JP2009513129A - 新規な切断特異性を有するI−CreIホーミングエンドヌクレアーゼ変異型及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
Biotechnol., 2001, 19, 656〜60)。しかし、非常に狭い基質特異性を維持することがゲノム工学的応用についての主要な課題の1つであり、現在のところ、ZFPが、治療用途についての非常に厳密な要件を充足するかどうか明確でない。さらに、これらの融合タンパク質は、おそらく特異性のレベルが低いために、細胞内で非常に毒性が高いことが示されている(Porteus及びBaltimore, 上記; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175))。
その機能は、ホーミングと呼ばれるプロセスにおけるDNA二本鎖切断(DSB)誘導組換え事象を開始することである(Chevalier及びStoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜74; Kostrikenら, Cell; 1983, 35, 167〜74; Jacquier及びDujon, Cell, 1985, 41, 383〜94)。数百のHESが、細菌、真核生物及び古細菌で同定されている(Chevalier及びStoddard, 上記)。しかし、選択した遺伝子でHE切断部位を見出す可能性は、非常に低い。
2, 469〜76; Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜6 ; Chevalierら J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜69; Moureら, J. Mol. Biol, 2003, 334, 685〜95; Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜70; Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300, 889〜901; Duanら, Cell, 1997, 89, 555〜64; Bolducら, Genes Dev., 2003, 17, 2875〜88; Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123〜36)。このコア構造において、2つのモノマー又は二重LAGLIDAGタンパク質の2つのドメインが寄与するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインともよばれる2つの特徴的なαββαββα折り畳みは、2回回転対称で互いに面している。DNA結合は、逆平行βシートに折り畳まれ、かつDNAらせん主溝上に鞍部を形成する各ドメインからの4つのβ鎖に依存する。その天然の標的に結合したI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて8つの残基(Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68及びR70)が、±3、4、5、6、7、9及び10位にて7つの残基と直接の相互作用を確立していることを示す(Juricaら, 1998, 上記)。さらに、いくつかの残基は、いくつかの塩基との水が媒介する接触を確立する。例えば、S40、K28及びN30と+8位及び-8位の塩基対とである(Chevalierら, 2003, 上記)。触媒コアは、対称のモノマー/ドメインの寄与により中央にある。このコア構造に加えて、他のドメインを見出すことができる。例えば、インテインであるPI-SceIは、タンパク質スプライシングドメインと、追加のDNA結合ドメインを有する(Moureら, 2002, 上記; Grindlら, Nucleic Acids Res., 1998, 26, 1857〜62)。
- ハイブリッド又はキメラの単鎖タンパク質
新しいメガヌクレアーゼは、異なるモノマー同士のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを交換することにより得ることができた(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。異なるメガヌクレアーゼからの2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインがスペーサーにより連結されているこれらの単鎖キメラメガヌクレアーゼは、2つの半分(half)の親DNA標的配列の融合に相当するハイブリッド標的を切断できる。これらの結果は、I-CreIダイマーの2つのDNA結合ドメインが独立して挙動することを意味する。各DNA結合ドメインはDNA標的部位の異なる半分に結合する。キメラ及び単鎖人工HEの構築は、新規な(非パリンドローム)標的配列を切断する新規なメガヌクレアーゼを得るために、コンビナトリアルアプローチを用い得る:異なるモノマー又はコアドメインを単一タンパク質に融合させて、新規な特異性を達成し得ることを示唆した。
突然変異誘発及びスクリーニング/選択によりDNA結合タンパク質の基質特異性を変更することは、しばしば、困難であることが示されており(Lanioら, Protein Eng., 2000, 13, 275〜281; Voziyanovら, J. Mol. Biol., 2003, 326, 65〜76; Santoroら, P.N.A.S., 2002, 99, 4185〜4190; Buchholz及びStewart, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 1047〜1052)、より具体的には、HEのDNA結合ドメインを改変することは、長い間、その実行を思いとどまらせる課題であると考えられていた(Ashworthら, Nature 2006, 441, 656〜659;
Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993〜1008 ; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006,
355, 443〜458; Doyonら, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477〜2484; Steuerら, 上記; Seligmanら, Nucleic Acids Res., 2002, 30, 3870〜3879)。
特に、野生型メガヌクレアーゼDNA標的のいくつかのヌクレオチドが同時に変異されている新規なDNA標的を切断し得るホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を作製することは、非常に価値があるだろう。
(a) I-CreIのβ1β2ヘアピンからのアミノ酸K28、N30、Y33、Q38及び/又はS40の少なくとも1つを、A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、W及びYからなる群より選択されるアミノ酸で置換し、
(b) 少なくとも-9位〜-8位のaaヌクレオチドダブレット及び/又は+8位〜+9位のttヌクレオチドダブレットが、異なるヌクレオチドダブレットで置換されている変異I-CreI部位からなるDNA標的配列を切断できる、工程(a)からのI-CreI変異型を選択及び/又はスクリーニングする
工程を含む、改変された切断特異性を有するI-CreIホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を作製する方法に関する。
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、ここで、例えばKはLys又はリジン残基を意味し、NはAsn又はアスパラギン残基を意味し、YはTyr又はチロシン残基を意味する。
- 「I-CreI変異型」又は「変異型」により、I-CreIの少なくとも1つのアミノ酸の、異なるアミノ酸での置換により得られるタンパク質を意図する。
- 「機能的I-CreI変異型」により、DNA標的、好ましくはI-CreIにより切断されないDNA標的を切断できるI-CreI変異型を意図する。例えば、このような変異型は、DNA標的配列に接触するか又は該DNA標的に直接若しくは間接的に相互作用する位置でアミノ酸の変動を有する。
NA標的の1つの半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれた4つのベータ鎖(β1、β2、β3、β4)を含む。例えば、ダイマーのホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。モノマーのホーミングエンドヌクレアーゼの場合、2つのこのようなドメインが、エンドヌクレアーゼの配列中に見出される。例えば、I-DmoI (194アミノ酸)において、第1ドメイン(残基7〜99)及び第2ドメイン(残基104〜194)は、短いリンカー(残基100〜103)により分けられている。
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得る各配列中の位置を比較することにより決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められている場合、これらの分子はその位置で同一である。核酸又はアミノ酸配列同士の類似性又は同一性の度合は、これらの核酸配列により共有される位置での同一又はマッチするヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む種々のアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を算出できる。
「哺乳類」及び「哺乳動物」は、本明細書で用いる場合、その子に授乳し、生存する子を出産する(真獣類(eutharian)又は胎盤哺乳類(placental mammals))又は産卵する(後獣類(metatharian)又は無胎盤哺乳類(nonplacental mammals))単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物の種の例は、ヒト、及びその他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)及び反芻類(例えばウシ、ブタ、ウマ)を含む。
- 24位のイソロイシンのバリンへの変異(I24V)、
- 70位のアルギニンのセリンへの変異(R70S)、及び
- 75位のアスパラギン酸の非荷電アミノ酸、好ましくはアスパラギン(D75N)又はバリン(D75V)への変異。
c-11n-10n-9n-8m-7y-6n-5n-4n-3k-2y-1 r+1m+2n+3n+4n+5r+6k+7n+8n+9n+10g+11 (I)
(式中、nはa、t、c又はgであり、mはa又はcであり、yはc又はtであり、kはg又はtであり、rはa又はgである(配列番号75)が、但し、n-9n-8がaaである場合、n+8n+9はttではなく、n+8n+9がttである場合、n-9n-8はaaではない)
を有する配列を含む。
-3位及び/又は+3位〜+5位のヌクレオチド配列がパリンドロームである。
好ましくは、上記のDNA標的は、-10位〜-8位にaac、aag、aat、acc、acg、act、aga、agc、agg、agt、ata、atg、cag、cga、cgg、ctg、gac、gag、gat、gcc、gga、ggc、ggg、ggt、gta、gtg、gtt、tac、tag、tat、tcc、tga、tgc、tgg、tgt若しくはttgからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレット、及び/又は+8位〜+10位に-10位〜-8位の上記のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列であるヌクレオチドトリプレットを含む。
例えば、本発明のI-CreI変異型の切断活性は、PCT出願WO 2004/067736に記載されるようにして、レポーターベクターを用いて、酵母又は哺乳動物細胞において、直列反復組換えアッセイにより測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクターにクローニングされた、レポーター遺伝子の2つの短縮された非機能的コピー(直列反復配列)と、DNA標的配列とを、介在配列内に含む(図2)。DNA標的配列は、±8〜10位の1〜3ヌクレオチドの置換により、C1221のようなI-CreI部位から導かれる(図1B)。DNA標的配列を切断し得る機能的I-CreI変異型の発現は、直列反復配列間の相同組換えを誘発し、機能的レポーター遺伝子をもたらし、その発現を適切なアッセイにより監視し得る。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、これは、工程b)で得られた1つの変異型とI-CreI又はその機能的変異型とを同時発現させて、ヘテロダイマーの形成を可能にするさらなる工程c2)を含む。好ましくは、工程b)で得られる2つの異なる変異型を同時発現させる。
ホーミングエンドヌクレアーゼに由来する単鎖キメラ分子を構築する方法は、当該技術において公知である(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。このような方法のいずれも、本発明で定義される変異型に由来する単鎖キメラ分子を構築するために用い得る。
上記のI-CreI変異型の別の有利な実施形態によると、これは、28位、30位、33位、38位及び40位にそれぞれ、
より好ましい実施形態によると、上記のI-CreI変異型は、少なくとも、親のホーミングエンドヌクレアーゼ(I-CreI D75N)により切断されないDNA標的配列を切断できる変異型であり、該変異型は、28位、30位、33位、38位及び40位にそれぞれ、
別のより好ましい実施形態によると、上記のI-CreI変異型は、少なくとも-8位のa及び/又は+8位のtが異なるヌクレオチドで置換されている変異I-CreI部位からなるDNA標的配列を切断し得る変異型であり、該変異型は、28位、30位、33位、38位及び40位にそれぞれ、
さらに別のより好ましい実施形態によると、上記のI-CreI変異型は、少なくとも-9位のa及び/又は+9位のtが別のヌクレオチドで置換されている変異I-CreI部位からなるDNA標的配列を切断できる変異型であり、該変異型は、28位、30位、33位、38位及び40位にそれぞれ、
上記のI-CreI変異型の別の有利な実施形態によると、これは、1又は複数のさらなる変
異を含む。
- 24位のイソロイシンのバリンへの変異(I24V)、
- 70位のアルギニンのセリンへの変異(R70S)、及び
- 75位のアスパラギン酸の非荷電アミノ酸、好ましくはアスパラギン(D75N)又はバリン(D75V)への変異。
上記のI-CreI変異型の別の有利な実施形態によると、これは、2つの異なる変異型からのモノマーを含むヘテロダイマーである。
より好ましくは、上記の標的化DNA構築物は:
a) 上記で定義されるようなDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を共有する配列と、
b) a)で定義される配列に接する、導入されるべき配列と
を含む。
本明細書で用いる場合、細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞のことをいう。
- 図1は、DNA標的を表す。A. 天然のI-CreIホーミング部位に由来する2つのパリンドロームI-CreI標的。I-CreIの天然の標的は、灰色で囲った2つのパリンドロームを含む:一方は-8〜-12及び+8〜+12ヌクレオチド、他方は-5〜-3及び+3〜+5ヌクレオチドである。ここではC1234 (配列番号1)と称する天然の標的から、パリンドローム配列であるC1221及びC4334 (配列番号2、3)を導き得る。これらはともに、インビトロ及び酵母においてI-CreIにより切断される。B. 64個のDNA標的。64個の標的は、C1221に由来する(配列番号4〜67)。これらは全て、-10位、-9位、-8位、+8位、+9位及び+10位での置換により得られる24 bpの完全パリンドロームに相当する。
をマーカーとして有する。LacZタンデム反復同士は800 bpの相同性を共有し、1.3 kbのDNAにより分けられている。これらは、ADHプロモーター及びターミネーター配列に取り囲まれている。標的部位は、SmaI部位にクローニングされる。
メガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、及び特異性が変更された変異型をスクリーニングするために用いる酵母細胞における切断誘発組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinatら, N.A.R., 2003, 31, 2952〜2962に記載される。これらのアッセイは、標準的な方法により監視できる機能的LacZレポーター遺伝子をもたらす(図2)。
a) 変異体ライブラリーの構築
I-CreI wt (I-CreI D75)、I-CreI D75N (I-CreI N75)及びI-CreI S70 N75のオープンリーディングフレームを、以前に記載されるようにして合成した(Epinatら, N.A.R., 2003,
31, 2952〜2962)。コンビナトリアルライブラリーは、1つのDNA標的半部位の±8〜10位の塩基との相互作用に含まれる可能性がある残基の2又は3の異なる組み合わせを置換する
ことにより、I-CreI N75、I-CreI D75又はI-CreI S70 N75骨格から誘導した。メガヌクレアーゼライブラリーの多様性は、選択された位置のそれぞれでユニーク縮重コドンを有する縮重プライマーを用いるPCRにより作製した。
C1221の24 bpパリンドローム(tcaaaacgtcgtacgacgttttga, 配列番号3)は、ほぼパリンドロームの天然I-CreI標的(tcaaaacgtcgtgagacagtttgg, 配列番号1)の半部位の反復である。C1221は、酵母及び哺乳動物細胞の両方におけるインビトロ及びエクスビボでI-CreI天然標的と同様に効率的に切断される。64個のパリンドローム標的は、次のようにして導いた。オリゴヌクレオチドの64対(ggcatacaagtttcnnnacgtcgtacgacgtnnngacaatcgtctgtca
(配列番号72)及び逆相補配列)を、Sigmaに注文し、アニールし、pGEM-T Easy (PROMEGA)に同じ方向でクローニングした。次いで、400 bpのPvuII断片を切り出し、以前に記載されたpCLS0042ともよばれる酵母ベクターpFL39-ADH-LACURAZにクローニングして(Epinatら, 上記, 図5)、64個の酵母レポーターベクター(標的プラスミド)を得た。
メガヌクレアーゼ発現変異型の3つのライブラリーを、leu2変異一倍体酵母株FYC2-6A: MATalpha, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200に形質転換した。従来の化学/熱ショックプロトコールを形質転換に用いたが、これは、通常、元になるDNAのμg当たり106個の独立した形質転換体を与える(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)。個別の形質転換体(Leu+)クローンを、96ウェルのマイクロプレートに別々に採取した。
メガヌクレアーゼ発現クローンは、64個の標的株のそれぞれと交配させ、図2に示すスクリーニングアッセイを用いることにより二倍体をベータ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。
酵母での1次及び/又は2次スクリーニングの間に同定された陽性のクローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、PROLIGOからのプライマー:PCR-Gal10-F (gcaactttagtgctgacacatacagg、配列番号73)及びPCR-Gal10-R (acaaccttgattgcagacttgacc、配列番号74)を用いて、酵母コロニー上でPCRにより増幅した。簡単に、酵母コロニーを採取し、100μlのLGlu液体培地中に再懸濁し、一晩培養した。遠心分離の後に、酵母ペレットを10μlの滅菌水に再懸濁し、1.5μlの各特異的プライマー(100 pmol/μl)を含む50μlの最終容量でPCR反応を行うのに用いた。PCR条件は、94℃にて10分間の変性を1サイクル、94℃にて30秒の変性、55℃にて1分のアニーリング、72℃にて1.5分の伸長を35サイクル、及び最終伸長の5分であった。得られたPCR生成物を、次いで、配列決定した。
タンパク質構造の全ての分析は、Pymolを用いて行った。I-CreIからの構造は、pdbエントリー1g9yに相当する。本文の残基の番号付けは、常にこれらの構造について記載するが、残基の番号が第1ドメインについて設定されたとおりであるホモダイマーの第2 I-CreIタンパク質ドメインでの残基は例外である。
I-CreIは、22 bpの偽パリンドローム標的を切断するダイマーホーミングエンドヌクレアーゼである。その天然の標的に結合したI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて、8残基が7塩基と直接的な相互作用を確立していることを示している(Juricaら, 1998, 上記)。これらの構造的データによると、±8〜10位のヌクレオチドの塩基は、I-CreIアミノ酸N30、Y33、Q38との直接の接触、及びI-CreIアミノ酸K28及びS40と間接的な接触を確立する(図6A、6B、6C)。つまり、30位、33位及び38位の変異を有する新規なタンパク質は、I-CreIにより切断されるパリンドローム標的(10NNN標的)の±8位、±9位及び±10位での置
換に起因する64個の標的の新規な切断プロファイルを示し得る。さらに、変異は、DNA塩基との直接接触に参加する残基の数及び位置を変化させるだろう。より具体的には、30、33、38以外であるが、折り畳まれたタンパク質のかなり近傍にある位置は、同じ塩基対との相互作用に参加し得る。
= 3.2×106の理論的多様性を導く。しかし、より低い多様性のライブラリーは、一度に2、3又は4残基を無作為化することにより作製され、225 (152)、1728 (123)又は10,000 (104)の多様性をもたらす。このストラテジは、以前に記載され(Epinatら, 2003, 上記、及び国際PCT出願WO 2004/067736)、かつその原理が図2に記載される酵母に基づくアッセイを用いる64個のパリンドローム10NNN DNA標的に対するこれらのライブラリーのそれぞれを、広範囲にわたってスクリーニングすることを可能にする。
次に、Ulib4ライブラリーを構築した。残基30、33及び38 (図6A〜C及び6D)を無作為化し、通常のアミノ酸(N30、Y33及びQ38)を、12アミノ酸(A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T)のうちの1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で1728の複雑さを有する(核酸の点で5832)。
い標的に関わらず、I-CreI誘導体の著しい数が、I-CreI N75変異体(切断された3つの10NNN標的配列)、又はI-CreI (切断された16個の10NNN標的配列)のものよりも、高くなければ同様の特異性レベルを示す。また、10NNN配列に対する変更された特異性について単離された変異体の大多数が、図6Cに記載される元のC1221標的配列をもはや切断しない(それぞれ61%及び59%)。
A) 材料及び方法
以前に記載されたようにして(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)、階層的クラスタリングを用いて、特定のタンパク質残基と標的塩基との間の可能性のある相関関係を確立した。クラスタリングは、2次スクリーニングからの定量的データに対して、R packageからのhclustを用いて行った。変異型は、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., American Statist. Assoc., 1963, 58, 236〜244)を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタにした。変異体のデンドログラムは、17の高さで切ってクラスタを規定した。分析のために、クラスタ内での標的の切断の累積強度(cumulated intensity)は、この標的を用いるクラスタの全ての変異体の切断強度の合計として算出し、全ての標的を用いるクラスタの全ての変異体の切断強度の合計に対して標準化した。
10個の異なる変異体クラスタを同定した(表I)。
骨格で見出された残基は、大きな比率を占めると予測された。実際に、K28、N30及びS40は、10クラスタの全てで最も頻度が高い残基であり、DNA/タンパク質相互作用についての結論は、実際には推断できない。しかし、Y33は、クラスタ7、8及び10においてのみ最も代表的な残基であったが、その他の7つのクラスタでは、H、R、G、T、C、P又はSのようなその他の残基の強い発生が観察された。野生型Q38残基は、1つ以外の全てのクラスタにおいて大きな比率を占めたが、R及びKがクラスタ4では最も頻度が高かった。
Claims (42)
- 少なくとも:
(a) I-CreIのβ1β2ヘアピンからのアミノ酸K28、N30、Y33、Q38及び/又はS40の少なくとも1つを、A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、W及びYからなる群より選択されるアミノ酸で置換し、
(b) 少なくとも-9位〜-8位のaaヌクレオチドダブレット及び/又は+8位〜+9位のttヌクレオチドダブレットが異なるヌクレオチドダブレットで置換されている変異I-CreI部位からなるDNA標的配列を切断できる、工程(a)からのI-CreI変異型を選択及び/又はスクリーニングする
工程を含む、改変された切断特異性を有するI-CreIホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を作製する方法。 - 工程b)のDNA標的が、配列番号1〜3から選択されるI-CreI部位に由来する請求項1に記載の方法。
- 工程b)のDNA標的が、式:
c-11n-10n-9n-8m-7y-6n-5n-4n-3k-2y-1 r+1m+2n+3n+4n+5r+6k+7n+8n+9n+10g+11 (I)
(式中、nはa、t、c又はgであり、mはa又はcであり、yはc又はtであり、kはg又はtであり、rはa又はgである(配列番号75)が、但し、n-9n-8がaaであるときにn+8n+9はttではなく、n+8n+9がttであるときにn-9n-8はaaではない)
を有する配列を含む請求項1又は2に記載の方法。 - n-5n-4n-3がgtcであり、及び/又はn+3n+4n+5がgacである請求項3に記載の方法。
- 工程b)のDNA標的の-11位〜-8位及び+8位〜+11位のヌクレオチド配列、及び/又は-5位〜-3位及び/又は+3位〜+5位のヌクレオチド配列が、パリンドロームである請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)のDNA標的が、-9位〜-8位にag、at、ac、ga、gg、gt、gc、ta、tg、tt、cg、ct若しくはccからなる群より選択されるヌクレオチドダブレットを含み、及び/又は+8位〜+9位に-9位〜-8位の前記ヌクレオチドダブレットの逆相補配列であるヌクレオチドダブレットを含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)のDNA標的が、I-CreI部位の-10位のaヌクレオチド、及び/又は+10位のtヌクレオチドの、異なるヌクレオチドでの置換をさらに含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- DNA標的が、-10位〜-8位にaac、aag、aat、acc、acg、act、aga、agc、agg、agt、ata、atg、cag、cga、cgg、ctg、gac、gag、gat、gcc、gga、ggc、ggg、ggt、gta、gtg、gtt、tac、tag、tat、tcc、tga、tgc、tgg、tgt若しくはttgからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットを含み、及び/又は+8位〜+10位に-10位〜-8位の前記ヌクレオチドトリプレットの逆相補配列であるヌクレオチドトリプレットを含む請求項7に記載の方法。
- 工程(b)が、前記変異型により生じる変異DNA標的配列中の二本鎖切断が正の選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又は負の選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化を導く条件下で、前記DNA二本鎖切断の組換え媒介修復によりインビボで行われる請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)で得られた1つの変異型を発現させてホモダイマーの形成を可能にする工程c1)をさらに含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)で得られた1つの変異型と、I-CreI又はその機能的変異型とを同時発現させてヘテロダイマーの形成を可能にする工程c2)をさらに含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)で得られた2つの異なる変異型を同時発現させる請求項11に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができ、少なくとも-9位及び/又は-8位のaヌクレオチド、及び/又は+8位及び/又は+9位のtヌクレオチドが異なるヌクレオチドで置換されている変異I-CreI部位からなるDNA標的配列を切断可能であり、28位、30位、33位、38及び40位にそれぞれ:
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができ、38位にアルギニン(R)又はリジン(K)を有し、-9位にグアニン及び/又は+9位にシトシンを含む変異I-CreI部位からなるDNA標的配列を切断可能であるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型。
- DNA標的配列に接触する位置又は該DNA標的と直接的若しくは間接的に相互作用する位置で1又は複数のさらなる変異を含む請求項13又は14に記載のI-CreI変異型。
- 前記変異が、I24、Q26、S32、Q44、R68、R70、D75、I77及びT140からなる群より選択される位置である請求項15に記載のI-CreI変異型。
- 75位のアスパラギン酸の、非荷電アミノ酸での置換を含む請求項16に記載のI-CreI変異型。
- D75N又はD75V変異を含む請求項17に記載のI-CreI変異型。
- R70S変異を含む請求項16に記載のI-CreI変異型。
- I-CreIの80位〜163位に、好ましくはI-CreIの80位、82位、85位、86位、87位、94位、96位、100位、103位、114位、115位、117位、125位、129位、131位、132位、147位、151位、153位、154位、155位、157位、159位及び160位に1又は複数のさらなる変異を含む請求項13〜19のいずれか1項に記載のI-CreI変異型。
- ホモダイマーである請求項13〜20のいずれか1項に記載のI-CreI変異型。
- 2つの異なる変異型からのモノマーを含むヘテロダイマーである請求項13〜20のいずれか1項に記載のI-CreI変異型。
- 請求項13〜20のいずれか1項で定義される変異型からのモノマーと、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型からのモノマー又はドメインとの融合体を含む単鎖キメラエンドヌクレアーゼ。
- 請求項13〜22のいずれか1項に記載のI-CreI変異型、又は請求項23に記載の変異型に由来する単鎖キメラエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
- 請求項24に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む組換えベクター。
- DNA標的配列を取り囲む領域と相同性を共有する配列を含む標的化構築物を含む請求項25に記載のベクター。
- 標的化DNA構築物が、a) DNA標的配列を取り囲む領域と相同性を共有する配列と、b) a)で定義される配列に接する、導入される配列とを含む請求項26に記載のベクター。
- 請求項23に記載のポリヌクレオチド、又は請求項25〜27のいずれか1項に記載のベクターにより改変された宿主細胞。
- 請求項24に記載のポリヌクレオチド、又は請求項25〜27のいずれか1項に記載のベクターにより改変された非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項23に記載のポリヌクレオチド、又は請求項25〜27のいずれか1項に記載のベクターにより改変されたトランスジェニック植物。
- 請求項13〜22のいずれか1項に記載の少なくとも1つのI-CreI変異型、請求項23に記載の少なくとも1つの変異型に由来する単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、又は請求項25〜27のいずれか1項に記載の組換えベクターを含む組成物。
- 標的遺伝子座と相同性を共有する配列により挟まれている興味のある部位を修復する配列を含む標的化DNA構築物を含む請求項31に記載の組成物。
- DNA標的配列を含むベクターを請求項13〜22のいずれか1項に記載のI-CreI変異型又は請求項23に記載の前記変異型を含む単鎖キメラエンドヌクレアーゼと接触させることにより、該ベクター上に位置する興味のある部位で二本鎖核酸を切断し、それにより前記変異型の切断部位を取り囲む配列と相同性を示す別のベクターとの相同組換えを誘導する工程を含む、遺伝子操作の方法。
- 1) 少なくとも1つのDNA標的配列を、請求項13〜22のいずれか1項に記載のI-CreI変異型又は請求項23に記載の前記変異型を含む単鎖キメラエンドヌクレアーゼと接触させることにより、前記少なくとも1つのDNA標的配列を含むゲノム遺伝子座を二本鎖切断し、2) 前記切断されたゲノム遺伝子座を、該標的遺伝子座と相同性を共有する配列に挟まれている、該遺伝子座に導入される配列を含む標的化DNA構築物との相同組換えに適する条件下で維持する工程を含む、ゲノム操作の方法。
- 1) 切断部位を、請求項13〜22のいずれか1項に記載のI-CreI変異型又は請求項23に記載の前記変異型を含む単鎖キメラエンドヌクレアーゼと接触させることにより、少なくとも1つのDNA標的配列を含むゲノム遺伝子座を二本鎖切断し、2) 前記切断されたゲノム遺伝子座を、前記切断部位を取り囲む領域と相同性を共有する染色体DNAとの相同組換えに適する条件下で維持する工程を含む、ゲノム操作の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の、治療目的でない分子生物学、インビボ又はインビトロの遺伝子操作、及びインビボ又はインビトロのゲノム操作のため、請求項1〜8のいずれか1項で定義されるようなDNA標的配列の切断のための使用。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができる少なくとも1つのI-CreI変異型の、個体にいずれの手段により投与される、必要とする個体における遺伝性疾患を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができる少なくとも1つのI-CreI変異型の、個体にいずれの手段により投与される、必要とする個体において、DNA中間体を提示する感染因子を原因とする疾患を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができる少なくとも1つのI-CreI変異型の、生物学的に誘導された生成物、又は生物学的使用を意図する生成物におけるDNA中間体を提示する感染因子の増殖の阻害、不活性化又は消去のため、或いは物体の消毒のための、インビトロでの使用。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができる少なくとも1つのI-CreI変異型の、他のメガヌクレアーゼを作製するための骨格としての使用。
- I-CreIの変異型が、KNSQS、KNRQS、KNTQS、KNHQSからなる群より選択されるアミノ酸残基を、それぞれ28位、30位、33位及び40位に有する請求項37〜39のいずれか1項に記載の使用。
- 前記I-Cre I変異型が、請求項13〜23のいずれか1項に定義されるものである請求項36〜40のいずれか1項に記載の使用。
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