具有新切割特异性的I-CreI归巢核酸内切酶变体及其用途
本发明涉及一种改造出能够切割突变I-CreI位点的I-CreI归巢核酸内切酶变体的方法，所述突变I-CreI位点在±8到±10位有改变。本发明还涉及可得自所述方法的I-CreI归巢核酸内切酶变体、编码所述变体的载体、经所述载体修饰的细胞、动物或植物，并涉及所述I-CreI核酸内切酶变体及其衍生产物在遗传工程、基因组治疗和抗病毒治疗中的用途。
大范围核酸酶是具有大(＞14bp)切割位点的序列特异性核酸内切酶，其可引发活细胞中特定基因座的DNA双链断裂(double-strandbreak，DSB)(Thierry和Dujon，Nucleic Acids Res.，1992，20，5625-5631)。大范围核酸酶已用于在培养的细胞和植物中刺激其靶序列周围发生同源重组(Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-106；Choulika等，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-73；Donoho等，Mol.Cell.Biol，1998，18，4070-8；Elliott等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，93-101；Sargent等，Mol.Cell.Biol.，1997，17，267-77；Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，5055-60；Chiurazzi等，Plant Cell，1996，8，2057-2066)，这使得大范围核酸酶诱导的重组成为用于基因组工程的有效且有力的方法。大范围核酸酶诱导重组的应用长期以来受到天然大范围核酸酶种类的限制，当前技术的主要限制在于需要预先在目的基因座引入大范围核酸酶切割位点。
因此，人们对产生具有特定底物特异性的人工大范围核酸酶进行了深入地研究。这样的蛋白质可用于切割真正的染色体序列，并开启了基因组工程在多种应用中的新前景。例如，大范围核酸酶可用于诱导修正与单基因遗传病相关的突变，避免目前基因治疗方法中使用的随机插入转基因所导致的风险(Hacein-Bey-Abina等，Science，2003，302，415-419)。
最近，Cys2-His2型锌指蛋白(ZFP)的锌指DNA结合结构域可与FokI核酸内切酶的催化结构域融合，从而诱导多种类型细胞(包括人淋巴样细胞)中的重组(Smith等，Nucleic Acids Res，1999，27，674-81；Pabo等，Annu.Rev.Biochem，2001，70，313-40；Porteus和Baltimore，Science，2003，300，763；Urnov等，Nature，2005，435，646-651；Bibikova等，Science，2003，300，764)。ZFP的结合特异性相对容易操作，目前得到了一组能够结合许多(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn序列的新的人工ZFP(Pabo等，如前引用；Segal和Barbas，Curr.Opin.Biotechnol.，2001，12，632-7；Isalan等，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-60)。但是，保持非常窄的底物特异性是基因组工程应用的主要问题之一，目前尚不清楚ZFP是否满足治疗应用极其严格的要求。另外，已证明这些融合蛋白质在细胞中具有高毒性(Porteus和Baltimore，如前引用；Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175)，这可能是由于特异性水平低所致。
在自然界中，大范围核酸酶基本上以归巢核酸内切酶(homingendonuclease，HE)为代表，归巢核酸内切酶是由可移动遗传元件(mobile genetic element)编码的核酸内切酶家族，其功能是在被称为“归巢”的过程中起始由DNA双链断裂(DSB)诱导的重组事件(Chevalier和Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-74；Kostriken等，Cell；1983，35，167-74；Jacquier和Dujon，Cell，1985，41，383-94)。在细菌、真核生物和古细菌中已鉴定出数百种HE(Chevalier和Stoddard，如前引用)；但是在所选基因中找到HE切割位点的可能性是非常低的。
由于其生物学功能以及在效率和特异性方面出色的切割特性，HE提供了理想的骨架来衍生出用于基因组工程的新核酸内切酶。在过去十年中积累了数据，其表征了四个HE家族中最大的LAGLIDADG家族(Chevalier和Stoddard，如前引用)。LAGLIDADG指整个家族中唯一事实上保守的序列，并发现其在所述蛋白质中以一个或(更经常)两个拷贝存在。具有单基序的蛋白质(例如I-CreI)形成同源二聚体，并切割回文或假回文的DNA序列，而较大的双基序蛋白质(例如I-SceI)是单体，并切割非回文靶标。已结晶了七种不同的LAGLIDADG蛋白，它们的核心结构表现出非常显著的保守性，这与其一级序列水平缺乏相似性形成对比(Jurica等，Mol.Cell.，1998，2，469-76；Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-6；Chevalier等J.Mol.Biol.，2003，329，253-69；Moure等，J.Mol.Biol，2003，334，685-95；Moure等，Nat.Struct.Biol.，2002，9，764-70；Ichiyanagi等，J.Mol.Biol.，2000，300，889-901；Duan等，Cell，1997，89，555-64；Bolduc等，Genes Dev.，2003，17，2875-88；Silva等，J.Mol.Biol.，1999，286，1123-36)。在该核心结构中，两个特征性的αββαββα折叠(也称作LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域，其来自两个单体或者两个LAGLIDAG蛋白的两个结构域)彼此相对并且双重对称。DNA结合依赖于来自每个结构域的4个β链，所述4个β链折叠成反向平行β片层并在DNA螺旋大沟上形成鞍(saddle)。对与其天然靶标结合的I-CreI结构的分析显示，在每个单体中，8个残基(Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68和R70)与±3、4、5、6、7、9和10位的7个碱基建立了直接的相互作用(Jurica等，1998，如前引用)。另外，某些残基与若干碱基建立了水介导的接触；例如S40、K28和N30与+8和-8位的碱基对(Chevalier等，2003，如前引用)。催化核心位于中央，两个对称单体/结构域均有贡献。除了该核心结构之外，还可发现其它结构域：例如，PI-SceI(一种内含肽)具有蛋白质剪接结构域以及另外的DNA结合结构域(Moure等，2002，如前引用；Grindl等，Nucleic AcidsRes.，1998，26，1857-62)。
两种从归巢核酸内切酶衍生新大范围核酸酶的方法正在研究之中：
-杂合或嵌合的单链蛋白质
可通过交换不同单体的LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域来获得新的大范围核酸酶(Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-62；Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10，895-905；Steuer等，Chembiochem.，2004，5，206-13；国际PCT申请WO 03/078619和WO2004/031346)。这些单链嵌合大范围核酸酶能够切割杂合靶标，所述杂合靶标相当于两种亲本DNA靶标序列一半的融合，其中来自不同大范围核酸酶的两个LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域由间隔区相连。这些结果意味着，I-CreI二聚体的两个DNA结合结构域独立地起作用；每个DNA结合结构域结合DNA靶位点之不同的一半。构建嵌合且单链的人工HE提示，组合的方法可用于获得切割新(非回文)靶序列的新大范围核酸酶：可将不同的单体或核心结构域融合在单个蛋白质中，从而实现新的特异性。
但是，因为得到的新靶标是衍生自两种不同的DNA靶标半位点的组合，该方法不会显著增加可作为归巢核酸内切酶靶标的DNA序列数。
-蛋白质变体
通过诱变和筛选/选择改变DNA结合蛋白的底物特异性常被证明是困难的(Lanio等，Protein Eng.，2000，13，275-281；Voziyanov等，J.Mol.Biol.，2003，326，65-76；Santoro等，P.N.A.S.，2002，99，4185-4190；Buchholz和Stewart，Nat.Biotechnol.，2001，19，1047-1052)，更具体地，改造HE的DNA结合结构域长期以来被认为是难以完成的任务(Ashworth等，Nature 2006，441，656-659；Gimble等，J.Mol.Biol.，2003，334，993-1008；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Doyon等，J.Am.Chem.Soc.，2006，128，2477-2484；Steuer等，如前引用；Seligman等，Nucleic Acids Res.，2002，30，3870-3879)。
对I-CreI/DNA晶体结构的分析表明，9个氨基酸与归巢位点直接接触(Chevalier等，2003；Jurica等，如前引用)，所述归巢位点的随机改变将得到209种组合，该数目超过了任何目前的筛选能力。
因此，几个实验室基于半推理性方法(Chica等，Curr.Opin.Biotechnol.，2005，16，378-384)来限制待处理突变体文库的多样性：根据结构数据选择一小组相关残基。尽管如此，这仍然不足以产生切割所选序列的重新设计的核酸内切酶：
Seligman及其同事使用推理性方法来替换I-CreIαββαββα折叠中特定的单残基(Sussman等，J.Mol.Biol.，2004，342，31-41；Seligman等，Nucleic Acids Res.，2002，如前引用；Seligman等，Genetics，1997，147，1653-64)。然而，仅在极少的I-CreI变体(Y33C、Y33H、Y33R、Y33L、Y33S、Y33T、S32K、S32R)中观察到显著地切割，并且只针对在±10位经修饰的靶标。
以类似的方式，Gimble等(如前引用)修饰了PI-SceI的另外的DNA结合结构域；他们获得了结合特异性改变而底物特异性不变的变体蛋白质，并且大多数所述蛋白质对野生型靶标序列保持了大部分亲和力。
为了获得更大数量的序列，能够得到具有新底物特异性(即能够切割不被亲本归巢核酸内切酶或迄今为止已分离的极少数变体所切割的DNA靶标)的其它归巢核酸内切酶变体是极其有意义的。
具体地，得到能够切割新DNA靶标的归巢核酸内切酶变体是极其有意义的，其中野生型大范围核酸酶DNA靶标的几个核苷酸已被同时突变。
然而，因为HE的DNA结合界面非常致密，并且负责基本上所有碱基特异性相互作用的两个不同的ββ发夹是单个折叠的一部分，所以此方法并不容易。因此，与在数个位点发生突变的靶标结合所必需的若干邻近氨基酸的突变可破坏结合界面的结构。
本发明人已改造了数百个新的I-CreI变体，其总共靶向在±10、±9和±8位具有差异的所有64种可能的突变I-CreI位点。这些具有新底物特异性(针对核苷酸±8、±9和/或±10)的变体增加了可作为大范围核酸酶靶标的DNA序列的数目。潜在的应用包括遗传工程、基因组工程、基因治疗和抗病毒治疗。
因此，本发明涉及改造出具有经修饰的切割特异性的I-CreI归巢核酸内切酶变体的方法，其包括至少以下步骤：
(a)用选自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、W和Y的氨基酸替换I-CreI中β1β2发夹的K28、N30、Y33、Q38和/或S40中的至少一个氨基酸；
(b)选择和/或筛选来自步骤(a)的能够切割DNA靶序列的I-CreI变体，所述DNA靶序列由突变的I-CreI位点组成，其中至少-9到-8位的aa核苷酸二联体和/或+8到+9位的tt核苷酸二联体被不同的核苷酸二联体所替换。
定义
-本文中根据单字母代码指代多肽序列中的氨基酸残基，其中，例如，K意为Lys或赖氨酸残基，N意为Asn或天冬酰胺残基，Y意为Tyr或酪氨酸残基。
-核苷酸的指代如下：使用单字母代码指代核苷的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸而言，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y代表t或c(嘧啶核苷酸)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，以及n代表g、a、t或c。
-“I-CreI”指具有SWISSPROT P05725或pdb登记码1g9y的序列的野生型I-CreI。
-“I-CreI变体”或“变体”指通过用不同的氨基酸替换I-CreI的至少一个氨基酸而获得的蛋白质。
-“功能性I-CreI变体”指能够切割DNA靶标(优选不被I-CreI切割的DNA靶标)的I-CreI变体。例如，这样的变体在接触DNA靶序列或者直接或间接与所述DNA靶标相互作用的位点具有氨基酸改变。
-“归巢核酸内切酶结构域”或“结构域”指与归巢核酸内切酶DNA靶标的一半相互作用并且能够与同一归巢核酸内切酶的另一结构域(与DNA靶标的另一半相互作用)相关联的区域，从而形成能够切割所述DNA靶标的功能性核酸内切酶。
-“核心结构域”指“LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域”，其是LAGLIDADG家族归巢核酸内切酶的特征性α1β1β2α2β3β4α3折叠，对应于约100个氨基酸残基的序列。所述结构域包含4个折叠成反向平行β片层的β链(β1、β2、β3、β4)，所述β片层与DNA靶标的一半相互作用。例如，在二聚体归巢核酸内切酶I-CreI(163个氨基酸)的情形中，所述LAGLIDADG归巢核酸内切酶的核心结构域对应于6到94位残基。在单体归巢核酸内切酶的情形中，两个这样的结构域存在于所述核酸内切酶的序列中；例如，在I-DmoI(194个氨基酸)中，第一结构域(7到99位残基)和第二结构域(104到194位残基)被短接头(100到103位残基)分隔开。
-“I-CreI位点”指被I-CreI切割的22到24bp的双链DNA序列。I-CreI位点包括野生型(天然)非回文I-CreI归巢位点和衍生出的回文序列，其在图1A中给出，例如也被称为C1221的序列5’-t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12(SEQ IDNO：3)。
-“DNA靶标”、“DNA靶序列”、“靶序列”、“靶标”、“识别位点”、“识别序列”、“归巢识别位点”、“归巢位点”、“切割位点”指22到24bp的双链回文、部分回文(假回文)或非回文多核苷酸序列，其被大范围核酸酶(例如LAGLIDADG归巢核酸内切酶，如I-CreI)或源自所述大范围核酸酶的变体或单链嵌合大范围核酸酶所识别并切割。这些术语指待由所述核酸内切酶诱导双链断裂(切割)的特定的DNA位置，优选基因组位置。用双链多核苷酸的一条链的5’到3’序列来定义DNA靶标。
-“DNA靶标半位点”指DNA靶标的一部分，其与每个LAGLIDADG归巢核酸内切酶核心结构域结合。
-“嵌合DNA靶标”或“杂合DNA靶标”指每个亲本大范围核酸酶DNA靶序列不同的一半的融合物。
-“具有新特异性的归巢核酸内切酶变体”指具有不同于亲本归巢核酸内切酶的切割靶标模式的变体。术语“新特异性”、“经修饰的特异性”、“新切割特异性”、“新底物特异性”指变体针对DNA靶序列核苷酸的特异性，它们是等同的以及无区别地加以使用。
-“载体”指能够运送与其相连的另一核酸的核酸分子。
-“同源的”指一序列与另一序列具有足以导致序列间发生同源重组的一致性，更具体地具有至少95％一致性，优选97％一致性，更优选99％。
-“一致性”指两个核酸分子或多肽间的序列一致性。可通过比较每个序列中的位点来确定一致性，所述序列可为了比较的目的而进行比对。当所比较序列的位点被相同碱基占据时，那么所述分子在此位点是一致的。核酸或氨基酸序列之间的相似或一致性程度是核酸序列共有位点处一致或匹配的核苷酸数目的函数。可使用多种比对算法和/或程序计算两个序列间的一致性，包括GCG序列分析软件包一部分(Universityof Wisconsin，Madison，Wis.)的FASTA或BLAST，并且可使用例如默认设置。
-“个体”包括哺乳动物以及其它一些脊椎动物(例如鸟类、鱼类和爬行类)。本文所使用的术语“哺乳动物”指任何哺乳喂养幼仔并且胎生(真哺乳亚纲(eutharian)或有胎盘哺乳类)或卵生(后哺乳亚纲(metatharian)或无胎盘哺乳类)的脊椎动物，包括单孔目动物、有袋目动物和有胎盘动物。哺乳动物物种的例子包括人和其它灵长类(例如猴、黑猩猩)、啮齿类(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和反刍动物(例如奶牛、猪、马)。
-“遗传病”指部分地或全部地、直接地或间接地由于一个或多个基因的异常所致的任何疾病。所述异常可以是突变、插入或缺失。所述突变可以是点突变。所述异常可影响基因的编码序列或其调节序列。所述异常可影响基因组序列的结构或者所编码mRNA的结构或稳定性。所述遗传病可以是隐性或显性的。这些遗传病可以是(但不限于)囊性纤维化病、亨廷顿舞蹈症、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、成肝细胞瘤、威尔逊病、先天性肝卟啉病、肝代谢遗传性疾病、莱-尼综合征、镰状细胞贫血、地中海贫血、着色性干皮病、范科尼贫血、视网膜色素变性、毛细血管扩张性共济失调、布卢姆综合征、成视网膜细胞瘤、迪谢纳肌营养不良和泰-萨病。
根据本发明的方法，将步骤a)中的氨基酸突变引入野生型I-CreI或其功能性变体中。步骤a)可包括引入另外的突变，尤其在接触DNA靶序列或者直接或间接与所述DNA靶标相互作用的其它位点处。功能性变体包含不影响所述蛋白质结构的突变。例如，可将步骤(a)中的氨基酸突变引入包含一个或多个选自下述的突变I-CreI变体中：
24位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I24V)，
70位的精氨酸突变为丝氨酸(R70S)，和
75位的天冬氨酸突变为不带电荷的氨基酸，优选天冬酰胺(D75N)或缬氨酸(D75V)。
可通过产生如国际PCT申请WO 2004/067736中所述的变体文库来实施步骤a)。
如国际PCT申请WO 2004/067736中所述，可通过使用体外或体内切割测定实施步骤(b)中的选择和/或筛选。
根据所述方法的一个有利的实施方案，步骤b)中的DNA靶标衍生自选自C1234、C4334和C1221的I-CreI位点(SEQ ID NO：1到3，图1A)。
根据所述方法的另一有利的实施方案，步骤b)中的DNA靶标包含
具有下式的序列：
c-11n-10n-9n-8m-7y-6n-5n-4n-3k-2y-1r+1m+2n+3n+4n+5r+6k+7n+8n+9n+10g+11(I)
其中n是a、t、c或g，m是a或c，y是c或t，k是g或t，r是a或g(SEQ ID NO：75)，只要当n-9n-8是aa时，n+8n+9不是tt，并且当n+8n+9是tt时，n-9n-8不是aa即可。
根据所述方法的一个优选实施方案，n-5n-4n-3是gtc和/或n+3n+4n+5是gac。
步骤b)中的DNA靶标可以是回文的、非回文的或假回文的。优选地，-11到-8位和+8到+11位的核苷酸序列和/或-5到-3位和/或+3到+5位的核苷酸序列是回文的。
根据所述方法的另一有利的实施方案，步骤b)中的DNA靶标包含-9到-8位的核苷酸二联体(其选自：ag、at、ac、ga、gg、gt、gc、ta、tg、tt、cg、ct或cc)和/或+8到+9的核苷酸二联体(其为-9到-8位所述核苷酸二联体的反向互补序列，即ct、ta、gt、tc、cc、ac、gc、at、ca、aa、cg、ag或gg)。
根据所述方法的另一有利的实施方案，步骤b)中的DNA靶标还包括用不同的核苷酸替换I-CreI位点-10位的核苷酸a和/或+10位的核苷酸t。
优选地，所述DNA靶标包含-10到-8位的核苷酸三联体(其选自：aac、aag、aat、acc、acg、act、aga、agc、agg、agt、ata、atg、cag、cga、cgg、ctg、gac、gag、gat、gcc、gga、ggc、ggg、ggt、gta、gtg、gtt、tac、tag、tat、tcc、tga、tgc、tgg、tgt或ttg)和/或+8到+10位的核苷酸三联体(其为-10到-8位所述核苷酸三联体的反向互补序列)。
根据所述方法的另一有利的实施方案，在某些条件下体内实施步骤(b)，在所述条件中：所述变体使得突变的DNA靶序列发生双链断裂，该双链断裂通过所述DNA双链断裂的重组介导的修复而导致正选择标记或报告基因的活化或者负选择标记或报告基因的失活。
例如，可在酵母或哺乳动物细胞中使用报告载体利用同向重复重组测定来检测本发明I-CreI变体的切割活性，如PCT申请WO2004/067736中所述。所述报告载体包含两个拷贝的截短的非功能性报告基因(同向重复)和间插序列之中的DNA靶序列，其被克隆入酵母或哺乳动物表达载体中(图2)。通过替换±8到10位的一至三个核苷酸，所述DNA靶序列从I-CreI位点衍生出(如C1221)(图1B)。能够切割所述DNA靶序列的功能性I-CreI变体的表达诱导同向重复之间的同源重组，得到功能性报告基因，其表达可通过适当的测定进行监测。
根据所述方法的另一有利的实施方案，它包括另外的步骤c1)，其表达步骤b)中获得的一种变体从而允许形成同源二聚体。
根据所述方法的另一有利的实施方案，它包括另外的步骤c2)，其共表达步骤b)中获得的一种变体和I-CreI或其功能性变体，从而允许形成异源二聚体。优选地，共表达步骤b)中获得的两种不同的变体。
例如，可通过编码所述变体的一种或两种重组表达载体对宿主细胞进行修饰。然后在允许表达变体的条件下培养所述细胞，然后从细胞培养物中回收形成的同源/异源二聚体。
根据本发明的方法，可通过将步骤b)中获得的一种变体与归巢核酸内切酶结构域/单体进行融合来构建单链嵌合核酸内切酶。所述结构域/单体可来自野生型归巢核酸内切酶或其功能性变体。
构建源自归巢核酸内切酶的单链嵌合分子的方法是本领域公知的(Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-62；Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10，895-905；Steuer等，Chembiochem.，2004，5，206-13；国际PCT申请WO 03/078619和WO 2004/031346)。可使用任何这样的方法构建源自本发明所定义变体的单链嵌合分子。
本发明的主题还包括可通过上文所述方法获得的I-CreI大范围核酸酶变体，所述变体能够切割由突变的I-CreI位点组成的DNA靶序列，其中至少-9和-8位核苷酸a中的一个或者+8和+9位核苷酸t中的一个被不同的核苷酸所替换。
根据所述I-CreI变体的一个有利的实施方案，它在38位是精氨酸(R)或赖氨酸(K)；在38位是R或K的变体能够切割包含-9位鸟嘌呤或+9位胞嘧啶的DNA靶标。
所述变体可选自在28、30、33、38和40位分别具有选自以下氨基酸残基的变体：Q28/N30/Y33/K38/R40，R28/N30/K33/R38/Q40，
Q28/N30/R33/R38/R40，Q28/N30/Y33/K38/K40，K28/N30/T33/R38/Q40，K28/N30/S33/R38/E40，S28/N30/Y33/R38/K40，K28/N30/S33/R38/D40，K28/N30/S33/R38/S40，Q28/N30/Y33/R38/K40，Q28/N30/K33/R38/T40，N28/N30/S33/R38/K40，N28/N30/S33/R38/R40，E28/N30/R33/R38/K40，R28/N30/T33/R38/A40，Q28/N30/Y33/R38/A40，Q28/N30/Y33/R38/S40，K28/N30/R33/K38/A40，R28/N30/A33/K38/S40，A28/N30/N33/R38/K40，Q28/N30/S33/R38/K40，K28/A30/H33/R38/S40，K28/H30/H33/R38/S40，K28/E30/S33/R38/S40，K28/N30/H33/R38/S40，K28/D30/H33/K38/S40，K28/K30/H33/R38/S40，K28/S30/H33/R38/S40和K28/G30/V33/R38/S40。
根据所述I-CreI变体的另一有利的实施方案，它在28、30、33、38和40位分别具有选自以下的氨基酸残基：Q28/N30/Y33/K38/R40，
R28/N30/K33/R38/Q40，Q28/N30/R33/R38/R40，Q28/N30/Y33/K38/K40，Q28/N30/T33/Q38/K40，Q28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/T33/Q38/R40，S28/N30/R33/S38/R40，N28/N30/Y33/Q38/R40，K28/N30/T33/R38/Q40，K28/N30/S33/R38/E40，Q28/N30/N33/Q38/K40，S28/N30/Y33/R38/K40，K28/N30/S33/R38/D40，K28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/S33/R38/S40，R28/N30/R33/D38/R40，A28/N30/S33/Q38/R40，Q28/N30/Y33/R38K/40，Q28/N30/K33/R38/T40，R28/N30/A33/Y38/Q40，K28/N30/R33/Q38/E40，N28/N30/S33/R38/K40，N28/N30/S33/R38/R40，Q28/N30/Y33/Q38/K40，Q28/N30/Y33/Q38/R40，S28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/Q38/K40，E28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/N33/Q38/A40，S28/N30/Y33/Q38/K40，T28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/R33/T38/Q40，K28/N30/R33/T38/R40，Q28/N30/E33/D38/H40，R28/N30/Y33/N38/A40，Q28/N30/Y33/T38/R40，R28/N30/T33/R38/A40，H28/N30/Y33/D38/S40，Q28/N30/Y33/R38/A40，Q28/N30/Y33/A38/R40，S28/N30/Q33/A38/A40，Q28/N30/Y33/E38/K40，T28/N30/N33/Q38/R40，Q28/N30/Y33/R38/S40，K28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/A38/R40，Q28/N30/N33/Q38/R40，R28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/R33/A38/R40，K28/N30/T33/A38/A40，K28/N30/R33/K38/A40，R28/N30/A33/K38/S40，K28/N30/R33/N38/A40，T28/N30/E33/S38/D40，R28/N30/N33/Q38/D40，R28/N30/R33/Y38/Q40，K28/N30/Y33/Q38/N40，K28/N30/R33/S38/S40，K28/N30/R33/Y38/A40，A28/N30/N33/R38/K40，K28/N30/R33/A38/T40，K28/N30/R33/N38/Q40，T28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Y40，Q28/N30/S33/R38/K40，R28/N30/Y33/Q38/S40，Q28/N30/R33/Q38/R40，K28/N30/R33/A38/Q40，A28/N30/R33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Q40，K28/N30/R33/Q38/A40，K28/N30/T33/A38/840，K28/A30/H33/R38/S40，K28/H30/H33/H38/S40，K28/D30/N33/H38/S40，K28/E30/S33/R38/S40，K28/H30/T33/P38/S40，K28/G30/H33/Y38/S40，K28/A30/R33/Q38/S40，K28/S30/R33/G38/S40，K28/S30/H33/H38/S40，K28/N30/H33/R38/S40，K28/R30/R33/E38/S40，K28/D30/G33/H38/S40，K28/R30/H33/G38/S40，K28/A30/N33/Q38/S40，K28/D30/H33/K38/S40，K28/K30/H33/R38/S40，K28/Q30/N33/Q38/S40，K28/Q30/T33/Q38/S40，K28/G30/R33/Q38/S40  K28/R30/P23/G38/S40，K28/R30/G33/N38/S40，K28/N30/A33/Q38/S40，K28/N30/H33/N38/S40，K28/H30/H33/A38/S40，K28/R30/G33/S38/S40，K28/S30/R33/Q38/S40，K28/T30/D33/H38/S40，K28/H30/H33/Q38/S40，K28/A30/D33/H38/S40，K28/S30/H33/R38/S40，K28/N30/R33/A38/S40，K28/S30/H33/Q38/S40，K28/D30/A33/H38/S40，K28/N30/H33/E38/S40，K28/D30/R33/T38/S40，K28/D30/R33/S38/S40，K28/A30/H33/Q38/S40，K28/R30/G33/T38/S40，K28/N30/H33/S38/S40，K28/Q30/H33/Q38/S40，K28/N30/H33/G38/S40，K28/N30/N33/Q38/S40，K28/N30/D33/Q38/S40，K28/D30/R33/G38/S40，K28/N30/H33/A38/S40，K28/H30/M33/A38/S40，K28/S30/S33/H38/S40，K28/G30/V33/A38/S40，K28/S30/V33/Q38/S40，K28/D30/V33/H38/S40，R28/D30/V33/Q38/S40，K28/G30/V33/Q38/S40，K28/G30/V33/T38/S340，K28/G30/V33/H38/S40，K28/G30/V33/R38/S40，K28/G30/V33/G38/S40，R28/A30/V33/G38/S40，R28/D30/V33/R38/S40，R28/N30/V33/Q38/S40，和N28/T30/V33/D38/S40。
根据一个更优选的实施方案，所述I-CreI变体是能够切割至少一个不被亲本归巢核酸内切酶(I-CReI D75N)所切割的DNA靶序列的变体，所述变体在28、30、33、38和40位分别具有选自以下的氨基酸残基：
Q28/N30/Y33/K38/R40，R28/N30/K33/R38/Q40，Q28/N30/R33/R38/R40，Q28/N30/Y33/K38/K40，Q28/N30/T33/Q38/K40，Q28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/T33/Q38/R40，S28/N30/R33/S38/R40，K28/N30/T33/R38/Q40，K28/N30/S33/R38/E40，S28/N30/Y33/R38/K40，K28/N30/S33/R38/D40，K28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/S33/R38/S40，R28/N30/R33/D38/R40，A28/N30/S33/Q38/R40，Q28/N30/Y33/R38/K40，Q28/N30/K33/R38/T40，R28/N30/A33/Y38/Q40，K28/N30/R33/Q38/E40，N28/N30/S33/R38/K40，N28/N30/S33/R38/R40，S28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/Q38/K40，E28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/N33/Q38/A40，S28/N30/Y33/Q38/K40，T28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/R33/T38/Q40，K28/N30/R33/T38/R40，Q28/N30/E33/D38/H40，R28/N30/T33/R38/A40，H28/N30/Y33/D38/S40，S28/N30/Q33/A38/A40，K28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/A38/R40，R28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/R33/A38/R40，K28/N30/T33/A38/A40，K28/N30/R33/K38/A40，K28/N30/R33/N38/A40，T28/N30/E33/S38/D40，R28/N30/R33/Y38/Q40，K28/N30/R33/S38/S40，K28/N30/R33/Y38/A40，A28/N30/N33/R38/K40，K28/N30/R33/A38/T40，K28/N30/R33/N38/Q40，T28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Y40，Q28/N30/S33/R38/K40，R28/N30/Y33/Q38/S40，Q28/N30/R33/Q38/R40，K28/N30/R33/A38/Q40，A28/N30/R33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Q40，K28/N30/R33/Q38/A40，K28/N30/T33/A38/S40，K28/A30/H33/R38/S40，K28/H30/H33/R38/S40，K28/D30/N33/H38/S40，K28/E30/S33/R38/S40，K28/H30/T33/P38/S40，K28/G30/H33/Y38/S40，K28/A30/R33/Q38/S40，K28/S30/R33/G38/S40，K28/S30/H33/H38/S40，K28/N30/H33/R38/S40，K28/R30/R33/E38/S40，K28/D30/G33/H38/S40，K28/R30/H33/G38/S40，K28/A30/N33/Q38/S40，K28/D30/H33/K38/S40，K28/K30/H33/R38/S40，K28/Q30/N33/Q38/S40，K28/Q30/T33/Q38/S40，K28/G30/R33/Q38/S40  K28/R30/P33/G38/S40，K28/R30/G33/N38/S40，K28/N30/A33/Q38/S40，K28/N30/H33/N38/S40，K28/H30/H33/A38/S40，K28/R30/G33/S38/S40，K28/S30/R33/Q38/S40，K28/T30/D33/H38/S40，K28/H30/H33/Q38/S40，K28/A30/D33/H38/S40，K28/S30/H33/R38/S40，K28/N30/R33/A38/S40，K28/S30/H33/Q38/S40，K28/D30/A33/H38/S40，K28/N30/H33/E38/S40，K28/D30/R33/T38/S40，K28/D30/R33/S38/S40，K28/A30/H33/Q38/S40，K28/R30/G33/T38/S40，K28/N30/H33/S38/S40，K28/Q30/H33/Q38/S40，K28/N30/H33/G38/S40，K28/N30/N33/Q38/S40，K28/N30/D33/Q38/S40，K28/D30/R33/G38/S40，K28/N30/H33/A38/S40，K28/H30/M33/A38/S40，K28/S30/S33/H38/S40，K28/G30/V33/A38/S40，K28/D30/V33/H38/S40，R28/D30/V33/Q38/S40，K28/G30/V33/T38/S340，K28/G30/V33/H38/S40，K28/G30/V33/R38/S40和K28/G30/V33/G38/S40。
根据另一优选的实施方案，所述I-CreI变体是能够切割由突变的I-CReI位点组成的DNA靶序列的变体，其中至少-8位的a和/或+8位的t被不同的核苷酸所替换，所述变体在28、30、33、38和40位分别具有选自以下的氨基酸残基：
Q28/N30/Y33/K38/R40，R28/N30/K33/R38/Q40，Q28/N30/R33/R38/R40，Q28/N30/K33/K38/K40，Q28/N30/T33/Q38/K40，Q28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/T33/Q38/R40，S28/N30/R33/S38/R40，N28/N30/Y33/Q38/R40，K28/N30/S33/R38/E40，Q28/N30/N33/Q38/K40，S28/N30/Y33/R38/K40，K28/N30/S33/R38/D40，K28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/S33/R38/S40，R28/N30/R33/D38/R40，A28/N30/S33/Q38/R40，Q28/N30/Y33/R38/K40，Q28/N30/K33/R38/T40，R28/N30/A33/Y38/Q40，K28/N30/R33/Q38/E40，N28/N30/S33/R38/K40，N28/N30/S33/R38/R40，Q28/N30/Y33/Q38/K40，Q28/N30/Y33/Q38/R40，S28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/Q38/K40，E28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/N33/Q38/A40，S28/N30/Y33/Q38/K40，T28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/N33/T38/R40，Q28/N30/E33/D38/H40，R28/N30/Y33/N38/A40，Q28/N30/Y33/T38/R40，R28/N30/T33/R38/A40，H28/N30/Y33/D38/S40，Q28/N30/Y33/R38/A40，Q28/N30/Y33/A38/R40，S28/N30/Q33/A38/A40，Q28/N30/Y33/E38/K40，T28/N30/N33/Q38/R40，Q28/N30/Y33/R38/S40，K28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/A38/R40，Q28/N30/N33/Q38/R40，R28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/R33/A38/R40，K28/N30/T33/A38/A40，K28/N30/R33/K38/A40，R28/N30/A33/K38/S40，K28/N30/R33/N38/A40，T28/N30/E33/S38/D40，R28/N30/N33/Q38/D40，R28/N30/R33/Y38/Q40，K28/N30/Y33/Q38/N40，K28/N30/R33/S38/S40，K28/N30/R33/Y38/A40，A28/N30/N33/R38/K40，K28/N30/R33/A38/T40，T28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Y40，Q28/N30/S33/R38/K40，R28/N30/Y33/Q38/S40，Q28/N30/R33/Q38/R40，A28/N30/R33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Q40，K28/N30/R33/Q38/A40，K28/N30/T33/A38/S40，K28/A30/H33/R38/S40，K28/H30/H33/R38/S40，K28/D30/N33/H38/S40，K28/E30/S33/R38/S40，K28/H30/T33/P38/S40，K28/G30/H33/Y38/S40，K28/A30/R33/Q38/S40，K28/S30/R33/G38/S40，K28/S30/H33/H38/S40，K28/N30/H33/R38/S40，K28/R30/R33/E38/S40，K28/D30/G33/H38/S40，K28/R30/H33/G38/S40，K28/A30/N33/Q38/S40，K28/D30/H33/K38/S40，K28/K30/H33/R38/S40，K28/Q30/N33/Q38/S40，K28/Q30/T33/Q38/S40，K28/G30/R33/Q38/S40  K28/R30/P33/G38/S40，K28/R30/G33/N38/S40，K28/N30/A33/Q38/S40，K28/N30/H33/N38/S40，K28/H30/H33/A38/S40，K28/R30/G33/S38/S40，K28/S30/R33/Q38/S40，K28/T30/D33/H38/S40，K28/H30/H33/Q38/S40，K28/A30/D33/H38/S40，K28/S30/H33/R38/S40，K28/N30/R33/A38/S40，K28/S30/H33/Q38/S40，K28/D30/A33/H38/S40，K28/N30/H33/E38/S40，K28/D30/R33/T38/S40，K28/D30/R33/S38/S40，K28/A30/H33/Q38/S40，K28/R30/G33/T38/S40，K28/N30/H33/S38/S40，K28/Q30/H33/Q38/S40，K28/N30/H33/G38/S40，K28/N30/N33/Q38/S40，K28/N30/D33/Q38/S40，K28/D30/R33/G38/S40，K28/N30/H33/A38/S40，K28/H30/M33/A38/S40，K28/S30/S33/H38/S40，K28/G30/V33/A38/S40，K28/S30/V33/Q38/S40，K28/D30/V33/H38/S40，R28/D30/V33/Q38/S40，K28/G30/V33/Q38/S40  K28/G30/V33/T38/S40，K28/G30/V33/H38/S40，K28/G30/V33/R38/S40，K28/G30/V33/G38/S40，R28/A30/V33/G38/S40，R28/D30/V33/R38/S40，R28/N30/V33/Q38/S40，和N28/T30/V33/D38/S40。
根据又一更优选的实施方案，所述I-CreI变体是能够切割由突变的I-CreI位点组成的DNA靶序列的变体，其中至少-9位的a和/或+9位的t被不同的核苷酸所替换，所述变体在28、30、33、38和40位分别具有选自以下的氨基酸残基：
Q28/N30/Y33/K38/R40，R28/N30/K33/R38/Q40，Q28/N30/R33/R38/R40，Q28/N30/Y33/K38/K40，Q28/N30/T33/Q38/K40，Q28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/T33/Q38/R40，S28/N30/R33/S38/R40，K28/N30/T33/R38/Q40，K28/N30/S33/R38/E40，S28/N30/Y33/R38/K40，K28/N30/S33/R38/D40，K28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/S33/R38/S40，R28/N30/R33/D38/R40，Q28/N30/Y33/R38/K40，R28/N30/A33/Y38/Q40，N28/N30/S33/R38/K40，N28/N30/S33/R38/R40，E28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/N33/Q38/A40，K28/N30/R33/T38/Q40，K28/N30/R33/T38/R40，Q28/N30/E33/D38/H40，R28/N30/T33/R38/A40，H28/N30/Y33/D38/S40，K28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/A38/R40，R28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/R33/A38/R40，K28/N30/T33/A38/A40，K28/N30/R33/K38/A40，K28/N30/R33/N38/A40，R28/N30/R33/Y38/Q40，K28/N30/R33/S38/S40，A28/N30/N33/R38/K40，K28/N30/R33/A38/T40，K28/N30/R33/N38/Q40，T28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Y40，Q28/N30/S33/R38/K40，K28/N30/R33/A38/Q40，A28/N30/R33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/A40，K28/N30/T33/A38/S40，K28/A30/H33/R38/S40，K28/H30/H33/R38/S40，K28/D30/N33/H38/S40，K28/E30/S33/R38/S40，K28/S30/R33/G38/S40，K28/S30/H33/H38/S40，K28/N30/H33/R38/S40，K28/R30/R33/E38/S40，K28/D30/G33/H38/S40，K28/D30/H33/K38/S40，K28/K30/H33/R38/S40，K28/Q30/N33/Q38/S40，K28/R30/G33/N38/S40，K28/N30/H33/N38/S40，K28/H30/H33/A38/S40，K28/R30/G33/S38/S40，K28/T30/D33/H38/S40，K28/A30/D33/H38/S40，K28/S30/H33/R38/S40，K28/N30/R33/A38/S40，K28/D30/A33/H38/S40，K28/D30/R33/T38/S40，K28/D30/R33/S38/S40，K28/R30/G33/T38/S40，K28/N30/H33/S38/S40，K28/N30/H33/G38/S40，K28/N30/N33/Q38/S40，K28/D30/R33/G38/S40，K28/N30/H33/A38/S40，K28/H30/M33/A38/S40，K28/S30/S33/H38/S40，K28/G30/V33/A38/S40，K28/D30/V33/H38/S40，K28/G30/V33/T38/S340，K28/G30/V33/H38/S40，K28/G30/V33/R38/S40，和K28/G30/V33/G38/S40。
根据所述I-CreI变体的另一有利的实施方案，它包含一个或多个另外的突变。
经突变的残基可有利地位于接触DNA靶序列或者直接或间接与所述DNA靶标相互作用的位点。优选地，所述突变位于选自以下的位点：I24、Q26、S32、Q44、R68、R70、D75、I77和T140。优选地，所述I-CreI变体包含一个或多个选自以下的突变：
24位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I24V)，
70位的精氨酸突变为丝氨酸(R70S)，和
75位的天冬氨酸突变为不带电荷的氨基酸，优选天冬酰胺(D75N)或缬氨酸(D75V)。
另外，可在整个I-CreI序列上(特别是在I-CreI的C末端一半(80到163位))突变其它一些残基。I-CreI的C末端一半中的替换优选在I-CreI的以下位点：80、82、85、86、87、94、96、100、103、114、115、117、125、129、131、132、147、151、153、154、155、157、159和160位。
另外，所述变体可包含插入到NH2末端和/或COOH末端的一个或多个残基。例如，将甲硫氨酸残基引入到NH2端，将标签(tag)(表位或多组氨酸序列)引入到NH2末端和/或COOH末端；所述标签可用于检测和/或纯化所述变体。
本发明的I-CreI变体可以是同源二聚体或异源二聚体。
根据所述I-CreI变体的另一有利的实施方案，它是包含来自两个不同变体的单体的异源二聚体。
本发明还包括单链嵌合核酸内切酶，其包含来自如上所述的I-CreI变体的单体。
本发明的主题还包括编码如上所述的I-CreI变体或源自所述变体的单链嵌合核酸内切酶的多核苷酸片段。
本发明的主题还包括重组载体，其包含至少一个如上所述的编码变体或源自所述变体的单链嵌合核酸内切酶的多核苷酸片段。所述载体可包含编码同源二聚体变体的一个单体、两个单体或者一个单体和单链分子一个结构域的多核苷酸片段。或者，所述载体可包含两个不同多核苷酸片段，其中每个多核苷酸片段编码异源二聚体变体的一个单体。
一种类型的优选载体是附加体，即能够在染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和/或表达与其相连的核酸的载体。能够指导与其可操纵连接的基因表达的载体在本文中称作“表达载体”。
本发明的载体包括但不限于YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、杆状病毒载体、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒载体、质粒、RNA载体或者可由染色体、非染色体、半合成或合成DNA组成的线性或环状的DNA或RNA分子。一般地，用于重组DNA技术的表达载体常常为“质粒”的形式，其通常指以载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA环。大量合适的载体是本领域技术人员已知的。
病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒，负链RNA病毒如正黏病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病毒和疱疹性口腔炎病毒)、副黏病毒(例如麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒，双链DNA病毒包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)，以及痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒)。其它病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。
载体可包含选择标记，例如：用于真核细胞培养的新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶；用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1；大肠杆菌(E.coli)中的四环素、利福平或氨苄青霉素抗性。
优选地，所述载体是表达载体，其中编码本发明所述变体的序列置于合适的转录和翻译控制元件的控制之下，从而允许产生或合成所述变体。因此，所述多核苷酸包含在表达盒中。更具体地，所述载体包含复制起点、与所述编码多核苷酸可操纵连接的启动子、核糖体结合位点、RNA剪接位点(当使用基因组DNA时)、聚腺苷酸化位点和转录终止位点。它还可包含增强子。启动子的选择取决于表达多肽的细胞。优选地，当所述变体是异源二聚体时，编码每个单体的两种多核苷酸包含在同一载体中，该载体能够驱动两种多核苷酸同时表达。
根据所述载体的另一有利的实施方案，它包含靶向构建体，该构建体包含与如上所述的DNA靶序列周围的区域具有同源性的序列。
更优选地，所述靶向DNA构建体包含：
a)与如上所述的DNA靶序列周围区域具有同源性的序列，和
b)其侧翼为a)中序列的待引入序列。
本发明还涉及被上文所述的多核苷酸或载体(优选表达载体)所修饰的原核或真核宿主细胞。
本发明还涉及非人转基因动物或转基因植物，其特征为其所有或部分细胞被上文所述的多核苷酸或载体所修饰。
本文所使用的细胞指原核细胞(例如细菌细胞)或真核细胞(例如动物、植物或酵母细胞)。
本发明的主题还包括组合物，其包含至少一种如上所述的I-CreI变体、源自所述变体的一种单链嵌合核酸内切酶、一种或两种多核苷酸(优选包含在表达载体中)。
在所述组合物的一个优选实施方案中，它含有靶向DNA构建体，其包含修复目的位点的序列，所述序列的侧翼具有与靶基因座具有同源性的序列。
编码本发明所述的变体或源自所述变体的单链嵌合核酸内切酶的多核苷酸序列可通过本领域技术人员已知的任何方法制备。例如，可通过使用特异性引物的聚合酶链式反应从cDNA模板对它们进行扩增。优选地，选择所述cDNA的密码子以利于在期望的表达系统中表达所述蛋白质。
可通过公知的重组DNA和遗传工程技术获得包含所述多核苷酸的重组载体，并导入到宿主细胞中。
通过表达如上所述的多肽得到本发明的变体；优选地，在适于所述多肽表达或共表达的条件下，所述多肽在经一种或两种表达载体修饰的宿主细胞中表达或共表达，并从宿主细胞培养物中回收所述变体。
本发明的主题还包括遗传工程方法，其包括在位于载体上的目的位点处断裂双链核酸的步骤，所述载体包含上所述的DNA靶标，所述步骤通过将所述载体与如上所述的I-CreI变体或包含所述变体的单链嵌合核酸内切酶接触，从而诱导与另一与所述变体的切割位点周围序列具有同源性的载体发生同源重组。
本发明的主题还包括基因组工程方法，其包括以下步骤：1)包含至少一个如上所述的DNA靶序列的基因座的双链断裂，其通过将所述靶标与如上所述的I-CreI变体或包含所述变体的单链嵌合核酸内切酶接触来实现；2)保持所述断裂的基因座处于适于与靶向DNA构建体发生同源重组的条件下，所述靶向DNA构建体包含待引入所述基因座的序列，其侧翼具有与靶基因座具有同源性的序列。
本发明的主题还包括基因组工程方法，其特征在于它包括以下步骤：1)包含至少一个如上所述的DNA靶序列的基因座的双链断裂，其通过将所述切割位点与如上所述的I-CreI变体或包含所述变体的单链嵌合核酸内切酶接触来实现；2)保持所述断裂的基因座处于适于与染色体DNA发生同源重组的条件下，所述染色体DNA与所述切割位点周围区域具有同源性。
本发明的主题还包括可通过如上文所述方法获得的I-CreI核酸内切酶变体在分子生物学、体内或体外遗传工程以及体内或体外基因组工程中的非治疗目的的用途，其用于切割如上所述的DNA靶序列。
不具有限制性地，分子生物学包括DNA限制性酶切(restriction)和DNA作图。用于非治疗目的的遗传工程和基因组工程包括例如(i)在包装细胞系中特定基因座的基因打靶，用于生产蛋白质，(ii)在作物植物中特定基因座的基因打靶，用于品系改良和代谢工程，(iii)在经遗传修饰的农作物中用于去除标记物的靶向重组，(iv)在经遗传修饰的微生物菌株中用于去除标记物的靶向重组(例如用于抗生素生产)。
根据所述用途的一个优选实施方案，它用于在目的位点诱导双链断裂，从而诱导DNA重组事件、DNA丢失或细胞死亡，所述目的位点包含被如上所述的变体切割的DNA靶序列。
在一个具体的实施方案中，在38位为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的I-CreI变体用于切割包含-9位鸟嘌呤或+9位胞嘧啶的DNA靶标。
根据本发明，所述双链断裂用于：修复特定序列，修饰特定序列，回复功能性基因而替代突变基因，削弱或活化目的内源基因，在目的位点引入突变，引入外源基因或其部分，失活或者检测(detecting)内源基因或其部分，使染色体臂易位或者使DNA不被修复并被降解。
本发明的主题还包括至少一种如上所述的I-CreI变体的用途，其用于制备在有此需要的个体中预防、改善或治愈遗传病的药物，所述药物通过任意方式施用于所述个体。
本发明的主题还包括用于在有此需要的个体中预防、改善或治愈遗传病的方法，所述方法至少包括通过任何方式将如上所述的组合物施用于所述个体的步骤。
在一个具体实施方案中，在38位为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的I-CreI变体用于切割包含-9位鸟嘌呤或+9位胞嘧啶的基因组DNA靶标。
本发明的主题还包括至少一种如上所述的I-CreI变体的用途，其用于制备在有此需要的个体中预防、改善或治愈疾病的药物，所述疾病由具有DNA中介体的传染原导致，所述药物通过任意方式施用于所述个体。
本发明的主题还包括用于在有此需要的个体中预防、改善或治愈疾病的方法，所述疾病由具有DNA中介体的传染原导致，所述方法至少包括通过任何方式将如上所述的组合物施用于所述个体的步骤。
本发明的主题还包括至少一种如上所述的I-CreI变体的用途，其用于在生物来源产品或者用于生物学用途的产品中体外抑制具有DNA中介体的传染原的增殖、或者将其灭活或消除，或者用于消毒物体。
本发明的主题还包括用于在产品或物质中消除具有DNA中介体的传染原污染的方法，所述方法至少包括以下步骤，将生物来源产品、其用于生物学用途的产品或者物体与如上所述的组合物接触足以抑制所述传染因子的增殖、或者将其灭活或消除的时间。
在一个具体的实施方案中，在38位为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的I-CreI变体用于切割包含-9位鸟嘌呤或+9位胞嘧啶的来自所述传染原的DNA靶标。
在另一具体的实施方案中，所述传染原是病毒。例如所述病毒是腺病毒(Ad11、Ad21)、疱疹病毒(HSV、VZV、EBV、CMV、疱疹病毒6、7或8)、嗜肝DNA病毒(HBV)、乳多空病毒(HPV)、痘病毒或逆转录病毒(HTLV、HIV)。
本发明的主题还包括如上所述的至少一种I-CreI变体作为产生其它大范围核酸内切酶的骨架的用途。例如，可对所述I-CreI变体进行第二轮诱变和选择/筛选，用以获得新的第二代归巢核酸内切酶。
根据所述用途的另一有利的实施方案，所述I-CreI变体与如上所述的靶向DNA构建体相关连。
根据所述用途的另一有利的实施方案，所述I-CreI变体在28、30、33、38和40位分别具有如下氨基酸：KNSQS、KNRQS、KNTQS或KNHQS。
本发明所述的I-CreI大范围核酸酶变体的用途以及使用所述I-CreI大范围核酸酶变体的方法还包括以下各项的用途：如上所述的源自所述变体的单链嵌合核酸内切酶，编码所述变体或单链嵌合核酸内切酶的多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳动物。
除了前述特征，本发明还包括从以下说明中得出的其它特征，所述说明指举例说明本发明的I-CreI归巢核酸内切酶变体及其用途的实施例，以及以下附图：
-图1表示DNA靶标。A.衍生自天然I-CreI归巢位点的两个回文I-CreI靶标。所述I-CreI天然靶标含有两个回文序列(用灰色框表示)：一个是-8至-12和+8至+12位核苷酸，另一个是-5至-3和+3至+5位核苷酸。可从天然靶标(本文称为C1234(SEQ ID NO：1))衍生出回文序列C1221和C4334(SEQ ID NO：2、3)。二者均在体外和酵母中被I-CreI切割。B.64个DNA靶标。所述64个靶标衍生自C1221(SEQ IDNO：4至67)。它们对应于-10、-9、-8、+8、+9、+10位发生替换的所有完美的24bp回文序列。
-图2举例说明酵母筛选测定的原理。表达待测定的大范围核酸酶的菌株(MEGA)(其带有LEU2基因标记)与携带含有所选靶标的报告质粒的菌株(其带有TRP1基因标记)接合。所述靶标的侧翼是重叠的截短LacZ基因(LAC和ACZ)。在二倍体(LEU2 TRP1)中，大范围核酸酶对靶位点的切割诱导两个LacZ重复之间的同源重组，其得到可通过X-Gal染色监测的功能性β-半乳糖苷酶基因。
-图3表示用于构建Ulib4和Ulib5文库的I-CreI N75骨架蛋白的序列以及简并引物。A.所述骨架(SEQ ID NO：68)是I-CreI ORF，其包含D75N密码子替换以及3’端三个另外的密码子(AAD)。B.引物(SEQ ID NO：69、70、71)。
-图4表示pCLS0542大范围核酸酶表达载体。pCLS0542是基于2μ的复制型载体，其带有LEU2营养缺陷型基因标记，以及用于驱动I-CreI变体的表达的诱导型Gal10启动子。
-图5表示pCLS0042报告载体。所述报告载体带有TRP1和URA3标记。LacZ串联重复共有800bp的同源性，并且被1.3kb的DNA分隔开。它们两侧是ADH启动子和终止子序列。靶位点被克隆至SmaI位点中。
-图6举例说明了I-CreI变体文库的基本原理。A.与其DNA靶标结合的I-CreI同源二聚体的结构(其根据Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)以及在本研究中用于随机改变的所选结合界面区域的定位；28、30、33、38和40位残基在左边单体中用黑色标出。B.放大显示所选用于随机改变的28、30、33、38和40位残基。C.在I-CreI的DNA靶标(图6A中黑色表示)的外部区域中I-CreI/DNA相互作用的总结。所示靶标(C1221(SEQ ID NO：3))是被I-CreI切割的回文靶标(Chevalier等，2003，如前引用)。仅标出了碱基特异性接触。框内是靶标的10NNN区域(±8、±9、±10位核苷酸，图6A中黑色表示)。D.Ulib4中随机化碱基的位置(30、33、38)。E.Ulib5中随机化碱基的位置(28、30、38)。F.Lib4中随机化碱基的位置(28、33、38、40)。
-图7表示141种I-CreI变体切割37种新DNA靶标的切割模式。对于筛选后获得并用28、30、33、38、40、70和75位残基定义的每种I-CreI变体而言，使用图1B中所述的64个靶标在酵母中监测切割。用对应于-10、-9和-8位核苷酸的三个字母指代靶标。例如GGG对应于tcgggacgtcgtacgacgtcccga靶标(SEQ ID NO：4；见图1)。在扫描滤膜后通过适当的软件评估的数值对应于切割强度。
-图8举例说明了切割每个靶标的突变体的模式和数目。A.切割模式的实例。针对图1B中所述的一系列64个回文靶标在酵母中分析每种新核酸内切酶的切割模式，所述靶标在±8、±9和±10位不同于图1A中所示的序列。如图8B排列这些靶标。用-10、-9、-8三联体(10NNN)命名每个靶序列。例如，GGG对应于tcgggacgtcgtacgacgtcccga靶标(SEQID NO：4；见图1B)。大范围核酸酶针对64个靶标测试4次。用黑色或灰色点示意由I-CreI(D75)、I-CreI N75或10个衍生的变体所切割的靶标。B.切割每个靶标的突变体的数目，以及切割的平均强度。用-10、-9、-8三联体(10NNN)命名每个序列。切割每个靶标的蛋白质的数目显示如下，灰色着色水平与在酵母中这些切割蛋白获得的平均信号强度成比例。
实施例1：具有针对±8、±9和±10位核苷酸(10NNN)的新特异性的功能性核酸内切酶
用于产生大范围核酸酶变体的方法以及在酵母细胞中基于切割诱导重组的用于筛选特异性改变的变体的测定在国际PCT申请WO2004/067736和Epinat等，N.A.R.，2003，31，2952-2962中已有描述。这些测定均得到可利用标准方法进行监测的功能性LacZ报告基因(图2)。
A)材料和方法
a)构建突变体文库
如前所述(Epinat等，N.A.R.，2003，31，2952-2962)，合成I-CreIwt(I-CreI D75)和I-CreI D75N(I-CreI N75)和I-CreI S70 N75的可读框。通过替换两个或三个不同组合的残基，组合文库源自I-CreI N75、I-CreI D75或I-CreI S70 N75骨架，所述残基可能参与与一个DNA靶标半位点的±8至10位碱基的相互作用。通过使用在每个所选位点具有独特简并密码子的简并引物进行PCR来产生大范围核酸酶文库的多样性。
通过用aac替换75位密码子而引入突变D75N。然后，在N30、Y33和Q38位(Ulib4文库)或者K28、N30和Q38位(Ulib5文库)的三个密码子被简并密码子VVK(18个密码子，编码12种不同的氨基酸：A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)所替换。因此，这些蛋白质文库的最大(理论)多样性为123或1728。但是，对核苷酸而言，多样性为183或者5832。
在订购自BIOMETHODES的Lib4中，首先用丝氨酸替换I-CreIN75骨架的70位精氨酸(R70S)。然后，将28、33、38和40位随机改变。用10种氨基酸(A、D、E、K、N、Q、R、S、T、Y)之一替换原有的核苷酸(K28、Y33、Q38和S40)。对蛋白质而言，所得文库理论上具有10000的复杂度。
另外，在I-CreI N75或I-CreI D75骨架中构建仅对两个位点随机改变的复杂度为225(152)的小文库，其使用NVK简并密码子(24个密码子，氨基酸ACDEGHKNPQRSTWY)。
使用编码10、12或15种不同氨基酸的简并引物对，通过PCR获得携带期望的突变组合的片段，并且以I-CreI N75(图3A)、I-CreI D75或I-CreI S70N75的可读框(ORF)作为DNA模板。例如，图3B举例说明了分别用于产生Ulib4和Ulib5文库的两对引物(Ulib456for和Ulib4rev；Ulib456for和Ulib5rev)。将对应的PCR产物克隆回I-CreI N75或I-CreI D75 ORF中，所述ORF在酵母复制型表达载体pCLS0542(Epinat等，如前所述；图4)中，所述载体携带LEU2营养缺陷型标记基因。在该基于2μ的复制型载体中，I-CreI变体处于半乳糖诱导型启动子的控制之下。
b)构建靶标克隆
C122124bp回文序列(tcaaaacgtcgtacgacgttttga，SEQ ID NO：3)是近乎回文的天然I-CreI靶标(tcaaaacgtcgtgagacagtttgg，SEQ ID NO：1)半位点的重复。在酵母和哺乳动物细胞中，在体外和离体时，C1221都如I-CreI天然靶标一样被高效切割。如下衍生出64个回文靶标：64对寡核苷酸(ggcatacaagtttcnnnacgtcgtacgacgtnnngacaatcgtctgtca(SEQ IDNO：72)以及反向互补序列)订购自Sigma，将其退火并以相同方向克隆至pGEM-T Easy(PROMEGA)中。然后，切出400bp的PvuII片段，并克隆至前述酵母载体pFL39-ADH-LACURAZ(Epinat等，如前引用，图5)中，该载体也叫pCLS0042，得到了64个酵母报告载体(靶标质粒)。
c)酵母菌株
将大范围核酸酶表达变体的三个文库转化至leu2突变的单倍体酵母菌株FYC2-6A(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)中。对于转化，可以使用经典的化学/热激方案，其通常每μgDNA产生106个独立转化体(Gietz和Woods，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)。将单个转化体(Leu+)分别挑入96孔微量培养板中。使用相同方案将所述64个靶标质粒转化至单倍体酵母菌株FYBL2-7B(MATα、ura3Δ851、trp1Δ63、leu2Δ1、lys2Δ202)中，得到64个测试菌株。
d)酵母中表达大范围核酸酶的克隆的接合和筛选
表达大范围核酸酶的克隆与所述64个靶标菌株接合，通过使用图2示意的筛选测定来检测二倍体的β-半乳糖苷酶活性。
I-CreI变体克隆以及酵母报告菌株贮存在甘油(20％)中，并复制到新的微量培养板中。使用菌落网格(QpixII，GENETIX)进行接合。将突变体以高密度(大约20个点/cm2)点在覆盖有尼龙滤膜的YPD平板上。在同样的滤膜上进行第二次点样，针对每个变体点样由64个不同的带报告基因的酵母菌株组成的第二层。将膜置于固体琼脂糖富含YEPD培养基上，并在30℃孵育过夜，使之发生接合。然后，将滤膜转移至缺乏亮氨酸和色氨酸并以半乳糖(2％)为碳源(并含有G418用于共表达实验)的合成培养基，在37℃孵育5天，从而选择二倍体，允许大范围核酸酶表达、报告质粒切割和重组以及β-半乳糖苷酶的表达。5天后，将滤膜置于固体琼脂糖培养基上，该培养基在0.5M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、0.1％SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mM β-巯基乙醇、1％琼脂糖中含有0.02％的X-Gal，并在37℃孵育，以检测β-半乳糖苷酶的活性。在孵育2天后，通过扫描鉴定阳性克隆。使用适当的软件对所述克隆的β-半乳糖苷酶活性进行定量。
分离对至少一个靶标显示出活性的克隆(初次筛选)。然后将点样密度降低至4个点/cm2，并针对所述64个报告菌株一式四份测试每个阳性克隆，从而建立完整的模式(二次筛选)。
e)测序
通过对酵母菌落进行PCR来扩增在酵母中初步和/或二次筛选所鉴定的阳性克隆的可读框(ORF)，其使用来自PROLIGO的如下引物：PCR-Gal10-F(gcaactttagtgctgacacatacagg，SEQ ID NO：73)和PCR-Gal10-R(acaaccttgattgcagacttgacc，SEQ ID NO：74)。简言之，挑取酵母菌落，将其重悬于100μl的LGlu液体培养基中，并培养过夜。离心后，将酵母沉淀重悬于10μl无菌水中，并用于进行终体积为50μl的含有1.5μl每种特异性引物(100pmol/μl)的PCR反应。PCR条件是：94℃变性10分钟的一个循环，94℃变性30秒、55℃退火1分钟、72℃延伸1.5分钟的35个循环，以及最终延伸5分钟。然后对所得PCR产物进行测序。
f)结构分析
使用Pymol进行对蛋白质结构的所有分析。I-CreI的结构对应于pdb条目1g9y。本文中的残基编号通常指这些结构，只有同源二聚体的第二I-CreI蛋白结构域中的残基除外，其中的残基编号根据第一结构域进行设置。
B)结果
I-CreI是二聚体归巢核酸内切酶，其切割22bp假回文靶标。对与其天然靶标结合的I-CreI结构的分析已显示出，在每个单体中8个残基与7个碱基建立了直接相互作用(Jurica等，1998，如前引用)。根据这些结构数据，在±8至10位核苷酸的碱基与I-CreI氨基酸N30、Y33、Q38直接接触，并与I-CreI氨基酸K28和S40间接接触(图6A、6B、6C)。因此，在30、33和38位具有突变的新蛋白质可显示出针对所述64个靶标的新切割模式，所述64个靶标来自对I-CreI所切割的回文靶标的±8、±9和±10位的替换(10NNN靶标)。另外，突变可改变参与与DNA碱基直接接触的残基的数目和位置。更具体地，除了30、33、38位之外，其它位于折叠蛋白质上邻近处的残基可参与与同样碱基对的相互作用。
使用穷举蛋白质文库对比靶标文库方法以局部地改造这一DNA结合界面部分。对5个氨基酸位点的随机改变会导致理论上205＝3.2×106的多样性。然而，通过一次随机改变2、3或4个残基产生具有较低多样性的文库，其得到225(152)、1728(123)或10000(104)的多样性。该策略允许针对所述64个回文10NNN DNA靶标广泛筛选这些文库中的任一个，其使用了前述基于酵母的测定(Epinat等，2003，如前引用，以及国际PCT申请WO 2004/067736)，其原理在图2中有所描述。
首先，将所述I-CreI骨架的D75突变为N。所述D75N突变不影响所述蛋白质结构，但是降低了过表达实验中I-CreI的毒性。
然后构建Ulib4文库：随机改变30、33和38位残基(图6A-C和6D)，并用12种氨基酸(A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)之一替换原有的氨基酸(N30、Y33和Q38)。对于蛋白质而言，所得文库具有1728的复杂度(对于核酸而言是5832)。
然后，构建两个另外的文库：Ulib5和Lib4。在Ulib5中，随机改变28、30和38位残基(图6A-C和6E)，并用12种氨基酸(ADEGHKNPQRST)之一替换原有的氨基酸(K28、N30和Q38)。对于蛋白质而言，所得文库具有1728的复杂度(对于核酸而言是5832)。在Lib4中，首先用丝氨酸替换70位的精氨酸。然后，随机改变28、33、38和40位(图6A-C和6F)，并用10种氨基酸(A、D、E、K、N、Q、R、S、T、Y)之一替换原有的氨基酸(K28、Y33、Q38和S40)。对于蛋白质而言，所得文库具有10000的复杂度。
在初次筛选实验中，将20000个来自Ulib4的克隆、10000个来自Ulib5的克隆以及20000个来自Lib4的克隆与所述64个测试菌株之每一个进行接合，测试二倍体的β-半乳糖苷酶活性。在针对所述64个靶标的第二轮筛选中，一式四份地测试对所述64个靶标之至少一个靶标表现出切割活性的所有克隆，并建立每种切割模式，如图8中所示。然后，利用PCR从每个菌株扩增大范围核酸酶的ORF，并测序。
在二次筛选以及对阳性克隆的整个编码区进行测序后，总共分离出1484个独特的突变体，其表现出对至少一个靶标的切割活性。可观察到不同的模式。图7举例说明被141种变体所切割的37个新的靶标，其包括34个不被I-CreI切割的靶标，以及3个被I-CreI切割的靶标(aag、aat和aac)。12种模式(包括I-CreI N75和I-CreI D75)的实例显示于图8A中。这些新模式中的某些与野生型骨架的模式具有某些相似性，而许多其它的则完全不同。归巢核酸内切酶通常可接受其靶序列中的某些简并性，并且I-CreI和I-CreI N75蛋白本身分别切割一系列的16个和3个靶标。在许多新核酸内切酶中发现了切割简并性，平均每个突变体有9.9个切割靶标(标准差：11)。然而，在1484个鉴定的突变体中，发现219个(15％)仅切割一个DNA靶标，179个(12％)切割两个，169个(11％)和120个(8％)分别能切割3个和4个靶标。因此，与其优选靶标无关地，显著数量的I-CreI衍生物显示出与I-CreI N75突变体(切割3个10NNN靶序列)或I-CreI(切割16个10NNN靶序列)相似的(如果不更高的话)特异性水平。同样地，所分离的针对10NNN序列的特异性发生改变的大多数突变体不再切割图6C所述的原始C1221靶序列(分别为61％和59％)。
总之，所述大量突变体允许在±10、±9和±8位不同的所有64种可能的DNA序列(图8B)作为靶标。然而，切割每种靶标的突变体的数目显著不同(图8B)这些数目的范围从3到936，平均为228.5(标准差：201.5)。常常在±8位为鸟嘌呤或±9位为腺嘌呤的靶标中观察到切割，而在±10或±8位为胞嘧啶则与切割蛋白(cleaver)的低数量相关。另外，所有的靶标不都以相同的效率被切割。因为取决于所述突变体，可观察到同一靶标的显著差异的信号(例如比较图8B中野生型10AAA靶标的切割效率)，如前所报道的(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458)测定每个靶标的平均切割效率。在图8B中这些平均效率用灰色程度来表示。对该结果的分析表明，在所述平均效率和切割蛋白数目之间存在明显相关性，最常被切割的靶标也具有最有效率的切割(比较例如图8B中的10TCN、10CTN和10CCN靶标与10GAN、10AAN和10TAN)。
因此，获得了数百个新的变体，其包括具有新底物特异性的突变体；这些变体可保持高活性水平，并且新蛋白质的特异性甚至可比野生型蛋白质对其靶标的特异性更窄。
实施例2：I-CreI变体与其靶标之间相互作用的统计学分析
A)材料和方法
如前所述(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458)，使用层级聚类以建立特定蛋白质残基和靶标碱基之间可能的相关性。使用R软件包的hclust对来自二次筛选的定量数据进行聚类分析。使用Euclidean距离和Ward’s方法(Ward，J.H.，American Stat.Assoc.，1963，58，236-244)，使用标准层级聚类分析对变体进行聚类分析。在高度为17处切割突变体系统树状图以定义聚类。为了进行分析，将聚类中靶标切割的累计强度计算为所有聚类的突变体对此靶标的切割强度总和，其归一化至所有聚类的突变体对所有靶标的切割强度总和。
B)结果
鉴定出10种不同突变体聚类(表I)。
表I：聚类分析
1靶标和碱基频率对应于累计切割强度，如材料和方法中所述。
2在每个位点，标出在多于15％的聚类中存在的碱基
分析每个聚类中的残基显示出所有随机化位点均有强偏好性。这些残基中没有一个在本研究中使用的所有文库内均被突变，预计I-CreI骨架中的残基会过度出现。实际上，在所有10个聚类中，K28、N30和S40是最常见的残基，但是不能得出DNA/蛋白质相互作用的结论。然而，Y33仅在聚类7、8和10中最常出现，而在其它7个聚类中观察到其它残基例如H、R、G、T、C、P或S的频繁出现。野生型Q38残基在除一个以外的所有聚类中过度出现，在聚类4中R和K更常出现。
同时，在残基33和38的性质与靶标±10和±9位的底物选择之间观察到强相关性。
Y33的普遍存在与腺嘌呤的高频率有关(在聚类7和10中分别为74.9％和64.3％)，而在聚类4、5和8中也观察到此相关性，但程度较低。H33或R33与鸟嘌呤相关(在聚类1、4和5中分别为63.0％、56.3％和58.5％)，T33、C33或S33与胸腺嘧啶相关(在聚类3和9中分别为45.6％和56.3％)。在聚类2中G33是相对常见的，该聚类在±10位具有最平均的碱基分布。这些结果与Seligman及其合作者的观察是一致的(Nucleic Acids Res.，2002，30，3870-3879)，他们先前表明Y33R或Y33H突变使I-CreI的特异性向±10位鸟嘌呤迁移，Y33C、Y33T、Y33S(以及Y33L)的特异性向±10位胸腺嘧啶迁移。
另外，R38和K38与聚类4中特别高频率的鸟嘌呤相关，而在其它所有的聚类中，野生型Q38残基以及靶标±9位的腺嘌呤是过度出现的。
与其靶标结合的I-CreI的结构(Chevalier等，2003，如前引用；Jurica等，1998，如前引用)显示出Y33和Q38接触-10和-9位的两个腺嘌呤(图6C)，此结果表明在许多所述突变体中可能保持这些相互作用。先前描述了对于44位残基和±4位的类似结果(Arnould等，如前引用)。但是，比较下列组合33/±10、38/±9和44/±4得到的结果，表明给定的碱基根据其位点可与不同的氨基酸残基相关联。对于鸟嘌呤而言，最常见的残基是33位的R和H，38位的R或K以及44位的K，对于腺嘌呤而言，最常见的残基是33位的Y，38位和44位的Q，对于胸腺嘧啶而言，最常见的残基是33位的S、C或T以及44位的A。在这三种情形中，没有观察到胞嘧啶的明显模式。因此，对于接触每个碱基来说，没有通用“密码(code)”，而是存在一系列解决方案，最佳解决方案取决于更一般的环境，这非常类似于锌指蛋白中所观察到的情形(Pabo等，如前引用)。
序列表
<110>赛莱克蒂斯公司
法国罗曼维尔
<120>具有新切割特异性的I-CreI归巢核酸内切酶变体及其用途
<130>1546PCT8
<160>75
<170>PatentIn version 3.3
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<223>I-CreI N75框架
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agcttgacct ttcaggtgac tcaaaagacc cagcgccgtt ggtttctgga caaactagtg    180
gatgaaattg gcgttggtta cgtacgtgat cgcggatccg tttccaacta catcttaagc    240
gaaatcaagc cgctgcacaa cttcctgact caactgcagc cgtttctgaa actgaaacag    300
aaacaggcaa acctggttct gaaaattatc gaacagctgc cgtctgcaaa agaatccccg    360
gacaaattcc tggaagtttg tacctgggtg gatcagattg cagctctgaa cgattctaag    420
acgcgtaaaa ccacttctga aaccgttcgt gctgtgctgg acagcctgag cgagaagaag    480
aaatcctccc cggcggccga c                                              501
<210>69
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>寡核苷酸
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<211>68
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<223>寡核苷酸
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<211>18
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<400>71
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<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(17)
<223>n 是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(34)
<223>n是a，c，g，或t
<400>72
ggcatacaag tttcnnnacg tcgtacgacg tnnngacaat cgtctgtca                  49
<210>73
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>73
gcaactttag tgctgacaca tacagg                                           26
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>人工序列
<223>
<400>74
acaaccttga ttgcagactt gacc                                             24
<210>75
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(4)
<223>n 是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(8)
<223>n 是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(15)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(20)
<223>n是a，c，g，或t
<400>75
cnnnmnnnky rmnnnrknnn g                                                          21

Claims (42)

1.一种改造出具有经修饰的切割特异性的I-CreI归巢核酸内切酶变体的方法，其包括至少以下步骤：
(a)用选自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、W和Y的氨基酸替换I-CreI中β1β2发夹的K28、N30、Y33、Q38和/或S40中至少一个氨基酸，
(b)选择和/或筛选来自步骤(a)的能够切割DNA靶序列的I-CreI变体，所述靶序列由突变的I-CreI位点组成，其中至少-9到-8位的aa核苷酸二联体和/或+8到+9位的tt核苷酸二联体被不同的核苷酸二联体所替换。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤b)中的DNA靶标衍生自选自SEQID NO：1至3的I-CreI位点。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤b)中的DNA靶标包含具有下式的序列：c-11n-10n-9n-8m-7y-6n-5n-4n-3k-2y-1r+1m+2n+3n+4n+5r+6k+7n+8n+9n+10g+11(I)，其中n是a、t、c或g，m是a或c，y是c或t，k是g或t，r是a或g(SEQ IDNO：75)，只要当n-9n-8是aa时，n+8n+9不是tt，并且当n+8n+9是tt时，n-9n-8不是aa即可。
4.根据权利要求3的方法，其中n-5n-4n-3是gtc和/或n+3n+4n+5是gac。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中步骤b)中所述DNA靶标的-11到-8位和+8到+11位的核苷酸序列和/或-5到-3位和/或+3到+5位的核苷酸序列是回文的。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中步骤b)中的DNA靶标包含-9到-8位的核苷酸二联体和/或+8到+9位的核苷酸二联体，所述-9到-8位的核苷酸二联体选自：ag，at，ac，ga，gg，gt，gc，ta，tg，tt，cg，ct或cc，所述+8到+9位的核苷酸二联体是-9到-8位所述核苷酸二联体的反向互补序列。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中步骤b)中的DNA靶标还包括用不同核苷酸替换I-CreI位点-10位的核苷酸a和/或+10位的核苷酸t。
8.根据权利要求7的方法，其中所述DNA靶标包含-10到-8位的核苷酸三联体和/或+8到+10位的核苷酸三联体，所述-10到-8位的核苷酸三联体选自：aac，aag，aat，acc，acg，act，aga，agc，agg，agt，ata，atg，cag，cga，cgg，ctg，gac，gag，gat，gcc，gga，ggc，ggg，ggt，gta，gtg，gtt，tac，tag，tat，tcc，tga，tgc，tgg，tgt或ttg，所述+8到+10位的核苷酸三联体是所述-10到-8位核苷酸三联体的反向互补序列。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中在某些条件下体内实施步骤(b)，在所述条件中：所述变体在突变的DNA靶序列中产生的双链断裂通过所述DNA双链断裂的重组介导的修复导致正选择标记或报告基因的活化或者负选择标记或报告基因的失活。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其包括另外的步骤c1)，其表达步骤b)中获得的一种变体从而允许形成同源二聚体。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其包括另外的步骤c2)，其共表达步骤b)中获得的一种变体和I-CreI或其功能性变体，从而允许形成异源二聚体。
12.根据权利要求11的方法，其中共表达在步骤b)中获得的两种不同变体。
13.一种可通过根据权利要求1至12中任一项的方法获得的I-CreI大范围核酸酶变体，所述变体能够切割由突变的I-CreI位点组成的DNA靶序列，其中至少-9和/或-8位的核苷酸a和/或+8和/或+9位的核苷酸t被不同的核苷酸所替换，所述变体在28、30、33、38和40位分别具有选自以下的氨基酸残基：Q28/N30/Y33/K38/R40，R28/N30/K33/R38/Q40，Q28/N30/R33/R38/R40，Q28/N30/Y33/K38/K40，Q28/N30/T33/Q38/K40，Q28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/T33/Q38/R40，S28/N30/R33/838/R40，N28/N30/Y33/Q38/R40，K28/N30/T33/R38/Q40，K28/N30/S33/R38/E40，Q28/N30/N33/Q38/K40，S28/N30/Y33/R38/K40，K28/N30/S33/R38/D40，K28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/S33/R38/S40，R28/N30/R33/D38/R40，A28/N30/S33/Q38/R40，Q28/N30/Y33/R38/K40，Q28/N30/K33/R38/T40，R28/N30/A33/Y38/Q40，K28/N30/R33/Q38/E40，N28/N30/S33/R38/K40，N28/N30/S33/R38/R40，Q28/N30/Y33/Q38/K40，Q28/N30/Y33/Q38/R40，S28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/Q38/K40，E28/N30/R33/R38/K40，K28/N30/N33/Q38/A40，S28/N30/Y33/Q38/K40，T28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/R33/T38/Q40，K28/N30/R33/T38/R40，Q28/N30/E33/D38/H40，R28/N30/Y33/N38/A40，Q28/N30/Y33/T38/R40，R28/N30/T33/R38/A40，H28/N30/Y33/D38/S40，Q28/N30/Y33/R38/A40，Q28/N30/Y33/A38/R40，S28/N30/Q33/A38/A40，Q28/N30/Y33/E38/K40，T28/N30/N33/Q38/R40，Q28/N30/Y33/R38/S40，K28/N30/R33/Q38/R40，Q28/N30/R33/A38/R40，Q28/N30/N33/Q38/R40，R28/N30/R33/E38/R40，K28/N30/R33/A38/R40，K28/N30/T33/A38/A40，K28/N30/R33/K38/A40，R28/N30/A33/K38/S40，K28/N30/R33/N38/A40，T28/N30/E33/S38/D40，R28/N30/N33/Q38/D40，R28/N30/R33/Y38/Q40，K28/N30/Y33/Q38/N40，K28/N30/R33/S38/S40，K28/N30/R33/Y38/A40，A28/N30/N33/R38/K40，K28/N30/R33/A38/T40，K28/N30/R33/N38/Q40，T28/N30/T33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Y40，Q28/N30/S33/R38/K40，R28/N30/Y33/Q38/S40，Q28/N30/R33/Q38/R40，K28/N30/R33/A38/Q40，A28/N30/R33/Q38/R40，K28/N30/R33/Q38/Q40，K28/N30/R33/Q38/A40，K28/N30/T33/A38/S40，K28/A30/H33/R38/S40，K28/H30/H33/R38/S40，K28/D30/N33/H38/S40，K28/E30/S33/R38/S40，K28/H30/T33/P38/S40，K28/G30/H33/Y38/S40，K28/A30/R33/Q38/S40，K28/S30/R33/G38/S40，K28/S30/H33/H38/S40，K28/N30/H33/R38/S40，K28/R30/R33/E38/S40，K28/D30/G33/H38/S40，K28/R30/H33/G38/S40，K28/A30/N33/Q38/S40，K28/D30/H33/K38/S40，K28/K30/H33/R38/S40，K28/Q30/N33/Q38/S40，K28/Q30/T33/Q38/S40，K28/G30/R33/Q38/S40  K28/R30/P33/G38/S40，K28/R30/G33/N38/S40，K28/N30/A33/Q38/S40，K28/N30/H33/N38/S40，K28/H30/H33/A38/S40，K28/R30/G33/S38/S40，K28/S30/R33/Q38/S40，K28/T30/D33/H38/S40，K28/H30/H33/Q38/S40，K28/A30/D33/H38/S40，K28/S30/H33/R38/S40，K28/N30/R33/A38/S40，K28/S30/H33/Q38/S40，K28/D30/A33/H38/S40，K28/N30/H33/E38/S40，K28/D30/R33/T38/S40，K28/D30/R33/S38/S40，K28/A30/H33/Q38/S40，K28/R30/G33/T38/S40，K28/N30/H33/S38/S40，K28/Q30/H33/Q38/S40，K28/N30/H33/G38/S40，K28/N30/N33/Q38/S40，K28/N30/D33/Q38/S40，K28/D30/R33/G38/S40，K28/N30/H33/A38/S40，K28/H30/M33/A38/S40，K28/S30/S33/H38/S40，K28/G30/V33/A38/S40，K28/S30/V33/Q38/S40，K28/D30/V33/H38/S40，R28/D30/V33/Q38/S40，K28/G30/V33/Q38/S40，K28/G30/V33/T38/S340，K28/G30/V33/H38/S40，K28/G30/V33/R38/S40，K28/G30/V33/G38/S40，R28/A30/V33/G38/S40，R28/D30/V33/R38/S40，R28/N30/V33/Q38/S40和N28/T30/V33/D38/S40。
14.一种可通过根据权利要求1至12中任一项的方法获得的I-CreI大范围核酸酶变体，所述变体在38位为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，并且所述变体能够切割由在-9位包含鸟嘌呤和/或在+9位包含胞嘧啶的突变I-CreI位点组成的DNA靶序列。
15.根据权利要求13或14的I-CreI变体，其在接触DNA靶序列或者直接或间接与所述DNA靶标相互作用的位点包含一个或多个另外的突变。
16.根据权利要求15的I-CreI变体，其中，所述突变位于选自I24、Q26、S32、Q44、R68、R70、D75、I77和T140的位置。
17.根据权利要求16的I-CreI变体，其包含用不带电荷的氨基酸替换75位天冬氨酸。
18.根据权利要求17的I-CreI变体，其包含D75N或D75V突变。
19.根据权利要求16的I-CreI变体，其包含R70S突变。
20.根据权利要求13至19中任一项的I-CreI变体，其包含位于I-CreI中80到163位的一个或多个另外的突变，优选位于I-CreI中80、82、85、86、87、94、96、100、103、114、115、117、125、129、131、132、147、151、153、154、155、157、159和160位的一个或多个另外的突变。
21.根据权利要求13至20中任一项的I-CreI变体，其为同源二聚体。
22.根据权利要求13至20中任一项的I-CreI变体，其为包含来自两个不同变体的单体的异源二聚体。
23.单链嵌合核酸内切酶，其包含来自权利要求13至20中任一项所述变体的单体与来自LAGLIDADG归巢核酸内切酶或其功能性变体的单体或结构域的融合物。
24.多核苷酸片段，其编码根据权利要求13至22中任一项的I-CreI变体或者根据权利要求23的源自所述变体的单链嵌合核酸内切酶。
25.重组载体，其包含至少一种根据权利要求24的多核苷酸片段。
26.根据权利要求25的载体，其包含靶向构建体，所述靶向构建体包含与DNA靶序列周围区域共有同源性的序列。
27.根据权利要求26的载体，其中所述靶向DNA构建体包含：a)与所述DNA靶序列周围区域共有同源性的序列，和b)其侧翼为a)中所定义序列的待引入序列。
28.经根据权利要求23的多核苷酸或根据权利要求25至27中任一项的载体修饰的宿主细胞。
29.经根据权利要求24的多核苷酸或根据权利要求25至27中任一项的载体修饰的非人转基因动物。
30.经根据权利要求23的多核苷酸或根据权利要求25至27中任一项的载体修饰的转基因植物。
31.组合物，其至少包含根据权利要求13至22中任一项的一种I-CreI变体、根据权利要求23的源自所述变体的一种单链嵌合核酸内切酶或者根据权利要求25至27中任一项的重组载体。
32.根据权利要求31的组合物，其含有靶向DNA构建体，所述DNA构建体包含修复目的位点的序列，所述序列的侧翼是与靶基因座具有同源性的序列。
33.一种遗传工程方法，其包括在位于包含DNA靶序列的载体上的目的位点处断裂双链DNA的步骤，所述步骤通过将所述载体与根据权利要求13至22中任一项的I-CreI变体或根据权利要求23的包含所述变体的单链嵌合核酸内切酶接触来实现，从而诱导与另一与所述变体的切割位点周围序列具有同源性的载体发生同源重组。
34.一种基因组工程方法，其包括以下步骤：1)使包含至少一个DNA靶序列的基因座双链断裂，其通过将所述靶标与根据权利要求13至22中任一项的I-CreI变体或根据权利要求23的包含所述变体的单链嵌合核酸内切酶接触来实现；2)保持所述断裂的基因座处于适于与靶向DNA构建体发生同源重组的条件下，所述靶向DNA构建体包含待引入所述基因座的序列，其侧翼具有与靶基因座具有同源性的序列。
35.一种基因组工程方法，其包括如下步骤：1)使包含至少一个DNA靶序列的基因座双链断裂，其通过将所述切割位点与根据权利要求13至22中任一项的I-CreI变体或根据权利要求23的包含所述变体的单链嵌合核酸内切酶接触来实现；2)保持所述断裂的基因座处于适于与染色体DNA发生同源重组的条件下，所述染色体DNA与所述切割位点周围区域具有同源性。
36.可通过根据权利要求1至12中任一项的方法获得的I-CreI大范围核酸酶变体用于分子生物学、体内或体外遗传工程以及体内或体外基因组工程的非治疗目的的用途，用于切割如权利要求1至8中任一项所述的DNA靶序列。
37.可通过根据权利要求1至12中任一项的方法获得的至少一种I-CreI变体的用途，其用于制备在有此需要的个体中预防、改善或治愈遗传病的药物，所述药物通过任意方式施用于所述个体。
38.可通过根据权利要求1至12中任一项的方法获得的至少一种I-CreI变体的用途，其用于制备在有此需要的个体中预防、改善或治愈疾病的药物，所述疾病由具有DNA中介体的传染原导致，所述药物通过任意方式施用于所述个体。
39.可通过根据权利要求1至12中任一项的方法获得的至少一种I-CreI变体的用途，其用于在生物来源产品或者旨在用于生物学用途的产品中体外抑制具有DNA中介体的传染原的增殖、或者将其灭失活或消除，或者用于消毒物体。
40.可通过根据权利要求1至12中任一项的方法获得的至少一种I-CreI变体作为产生其它大范围核酸内切酶的骨架的用途。
41.根据权利要求37至39中任一项的用途，其中所述I-CreI变体在28、30、33、38和40位分别具有选自以下的氨基酸残基：KNSQS、KNRQS、KNTQS或KNHQS。
42.根据权利要求36至40中任一项的用途，其中所述I-CreI变体如权利要求13至23中任一项所定义。
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