CN101296943A

CN101296943A - 通过多巴胺d1r激动剂杀伤人类淋巴瘤和白血病癌细胞和tcr活化的人类正常细胞

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Publication number: CN101296943A
Application number: CNA2006800366308A
Authority: CN
Inventors: 米亚·利维特
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-08-03
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2008-10-29
Also published as: AU2006278514A1; WO2007019266A3; EP1917275A4; US20090022739A1; EP1917275A1; JP2009502206A; JP2009503109A; WO2007019266A2; IL189227A0; US20080311657A1

Abstract

多巴胺D1/D5受体在多种类型的人类和动物白血病、淋巴瘤以及活化的T细胞中高度过表达。多巴胺D1受体在其他类型的癌细胞中也以显著升高或甚至中度水平表达。选择性的多巴胺D1受体激动剂，例如非诺多巴甲磺酸盐，快速、有效以及选择性杀伤表达多巴胺D1受体的人类和动物T细胞。因此，选择性多巴胺D1/D5受体激动剂通过杀伤引起疾病的细胞而用于治疗淋巴瘤、白血病以及免疫系统的其他癌症，以及T细胞介导的自身免疫性疾病和过度活化的炎性T细胞引起的其他疾病(例如慢性炎症)，或移植物抗宿主疾病(GVHD)或移植物排斥，或表达多巴胺D1受体的任何其他细胞类型引起的疾病。选择性多巴胺D1/D5受体激动剂可在体外或体内用于这些目的，例如在进一步的使用之前清除来自不需要的白血病、淋巴瘤或活化的T细胞的给定细胞群。

Description

通过多巴胺D1R激动剂杀伤人类淋巴瘤和白血病癌细胞和TCR活化的人类正常细胞

背景技术

淋巴瘤和白血病

人类可患有多种类型的淋巴瘤和白血病，它们是具有极大破坏性的肿瘤。在大多数情况中，目前存在的治疗方式(化疗、放疗、手术、某些其他抗癌药物和骨髓移植)远不令人满意，且仅相对小部分淋巴瘤和白血病患者可存活多年。因此，急需发现可选择性杀伤淋巴瘤和白血病癌细胞而对正常细胞(非恶性细胞)影响小得多(即使有一点)的新型药物。

多巴胺及其受体

多巴胺，是神经系统中最重要的神经递质，具有5种受体，DR1-DR5，它们可再分为D1R家族和D2R家族，D1R家族包括D1R和D5R，D2R家族包括D2R、D3R以及D4R。D1类多巴胺受体(同样，D1R和D5R属于该类)为Gs蛋白偶联的，而D2类多巴胺受体(同样，D2R、D3R以及D4R属于该类)为Gi蛋白偶联的。

几个独立的研究显示人类正常T细胞和外周淋巴细胞表达D2、D3、D4以及D5亚型的多巴胺能受体，而不表达多巴胺D1受体亚型。

非诺多巴甲磺酸盐(Fenoldopam mesylate)

非诺多巴甲磺酸盐是具有高度选择性的多巴胺D1受体，在临床中因其主要在严重高血压、充血性心力衰竭以及急性和慢性肾衰竭的治疗中的血管舒张作用(vasodilatory actions)，而受到广泛研究和使用。

非诺多巴甲磺酸盐不穿过BBB，因此仅具有外周作用。化学上，非诺多巴是6-氯-2，3，4，5-四氢化-(4-羟苯基)-[1H]-3-苯并氮杂卓-7，8-二醇甲磺酸盐。其在美国专利4,197,297、4,600,714以及6,238,693中有描述，目前为通用名药。

非诺多巴是含有具有生物活性的R异构体的外消旋混合物。R异构体比对D1样受体的亲和力比S异构体高大约250倍。非诺多巴与ce2-肾上腺素受体以中度亲和力结合。它对于D2样受体、α1以及β肾上腺素受体、5HT1和5HT2受体或毒蕈碱受体无显著亲和力。至今无证据表明非诺多巴或任何其他D1受体激动剂具有杀伤癌细胞的能力。现在已发现多种类型的人类和动物白血病和淋巴瘤以及活化的T细胞与正常检测的不表达D1受体的T细胞相比表达高度增加水平的多巴胺D1受体。还发现选择性多巴胺D1受体激动剂非诺多巴以及其他选择性多巴胺D1受体激动剂可快速、有效和选择性杀伤淋巴瘤、白血病和活化的T细胞。基于这些发现，本发明涉及非诺多巴甲磺酸盐和其他多巴胺D1受体激动剂用于选择性杀伤淋巴瘤、白血病、活化的T细胞以及高度活化的炎性T细胞。预期非诺多巴还具有杀伤表达多巴胺D1受体的其他癌细胞的能力。

T细胞介导的自身免疫性疾病

人类可患有几种类型的自身免疫性疾病，其中一些为自身免疫性T细胞介导(或多或少的程度)。人类T细胞介导的自身免疫性疾病有下列：胰岛素依赖型(1型)糖尿病、多发性硬化症、重症肌无力、自身免疫性心肌炎，以及可能的至少部分(根据最近几年所做的新观察)秃发症和银屑病。所有这些疾病的目前治疗的有益结果非常有限并且远不令人满意。因此，急需发现可选择性杀伤或沉默活化的自身免疫性T细胞而不作用于静止的非活化的T细胞的新型药物。

发明内容

本发明的涉及杀伤淋巴瘤和白血病的方面基于下列发现：

1)某些类型的人类和小鼠淋巴瘤(尤其是几种T细胞淋巴瘤)和白血病(尤其是T细胞白血病)在它们的细胞表面表达的多巴胺D1受体水平显著提高，这与不表达D1多巴胺受体的静止的人类正常外周T细胞大不相同。其他类型的非T细胞白血病和淋巴瘤(尤其是B细胞伯基特氏淋巴瘤)也表达不同水平的多巴胺D1受体。

2)在体外将5种不同类型的人类淋巴瘤和白血病(上述)暴露于1mM-0.01mM浓度的非诺多巴甲磺酸盐或类似浓度的其他多巴胺D1/5受体激动剂导致所有或绝大多数这些癌细胞死亡。

3)在体外将不同类型的人类淋巴瘤和白血病暴露于非诺多巴甲磺酸盐或其他高特异性多巴胺D1/5受体激动剂(上述)相对短的时间段(如10-30分钟)足以导致淋巴瘤或白血病细胞死亡。所试验并发现可有效杀伤淋巴瘤和白血病的选择性多巴胺D1/5受体激动剂为：盐酸(1R-顺式)-1-(氨甲基)-3，4-二氢-3-三环[3.3.1.13，7]癸-1-基-[1H]-2-苯并吡喃-5，6-二醇(TOCRIS Cookson产品名：盐酸A 77636；产品目录号：1701；被称为“具有口服活性的有效、选择性D1样激动剂”)；氢溴酸(±)-1-苯基-2，3，4，5-四氢-(1H)-3-苯并氮杂卓-7，8-二醇(TOCRIS Cookson产品名：氢溴酸SKF38393；产品目录号：0922；被称为“D1样多巴胺受体选择性部分激动剂”)；以及盐酸顺式-(±)-1-(氨甲基)-3，4-二氢-3-苯基-1H-2-苯并吡喃-5，6-二醇(TOCRIS Cookson产品名：1534；产品目录号：盐酸A 68930；被称为“有效、选择性D1样多巴胺受体激动剂”)。

4)非诺多巴甲磺酸盐和所有其他选择性多巴胺D1/5受体激动剂杀伤淋巴瘤和白血病总是具有剂量依赖性。尽管如此，如所预期的，某些D1R激动剂比其他药物更有效，可以以低于其他药物的浓度杀伤癌细胞。非诺多巴甲磺酸盐和盐酸A77636为最有效的癌细胞杀伤药物，因此为用于本发明的有效实施方案。

5)与人类正常(非癌症)T细胞上的各受体的较低表达相比，所试验的大多数淋巴瘤和白血病细胞在其细胞表面不但表达显著升高D1/5受体的水平还表达显著升高的多巴胺D3和多巴胺D2受体的水平。然而，多巴胺D2和D3受体激动剂，与多巴胺D1/5受体激动剂产生的作用相比，表现较低的抗癌杀伤活性。

尽管多巴胺D1R激动剂始终引起所试验的白血病和淋巴瘤细胞的显著死亡(主要坏死)，但原则上可激发所有其5种受体亚型的多巴胺本身在某些情况中也杀伤人类白血病和淋巴瘤，但在某些其他情况中没有该作用。在本发明所试验的所有高选择性D1R激动剂中，非诺多巴甲磺酸盐和盐酸A 77636为最有效的癌症杀伤药物。

本发明涉及治疗T细胞介导的自身免疫性疾病的治疗的方面基于下列方面：

1.T细胞受体(TCR)活化的人类正常外周T细胞在其细胞表面上表达显著升高水平的多巴胺D1受体(与不表达该受体或以最低非显著水平表现该作用的静止的人类正常外周T细胞不同)；

2.在体外将TCR活化的人类正常外周T细胞暴露于几种高选择性多巴胺D1/5受体激动剂，例如非诺多巴甲磺酸盐，杀伤大部分这些活化的T细胞，但较少杀伤静止的(非活化的)人类正常外周T细胞。所有选择性多巴胺D1/5受体激动剂杀伤TCR活化的T细胞具有剂量依赖性。尽管如此，如所期望的，某些D1R激动剂比其他药物更有效，可以以低于其他药物的浓度杀伤癌细胞。在本发明试验的所有高选择性D1R激动剂中，非诺多巴甲磺酸盐和盐酸A 77636为最有效的TCR活化的T细胞杀伤药物，因此为用于该方法的有效实施方案。

附图说明

参考附图，本发明将得以更好理解，其中：

图1A-F显示流式细胞计量术FACSort结果，确定多巴胺D1受体在绝大多数T白血病细胞和T淋巴瘤细胞中表达，而很少在人类正常T细胞中表达。在图1A-C中，新分离的人类正常T细胞以及人类T白血病细胞系(Jurkat)和小鼠T淋巴瘤细胞系(EL-4)经受使用兔抗DR1 IgG然后是FITC共轭的抗兔IgG(第二Ab)和PE共轭的抗人类TCRαβmAb(第三Ab)(后者证实所有试验的细胞的T细胞来源)的双重免疫荧光染色。在图1D-F中，使用正常兔血清和相似的第二和第三Ab进行所有三种类型的T细胞的同种型对照非特异性染色。通过从特异性染色中(各较高数字的框窗)减去非特异性染色(各较低数字的框窗)导出各T细胞类型中TCR⁺D1R⁺双阳性细胞的实际百分数：人类正常T细胞：％TCR⁺D1R⁺细胞＝13.9-8.21＝5.69％；人类T细胞白血病：％TCR⁺D1R⁺细胞＝74.8-13.7＝61.1％；小鼠T细胞淋巴瘤：％TCR⁺D1R⁺细胞＝71-13.2＝57.8％。进行了4个中的代表性实验。

图2是显示高选择性多巴胺D1R激动剂非诺多巴甲磺酸盐(FDM)以剂量依赖性方式杀伤人类T细胞白血病的曲线图。将人类T细胞白血病(Jurkat)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M-10^-10M的起始浓度添加FDM，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终FDM浓度为10^-4M-10^-12M。在总共1小时的时间段中的0时、15分钟、30分钟以及45分钟时将FDM(以各上述浓度)添加至相应的微孔四次。在进行FDM的这些添加之间，将微孔板放置于潮湿的培养箱中(37℃，5％CO₂)。在最后一次添加FDM之后15分钟，从各孔的上部分小心去除50微升的上清液，使用商业试剂盒根据生产商的说明和如材料与方法部分(实施例1)所述检测乳酸脱氢酶(LDH)释放至该上清液的程度，该酶是当细胞死亡/溶解时释放的稳定胞浆酶。

图3是显示非诺多巴甲磺酸盐(FDM)以剂量依赖性方式杀伤人类表皮Sezary T细胞淋巴瘤的曲线图。将人类Sezary T细胞淋巴瘤(HUT-78)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M-10^-10M的起始浓度添加FDM，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终FDM浓度为10^-4M-10^-12M。在总共1小时的时间段中的0时、15分钟、30分钟以及45分钟时将FDM(以各上述浓度)添加至相应的微孔四次。在进行FDM的这些添加之间，将微孔板放置于潮湿的培养箱中(37℃，5％CO₂)。在最后一次添加FDM之后15分钟，从各孔的上部分小心去除50微升的上清液，使用商业试剂盒根据生产商的说明和如材料与方法部分(实施例1)所述检测LDH释放至该上清液的程度，该酶是当细胞死亡/溶解时释放的稳定胞质酶。

图4是显示FDM以剂量依赖性方式杀伤人类慢性髓细胞性白血病(CML)的曲线图。将人类CML(K-562)细胞接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M-10^-10M的起始浓度添加FDM，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终FDM浓度为10^-4M-10^-12M。在总共1小时的时间段中的0时、15分钟、30分钟以及45分钟时将FDM(以各上述浓度)添加至相应的微孔四次。在进行FDM的这些添加之间，将微孔板放置于潮湿的培养箱中(37℃，5％CO₂)。在最后一次添加FDM之后15分钟，从各孔的上部分小心去除50微升的上清液，使用商业试剂盒根据生产商的说明和如材料与方法部分(实施例1)所述检测LDH释放至该上清液的程度，该酶是当细胞死亡/溶解时释放的稳定胞质酶。

图5是显示FDM以剂量依赖性方式杀伤人类伯基特氏B细胞淋巴瘤(Human Burkitt’s B-Cell Lymphoma)的曲线图。将人类伯基特氏B细胞淋巴瘤细胞(Daudi)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M-10^-10M的起始浓度添加FDM，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终FDM浓度为10^-4M-10^-12M。在总共1小时的时间段中的0时、15分钟、30分钟以及45分钟时将FDM(以各上述浓度)添加至相应的微孔四次。在进行FDM的这些添加之间，将微孔板放置于潮湿的培养箱中(37℃，5％CO₂)。在最后一次添加FDM之后15分钟，从各孔的上部分小心去除50微升的上清液，使用商业试剂盒根据生产商的说明和如材料与方法部分(实施例1)所述检测LDH释放至该上清液的程度，该酶是当细胞死亡/溶解时释放的稳定胞质酶。

图6A和6B为显示多巴胺D1受体在绝大多数人类TCR活化的(图6B)细胞表达但不在静止的正常(图6A)外周T细胞中表达的曲线图。对从任意个体的“新鲜”血样纯化的人类正常T细胞不作任何进一步处理，且在潮湿的培养箱中这样培养72小时，或在体外进行“经典”的T细胞受体(TCR)活化(使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体，如材料和方法部分所述)(图6B)。然后使用兔抗DR1 IgG然后是FITC共轭的抗兔IgG(第二Ab)(图6A)使“静止”和TCR活化的T细胞经受单免疫荧光染色。平行地，使用正常兔血清而不是抗D1R抗体使所述细胞经受非特异性对照染色，(也作为可选行示于图6A和6B)。

图7A和7B为显示多巴胺D1受体在绝大多数人类TCR活化的(图7B)细胞表达但不在静止的正常(图7A)外周T细胞中表达的曲线图。如图6所述，对从另一任意个体的“新鲜”血样纯化的人类正常T细胞进行准确处理和试验。

图8为显示FDM以剂量依赖性方式杀伤人类TCR活化的T细胞的曲线图。对从任意个体的“新鲜”血样纯化的人类正常T细胞照这样放置或在体外进行“经典”的T细胞受体(TCR)活化(使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体，如材料和方法部分所述)(图6B)。然后，TCR活化的T细胞和静止的未处理的细胞(示于图9中的结果)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M-10^-8M的起始浓度添加FDM，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终FDM浓度为10^-4M-10^-10M。在总共1小时的时间段中的0时、15分钟、30分钟以及45分钟时将FDM(以各上述浓度)添加至相应的微孔四次。在进行FDM的这些添加之间，将微孔板放置于潮湿的培养箱中(37℃，5％CO₂)。在最后一次添加FDM之后15分钟，从各孔的上部分小心去除50微升的上清液，使用商业试剂盒根据生产商的说明和如材料与方法部分(实施例1)所述检测LDH释放至该上清液的程度，该酶是当细胞死亡/溶解时释放的稳定胞质酶。

图9为显示FDM对静止的人类正常T细胞具有较温和杀伤效应的曲线图。对从一给定的任意个体的“新鲜”血样纯化的人类正常T细胞照这样放置(且因此认为是“静止”)或在体外进行”经典”的T细胞受体(TCR)活化(使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体，如材料和方法部分所述)(图6B)。然后，TCR活化的T细胞和静止的未处理的细胞(示于图9中的结果)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M-10^-8M的起始浓度添加FDM，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终FDM浓度为10^-4M-10^-10M。在总共1小时的时间段中的0时、15分钟、30分钟以及45分钟时将FDM(以各上述浓度)添加至相应的微孔四次。在进行FDM的这些添加之间，将微孔板放置于潮湿的培养箱中(37℃，5％CO₂)。在最后一次添加FDM之后15分钟，从各孔的上部分小心去除50微升的上清液，使用商业试剂盒根据生产商的说明和如材料与方法部分(实施例1)所述检测LDH释放至该上清液的程度，该酶是当细胞死亡/溶解时释放的稳定胞质酶。

图10是显示高选择性多巴胺D1R激动剂盐酸A 77636以剂量依赖性方式诱导人类T细胞白血病显著细胞死亡的曲线图。将人类T细胞白血病(Jurkat)细胞接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。值得注意的是，根据生产商(Tocris)说明，盐酸A 77636是具有口服活性的D1R激动剂。

图11是显示高选择性多巴胺D1R激动剂盐酸A 68930以剂量依赖性方式诱导人类T细胞白血病显著细胞死亡的曲线图。将人类T细胞白血病(Jurkat)细胞接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 68930，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图12是显示高选择性多巴胺D1R激动剂氢溴酸SKF 38393以剂量依赖性方式诱导人类T细胞白血病显著细胞死亡的曲线图。将人类T细胞白血病(Jurkat)细胞接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加氢溴酸SKF 38393，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图13是显示盐酸A 77636以剂量依赖性方式诱导人类表皮Sezary T淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类表皮Sezary T淋巴瘤细胞(HUT-78)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图14是显示盐酸A 68930以剂量依赖性方式诱导人类表皮Sezary T淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类表皮Sezary T淋巴瘤细胞(HUT-78)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 68930，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图15是显示氢溴酸SKF 38393以剂量依赖性方式诱导人类表皮Sezary-T淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类表皮Sezary-T淋巴瘤细胞(HUT-78)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加氢溴酸SKF 38393，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图16是显示盐酸A 77636以剂量依赖性方式诱导人类伯基特氏B淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类伯基特氏B淋巴瘤细胞(Daudi)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图17是显示盐酸A 68930以剂量依赖性方式诱导人类伯基特氏B淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类伯基特氏B淋巴瘤细胞(Daudi)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 68930，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图18是显示氢溴酸SKF 38393以剂量依赖性方式诱导人类伯基特氏B淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类伯基特氏B淋巴瘤细胞(Daudi)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加氢溴酸SKF 38393，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图19是显示盐酸A 77636以剂量依赖性方式诱导人类伯基特氏B淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类伯基特氏B淋巴瘤细胞(Raji)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图20是显示盐酸A 68930以剂量依赖性方式诱导人类伯基特氏B淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类伯基特氏B淋巴瘤细胞(Raji)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 68930，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图21是显示氢溴酸SKF 38393以剂量依赖性方式诱导人类伯基特氏B淋巴瘤细胞显著死亡的曲线图。将人类伯基特氏B淋巴瘤细胞(Raji)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加氢溴酸SKF 38393，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图22是显示盐酸A 77636以剂量依赖性方式诱导慢性髓细胞性白血病细胞显著死亡的曲线图。将人类慢性髓细胞性白血病细胞(CML)(K-562)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图23是显示盐酸A 68930以剂量依赖性方式诱导慢性髓细胞性白血病细胞显著死亡的曲线图。将人类慢性髓细胞性白血病细胞(CML)(K-562)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 68930，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图24是显示氢溴酸SKF 38393以剂量依赖性方式诱导慢性髓细胞性白血病细胞显著死亡的曲线图。将人类慢性髓细胞性白血病细胞(CML)(K-562)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加氢溴酸SKF 38393，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图25是显示盐酸A 77636对静止的人类正常T细胞具有较温和杀伤效应的曲线图。将从另一任意个体的“新鲜”血样纯化的人类正常T细胞接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图26是显示盐酸A 68930对静止的人类正常T细胞具有较温和杀伤效应的曲线图。将从另一任意个体的“新鲜”血样纯化的人类正常T细胞接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加盐酸A 68930，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图27是显示氢溴酸SKF 38393对静止的人类正常T细胞具有较温和杀伤效应的曲线图。将从另一任意个体的“新鲜”血样纯化的人类正常T细胞接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-1M-10^-4M的起始浓度添加氢溴酸SKF 38393，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-3M-10^-6M。之后，将微孔板放置于培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)中3天。然后，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图28显示盐酸A 77636导致人类伯基特氏B淋巴瘤极快速死亡。将人类伯基特氏B淋巴瘤细胞(Raji)接种于96孔板(50万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M的固定起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-4M。然后，将细胞转移至培养箱(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)1分钟、10分钟、30分钟、60分钟或120分钟培养。然后，从各孔的上部分小心去除50微升的上清液，使用商业试剂盒根据生产商的说明和如材料与方法部分(实施例1)所述检测LDH释放至该上清液的程度，该酶是当细胞死亡/溶解时释放的稳定胞质酶。

图29是显示盐酸A 77636导致人类慢性髓细胞性白血病极快速死亡的曲线图。将人类慢性髓细胞性白血病细胞(CML)(K-562)接种于96孔板(50万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M的固定起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-4M。将该实验设计成检测将所述细胞暴露于D1R激动剂1分钟、15分钟、1小时或72小时的作用。因此，在添加D1R激动剂之后1分钟、15分钟、1小时，将相应的细胞转移至试管，离心(1000rpm，10分钟)，并去除上清液。然后将细胞重悬于新鲜的培养基中(即不含D1R激动剂)，接种于新的干净的微孔中，并放回培养箱中3天。在添加D1R激动剂之后，不对72小时样品进行这样的离心。因此，不更换其培养基，这些细胞和剩余的细胞照这样在培养箱中72小时。在72小时培养结束时，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图30显示盐酸A 77636导致人类T细胞白血病极快速死亡的曲线图。将人类T细胞白血病细胞(Jurkat)接种于96孔板(50万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-2M的固定起始浓度添加盐酸A 77636，并以1∶00稀释至相应孔，使得所试验的最终浓度为10^-4M。将该实验设计成检测将所述细胞暴露于D1R激动剂1分钟、15分钟、1小时或72小时的作用。因此，在添加D1R激动剂之后1分钟、15分钟、1小时，将相应的细胞转移至试管，离心(1000rpm，10分钟)，并去除上清液。然后将细胞重悬于新鲜的培养基中(即不含D1R激动剂)，接种于新的干净的微孔中，并放回培养箱中3天。在添加D1R激动剂之后，不对72小时样品进行这样的离心。因此，不更换其培养基，这些细胞和剩余的细胞照这样在培养箱中72小时。在72小时培养结束时，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

图31A和B为显示盐酸A 77636比静止的正常(图31A)人类T细胞杀伤多的TCR活化的细胞(图31B)。对从一给定的任意个体的“新鲜”血样纯化的人类正常T细胞照这样放置或在体外进行”经典”的T细胞受体(TCR)活化(使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体，如材料和方法部分所述)。然后，TCR活化的T细胞(图31B)和静止的未处理的细胞(图31A)接种于96孔板(20万细胞/ml，0.5ml/孔)，并以10^-5M的最终浓度添加高选择性多巴胺D1R激动剂盐酸A 77636。将细胞转移至培养箱培养72小时。在72小时培养结束时，通过流式细胞计量评估活细胞的数量(通过FACsort对细胞进行计数，持续固定的1分钟时间长，其中对100微升各样品进行试验)。

优选实施方案的详细描述

尽管五种选择性D1R激动剂在本文有特别描述并用于实验，但认为本发明不限于此。确定其他所述激动剂在本领域技术范围内，例如通过改变已知为所述激动剂的分子的结构并筛选激动剂活性，或通过本领域已知的其他方法。另外，单克隆抗体常具有激动剂活性。因此，可使用D1R或其表位作为抗原来产生抗体，并对其筛选D1R激动剂活性。那么，任何这样的阳性抗体可直接根据本发明使用或以传统方法遗传改造而产生保留母体抗体的D1R激动活性的人源化抗体，单链抗体或抗体片段或衍生物。本文所使用的术语“抗体”意于包括多克隆或单克隆抗体或任何前述的遗传工程抗体。

多巴胺D1激动剂可直接或间接活化多巴胺D1受体。也可通过本发明的激动剂直接或间接活化受体的G蛋白连接蛋白或任何其下游效应因子蛋白。一旦本发明的作用得以理解，筛选和获得具有所需活性和选择性的其他激动剂在本领域普通技术人员的技术范围内。

本发明说明书和权利要求中使用的术语“选择性”是指针对D1R和D5R具有大体上选择性的激动剂活性，而对D2R、D3R以及D4R具有较小的活性或无活性。尽管本发明的激动剂优选对多巴胺D1受体具有完全的选择性，但它们还对D5受体具有某些激动剂活性也是容许的，所述D5受体也是多巴胺受体的D1家族的成员。优选的激动剂对于D1R具有强活性，对D5R可能具有很小的活性，对D2R、D3R以及D4R具有较小的活性或无活性。

通过本发明的方法可杀伤表达多巴胺D1受体的任何细胞，特别是过表达所述受体的那些。如本文所述，某些白血病和淋巴瘤细胞(常70-80％的D1R阳性)和TCR活化的细胞与相应的正常或静止细胞相比过表达D1R。然而，某些其他癌症具有较低的D1R表达(有时甚至仅10％阳性)，但也可通过根据本发明的D1R激动剂非常有效地杀伤。因此，甚至低或中度水平的D1R可使得细胞对于由D1R选择性激动剂诱导的死亡敏感。因此，本发明还意于涵盖杀伤以甚至低或中度水平表达D1R的其他恶性细胞。

TCR活化的T细胞与正常“静止”T细胞相比过表达D1R。因此，可消除疾病或病症中所述活化的T细胞，其中所述活化的T细胞促成待治疗的疾病或病症，即所述疾病或病症由活化的T细胞例如炎性T细胞引起或加剧。所述疾病或病症的实例为T细胞介导的自身免疫性疾病，例如胰岛素依赖型(1型)糖尿病、多发性硬化症、重症肌无力、自身免疫性心肌炎、秃发症和银屑病。其他所述疾病包括顽固性炎症和由炎性T细胞介导的其他疾病。

根据本发明可治疗的另一种疾病或病症为移植物抗宿主疾病(GVHD)。可通过杀伤来自人类和/或动物供体的活化的宿主活化的同种异体T细胞来预防或治疗GVHD。所述活化的T细胞可引起完全或部分错配的器官或骨髓细胞的移植后继发的GVHD。相似地，可通过本发明的方法来治疗或预防移植物排斥。活化的宿主T细胞可引起针对供体组织的宿主反应，由此导致完全或部分错配的器官或骨髓细胞的移植后继发的移植物排斥。

本发明的激动剂可用于在体内或体外导致表达D1R受体的细胞死亡。当治疗人类或其他动物受治疗者的疾病时，可以本领域已知的任何方便的方法全身施用本发明的激动剂或将其局部施用于待治疗的细胞的部位。因此，可通过静脉内、皮下、腹膜内、瘤内、鞘内或颅内注射施用所述激动剂。可通过透皮膏剂或可植入的递送药物泵来施用所述激动剂。还可通过口服施用所述激动剂。

本发明的激动剂还可通过活体外使用。例如，可以以清除和/或杀伤白血病和/或淋巴瘤细胞的方式使用它们，例如用于杀伤稍后用于自体骨髓移植的自体同源干细胞制品中的癌细胞。的确，多巴胺D1受体激动剂可用于清除或“清理”来自白血病、淋巴瘤或活化的T细胞的给定的细胞群，例如骨髓细胞，然后再使用“清理的”细胞群用于骨髓移植、T细胞移植或任何其他用途。所述“清理的”细胞群还可用于例如进一步在体外培养，例如用于癌症的免疫治疗，收集T细胞细胞因子或生长因子或任何其他T细胞分泌蛋白等。

实施例1：

材料与方法

被检验其抗癌作用的多巴胺D1受体激动剂

对五种不同的高选择性多巴胺D1/5受体激动剂检验其抗淋巴瘤和抗白血病杀伤活性：

1)TOCRIS Cookson产品名：盐酸A 77636；产品目录号：1701；化学名：盐酸(1R-顺式)-1-氨甲基)-3，4-二氢-3-三环[3.3.1.13，7]癸-1-基-[1H]-2-苯并吡喃-5，6-二醇(TOCRIS Cookson产品名：被称为“具有口服活性的有效、选择性D1样激动剂”)。

2)TOCRIS Cookson产品名：氢溴酸SKF 38393；产品目录号：0922；化学名：氢溴酸(±)-1-苯基-2，3，4，5-四氢-(1H)-3-苯并氮杂卓-7，8-二醇；被称为-D1样多巴胺受体选择性部分激动剂)。

3)TOCRIS Cookson产品名：1534；产品目录号：盐酸A 68930；化学名：盐酸顺式-(±)-1-(氨甲基)-3，4-二氢-3-苯基-1H-2-苯并吡喃-5，6-二醇；被称为-有效、选择性D1样多巴胺受体激动剂。

4)非诺多巴甲磺酸盐(FD)：Bedford Labopratories/USA产品名-非诺多巴甲磺酸盐注射剂USP-(非诺多巴是6-氯-2，3，4，5-四氢化-(4-羟苯基)-[1H]-3-苯并氮杂卓-7，8-二醇甲磺酸盐。

5)非诺多巴氢溴酸盐：SIGMA产品名F6800，CAS#：67227-56-9；别名：SKF 82526。

多巴胺和其他多巴胺受体类似物用作对照

i.多巴胺和多巴胺D3R选择性激动剂：U-99194A马来酸盐(SigmaChemicals)。多巴胺D1R选择性激动剂：SKF 38393。多巴胺D2R选择性激动剂：喹吡罗。多巴胺D3R选择性激动剂：7-羟基-DPAT；

ii.多巴胺D4R选择性激动剂：PD 168077。多巴胺D2R选择性激动剂：L-741，626。多巴胺D4R选择性激动剂：L-741，741(Tocris Cookson)。

人类癌细胞系

人类B淋巴瘤(伯基特氏淋巴瘤)系：Raji和Daudi；人类T细胞白血病系：Jurkat；人类T淋巴瘤(表皮“Sezary”T淋巴瘤)系：HuT-78；以及人类慢性髓细胞性白血病(CML)：K-562获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并将其维持(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)于补充10％FCS、1％谷氨酰胺和1％抗生素的组织培养基中(IMDM或RP MI-1640)。

人类正常外周T细胞

密度梯度离心用于将淋巴细胞与红细胞、死亡细胞、多形核白细胞和粒细胞进行分离。使用PBS以1∶1稀释血库供应的无血浆和无先前冷冻的“新鲜”50ml白细胞样品并将其添加至其底部含有5.6％聚蔗糖和9.6％甲泛影钠的Uni-SEPmaxi+试管中(Novamed，Jerusalem，Israel)，并通过2ml移液管去除所产生的白细胞层(迁移至血浆和聚蔗糖/甲泛影钠之间的界面)。使用PBS(1000rpm，10分钟)清洗白细胞两次，并重悬于8ml含5％FCS的PBS中。然后，将尼龙羊毛柱用于将T细胞与其他淋巴细胞(即B细胞和NK细胞)进行分离。将细胞悬浮液(每柱2ml)上样于(通过注射器注射)在37℃使用PBS/5％FCS预温育的尼龙羊毛柱(Novamed)。在此细胞上样之后，所述柱再于室温下平放温育1小时。在温育之后，将PBS(每柱12ml)添加至柱子用于洗脱非粘附的T细胞。将洗脱的细胞收集于干净的试管中并离心(800rpm，15分钟)。所产生的细胞群包括＞90％的T细胞，如使用FACSort通过TCR染色和流式细胞计量术所评估的。将细胞维持(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)于补充10％FCS、1％谷氨酰胺以及1％抗生素的RPMI-1640中。

人类正常外周T细胞的T细胞受体(TCR)活化

使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体(mAbs)(BD Pharmingen，San Jose，CA)；(于PBS中10g/ml)过夜包被非组织培养物处理的24孔板(Falcon，Franklin Lakes，NJ)。然后使用PBS清洗微孔，在37℃封闭1小时(PBS/1％BSA)，并再进行清洗。将新纯化的人类正常T细胞重悬于其各自的新鲜培养基中并接种于抗CD3/CD28包被的微孔中(每孔1×10⁶)，并将培养板温育72小时(37℃，潮湿培养箱，5％CO₂)。然后从各孔收集细胞及其培养基，将它们转移至50ml试管中，离心，并收集TCR活化的细胞及其培养基并将它们转移至干净的各试管中。

癌细胞、以及正常“静止”和正常TCR活化的T细胞暴露于D1R激动剂(其中为FD)

将人类癌细胞、且同时“静止”和T细胞受体(TCR)活化的人类正常T细胞接种于96孔组织培养微孔((20-50万细胞/孔)，并以通常在0.1nM-0.1mM范围(除非另有指明)的系列稀释度添加D1R激动剂，保持1分钟至72小时的不同时间段。之后检测细胞活力。在关于FD的大部分实验中，再次以0.01nM-0.1mM的系列稀释度在总共1小时的时间段的0时、15分钟、30分钟以及60分钟添加该药物四次(FDx4)。

检测在LDH释放之后FD对细胞活力的影响

使用

非放射活性细胞毒性测定(Promega)根据生产商的说明实施通过检测LDH的释放来检测细胞死亡。

详细说明：

非放射活性细胞毒性测定是51Cr释放细胞毒性测定的色度可选方法。

测定定量检测乳酸脱氢酶(LDH)，乳酸脱氢酶是细胞溶解时释放的稳定胞质酶，其与放射活性测定中⁵¹Cr的释放方式一样。使用30分钟配对酶测定检测培养上清中释放的LDH，这导致四唑盐(INT)转化为红色的甲(月替)(formazan)产物。所形成的颜色的量与溶解的细胞的数量成比例。使用标准96孔板读数仪收集可见的波长吸光度数据。

使用流式细胞计量方法检测细胞死亡、细胞凋亡以及坏死之后FD对细胞活力的作用

使用IQ Products试剂盒(R&D systems)根据生产商说明进行通过流式细胞计量的细胞死亡的检测和磷脂酰丝氨酸的检测。

详细说明：磷脂酰丝氨酸检测试剂盒提供了用于通过流式细胞计量术检测细胞凋亡的快速和可靠的方法。该方法使得能够以单细胞水平检测，且还允许区别细胞凋亡和坏死。

在细胞凋亡的早期阶段，磷脂酰丝氨酸开始暴露于细胞膜的外面。该细胞凋亡的早期阶段可通过PS结合蛋白(膜联蛋白V)特异性检测到。

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜完整并且细胞排除碘化丙锭(PI)。之后，在细胞凋亡过程中，细胞膜变得多孔，PI与DNA结合。PI的摄取提示坏死。

通过锥虫蓝(Trypan Bleu)使用标准显微镜进行活细胞和死细胞计数

吸收锥虫蓝的细胞死亡或在濒死的进程中。

多巴胺D1受体的免疫表型染色和流式细胞计量分析

使用针对DR1的兔抗血清(Calbiochem)以1∶50稀释度/1×10⁶细胞/100A1使人类正常T细胞(静止的或72小时TCR活化之后)在冰上经受单或双免疫荧光染色30分钟。对于使用表型对照染色，使用正常兔血清(Jackson Immunoresearch Laboratories)对细胞进行染色。然后，使用异硫氰酸荧光素(FITC)共轭的山羊抗兔IgG(1∶100稀释度的100Al；Jackson)对细胞进行染色。在某些实验中，使用PE共轭的小鼠抗人类TCRab mAb(20Al原液；Serotec)进行双染色。仅使用第二和第三抗体染色的细胞用作另外的阴性对照。将荧光模式记录于FACSort中。

实施例2：人类T细胞癌于其细胞表面表达极高水平的多巴胺D1R，而人类正常T细胞没有该表现

通过开始使用兔抗D1R特异性抗体然后使用FITC共轭的抗兔抗体进行免疫荧光染色并通过使用FACSort进行流式细胞计量分析研究了多巴胺D1受体(D1R)在正常T细胞和癌症T细胞白血病和淋巴瘤细胞的细胞表面的表达。对于非特异性同种型对照染色，使用兔血清。

示于图1中的结果确定人类T白血病细胞(Jurkat)和小鼠T淋巴瘤细胞(EL-4)于其细胞表面表达极高水平的多巴胺D1R，而人类正常T细胞没有该表现。因此，人类白血病上的纯粹的特异性D1R染色为61％(74.8％特异性染色-13.7％对照非特异性染色)，人类T淋巴瘤上为57.8％(71％特异性染色-13.2％对照非特异性染色)，而人类正常外周T细胞上仅5.7％(13.9％特异性染色-8.2％对照非特异性染色)(图1A-F)。

还分析基质类型的非T人类淋巴瘤和白血病，即人类伯基特氏B淋巴瘤(Daudi和Raji)和人类慢性髓细胞性白血病(CML)(K-562)细胞也于其细胞表面表达不同程度的D1R(数据未显示)。

实施例3：通过存活细胞的数量表现的非诺多巴甲磺酸盐杀伤人类癌症白血病和淋巴瘤

进行了进一步的试验确定选择性D1R激动剂例如非诺多巴甲磺酸盐(FDM)(也是FDA批准的用于调节血压的药物)可杀伤表达多巴胺D1R的人类癌细胞。对此目的，将Jurkat T细胞白血病系、HuT-78人类T淋巴瘤(表皮-Sezary-T淋巴瘤)系以及K-562人类慢性髓细胞性白血病(CML)和Daudi人类B淋巴瘤(伯基特氏淋巴瘤)系接种于组织培养孔中(50万细胞/0.5ml/孔)。使用0.9％氯化钠注射液(根据生产商教导)将FDM(来自最初临床上使用的安瓶，原始浓度，MW＝401，10mg/ml＝25mM)稀释成10^-2M-10^-10M的系列稀释度。然后，将FDM添加至相应的微孔中(5微升给定浓度的FDM至0.5细胞，1∶100的稀释度)，使得所试验的最终的FDM浓度为10^-4M-10^-12M。

在1小时总时间中于0时、15分钟、30分钟以及60分钟将FDM(以上述各浓度)添加至相应的微孔4次。3天后，通过使用流式细胞计量术进行活细胞数量计数评估细胞存活/死亡。

表1显示FDM以非常显著和剂量依赖性方式杀伤人类T细胞白血病、Sezary T细胞淋巴瘤以及慢性髓细胞性白血病(CML)。

表1

有趣的是，表1显示1小时10^-4M FDM(原始FDM浓度，注射给患者用于FDA批准的48小时输注治疗以减轻他们的血压)导致杀伤所有癌细胞。10,000较低浓度的10^-8M(＝0.1nM)FDM，其是被报道在接受48小时的FDA批准的输注的患者的循环中FDM的大约稳态浓度，导致62％人类T白血病、32％人类Sezary T淋巴瘤和25％人类CML的死亡。

在接下来的实验中，使用上述相同的人类T白血病、T淋巴瘤和CML细胞以及人类伯基特氏B细胞淋巴瘤(Daudi)，显示不同浓度的FDM(在总共1小时内每隔15分钟再次添加至细胞四次)杀伤表现有乳酸脱氢酶(LDH)释放增强的所有四种类型的人类T细胞、B细胞和CML癌症，乳酸脱氢酶是细胞死亡/溶解时释放的稳定胞质酶(图2-5)。

值得注意的是，在添加FDM的1小时之后，立即检测LDH释放增强。尽管FDM具有明确的杀伤效应，但该效应的剂量依赖性复杂、意想不到且对各癌症类型不同(图2-5)。

实施例4：活化的人类正常T细胞也于其细胞表面表达极高水平的多巴胺D1R，而静止的人类正常T细胞无该表现

多巴胺D1R还在进行体外”经典”T细胞受体(TCR)活化(使用抗CD3和抗CD28单克隆抗体)的人类正常(即非癌症)外周T细胞中表达，而“静止”(即未活化的)人类正常T细胞无该表现(图6和7，表示来源自两个不同健康人类个体的T细胞)。所述TCR活化通常用于模拟通过T细胞的体内形式，其遭遇由合适的抗原递呈细胞(APC’s)递呈的外源抗原，经TCR而高度活化。

实施例5：非诺多巴甲磺酸盐诱导TCR活化的人类正常外周T细胞显著死亡，而静止的人类正常T细胞无该表现

与本发明发现的在TCR活化的人类正常T细胞中D1R表达水平升高相一致(图6和7)，10^-4M-10^-10M的FDM导致这些活化的细胞显著死亡(图8)，而几乎不影响静止的人类正常T细胞(图9)；后者静止的细胞实际上仅杀伤本发明所试验的最高FDM浓度(10^-4M)。

实施例6：非诺多巴甲磺酸盐对人类白血病和淋巴瘤的作用

接下来，对非诺多巴氢溴酸盐(具有与FDM相似的化学结构)检测其杀伤人类白血病和淋巴瘤的能力。表2-4显示下列情况确切：非诺多巴甲磺酸盐以剂量和时间依赖性方式显著增加LDH自人类B细胞淋巴瘤(表2)、T细胞淋巴瘤(表3)和CML的释放(表4)。表2显示了对于10^-8M非诺多巴氢溴酸盐观察到的对于人类B细胞淋巴瘤的最大杀伤。

表3和4显示了最初设计用于研究效应的动力学的实验的结果(本发明中，仅以10⁴M-10^-6M的浓度范围研究非诺多巴氢溴酸盐)，并且提示已经在非诺多巴氢溴酸盐的添加1分钟之后，具有增加的LDH。然而，死亡的程度随时间(10、30以及60分钟)逐渐增加，且在1小时之后，癌细胞释放显著水平的LDH，提示大量细胞死亡。

表2

表3

表4

实施例7：其他选择性多巴胺D1R激动剂对淋巴瘤和白血病细胞的效应

三种其他的高选择性多巴胺D1R激动剂也显示杀伤人类淋巴瘤和白血病细胞。这些高选择性D1R激动剂包括被称为“具有口服活性的有效、选择性D1样激动剂”的盐酸A 77636；被称为“D1样多巴胺受体选择性部分激动剂”的氢溴酸SKF 38393；被称为“有效、选择性D1样多巴胺受体激动剂”的盐酸A 68930(Tocris Cookson产品目录)。

这三种高选择性D1R激动剂确实以剂量依赖性方式杀伤显著数量的人类T细胞白血病(图10-12)、T细胞淋巴瘤(图13-15)、两种类型的B细胞淋巴瘤(图16-18：Daudi；图19-21：Raji)；以及CML(图22-24)。相比之下，这些D1R激动剂对人类正常(即非癌症)T细胞(图25-27)具有较低的效应。在所有上述实验中(图10-24)，通过添加D1R激动剂之后3天存活细胞的数量来评估细胞死亡。有趣的是，D1R激动剂在它们的杀伤效能方面不同，最有效的通常是盐酸A 77636。另外，给定的D1R激动剂诱导的癌细胞死亡的程度在癌细胞类型之间不同(图10-24)。

选择性D1R激动剂诱导的癌死亡对D1受体来说具有高特异性。图28显示了将人类B细胞癌仅暴露于D1R激动剂(在此情况中，A77636)1分钟足以杀伤细胞，如LDH释放a≈3倍增加所表现的。较长暴露于LDH(10、30以及60分钟)导致细胞死亡程度进一步增加，在1小时达到高峰，使得添加D1R激动剂2小时并不更有效。图29显示CML仅暴露于D1R激动剂1分钟(然后清洗细胞和重悬于无D1R激动剂的培养基)足以杀伤＜＜48％的细胞，如3天后从流式细胞计量计数的活细胞数量所见。将CML细胞暴露于D1R激动剂15分钟或1小时分别杀伤60％和76％的细胞。将CML细胞与D1R激动剂一起温育较长时间(72小时)没有超过1小时效应的额外数值。图30显示对于T白血病细胞，与D1R激动剂一起温育1分钟不足以导致显著的细胞死亡。在15分钟之后效应变得显著，并在温育1小时之后达到最大——杀伤94％的细胞。再者，与D1R激动剂一起温育72小时没有进一步的效应。

仅选择性D1R激动剂诱导癌死亡，而D2R和D3R激动剂不诱导癌死亡，显示D1R受体特异性诱导效应。

为了检测多巴胺D1R激动剂诱导的效应的选择性，同时(即在相同的实验中)检测了高选择性激动剂对多巴胺D2R-喹吡罗和D3R-R7-羟基-DPAT的效应。还检测了多巴胺自身的效应(当然可活化所有其D1R-5受体)。以相似浓度(10^-4M)检测了所有这些分子。表5和6显示了在D1R激动剂(1小时)杀伤显著数量的人类B淋巴瘤和CML的同时，D2R和D3R激动剂没有这样的效应。对D1R的效应的特异性和限制性也可见于表7和8。这些结果表明多巴胺D1R特异性诱导癌细胞的杀伤。有趣的是，多巴胺自身杀伤B淋巴瘤，但不杀伤CML(表5和6)。

表5

表6

实施例8：在使用DR1激动剂诱导之后细胞死亡机制的研究

选择性D1R激动剂诱导的癌死亡经坏死发生。为了研究由于与DR1激动剂一起温育导致癌细胞死亡的机制，使用了磷脂酰丝氨酸检测试剂盒。该试剂盒提供了通过流式细胞计量术检测细胞凋亡的快速和可靠方法，使得能够以单细胞水平进行检测，且还使得能够区别细胞凋亡和坏死。

在在细胞凋亡的早期阶段，磷脂酰丝氨酸开始暴露于细胞膜的外面。该细胞凋亡的早期阶段可通过PS结合蛋白(膜联蛋白V)特异性检测到。在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜完整并且细胞排除碘化丙锭(PI)。之后，在细胞凋亡过程中，细胞膜变得多孔，PI与DNA结合。PI的摄取提示坏死。因此，认为膜联蛋白V⁺PI^-是经受细胞凋亡的细胞，而膜联蛋白V⁺PI⁺是经受坏死的细胞。活细胞为膜联蛋白V^-PI^-.

表7和8显示暴露于D1R(而非D2R或D3R)1小时的T白血病和T淋巴瘤细胞主要经坏死机制死亡。确实，在1小时之后，膜联蛋白V⁺PI⁺坏死的T白血病细胞百分数从6.3％显著升高至90.4％，与活细胞数量的显著减少平行，而凋亡细胞的百分数无变化(表7)。

表7

关于Sezary T淋巴瘤(表8)，D1R激动剂导致坏死细胞的数量显著增加，且还导致凋亡细胞的百分数2倍增加。

表8

实施例9：除了非诺多巴以外的D1R激动剂对TCR活化的和静止的人类正常外周T细胞的效应

除了非诺多巴以外的D1R激动剂也杀伤比静止的人类正常外周T细胞多的TCR活化的人类正常外周T细胞。与本发明中可见于TCR活化的人类正常T细胞中的D1R表达水平增加(图6和7)和FDM导致这些活化的细胞死亡(图8)而几乎不影响静止的人类正常T细胞(图9)的发现相一致，其他D1R激动剂表现了相似的特性(图31)。因此，例如，以10^-5M使用的高选择性多巴胺D1R激动剂A77636杀伤了12％的静止的人类正常T细胞和46％(即3.8倍多)的TCR活化的人类正常细胞(图31)。

前述具体实施方案的说明完全揭示了本发明的一般性质，使得其他人为了不同应用可以在适当的实验和不背离一般概念的情况下通过目前的知识容易地修改和/或改变所述具体实施方案，且因此，所述改变和修改应当并意于涵盖在所公开的实施方案的等同替代的含义和范围内。应知道本文所使用的措辞或术语是为了说明的目的而不是为了限制的目的。用于实施各种公开的机能的方法、材料以及步骤可在不背离本发明的情况下采取多种可选形式。因此，可见于上述说明书和/或下文的权利要求书/之后是功能性描述的表达方法“......的方法”、“用于......的方法”或任何方法步骤语言意于限定和涵盖结构、物理、化学或电元件或结构或方法步骤，其可现在或在将来存在实施所述功能，无论是否确切等同于上文说明书中所公开的一个或多个实施方案，即可使用进行相同功能的其他方法或步骤；意于给出这些表达方法的最宽的解释。

Claims

1.一种导致表达多巴胺D1受体的人类或其他动物细胞死亡的方法，其包括使所述细胞与有效量的选择性多巴胺D1受体激动剂接触。

2.根据权利要求1的方法，其中所述表达多巴胺D1受体的细胞为白血病细胞或淋巴瘤细胞。

3.根据权利要求1的方法，其中所述表达多巴胺D1受体的细胞为表达多巴胺D1受体的癌细胞，所述癌细胞不是白血病细胞或淋巴瘤细胞。

4.根据权利要求1的方法，其中所述表达多巴胺D1受体的细胞为TCR活化的T细胞。

5.根据权利要求4的方法，其中所述TCR活化的T细胞为自身免疫性T细胞。

6.根据权利要求1的方法，其中所述使所述细胞与有效量选择性多巴胺D1受体激动剂接触的步骤包括将所述多巴胺D1受体激动剂施用于患有可通过消除表达多巴胺D1受体的细胞而得到缓解的疾病或病症的人类或动物受治疗者的体内。

7.根据权利要求6的方法，其中所述疾病或病症为其细胞表达所述多巴胺D1受体的癌症。

8.根据权利要求7的方法，其中所述疾病或病症为白血病或淋巴瘤，且所述表达多巴胺D1受体的细胞为白血病细胞或淋巴瘤细胞。

9.根据权利要求6的方法，其中所述疾病或病症为T细胞介导的自身免疫性疾病。

10.根据权利要求9的方法，其中所述T细胞介导的自身免疫性疾病为胰岛素依赖型(1型)糖尿病、多发性硬化症、重症肌无力、自身免疫性心肌炎、秃发症或银屑病。

11.根据权利要求6的方法，其中所述疾病或病症为过度活化的炎性T细胞引起或加剧的疾病或病症。

12.根据权利要求11的方法，其中所述疾病或病症为顽固性炎症。

13.根据权利要求6的方法，其中所述疾病或病症为移植物抗宿主疾病，且所述表达多巴胺D1受体的细胞为活化的供体抗宿主T细胞。

14.根据权利要求6的方法，其中所述疾病或病症为移植物排斥，且所述表达多巴胺D1受体的细胞为抗所述移植物组织而活化的宿主T细胞。

15.根据权利要求6-14任一项的方法，其中所述施用步骤是通过静脉内、皮下、腹膜内、瘤内、鞘内或颅内注射。

16.根据权利要求1的方法，其中所述使所述细胞与有效量选择性多巴胺D1受体激动剂接触的步骤包括使所述细胞与所述多巴胺D1受体激动剂活体外接触。

17.根据权利要求16的方法，其中所述细胞为需要从中清除白血病、淋巴瘤或活化的T细胞的细胞群。

18.根据权利要求17的方法，其还包括如下步骤：使用所述经清除的细胞群用于骨髓移植、T细胞移植或体外培养以收获由此分泌的分子。

19.根据权利要求16的方法，其中所述细胞为来自患有白血病或淋巴瘤的人类或其他动物受治疗者的自体T细胞。

20.根据权利要求19的方法，其还包括如下步骤：将已如此活体外处理的自体T细胞施用回所述人类或动物受治疗者，由此清除所述白血病细胞或淋巴瘤细胞的T细胞。

21.根据权利要求1-20任一项的方法，其中所述激动剂为非诺多巴的盐。

22.根据权利要求21的方法，其中所述激动剂为非诺多巴甲磺酸盐。

23.根据权利要求21的方法，其中所述激动剂为非诺多巴氢溴酸盐。

24.根据权利要求1-20任一项的方法，其中所述激动剂为盐酸(1R-顺式)-1-(氨甲基)-3，4-二氢-3-三环[3.3.1.13，7]癸-1-基-[1H]-2-苯并吡喃-5，6-二醇。

25.根据权利要求1-20任一项的方法，其中所述激动剂为氢溴酸(±)-1-苯基-2，3，4，5-四氢-(1H)-3-苯并氮杂卓-7，8-二醇。

26.根据权利要求1-20任一项的方法，其中所述激动剂为盐酸顺式-(±)-1-(氨甲基)-3，4-二氢-3-苯基-1H-2-苯并吡喃-5，6-二醇。