KR101975716B1 - 외상후 스트레스 장애(ptsd) 질환 동물모델 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 도파민 수용체 타입 4가 손상 또는 결핍된, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환 동물모델, 이의 제조방법, 이를 이용한 PTSD 치료약물 스크리닝 방법, 이 스크리닝 방법에 의해 탐색된 약물을 포함하는 PTSD 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 장기 시냅스 저하에 의한 공포 기억 발현 메커니즘에서 특정 타입의 도파민 수용체가 관련 있음을 밝힘으로서, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환의 발병 기전에 대한 이해를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 외상후 스트레스 장애 질환의 임상상황과 유사한 동물모델 및 그 제조방법을 제공함으로써, PTSD 질환 치료제의 안전성과 유효성 분석, 치료약물의 스크리닝에 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 도파민 수용체 타입 4(D4R)의 작용제(agonist)에 의하면, 이미 미국 FDA의 승인을 받아 조현병 등의 정신질환에 임상적으로 사용되고 있으므로, 외상 후 스트레스 증상에 임상적으로 신속한 적용이 가능하다.
본 발명에 의하면, 장기 시냅스 저하에 의한 공포 기억 발현 메커니즘에서 특정 타입의 도파민 수용체가 관련 있음을 밝힘으로서, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환의 발병 기전에 대한 이해를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 외상후 스트레스 장애 질환의 임상상황과 유사한 동물모델 및 그 제조방법을 제공함으로써, PTSD 질환 치료제의 안전성과 유효성 분석, 치료약물의 스크리닝에 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 도파민 수용체 타입 4(D4R)의 작용제(agonist)에 의하면, 이미 미국 FDA의 승인을 받아 조현병 등의 정신질환에 임상적으로 사용되고 있으므로, 외상 후 스트레스 증상에 임상적으로 신속한 적용이 가능하다.
Description
본 발명은 도파민 수용체 타입 4가 손상 또는 결핍된, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환 동물모델, 이의 제조방법, 이를 이용한 PTSD 치료약물 스크리닝 방법, 이 스크리닝 방법에 의해 탐색된 약물을 포함하는 PTSD 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
편도체(amygdala)는, 공포 반응 및 공포와 관련된 자극의 학습이 일어나는 데 필수적인 역할을 하는 뇌 영역으로, 대뇌 변연계(limbic system)의 구성요소 중 하나로서 해마 끝부분에 위치한다. 기저외측핵(basolateral nuclei), 피질내측핵(corticomedial nuclei), 중심핵(CeA; central nucleus)을 포함하여 10개 이상의 핵으로 구성되어 있다. 특히, 편도 복합체를 구성하는 몇몇 핵중에서, 편도체 측핵(LA; lateral nucleus)은 공포 조건화 동안 감각 신호를 받아 직접 또는 기저핵을 통해 중심핵으로 신호를 전달한다. dorsal, ventral, 및 lateral cluster를 둘러싸는 편도체 핵 사이에 위치한 편도체 개재 신경세포군(ITC; intercalated cell masses)는 이러한 편도체 핵 사이의 신호를 조절함으로써 공포와 관련된 행동을 조절하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 사포닌 매개의 ITCs 병변 또는 약물로 인한 기저외측 편도에서 ITC로의 신호 억제는 공포 기억 소거를 저해한다. 공포 기억의 소거가 기저외측 편도에서 ventral ITC로 가는 흥분성 신호를 강화시킨다고 알려져 있긴 하나, 배측(dorsal) ITC에서 유도된 시냅스 가소성(synaptic plasticity) 즉 하나의 신경세포가 다른 신경세포로 신호를 전달할 때 신호의 세기나 효율을 조절하는 현상이 어떻게 공포 습득 및 발현을 조절할 수 있는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.
편도체 측핵 및 중심핵 사이에 존재하는 dorsal ITC는, 대뇌피질 뿐만 아니라 측핵으로부터 glutamatergic 신호를 받고, 중심핵 및 ventral ITC의 측면 부분으로 GABAergic 억제성 신호를 보낸다. 이와 대조적으로, ventral ITC는 편도체의 기저핵으로부터 주요 신호를 받아 중심핵의 안쪽 구역으로 신호를 보낸다. 이와 같이, 각각의 ITC는 신호전달 경로에 차이가 있는 바, 각 ITC가 공포 행동의 조절에 있어서 구별되는 역할을 수행할 수 있음을 의미한다. 실제로, ventral ITC는 공포 기억 소거를 조절하는 반면, dorsal ITC는 공포 기억 발현을 조절한다고 알려져 있다. 이는 dorsal ITC에서의 시냅스 가소성이 편도체 측핵으로부터 중심핵으로 공포와 관련된 신호 및 이에 의해 수반되는 행동을 조절할 수 있고, dorsal ITC의 가소 능력 결손은 외상 후 스트레스 장애(PTSD; posttraumatic stress disorder)와 같은 공포와 관련된 정신질환을 유발할 수 있음을 의미한다.
도파민 작동성 신경세포(dopaminergic neurons)는 편도체 신경세포의 활성을 조절함으로써 공포 기억의 발현을 조절할 수 있다. 도파민 작동성 신경세포들은 회피 자극에 노출시 강하게 활성화되며, 그 흥분정도는 자극의 강도와 비례한다. 도파민(DA)은 편도체에서 시냅스 가소성을 개시하고, 결국 local interneuron에서 이중시냅스의 억제성 후-시냅스 전류(IPSCs; inhibitory postsynaptic currents) 증가를 통해 편도체 측핵 신경세포로의 feed-forward 억제를 감소시킴으로써 공포 기억의 습득을 조절한다. 또한, 편도체 기저핵 내 local interneuron처럼 ITC의 신호 또한 도파민에 의해 조절될 수 있다. 그러나 종래에는 dorsal ITC가 강한 도파민 신호를 받는다는 것만 알려졌을 뿐, dorsal ITC 회로에서 도파민 의존적 장기 시냅스 가소성에 대하여는 알려진 바가 없다.
한편, 약물을 이용한 질병의 치료에 있어서 부작용을 줄이기 위해 타겟 특이적 기법들이 개발되고 있지만 뇌에서 적용할 수 있는 기술은 매우 제한적이다. 따라서, 정신질환으로 분류되는 환자들의 수는 더욱 늘어나고 있는 현재상황에서, 약물의 부작용을 최소화하기 위하여 보다 기능/부위 특이적인 타겟을 설정하는 것이 필요하다.
특히, 외상후 스트레스 장애(PTSD)는 치료하기가 곤란한 것으로 악명높은 만연되어 있는 고도 쇄약 정신 장애로서, 플래시백, 정서적 무감각 및 불면증을 특징으로 하고, 우울증과 같은 정신 건강 동반이환과 연관이 있다. PTSD는 대재앙적 및 위협적 사건, 예를 들어 자연 재해, 전시 상황, 사고, 가정 폭력 또는 폭력 범죄로부터 생길 수 있으며, 증상은 전형적으로 3개월 내에 발생하지만, 초기 외상 수년 후에 나타날 수도 있다. 또한, PTSD는 전투 참전용사들 중에서 특히 만연되어 있는데, 이라크전 참전용사들의 17% 정도가 PTSD 증상을 보였다는 보고가 있는 바, 종래 개발된 약물보다 부작용이 적고 치료효과가 우수한 치료제에 대한 니즈는 계속해서 증가하고 있는 상황이나, 아직까지 뚜렷한 치료제는 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은, 도파민 수용체 타입 4(D4R)에 의하여 조절되는 억제성 시냅스 가소성이 공포 반응을 제어하여, 불안증이나 PTSD과 같은 증상을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 도파민 수용체 타입 4(D4R)의 작용제(agonist)를 사용하면 PTSD 증상을 완화시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은, 도파민 수용체 타입 4가 손상 또는 결핍된, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환 동물모델, 이의 제조방법, 이를 이용한 PTSD 치료약물 스크리닝 방법, 이 스크리닝 방법에 의해 탐색된 약물을 포함하는 PTSD 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 도파민 수용체 타입 4가 손상 또는 결핍된, 인간을 제외한 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환 동물모델을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 도파민 수용체 타입 4의 손상 또는 결핍은 편도체 배측 ITC(intercalated cell masses)에서 발생한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 도파민 수용체 타입 4의 손상 또는 결핍에 의해 장기 시냅스 저하(LTD)가 억제된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 장기 시냅스 저하(LTD) 억제에 의해 과도한 공포 반응이 유도된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 도파민 수용체 타입 4 유전자를 넉다운(knock-down) 또는 넉아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 동물모델을 이용한, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 (a) PTSD 동물모델에 후보 약물을 처리하는 단계; 및 (b) 편도체에서 도파민 수용체 타입 4의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 (c) 처리 약물이 도파민 수용체 타입 4를 활성화시킬 경우 치료약물로 선정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 도파민 수용체 타입 4의 활성화에 의해 장기 시냅스 저하(LTD)가 유도되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 장기 시냅스 저하(LTD)에 의해 공포 반응이 억제되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 치료약물은 도파민 수용체 타입 4의 작용제(agonist)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 작용제(agonist)는 PD-168077(N-([4-(2-시아노페닐)피페라진-1-일]메틸)-3-메틸벤즈아미드)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 탐색된 약물을 유효성분으로 함유하는, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약물은 도파민 수용체 타입 4의 작용제(agonist)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 도파민 수용체 타입 4의 작용제는 하기의 물질들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
PD 168077 maleate : N-(Methyl-4-(2-cyanophenyl)piperazinyl-3-methylbenzamide maleate
A 412997 dihydrochloride : N-(3-Methylphenyl)-4-(2-pyridinyl)-1-piperidineacetamide
ABT 724 trihydrochloride : 2-[[4-(2-Pyridinyl)-1-piperazinyl]methyl]-1H-benzimidazole trihydrochloride
WAY 100635 maleate : N-[2-[4-(2-Methoxyphenyl)-1-piperazinyl]ethyl]-N-2-pyridinylcyclohexanecarboxamide maleate
Ro 10-5824 dihydrochloride : 5-[(3,6-Dihydro-4-phenyl-1(2H)-pyridinyl)methyl]-2-methyl-4-pyrimidinamine dihydrochloride
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 도파민 수용체 타입 4의 작용제는 PD-168077(N-([4-(2-시아노페닐)피페라진-1-일]메틸)-3-메틸벤즈아미드)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 도파민 수용체 타입 4의 작용제는 상기 수용체를 활성화시켜 장기 시냅스 저하(LTD)를 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 장기 시냅스 저하(LTD)는 편도체배측 ITC(intercalated cell masses)에서 일어나는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 장기 시냅스 저하(LTD)에 의해 공포 반응이 억제되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 도파민 수용체 타입 4 작용제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 외상후 스트레스 장애의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 도파민 수용체 타입 4 작용제의 외상후 스트레스 장애 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 의하면, 장기 시냅스 저하에 의한 공포 기억 발현 메커니즘에서 특정 타입의 도파민 수용체가 관련 있음을 밝힘으로서, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환의 발병 기전에 대한 이해를 높일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 외상후 스트레스 장애 질환의 임상상황과 유사한 동물모델 및 그 제조방법을 제공함으로써, PTSD 질환 치료제의 안전성과 유효성 분석, 치료약물의 스크리닝에 적용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 밝힌 타겟인 도파민 수용체 타입 4(D4R)는 뇌의 특정 부위에서만 발현하고 발현량 자체가 적은데, 공포 조건화에 중요하다고 생각되는 편도체 내에서도 그 발현량이 많지 않기 때문에 부작용을 최소화할 수 있는 치료타겟 중 하나로 고려될 수 있다. 특히, 편도체에 존재하는 억제성 신경세포군에서 신경회로 특이적으로 발생하는 시냅스 가소성에 대한 분자적 메커니즘에 기반한 타겟으로, 해당 약물의 적용 이해도가 기존의 약물들 보다 높다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 도파민 수용체 타입 4(D4R)의 작용제(agonist)에 의하면, 이미 미국 FDA의 승인을 받아 조현병 등의 정신질환에 임상적으로 사용되고 있으므로, 외상 후 스트레스 증상에 임상적으로 신속한 적용이 가능하다.
도 1은, 공포 조건화에 의해 배측 ITC 시냅스 가소성이 조절됨을 보여주는 결과로서,
도 1a는 배측 ITC 신경세포를 공간적/형태학적으로 분석한 결과이고,
도 1b는 편도체 측핵을 전기적으로 자극하면서 흥분성 후-시냅스 전위(EPSPs)에 대한 전체 세포 patch 기록을 얻는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 1c는 공포기억이 없는 마우스와 약한/강한 공포 조건화 후의 마우스에 대해, STDP 프로토콜에 따른 편도체 시냅스 가소성을 평가한 결과이고,
도 1d는 장기 약화를 보이는 특정 경로에서의 시냅스 가소성을 평가하기 위한 광유전학적 분석법을 나타내는 모식도이고,
도 1e는 편도체 측핵-배측 ITC 경로에서의 시냅스 가소성을 STDP 유사 광자극으로 평가한 결과이다.
도 2는, 약한 공포 조건화 후에 배측 ITC 신경세포에 대한 억제가 증가됨을 확인한 결과로서,
도 2a는 공포 조건화 후 작은 억제성 후-시냅스 전류(miniature inhibitory postsynaptic currents; mIPSCs)를 측정한 결과이고,
도 2b는 공포 조건화 후 작은 흥분성 후-시냅스 전류(mEPSCs)를 측정한 결과이고,
도 2c는 편도체 측핵 자극에 의한 biphasic PSP(EPSP/IPSP)를 관찰한 결과이고,
도 2d는 약한/강한 공포 조건화 후 이중시냅스 IPSP에 대한 input-output 곡선을 나타내는 것이다.
도 3은, D4R의 활성화에 의한 도파민(DA) 의존적 장기 약화를 확인한 결과로서,
도 3a는 배측 ITC 신경세포에서 STDP 자극동안 도파민에 의해 장기 약화가 유도됨을 보여주는 결과이고,
도 3b는 편도체 측핵에 rAAV5-CamKIIα-hChR2-eYFP를 주입한 후 광자극으로 도파민 의존적 장기 약화가 유도됨을 보여주는 결과이고,
도 3c는 도파민 수용체 서브타입 특이적인 길항제(antagonist)를 처리하여 도파민 의존적 장기 약화를 평가한 결과이고,
도 3d는 도파민 수용체 서브타입 특이적인 작용제(agonist)를 처리하여 도파민 의존적 장기 약화를 평가한 결과이고,
도 3e는 D4R 넉아웃 마우스에서 도파민 의존적 장기 약화를 평가한 결과이고,
도 3f는 약한 공포 조건화 후의 장기 약화가 D4R 특이적 길항제 처리에 의해 저해됨을 보여주는 결과이고,
도 3g는 야생형 마우스에서 D4R의 세포 내 위치를 분석하기 위해, post-embedding immuno-gold 전자현미경으로 관찰한 결과이고,
도 3h는 D4R 넉아웃 마우스에서 D4R의 세포 내 위치를 분석하기 위해, post-embedding immuno-gold 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는, 배측 ITC에서 도파민 의존적 장기 약화에 의한 피드 포워드(Feed-Forward) 억제 신호가 증가됨을 보여주는 결과로서,
도 4a는 도파민 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, 작은 억제성 후-시냅스 전류(mIPSC)의 frequency가 증가함을 보여주는 결과이고,
도 4b는 도파민 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, 작은 흥분성 후-시냅스 전류(mEPSC)에는 변화가 없음을 보여주는 결과이고,
도 4c는 도파민 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, 이중시냅스의 억제성 후-시냅스 전위(IPSP)가 증가함을 보여주는 결과이고,
도 4d는 편도체 측핵 또는 배측 ITC 구역에 interleaving 자극을 주어 배측 ITC 신경세포로부터 시냅스 반응을 평가한 결과이고,
도 4e는 도파민 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, IPSC는 증가하는 반면 EPSC는 감소함을 보여주는 결과이고,
도 4f는 후시냅스 신경세포에서의 unitary IPSCs(uIPSCs)를 보여주는 결과이고,
도 4g는 D4R 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, 후시냅스 신경세포에서 uIPSCs가 증가함을 보여주는 결과이고,
도 4h는 uIPSCs의 증가는 장기 약화 크기와 양의 상관관계가 있음을 보여주는 결과이다.
도 5는, 배측 ITC 신경세포에서 D4R 활성에 의해 공포 행동이 조절됨을 보여주는 결과로서,
도 5a는 배측 ITC에 D4R 길항제(L-745870)를 주입시, 약한 공포 조건화 후의 공포 행동 발현에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험 모식도이며, 도 5b는 그 실험 결과이며,
도 5c는 배측 ITC의 억제성 신경세포에서 D4R을 결손시키기 위한 유전적 방법을 이용하여, 약한 공포 조건화 후의 공포 행동 발현에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험 모식도이며, 도 5d는 그 실험 결과이다.
도 6은, 장기 약화를 광유전학적으로 저해시 공포 기억 발현이 증가됨을 확인한 결과로서,
도 6a는 공포가 학습된 마우스에서 공포를 상기시킨지 24시간 후에 배측 ITC에서 장기약화가 억제됨을 보여주는 결과이며,
도 6b는 약한 공포 조건화를 일으킨 후 편도체 측핵-배측 ITC 경로를 광유전학적으로 조작시 도파민 의존적 장기약화가 저해됨을 보여주는 결과이며,
도 6c는 in vivo에서의 광유전학적 조작 및 행동테스트 실험 설계에 대한 모식도이며,
도 6d는 배측 ITC에 광유전학적 TBS를 적용시 rAAV5-CamKIIα-hChR2-eYFP가 주입된 마우스는 대조군에 대해 공포 행동반응이 현저히 증가됨을 보여주는 결과이다.
도 7은, 외상 후 스트레스 장애(PTSD) 유사 동물모델의 배측 ITC에서 장기 약화가 손상되어 있음을 확인한 결과로서,
도 7a는 각각 Cue와 Context에 대하여 약한 공포 조건화를 겪은 마우스에 코르티코르테론(CORT)을 투여하여 cue-induced 공포 반응을 측정한 결과이며,
도 7b는 각각 Cue와 Context에 대하여 약한 공포 조건화를 겪은 마우스에 코르티코르테론(CORT)을 투여하여 context-induced 공포 반응을 측정한 결과이며,
도 7c는 공포 조건화 후 코르티코르테론(CORT)을 투여한 마우스의 경우 배측 ITC에서 장기약화가 유도되지 않음을 보여주는 결과이며,
도 7d는 배측 ITC에서 D4R의 발현이 저해된 Dlx5/6-Cre (+) 마우스에서는 Cue에 대한 약한 공포 조건화 후에 context-induce 공포 반응 수준을 증가시킴을 보여주는 결과이며,
도 7e는 배측 ITC에서 이중시냅스의 IPSP에 대한 input-output 곡선을 나타내는 것이다.
도 8은 외상 후 스트레스 장애(PTSD) 유사 행동을 보이는 마우스에서 도파민수용체 타입 4(D4R)의 작용제(agonist)를 처리하여 수용체의 기능을 증가시 공포 행동 반응이 감소됨을 보여주는 결과이다.
도 1a는 배측 ITC 신경세포를 공간적/형태학적으로 분석한 결과이고,
도 1b는 편도체 측핵을 전기적으로 자극하면서 흥분성 후-시냅스 전위(EPSPs)에 대한 전체 세포 patch 기록을 얻는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 1c는 공포기억이 없는 마우스와 약한/강한 공포 조건화 후의 마우스에 대해, STDP 프로토콜에 따른 편도체 시냅스 가소성을 평가한 결과이고,
도 1d는 장기 약화를 보이는 특정 경로에서의 시냅스 가소성을 평가하기 위한 광유전학적 분석법을 나타내는 모식도이고,
도 1e는 편도체 측핵-배측 ITC 경로에서의 시냅스 가소성을 STDP 유사 광자극으로 평가한 결과이다.
도 2는, 약한 공포 조건화 후에 배측 ITC 신경세포에 대한 억제가 증가됨을 확인한 결과로서,
도 2a는 공포 조건화 후 작은 억제성 후-시냅스 전류(miniature inhibitory postsynaptic currents; mIPSCs)를 측정한 결과이고,
도 2b는 공포 조건화 후 작은 흥분성 후-시냅스 전류(mEPSCs)를 측정한 결과이고,
도 2c는 편도체 측핵 자극에 의한 biphasic PSP(EPSP/IPSP)를 관찰한 결과이고,
도 2d는 약한/강한 공포 조건화 후 이중시냅스 IPSP에 대한 input-output 곡선을 나타내는 것이다.
도 3은, D4R의 활성화에 의한 도파민(DA) 의존적 장기 약화를 확인한 결과로서,
도 3a는 배측 ITC 신경세포에서 STDP 자극동안 도파민에 의해 장기 약화가 유도됨을 보여주는 결과이고,
도 3b는 편도체 측핵에 rAAV5-CamKIIα-hChR2-eYFP를 주입한 후 광자극으로 도파민 의존적 장기 약화가 유도됨을 보여주는 결과이고,
도 3c는 도파민 수용체 서브타입 특이적인 길항제(antagonist)를 처리하여 도파민 의존적 장기 약화를 평가한 결과이고,
도 3d는 도파민 수용체 서브타입 특이적인 작용제(agonist)를 처리하여 도파민 의존적 장기 약화를 평가한 결과이고,
도 3e는 D4R 넉아웃 마우스에서 도파민 의존적 장기 약화를 평가한 결과이고,
도 3f는 약한 공포 조건화 후의 장기 약화가 D4R 특이적 길항제 처리에 의해 저해됨을 보여주는 결과이고,
도 3g는 야생형 마우스에서 D4R의 세포 내 위치를 분석하기 위해, post-embedding immuno-gold 전자현미경으로 관찰한 결과이고,
도 3h는 D4R 넉아웃 마우스에서 D4R의 세포 내 위치를 분석하기 위해, post-embedding immuno-gold 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는, 배측 ITC에서 도파민 의존적 장기 약화에 의한 피드 포워드(Feed-Forward) 억제 신호가 증가됨을 보여주는 결과로서,
도 4a는 도파민 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, 작은 억제성 후-시냅스 전류(mIPSC)의 frequency가 증가함을 보여주는 결과이고,
도 4b는 도파민 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, 작은 흥분성 후-시냅스 전류(mEPSC)에는 변화가 없음을 보여주는 결과이고,
도 4c는 도파민 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, 이중시냅스의 억제성 후-시냅스 전위(IPSP)가 증가함을 보여주는 결과이고,
도 4d는 편도체 측핵 또는 배측 ITC 구역에 interleaving 자극을 주어 배측 ITC 신경세포로부터 시냅스 반응을 평가한 결과이고,
도 4e는 도파민 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, IPSC는 증가하는 반면 EPSC는 감소함을 보여주는 결과이고,
도 4f는 후시냅스 신경세포에서의 unitary IPSCs(uIPSCs)를 보여주는 결과이고,
도 4g는 D4R 의존적 장기 약화를 유도하였을 때, 후시냅스 신경세포에서 uIPSCs가 증가함을 보여주는 결과이고,
도 4h는 uIPSCs의 증가는 장기 약화 크기와 양의 상관관계가 있음을 보여주는 결과이다.
도 5는, 배측 ITC 신경세포에서 D4R 활성에 의해 공포 행동이 조절됨을 보여주는 결과로서,
도 5a는 배측 ITC에 D4R 길항제(L-745870)를 주입시, 약한 공포 조건화 후의 공포 행동 발현에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험 모식도이며, 도 5b는 그 실험 결과이며,
도 5c는 배측 ITC의 억제성 신경세포에서 D4R을 결손시키기 위한 유전적 방법을 이용하여, 약한 공포 조건화 후의 공포 행동 발현에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험 모식도이며, 도 5d는 그 실험 결과이다.
도 6은, 장기 약화를 광유전학적으로 저해시 공포 기억 발현이 증가됨을 확인한 결과로서,
도 6a는 공포가 학습된 마우스에서 공포를 상기시킨지 24시간 후에 배측 ITC에서 장기약화가 억제됨을 보여주는 결과이며,
도 6b는 약한 공포 조건화를 일으킨 후 편도체 측핵-배측 ITC 경로를 광유전학적으로 조작시 도파민 의존적 장기약화가 저해됨을 보여주는 결과이며,
도 6c는 in vivo에서의 광유전학적 조작 및 행동테스트 실험 설계에 대한 모식도이며,
도 6d는 배측 ITC에 광유전학적 TBS를 적용시 rAAV5-CamKIIα-hChR2-eYFP가 주입된 마우스는 대조군에 대해 공포 행동반응이 현저히 증가됨을 보여주는 결과이다.
도 7은, 외상 후 스트레스 장애(PTSD) 유사 동물모델의 배측 ITC에서 장기 약화가 손상되어 있음을 확인한 결과로서,
도 7a는 각각 Cue와 Context에 대하여 약한 공포 조건화를 겪은 마우스에 코르티코르테론(CORT)을 투여하여 cue-induced 공포 반응을 측정한 결과이며,
도 7b는 각각 Cue와 Context에 대하여 약한 공포 조건화를 겪은 마우스에 코르티코르테론(CORT)을 투여하여 context-induced 공포 반응을 측정한 결과이며,
도 7c는 공포 조건화 후 코르티코르테론(CORT)을 투여한 마우스의 경우 배측 ITC에서 장기약화가 유도되지 않음을 보여주는 결과이며,
도 7d는 배측 ITC에서 D4R의 발현이 저해된 Dlx5/6-Cre (+) 마우스에서는 Cue에 대한 약한 공포 조건화 후에 context-induce 공포 반응 수준을 증가시킴을 보여주는 결과이며,
도 7e는 배측 ITC에서 이중시냅스의 IPSP에 대한 input-output 곡선을 나타내는 것이다.
도 8은 외상 후 스트레스 장애(PTSD) 유사 행동을 보이는 마우스에서 도파민수용체 타입 4(D4R)의 작용제(agonist)를 처리하여 수용체의 기능을 증가시 공포 행동 반응이 감소됨을 보여주는 결과이다.
대뇌의 편도체는 공포로 인한 반응 행동 및 공포와 관련된 자극을 학습하는 데 필수적인 역할을 하며, 내부의 측핵과 중심핵으로 이어지는 신경회로에 공포 기억이 저장되는 것으로 알려져 있다. 그러나 이 신경회로를 조절하는 억제성 신경세포군은 크기가 너무 작아서(마우스의 경우 0.0098mm3) 연구가 어려워 그 역할과 조절 메커니즘이 거의 밝혀진 바 없었다.
본 발명에서는, 공포와 관련된 자극이 일어나는 편도체 영역을 억제하고 조절하는 신경회로가 어떻게 작동하는지를 밝혔다. 구체적으로, 약한 공포를 학습시킨 마우스의 억제성 세포군에서는 장기 시냅스 저하(LTD)가 쉽게 일어나는데 이러한 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 광유전학적(optogenetics) 방법으로 제거한 결과 마우스가 과도한 공포 반응을 보임을 밝혔다. 광유전학(optogenetics)은, 빛에 의해 반응하는 유전자를 신경세포에 인위적으로 발현시킨 후 특정 파장대의 빛을 비추어 신경 세포의 활성을 on/off 할 수 있는 시스템 신경과학 분야의 기술이다.
또한, 본 발명에서는, 외상후 스트레스 장애(PTSD)를 보이는 마우스나 배측 ITC에서 도파민 수용체 4 발현을 억제시킨 마우스에서도 약한 공포 학습에도 불구하고 강한 공포 반응이 관찰됐으며, 도파민 수용체가 장기 시냅스 저하를 일으킨다는 것을 확인하였다.
이를 통해, 약한 공포에 대한 학습이 도파민 수용체를 활성화시켜 장기 시냅스 저하를 일으킴으로써 강한 공포 행동이 나오지 못하도록 제어할 수 있지만, PTSD를 앓거나 도파민 수용체가 제 기능을 하지 못하면 장기 시냅스 저하가 일어나지 않아서, 즉 신경전달 신호가 약해지지 않으면서 공포반응을 억제하지 못하고 과도한 공포 반응을 보인다는 것을 규명하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 발화 시간 기반 가소성(spike-timing-dependent plasticity; STDP) 자극 프로토콜을 이용하여 배측 ITC에서 시냅스 가소성을 평가하였다. STDP 자극은 약한 공포 조건화 후에 편도체 측핵-배측 ITC 경로에서 장기 약화를 유도하였고, 강한 공포 조건화의 경우에는 장기 약화가 유도되지 않았다. 더욱이, 배측 ITC에서 장기 약화의 유도는 D4R(dopamine receptor subtype 4)의 활성 및 주변 ITC 신경세포로부터의 GABA 분비 증가에 의존적임을 확인하였다. 특히, 편도체 중심의 배측 ITC 부분에서 D4R의 선택적 저해 또는 결손, 또는 in vitro에서 편도체 측핵-배측 ITC 경로에서 장기 약화를 반전시키는 광유전학적 조작을 통해 마우스에서 공포 행동 반응의 증가를 확인하였고, 이를 통해 공포 발현을 제어하는데 있어서 D4R 의존적 장기 약화가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에서는 외상 후 스트레스 장애 마우스 모델에서 장기 약화를 분석한 결과, 배측 ITC에서 장기 약화의 손상을 관찰하였다. 즉, 본 발명을 통해, 배측 ITC에서 유도된 시냅스 가소성은 학습된 공포의 발현을 제어하는데 관여하고, 그 손상은 외상 후 스트레스 장애의 발생을 유도함을 확인하였다. 이러한 실험결과는 편도체에서 특정 억제성 회로의 기능적 역할에 대한 새로운 시각을 제공하며, 장기 기억으로 저장될 수 있는 감정적 자극의 영역을 구별할 수 있음을 의미한다.
이와 같이, 본 발명에서는 도파민 수용체와 장기 시냅스 저하에 의한 공포 기억 발현 메커니즘을 밝혔을 뿐만 아니라, PTSD 및 편도체내 억제성 신경회로의 연관성을 밝힘으로써, 향후 공포 기억과 관련된 정신질환의 치료제 개발에 중요한 기여를 할 수 있을 것이다.
본 발명은, 편도체 배측 ITC에서 도파민 수용체 타입 4가 손상 또는 결핍된, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환 동물모델을 제공한다.
도파민(Dopamine)은 인간을 포함한 동물의 뇌에서 발견되는 신경신호전달에 필수적인 신경전달제(neurotransmitter)이며, 도파민 수용체는 도파민과의 결합신호를 세포 내에 전달하는 7회 막관통형(G단백질 공역형) 펩티드이다. 본 발명에서는 도파민 수용체 서브타입 1-5(D1R-D5R)중에서 타입 4(D4R)만이 배측 ITC에서 장기약화를 유도함을 확인하였다.
본 발명에서, 외상 후 스트레스 장애(PTSD)는, 심한 사고를 통해 정신적 외상을 받은 후 일어날 수 있는 정신 질환을 의미하며, 과민반응, 충격의 재경험 또는 감정 회피나 마비를 주요 증상으로 가진다.
본 발명에서, 개재 세포군(ITC; intercalated cell masses)은 편도체 핵 사이의 신호를 조절함으로써 공포와 관련된 행동을 조절하는 신경세포군을 의미하며, 배측 ITC는 편도체 측핵 및 중심핵 사이에 존재하여 측핵으로부터 glutamatergic 신호를 받고, 중심핵 및 ventral ITC의 측면 부분으로 GABAergic 억제성 신호를 보낸다.
본 발명에서, 장기 시냅스 저하(long-term depression; LTD)는, 신경세포들의 연결 부위인 시냅스의 신호 전달 세기가 지속적으로 약해지는 현상을 의미한다.
또한, 본 발명은, 편도체 배측 ITC에서 도파민 수용체 타입 4가 손상 또는 결핍된, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 도파민 수용체 타입 4 유전자를 넉다운(knock-down) 또는 넉아웃(knock-out)시킴으로써 단백질을 손상 또는 결핍시킬 수 있다. 넉다운 또는 넉아웃 방법에 제한은 없으며 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 상기 유전자를 타겟으로 하는 shRNA, siRNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, PNA, aptamer, CRISPER Cas9 기술 등을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 동물모델을 이용한, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는, PTSD 동물모델에 후보 약물을 처리한 후 편도체에서 도파민 수용체 타입 4(D4R)의 활성을 측정하여 D4R을 활성화시키는 물질을 약물로 선정할 수 있다.
본 발명에서 상기 D4R을 활성화시키는 작용제(agonist)는 도파민과 유사한 활성을 갖는 물질이라면 제한없이 사용가능하며, 예를 들면 하기의 물질들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, PD-168077(N-([4-(2-시아노페닐)피페라진-1-일]메틸)-3-메틸벤즈아미드)일 수 있다.
PD 168077 maleate : N-(Methyl-4-(2-cyanophenyl)piperazinyl-3-methylbenzamide maleate
A 412997 dihydrochloride : N-(3-Methylphenyl)-4-(2-pyridinyl)-1-piperidineacetamide
ABT 724 trihydrochloride : 2-[[4-(2-Pyridinyl)-1-piperazinyl]methyl]-1H-benzimidazole trihydrochloride
WAY 100635 maleate : N-[2-[4-(2-Methoxyphenyl)-1-piperazinyl]ethyl]-N-2-pyridinylcyclohexanecarboxamide maleate
Ro 10-5824 dihydrochloride : 5-[(3,6-Dihydro-4-phenyl-1(2H)-pyridinyl)methyl]-2-methyl-4-pyrimidinamine dihydrochloride
또한, 본 발명은, 상기 스크리닝 방법에 의해 탐색된 약물을 유효성분으로 함유하는, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "약학 조성물"은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 "투여량"은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여횟수, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 "약학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 "투여방법"에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 D4R 작용제에 의하면 편도체 배측 ITC에서 장기 시냅스 저하(LTD)를 유도하여 공포반응을 억제시킬 수 있으므로, PTSD 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 실험방법
1-1. 실험동물
수컷 C57BL/6J, D4R-KO, 및 Dlx5 /6- Cre과 Ai14 리포터 마우스는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하였으며, 12시간 낮/밤 주기하에 자유로이 사료 및 식수를 급이하면서 사육하였다. 모든 동물실험은 포항공대(POSTECH)의 윤리평가위원회의 승인을 받아 가이드라인에 따라 진행하였다.
1-2. 플라스미드 및 바이러스 벡터
pCMV6-AC-D4R-turboGFP는 OriGene Technologies (Rockville, MD)에서 구입하였고, D4R을 표적으로 하는 shRNA(gctgctcatcggcttggtgtt) 또한 OriGene Technologies에서 구입하여 pLL3.7 construct에 클로닝하였다. 다음으로, shD4R 서열의 효과는 pCMV6-AC-D4R-turboGFP 및 pLL3.7-shD4R를 함께 트랜스펙션한 HEK-293 세포주(GenTarget, San Diego, CA)를 이용하여 정량적 RT-PCR을 통해 검증하였다. 동일한 세포에서 Cre-의존적 넉다운 및 eYFP 발현을 동시에 달성하기 위해, AAV-EF1a-DIO-eYFPs에 U6 프로모터 및 TATAlox를 삽입하고 새로운 서열을 추가하여 변형시켰다. 최종적으로 얻은 cKDeYFP-shD4R(pAAV-EF1α-DIO-TATAlox-eYFP-U6-shD4R) 및 대조군 cKD-eYFP(pAAV-EF1α-DIO-TATAlox-eYFP-U6) 벡터는 바이러스 생산을 위해 이용하였다.
바이러스 생산은 정립된 프로토콜에 따라 실시하였다. 간단하게, HEK-293 세포주에 helper plasmids와 함께 cKD-eYFPshD4R 또는 cKD-eYFP를 동일한 몰비로 Lipofector-Q 트랜스펙션 시약(AptaBio, Korea)을 이용하여 함께 트랜트펙션하였다. 72시간 후, freeze-thaw 공정을 통해 세포를 용해시키고, 얻어진 AAV 파티클을 340,000 g에서 2시간 동안 iodixanol-gradient 초원심분리를 통해 정제하였다. 정제된 AAV 파티클은 Amicon Filter(100K, Millipore, Bedford, MA)를 이용해 농축하여 적어도 5.0 × 1012 gc/㎖가 되도록 하였다.
1-3.
웨스턴
블롯
정상 HEK-293 및 Cre를 발현하는 HEK-293 세포를, 10% fetal bovine serum(Hyclone, South Logan, UT) 및 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 100 g/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용해 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
D4R의 이형발현을 위해서, HEK-293 세포에 Lipofector-Q를 이용해 pCMV-D4R-turboGFP를 트랜스펙션한 후, rAAV2-cKD-eYFP 또는 rAAV2-cKD-eYFP-shD4R를 더욱 처리하였다. 상기 세포에 바이러스를 감염시키고 2일 후, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Roche, Indianapolis, IN)이 포함된 HEPES lysis buffer(40 μM HEPES, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100)를 이용해 상기 세포로부터 총 단백질을 추출하여 SDS-PAGE를 수행하여 10% SDS PAGE gel 상에 단백질을 크기별로 분리한 후 트랜스퍼 과정을 통해 분리된 단백질들을 PVDF 맴브레인(0.45 μm pore, Millipore)상으로 이동시켰다.
이후 TBST(Tris-buffered-saline and Tween 20)로 희석한 5% skim milk를 맴브레인에 처리하고, 각 맴브레인을 anti-D4R(sc-31481, 1:1000, Santa Cruz, Paso Robles, CA), anti-GFP(LF-PA0043, 1:1000, AbFrontier, Korea), 또는 anti-GAPDH(sc-25778, 1:1000, Santa Cruz) 1차 항체와 밤새 반응시켰다. 상기 각 1차 항체와 반응이 끝난 맴브레인은 HRP-conjugated anti-goat(sc-2020, 1:5000, Santa Cruz) 또는 anti-rabbit(A120-201P, 1:5000, Bethyl Laboratories, Montagomery, TX) 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시키고, ECL 시약(WBKLS0100, Millipore)을 처리한 후 LAS-4000(GE Heath Care, Piscataway, NJ)을 이용해 특정 단백질을 감광하여 발현량을 시각화하였다. 또한, 단백질 발현의 정량적 분석은 ImageJ(NIH, Bethesda, MD)를 이용해 수행하였다.
1-4. 면역세포화학염색법(
Immunocytochemistry
)
HEK-293 세포주를 0.1 mg/ml poly-L-lysine으로 코팅된 12-mm 글라스 커버슬립 위에 분주하고, rAAV2-cKD-eYFP-shD4R 또는 rAAV2-cKD-eYFP를 처리하였다. 3일간 배양 후, PBS(phosphate buffered saline)로 희석한 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 이용해 4℃에서 24시간 동안 반응시켜 세포를 고정시키고, PBS에 희석한 0.25% Triton X-100을 10분 동안 처리하여 세포 투과성을 높였다. 다음으로, PBS에 희석한 1% BSA, 5% normal goat serum, 및 0.25% Triton X-100을 처리하여 블로킹 과정을 실시하였다.
Cre 염색을 위해서는, anti-Cre(MAB3120, 1:500, Millipore) 1차 항체를 처리하고 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 goat anti-mouse Alexa Fluor 568 conjugated IgG(A11004, 1:500, Invitrogen, Carlsbad, CA) 2차 항체를 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 샘플을 슬라이드 글라스 위에 올리고 DAPI가 포함된 마운팅 배지(Santa Cruz)를 이용해 마운팅하였다.
1-5. 면역조직화학염색법(
Immunohistochemistry
)
트리브로모에탄올(tribromoethanol, 250 mg/kg)을 이용해 마우스를 깊게 마취시키고 PBS를 이용해 경심관류로 관류시킨 후 고정용액인 4% 파라포름알데히드로 관류시켜 고정하였다. 분리한 마우스 뇌는 고정 용액에 담그고 4℃에서 밤새 보관한 후 5% 아가로오즈(agarose)에 포매하여 vibratome(VT1000S, Leica, Germany)를 이용해 50-μm 두께로 관상면 조직으로 절단하였다. 절단된 부분에 대하여 4% normal donkey serum 및 0.4% Triton X-100을 처리하여 4℃에서 1시간 동안 반응시키고, goat anti-D4R(sc-31481; 1:500, Santa Cruz), rabbit anti-synaptophysin (04-1019; 1:1000, Millipore) 또는 mouse anti-gephyrin(sc-25311, 1:300, Santa Cruz) 1차 항체를 처리한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 Donkey anti-goat DyLight 488 conjugated IgG(1:300, Bethyl Laboratories) 또는 donkey anti-goat Alexa Fluor 594 conjugated IgG(1:300, Invitrogen), donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 conjugated IgG(1:300, Invitrogen) 또는 DyLight 550 conjugated donkey anti-mouse IgG(1:300, Bethyl Laboratories) 2차 항체를 처리하였다.
c-Fos 염색을 위해서는, 4% normal goat serum을 이용해 블로킹 과정을 수행하고 rabbit anti-c-Fos(sc-52, 1:500, Santa Cruz) 1차 항체 및 goat anti-rabbit Alexa Fluor 647 conjugated IgG(1:500, Invitrogen) 2차 항체를 처리하였다. 모든 조직은 UltraCruz 마운팅 배지(Santa Cruz)를 이용해 슬라이드 글라스 위에 마운팅하였다.
1-6. 세포
이미징
D4R와 시냅스 마커 단백질간의 co-localization 분석을 제외하고는 세포 이미징 분석을 위해 laser scanning confocal microscopes(LSM 510, Zeiss, Germany or Fluoview 1000, Olympus, Japan)을 이용하였다. 또한, D4R과 제피린(gephyrin)/시냅토파이신(synaptophysin) 간의 co-localization을 일반적인 공초점 현미경에서 보다 더욱 면밀히 관찰하기 위해 structured illumination microscope(N-SIM, Nikon, Japan)을 이용하였다. 또한, 면역반응성 부점(immunoreactive puncta)의 정량적 분석은 MetaMorph 7.7 software(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용해 수행하였다.
1-7.
Post
-
embedding
immuno
-
gold
electron
microscopy
면역 전자현미경 분석은 정립된 프로토콜에 따라 수행하였다. 뇌 조직 절편 샘플은 슬라이스 두께가 200 μm 인 것을 제외하고는 면역조직화학염색 실험에 이용한 것과 동일하다. 배측(dorsal) ITC는 실체현미경(Olympus)을 이용해 편도체 절편으로부터 분리하였다. 분리한 상기 조직을 얼음 위에서 0.001% osmium tetroxide(OsO4) 용액에 1시간 동안 담궈 세포막이 보존되도록 한 후 PBS로 세척하고, cryoprotection을 위해 조직을 10% 수크로오스 용액에 보관하였다. 이후 세포막 및 세포 구성요소가 보존된 상태에서 조직을 빠르게 동결시키기 위해 High-pressure freezing system(HPM 100, Leica)을 이용해 조직을 동결하고, 샘플 조직을 아세톤에 담근 후 -45℃에서 2시간 동안 Lowicryl HM20 resin(Electron microscopy sciences, Hatfield, PA)에 포매시키고 EM AFS2(Leica)으로 1일 동안 UV 중합되도록 하였다. 다음으로, 배측 ITC 조직을 포함하는 UV-중합된 샘플 블록을 ultra-microtome(Leica)으로 박절하고, 조직절편을 니켈 그리드(FCF200-Ni, Electron microscopy sciences) 위에 놓았다.
면역염색을 위해, goat anti-D4R(1:20, Millipore) 및 mouse monoclonal anti-GAD67(MAB5406, 1:20, Millipore) 1차 항체를 이용하였고, 4℃에서 밤새 detergent-free PBS에 희석한 0.2% normal donkey serum를 이용해 블로킹 과정을 수행한 이후 Jackson Immuno Research에서 구입한 각각의 12-nm gold particle-Donkey anti-goat 또는 6-nm gold particle-Donkey anti-mouse(705-205-147 및 715-195-150)을 이용해 D4R 또는 GAD-67를 표지하였다. 항체 처리 후, 높은 해상도 이미지를 얻기 위해 1-2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)를 4분 동안 처리하고 2분 동안 Reynolds 용액을 처리하였다. 이미지는 투과전자현미경(JEM-1011, Jeol, Japan)을 이용해 관찰하였다.
1-8. 바이러스 주입 및 텅스텐 전극과 광섬유 이식
마우스를 케타민(ketamine) 및 자일라진(xylazine)을 이용해 마취시키고, stereotaxic frame(Kopf, Tujunga, CA)으로 마우스 머리를 고정시켰다. 이후 ~0.1 ㎕의 바이러스 용액을 유리 바늘을 수평으로 하여 Nanoject II (Drummond scientific instrument, Broomall, PA)을 이용해 1분(뇌 반쪽 당 4회 주입하였고, 46 nl/sec의 속도로 23.0 nl씩 주입) 동안 뇌의 반쪽에 바이러스를 주입하였고, AAV가 확산될 수 있도록 주사바늘을 10분 동안 빼지 않았다.
이후, 단일 텅스텐 전극은 나사 및 치과용 시멘트를 이용해, in vivo 활성 기록용으로는 배측 ITC 쪽 및 in vivo 자극용으로는 변연계 아래 피질(IL) 쪽으로 도달하도록 동측으로 심었다. 기록용 전극은 배측 ITC에 정확하게 놓이도록 하기 위해, 신경 활성이 배측 ITC로부터 모니터링 되는 동안 전기적으로 변연계 아래 피질을 자극(0.1 Hz)시켰다. 만약 burst-like 스파이크가 각 변연계 아래 피질 자극으로부터 50 ms 보다 일찍 관찰되면, 기록용 전극은 치과용 시멘트로 잘 고정된 것으로 간주하였다. 광섬유(50-μm core diameter, ThorLabs, Newton, NJ)는 접착제 및 에폭시로 multi-mode zirconia ceramic ferrule(Precision Fiber Products, Milpitas, CA)로 보호하고, 하기 좌표에서 배측 ITC의 배측 맨 위로 광섬유의 끝이 놓이도록 심었다. 좌표는 브레그마(bregma)로부터 AP -1.4 mm, ML ± 3.2 mm, DV -4.0 mm이며, 치과용 시멘트로 고정시켰다.
1-9. 약물 주입
가이드 캐뉼라(Guide cannulae)(26 gauge, Plastics One, Roanoke, VA))를 다음 좌표 즉, 브레그마로부터 AP -1.4 mm, ML ± 3.2 mm, DV -4.2 mm의 배측 ITC 쪽으로 양방향으로 심은 후 치과용 시멘트로 두개골 내에 고정시켰다. 실험동물은 개별적으로 사육하고 수술 후 적어도 1주일 동안 회복되도록 하였다. 약물은 공포 조건화 20분 전, 10 μl Hamilton syringe에 연결된 주입 캐뉼라(33 gauge, Plastics One)를 통해 L-745870 또는 vehicle 각각을 0.5 μl씩 5분 동안 microinfusion pump(Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 이용해 0.1 μl/min의 속도로 주입하였다. L-745870은 주입 전 0.9% 식염수에 녹여 500 nM의 농도로 준비하였다. 마우스는 약물을 주입하고 5분 후까지 캐뉼라를 장착하였고, 이후 공포 조건화 반응 실험에 이용하였다. 또한, L-745870의 확산범위를 측정하기 위해, FITC(500 nM)를 각 약물에 포함시켜 주입하였다. 실험을 진행한 마우스는 마지막 행동 검사를 실시한 후 경심관류로 관류시키고 약물 주입 부위를 분석하였다. 캐뉼라 끝이 잘못 위치된 마우스로부터 얻은 실험 데이터는 이후 분석에서 제외하였다.
1-10. 행동검사 (
Behavioral
tests
)
행동검사를 위해 2개의 다른 챔버(26 cm x 26cm x 24 cm)를 사용하였으며, Context A는 검은색의 불투명한 PVC 벽과 격자무늬 바닥으로 구성하였고 각 실험 전 70% 에탄올로 닦은 반면, context B는 투명한 플라스틱 벽과 케이지 덮개로 덮인 PVC 바닥으로 구성하였고 페퍼민트 냄새가 나도록 하였다.
공포 조건화 트레이닝은 소리가 약화되는 조건(Panlab, Spain)인 context A에서 수행되었고, 소리 자극(조건 자극, conditioned stimulus; CS)은 발에 전기충격 자극(무조건 자극, unconditioned stimulus; US)이 충격 생성기(Panlab)가 부착된 격자무늬 바닥을 통해 가해지는 동안 스피커를 통해 전달되었다. 또한, 상기 챔버들에는 동물의 행동을 기록하기 위해 컴퓨터에 연결된 적외선 웹캠을 설치하였다. 실험 전 마우스들을 새로운 환경에 적응시키기 위해 2분 동안 context A에 놓아둔 후 소리(CS: 3 kHz, 80 dB for 30 sec)를 들려주었고, 발에 전기충격(US: 0.4 or 0.8 mA for 0.5 sec)을 가한 후 동시에 종료시켰으며, 총 8번의 소리-전기충격 자극을 무작위 간격(60~120초)으로 주었다. 공포 조건화 실험 24시간 후 마우스를 context B로 옮기고 2분 동안 전기충격 없이 소리만 다시 들려주어 공포 기억을 상기시키도록 하였다.
외상 후 스트레스 장애 유사 기억 손상 실험을 위해, 종래 알려진 방법에 따라 마우스에 공포 조건화 후 즉시 코르티코스테론(corticosterone, CORT, 5 mg/kg) 또는 vehicle(saline, 0.9% NaCl)을 복강으로 투여하였다. context A에서 상기 소리-전기충격 공포를 약하게 준 cue-conditioning group은 다음날 context B로 옮겨 소리 신호를 통해 공포를 상기시켰다.
신호 조건화된 동물로부터 상기된 공포 기억을 평가하기 위해, 마우스를 첫 번째 상기 테스트 종료 후 2시간째에 context A에 다시 가두고 신호 자극을 주지 않고 2분 동안 공포 행동 반응 시간을 측정하였다. 마우스를 첫 번째 공포 상기 테스트 종료 2시간 후 context B로 옮기고 청각 신호를 주면서 공포 행동 반응을 2분 동안 측정하였다.
이때, D4R 작용제(PD 168077, Tocris, 1 mg/kg) 또는 Vehicle(saline, 0.9% NaCl)은 context A 노출 15분 전에만 복강내(i.p.) 주입하였다.
1-11.
ChR2
-매개
광유전학적
자극
rAAV5-CamKIIα-hChR2(H134R)-eYFP 및 rAAV5-CamKIIα-eYFP를 광유전학적 조작에 이용하였다. STDP 유도를 위해 LED source(ThorLabs)로부터 푸른 빛을 1-msec pulses로 강하게 비추어 배측 ITC 뉴런의 엑손 말단에 광 활성화를 유도하였다. 빛의 강도는 강한 흥분성 시냅스후 전위(EPSP)를 일으키도록 조정하였다. in vivo에서 광유전학적 TBS를 LA-배측 ITC 경로로 주기 위해, 473 nm DPSS blue laser(Shanghai Laser & Optics Century, China)를 이용하였다. 광유전학적 TBS는 custom-made patch cable(50μm 중심 직경 광섬유, ThorLabs)를 이용해 전달하였으며, 상기 TBS는 0.1 Hz에서 10세트의 광펄스로 구성하였고, 10세트 펄스의 각 세트는 5 Hz, 단일 자극은 50 Hz에서 4번의 펄스로 구성하였다. 또한, 광유전학적 TBS 생성은 Master-8 stimulator(AMPI, Israel)로 조절하였다. 광유전학적 TBS 동안, 마우스는 마취 없이 사육 케이지 근처에서 자유롭게 움직이도록 하였다. 광섬유가 심어진 부분을 통한 완화에 대하여 빛 손실을 보상하였으며, 수술 전에 측정하였다. 또한, 뇌에서 기하학적 빛 손실이 예측되어서 web-based light transmission calculator (http://optogenetic.org/)로 보상하였다. 그러나 심장 관류 후, 두개골로부터 회수된 각 광섬유는 수술 전 측정된 것과 비교하여 빛 손실에 차이가 없었다.
1-12.
뇌절편
전기생리학
뇌 절편을 기록 챔버에 놓고, 상온에서 95% O2 및 5% CO2(pH 7.3 - 7.4)로 평형을 유지하면서 119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 및 10 mM D-glucose가 포함되어 있는 bathing solution을 지속적으로 공급하였다(2 ml/min). 전류 클램프 모드 또는 전압 클램프 모드에서 전체 세포 patch 기록은 MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices)로 하였다. 기록 전극(8-10 MΩ)은, 흥분성 시냅스후 전위(EPSP) 기록을 위해 120 mM K-gluconate, 5 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM MgATP, 및 0.1 mM NaGTP로 구성된 용액으로 채우고, KOH를 이용해 pH 7.2로 조정하였다. 흥분성 시냅스후 전류(EPSC) 기록을 위해서는, 130 mM CsMeSO4, 8 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM MgATP, 0.1 mM NaGTP, 5 mM QX-314, 및 10 mM phosphocreatine으로 구성된 용액으로 채우고 CsOH를 이용해 pH 7.2로 조정하였다. 또한, 억제성 시냅스후 전위(IPSP) 기록을 위해서는, 135 mM KCl, 10 mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM MgATP, 및 0.1 mM NaGTP으로 구성된 용액을 채우고 KOH로 pH를 7.2로 조정하였으며, 억제성 시냅스후 전류(IPSC) 기록을 위해서는, 135 mM CsCl, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM MgATP, 0.1 mM NaGTP, 및 5 mM QX-314로 구성된 용액을 채우고 CsOH를 이용해 pH를 7.2로 조정하였다.
발화 시간 기반 가소성(STDP) 후 또는 STDP 없이 mPSCs를 비교하기 위해, KCl-기반 및 K-gluconate 기반 내부 용액을 이용하여 작은 억제성 시냅스후 전류(mIPSCs) 및 작은 흥분성 시냅스후 전류(mEPSCs)를 각각 기록하고자 하였다. K-gluconate 기반 용액은 또한 interleaved 자극에 의해 유발된 흥분성 시냅스후 전류(EPSCs) 및 억제성 시냅스후 전류(IPSCs)를 기록하기 위해 이용하였다. 직렬저항(10-30 MΩ)은 모든 실험에 걸쳐 모니터링하였으며, mEPSCs는 1 μM의 테트로도톡신(tetrodotoxin; TTX) 및 100 μM 피크로톡신(picrotoxin)(Tocris, UK) 존재하에 -70 mV holding potential에서 기록하였고, 반면 mIPSCs는 1 μM TTX, 25 μM NBQX, 및 50 μM 2-amino-5-phosphonovaleric acid(APV, Tocris) 존재하에 -70 mV에서 측정하였다. 이후 mPSCs는 MiniAnalysis(Synaptosoft, Fort Lee, NJ) 또는 Clampfit 10.1 software(Molecular Devices)로 분석하였다. 또한, interleaved 자극에 의한 PSC를 기록하기 위해, holding potential은 -70 mV 에서 +10 mV로 변화시켜 추정되는 IPSC가 분리될 수 있도록 EPSC의 반전 전위에 도달하도록 하였다. STDP 실험을 위해서는, 최대 진폭의 25~30%를 나타내는 EPSPs를 일으키기 위해 자극강도를 조절하였다. 안정한 기준치 기록을 얻은 후, 80 전-시냅스 자극은 LA쪽에 위치한 금속 자극 전극을 통해 2 Hz로 전달하였고, 후-시냅스 뉴런으로 탈분극 전류를 주입하여 활동전위를 유도하였다. 양자 함량은 inverse square of the coefficient of variation (1/CV 2)를 얻어 추정하였다. 각 1/CV 2 수치를 측정한 후, 종래 알려진 방법에 따라 50 EPSCs 또는 50 IPSCs로부터 계산하였다.
한편, 도파민 의존적 장기 약화에 대한 D4R 매개 신호전달에 있어서 전시냅스/후시냅스 기여도를 측정하기 위해 GDPβS(0.5 mM)를 내부 용액에 포함시켰다. K-gluconate 기반 내부 용액 및 extracellular ACSF(13.3 mV) 사이의 액체 junction 전위는 안정막 전위의 표시를 위해 수정되었다. 뉴런의 형태학적 특성분석을 위해 뉴로비오틴(0.5%, Vector Labs, CA)을 피펫 용액에 첨가하였다. 뉴로비오틴(neurobiotin)이 주입된 뉴런은 밤새 고정 후 Texas Red conjugated avidin(Vector Labs)으로 염색함으로써 시각화하였다.
1-13.
in
vivo
전기생리학
전극이 심어진 마우스에 대하여 배측 ITC 신경세포의 자발적 발화(Spontaneous firings)를 안정적으로 기록하기 위해 케타민 및 자일라진으로 마우스를 약하게 마취시켰다. 자발적 발화는 공포 조건화 전인 순화 단계 1시간 후에 기록하였다. 약한 공포 조건화는 첫 번째 in vivo 기록 후 24시간째에 수행하였다. 이후 상기 공포 조건화 24시간 후에 상기와 동일한 방법에 따라 자발적 발화를 기록하였다. 기록 전극으로부터 받은 신호는 104번 증폭시켰고, band-pass는 DAM80 differential amplifier(World Precision Instruments, Sarasota, FL)를 이용해 10 kHz(low pass) 및 300 Hz(high-pass) 사이에서 필터링하였으며, PowerLab/4sp(ADinstruments, Colorado Springs, CO)를 이용해 40 kHz에서 디지털화하였다. 자발적 발화는 추가적으로 Chart acquisition software(ADinstruments)를 이용해 진행 및 모니터링하였다. Single unit는 종래 보고된 바에 따라 Spike2 software(Cambridge Electronic Design, UK)를 이용해 저장하였다. 단일 스파이크는 진폭 역치에 의해 초기 검출되었으며, 모든 검출된 스파이크는 주형인 파형과 비교하여 분리하였다. 만약 검출된 스파이크가 어떠한 주형과도 매치되지 않는다면 새로운 주형 파형을 검출된 스파이크의 파형에 기초하여 생성하였다. 스파이크 분리는 주성분 분석에 의해 정제하였으며, 1 ms 보다 낮은 스파이크 사이 간격을 보이는 유닛은 이후 분석에서 이용하지 않았다. 각 유닛으로부터 얻은 총 스파이크 수는 배측 ITC 신경세포의 자발적 발화 빈도를 계산하는데 이용하였고, 전극 배치는 검시 해부를 통해 철저히 확인하였다.
실시예
2: 실험결과
2-1. 약한 공포 조건화 후
배측
편도체
개재세포(Dorsal ITC)에서의
장기약화 유도 확인
배측 ITC는 공포반응을 조절하는 편도체 측핵(LA) 및 내측 전전두엽(mPFC)으로부터 흥분성 신호를 받는데, 본 실시예에서는 배측 ITC 신경세포를 공간적 및 형태학적으로 분석하였다(도 1a).
우선, 편도체 측핵 내 배측 ITC의 신호전달 경로에서 시냅스 특성 및 다른 신경세포들의 특성을 평가하기 위해, 편도체 측핵을 전기적으로 자극하면서 흥분성 후-시냅스 전위(excitatory postsynaptic potentials; EPSPs)에 대한 전체 세포 patch 기록을 얻었다(도 1B). 전-시냅스에서의 전기적 자극을 시작으로 다양한 시간 간격으로 80 pair의 전-시냅스 자극 및 후-시냅스 활동전위를 유발시켜 STDP를 유도하였다.
그 결과, GABAA 수용체의 길항제인 피크로톡신(picrotoxin) 처리시 +4 및 +6 ms 간격의 지연으로 장기강화(long-term potentiation; LTP)가 나타났다. 이러한 결과는 기저 측 편도(basolateral amygdala; BLA)의 신경세포에서처럼 배측 ITC 신경세포에서 억제성 신호전달이 STDP을 조절하는 것을 의미한다.
또한, 다른 공포 조건화에 따른 행동 및 생리학적 결과를 분석하기 위하여, 소리를 역치 이하의 전기충격(0.5초 동안 0.4 mA, 약한 공포 조건) 또는 역치 이상의 강한 전기충격(0.5s 동안 0.8 mA, 강한 공포 조건)과 함께 Pavlovian 공포 조건화 실험을 수행하였다.
그 결과, 약한 공포 조건화의 경우에는 학습 24시간후에 소리와 전기충격을 페어링하지 않은 경우(unpaired CS-US) 또는 소리만 준 대조군(tone-only control groups)과 비교하여 공포 행동(freezing)이 감소하였다. 반면에 강한 공포 조건화의 경우에는 현저히 증가된 공포 행동 수준을 보였다. 따라서, 약한 공포 조건화는 장기 기억으로 유지되지 않는 덜 중요한 경험으로 여겨짐을 알 수 있다.
특히, 약한 공포 조건화 24시간 후의 편도체 조직절편을 관찰한 결과, picrotoxin(억제성 조절이 최대로 효과적인 +6 ms 간격)이 없는 경우에는 STDP에 의해 배측 ITC 신경세포에서 장기약화가 유도되었다. 그러나 강한 공포 조건화 또는 공포 학습을 하지 않은 동물(naive)의 편도체 조직 절편에서는 어떠한 유의한 시냅스 가소성도 관찰되지 않았다(도 1C).
상기와 같이 편도체 측핵 자극에 의해 배측 ITC 신경세포에서 시냅스 반응이 유도되어도, 내측 전전두엽으로부터 통과하는 시냅스가 장기약화 경로를 방해할 수 있기 때문에, 특정 경로에서 시냅스 가소성을 평가하였다. 이를 위하여, ChR2(channelrhodopsin-2) 및 eYFP(enhanced yellow fluorescence protein)를 암호화하는 AAV(adeno-associated virus)를 제작하고 기저핵 또는 내측 전전두엽에 감염시켜 ChR2 발현을 평가하였다(도 1D).
이후 광유전학적으로 유도된 전-시냅스의 전기적 자극에 의한 단일시냅스 특성을 확인한 후 STDP과 유사한 광학적 자극을 주었다. 그 결과, rAAV5-CamKIIα-hChR2-eYFP를 편도체 측핵에 감염시켰을 때에는, 약한 공포 조건화 후에 광유도 EPSP 및 활동전위의 반복된 페어링에 의해 장기약화가 유도되었으나, 상기 바이러스를 내측 전전두엽에 감염시켰을 때는 유도되지 않았다. 또한, 광학적 STDP는 강한 공포 조건화를 겪은 동물 또는 공포 조건화를 겪지 않은 동물의 편도체 절편에서는 생성되지 않았다(도 1E).
따라서, 장기약화는 약한 공포 조건화 후 편도체 측핵에서 배측 ITC로 연결되는 시냅스에서 유도됨을 알 수 있었다.
2-2. 약한 공포 조건화 후
배측
ITC
신경세포에 대한 억제 증가
확인
공포 조건화 후 basal 시냅스 전달을 모니터링한 결과, 작은 억제성 후-시냅스 전류(miniature inhibitory postsynaptic currents; mIPSCs)가 현저히 증가된 반면(도 2A), 작은 흥분성 후-시냅스 전류(mEPSCs)는 (흥분성 전달 감소가 분명히 관찰되었음에도) 현저한 변화가 관찰되지 않았다(도 2B).
또한, 배측 ITC 신경세포는 주위의 ITC 신경세포들로부터 억제성(GABAergic) 신호를 받고, 편도체 측핵으로부터 흥분성(glutamatergic) 신호를 받는다고 알려져 있기 때문에, 배측 ITC 신경세포에서 이중시냅스의 억제성 후-시냅스 전위를 일으켰다.
그 결과, 편도체 측핵 자극에 의해 빠른 EPSP 및 느린 IPSP로 이루어진 biphasic PSP를 관찰하였으며, AMPA(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 수용체 및 kainate 수용체에 대한 길항체인 DNQX를 처리함으로써 이중시냅스의 특성을 확인하였다(도 2C). 또한, input-output 곡선은 다른 군과 비교하여 약한 공포 조건화 후에 배측 ITC 신경세포로 들어가는 억제성 신호가 현저히 증가하는 것을 의미한다(도 2D). 따라서, 배측 ITC 신경세포로 들어가는 억제성 신호는 약한 공포 조건화에 의해 향상될 수 있으며, 이는 억제를 분로(shunting)시킴으로써 장기약화를 유도한다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 배측 ITC의 신경세포 활성이 증가하는지 알아보기 위하여, in vivo에서 약한 공포 조건화 전후의 자발적 활성을 분석하고자 하였다. 살아있는 동물의 내측 전전두엽의 변연계부분의 전기적 자극에 반응하는 배측 ITC 신경세포를 정하고 부검을 통해 배측 ITC 내 recording site를 확인하였다. 그러나, 확인된 ITC 신경세포의 단일 유닛에서 현저한 활성 변화를 측정하지는 못하였다. 이는 배측 ITC 자체의 신경세포의 활성이 약한 공포 조건화에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다.
2-3.
D4R의
활성화에 의한 도파민(DA) 의존적 장기약화 확인
배측 ITC 신경세포에서 도파민의 역할을 알아보기 위해, 도파민(30 mM) 존재 하에서 상기 배측 ITC 신경세포들의 특성을 분석한 결과, 도파민 처리 전후의 안정막전위(resting membrane potentials; RMPs) 및 흥분성의 작은 변화만이 측정되었다. 도파민 단독 처리에 의해 시냅스 전달 변화는 측정되지 않았으나, 도파민(30 mM)의 존재하에 STDP 프로토콜에 의해 장기약화는 쉽게 유도되었다(도 3A).
이에, 도파민 의존적 장기약화(DA-LTD)를 나타내는 경로를 규명하기 위해, 편도체 측핵에 rAAV5-CamKIIα-hChR2-eYFP를 주입하고 광자극으로 도파민 의존적 장기약화가 유도되도록 하였다(도 3B). 이러한 결과는 도파민이 편도체 측핵 및 배측 ITC 간의 시냅스가 장기약화 되도록 한다는 것을 뒷받침하며, 이는 상술한 약한 공포 조건화 후 장기약화를 관찰한 것과 유사한 결과라고 할 수 있다.
도파민 수용체중 어떠한 서브타입이 도파민 의존적 장기약화의 유도에서 주도적인 역할을 하는지 알아보기 위해, 각 수용체에 대한 다양한 길항제를 최적의 농도로 처리하여 각 도파민 수용체를 억제하였다. 그 결과, D4R 특이적 길항제인 L-745870만이 도파민 의존적 장기약화를 저해하였고, 반면 D1/5R 길항제(SCH-23390), D2R 길항제(L-741626), 또는 D3R 길항제(GR-103691)는 도파민 의존적 장기약화에 영향을 미치지 않았다(도 3C).
상기 길항제 처리 결과와 상응하게, PD-168077에 의한 D4R의 활성화는 도파민을 처리한 것과 유사하게 배측 ITC에서 장기약화를 유도하였으며, D1/5R, D2R, 또는 D3R 작용물질(agonist)로서 각각 SKF-38393, quinpirole, PD-128907을 처리한 경우에는 장기약화가 유도되지 않았다(도 3D).
또한, 약물 조작의 교차반응성의 가능성을 배제시키기 위해, D4R이 결손된 유전자 모델을 이용하였다. 그 결과, D4R 넉아웃(KO) 마우스에서는 도파민의 존재에도 불구하고 동일한 STDP가 장기약화를 유도하지 못하였다(도 3E). 특히, D4R 특이적 길항제인 L-745870 또한 D4R이 존재하는 야생형 마우스에서 약한 공포 조건화후에 장기약화가 정상적으로 유도되는 것을 저해하였다(도 3F).
상기 결과를 종합하면, D4R은 도파민 의존적 장기약화 유도에 중요한 도파민 수용체의 주요 서브타입으로, 이의 활성화는 약한 공포 조건화 후 배측 ITC에서 장기약화를 유도할 수 있음을 의미한다.
D4R은 편도체를 포함한 뇌의 전체적인 부분에서 발현되며, 이의 다형성은 다양한 정신질환자들에서 발견된다. 실제로, 면역조직화학염색법을 통해 배측 ITC 뿐만아니라 다른 편도체 핵에서 D4R의 존재를 확인하였다.
이에, 시냅스 소포의 마커인 시냅토파이신(synaptophysin) 또는 억제성 후-시냅스의 마커인 제피린(gephyrin)로 D4R의 colocalization을 확인하기 위해, 배측 ITC 신경세포를 SIM(structured illumination microscopy)으로 관찰하였다. 그 결과, 고해상도(superresolution) 이미징을 통해 D4R이 제피린 보다 시냅토파이신과 더 높게 colocalization함을 확인하였다.
또한, D4R의 세포 내 위치를 분석하기 위해, post-embedding immuno-gold 투과전자현미경을 이용하였다. 그 결과, GAD67로 표지되고 대칭적인 억제성 시냅스의 엑손 말단에서 D4R에 결합된 금입자를 확인하였다(도 3G). 이와 대조적으로, D4R 넉아웃 마우스의 GAD67-함유 전-시냅스 말단에서는 D4R의 면역반응성이 관찰되지 않았다(도 3H). 따라서, D4R은 배측 ITC 시냅스에 존재하며 주로 억제성 전-시냅스 말단에 분포되어 있는 것을 알 수 있다.
2-4.
배측
ITC에서 도파민 의존적 장기 약화에 의한
피드
포워드(
Feed
-Forward) 억제 신호
도파민 의존적 장기약화의 기작을 규명하기 위해, 배측 ITC 시냅스의 basal 신호전달을 모니터링하였다. 그 결과, 도파민 의존적 장기약화를 유도하였을 때, 작은 억제성 후-시냅스 전류(mIPSC)의 frequency가 현저히 증가한 반면 작은 흥분성 후-시냅스 전류(mEPSC)는 영향을 받지 않는 것을 확인하였다(도 4A 및 4B).
즉, 작은 억제성 후-시냅스 전류의 누적 probability plot이 도파민 의존적 장기약화 유도 후 frequency 및 진폭이 증가한 반면, 작은 흥분성 후-시냅스 전류의 경우에는 변화가 나타나지 않았다. 또한, 도파민 의존적 장기약화 유도 후 이중시냅스의 억제성 후-시냅스 전위(inhibitory postsynaptic potential ; IPSP)의 현저한 증가를 확인하였다(도 4C). 이러한 결과는, 주변의 배측 ITC 신경세포들로부터 피드 포워드 억제 신호가 향상되었음을 의미한다.
또한, 배측 ITC 내의 억제성 신호전달 증가를 확인하기 위해, 편도체 측핵 또는 배측 ITC 구역에 interleaving 자극(매 5초)을 주는 동안 단일 ITC 신경세포로부터 후-시냅스 전류를 기록하였다(도 4D). 배측 ITC의 작은 크기 때문에 단일시냅스의 억제성 후-시냅스 전위는 유리전극으로 야기된 반면, 흥분성 후-시냅스 전위는 표준 금속 전극으로 편도체 측핵을 자극함으로써 야기되었다.
특히, 편도체 측핵(2.78 ± 0.19 ms) 및 배측 ITC(3.76 ± 0.17 ms) 모두의 자극에 의해 야기된 후시냅스 전류의 지연은 이전에 보고된 단일시냅스 전류의 지연과 일치하였다. 일단 도파민 의존적 장기약화가 유도되면, 억제성 후-시냅스 전위는 증가하는 반면 흥분성 후-시냅스 전위는 감소하는 것을 확인하였다(도 4E). 전-시냅스의 신경전달물질 분비는 야기된 반응의 1/CV2(coefficient of variation에 의해 나타낼 수 있는데, 향상된 전-시냅스의 GABA 분비와 일치하게 1/CV2가 억제성 후-시냅스 전위(IPSC)에 대하여는 증가된 반면, 흥분성 후-시냅스 전위(EPSC)에 대하여는 증가되지 않았다.
시냅스와 연결된 ITC 신경세포는 전류 주입에 의해 유도된 활동전위와 그 결과 생긴 outward IPSC로 확인한 후, unitary IPSCs(uIPSCs)를 분석하였다(도 4F). 그 결과, PD-168077의 존재하에 편도체 측핵을 자극하면서 후-시냅스 ITC 신경세포에 전류를 주입함으로써 장기약화를 유도하였을 때 uIPSCs의 진폭이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 4G). 특히, uIPSCs의 진폭 증가는 장기약화 크기와 상관관계가 있고, 장기약화를 위한 GABA 분비의 역할과 일치한다(도 4H).
D4R은 전-시냅스 부분에 풍부하기 때문에(도 3G), 전-시냅스 D4R의 활성화에 의한 GABA 분비 증가가 장기약화에 기여하는지 확인하기 위해, ITC 신경세포의 전-시냅스 또는 후-시냅스에서 G protein 신호전달 경로의 길항제인 GDPβS를 이용하였다. 그 결과, GDPβS는 전-시냅스 ITC 신경세포에서는 장기약화에 의해 유도되는 uIPSC의 진폭증가를 저해한 반면, 후-시냅스 ITC 신경세포에서는 이러한 현상이 나타나지 않았다(도 4G).
결론적으로, 도파민 의존적 장기약화는 전-시냅스 D4R의 활성화에 의해 배측 ITC 회로에서 억제성 신호전달 강화에 의해 일어남을 알 수 있었다.
2-5.
D4R
억제 또는 장기약화 전환에 의한 공포의 발현 증가 확인
만약 배측 ITC에서 도파민 의존적 장기약화가 공포 기억을 전달하는 신경회로를 조절하는 시냅스 기작이라면, 배측 ITC에서 D4R의 활성 또는 시냅스 가소성을 조절할 경우 공포 기억에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 이를 검증하기 위해, 배측 ITC에서 D4R의 약리 불활성화에 의한 도파민 의존적 장기약화의 행동학적 결과를 조사하였다. 이를 위해, 배측 ITC에 vehicle 또는 L-745870를 주입하고, 공포 기억의 학습 및 발현을 평가하였다(도 5A).
그 결과, vehicle 또는 L-745870가 주입된 동물은 소리와 전기충격을 같이 반복적으로 주는 공포 학습시와 유사한 공포학습을 나타내었다(도 5B). 약한 공포 조건화 24시간 후에 평가하였을 때, L-745870를 주입한 마우스는 vehicle을 주입한 마우스와 비교하여 현저히 높은 수준의 공포행동 반응을 나타내었으며(도 5B), 이는 공포 발현에 D4R 활성이 관여함을 의미하는 것이다.
다음으로, 배측 ITC의 억제성 신경세포에서 D4R을 결손시키기 위한 새로운 유전적 방법을 개발하였다. 즉, 특정 유전자를 넉다운할 수 있는 shRNA(small hairpin RNA)를 포함하고, 동시에 Cre-의존적 방법으로 eYFP의 발현에 의해 감염/넉다운된 신경세포를 확인할 수 있는 새로운 바이러스 벡터를 개발하였다. 즉, D4R의 발현을 특이적으로 저해하는 shRNA를 포함하는 AAV(rAAV2-cKDeYFP-shD4R)를 Dlx5/ 6-Cre (-) 또는 억제성 신경세포에서 Cre를 발현하는 Dlx5/6-Cre (+) 마우스 각각의 배측 ITC에 주입하였다(도 5C).
그 결과, eYFP는 배측 ITC 구역에서 주로 발현되었고, D4R은 Dlx5/6-Cre (-) 대조군과 비교하여 Dlx5/6-Cre (+) 마우스의 배측 ITC에서 발현이 현저히 저해되었다. 특히, rAAV2-cKD-eYFP-shD4R가 주입된 Dlx5/6-Cre (+) 마우스는 Dlx5/6-Cre (-) 마우스에 비하여 높은 수준의 공포행동 반응을 나타내었으며, 반면에 공포 기억 학습에는 별다른 차이가 없었다(도 5D). 또한, 정상 및 D4R 넉아웃 마우스는 약한 공포 조건에 대한 공포 발현에 차이가 없었으며, 이는 공포 발현 조절에 대한 배측 ITC 회로의 중요성을 보여준다.
이와 같이, 종래에는 배측 ITC의 크기가 작아 상기 구역에서만 D4R의 발현을 특이적으로 저해시키는 것이 어려웠으나, 본 실시예에서는 D4R의 국소적인 조작을 위해 약학적, 유전적 접근법을 개발하여 서로 일치하는 결과를 도출하였다.
따라서, 배측 ITC 신경세포에서 D4R은 공포 발현을 억제하기 위한 전제조건이 될 수 있으며, 이는 결국 공포기억을 통합적으로 설명해줄 수 있을 것이다.
2-6. 장기 약화를
광유전학적으로
저해시 공포기억 발현 증가 확인
배측 ITC 회로에서 시냅스 가소성이 약한 공포 조건화와 관련된 신호에 의해 유도된다면, 신호 노출에 의해 기억된 공포가 차후의 장기약화 유도에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 실제로, 공포가 학습된 마우스에서 소리에 의해 공포를 상기시킬 때 장기약화가 억제되었다(도 6A).
따라서, 편도체 측핵-배측 ITC 경로에서 장기약화가 저해될 경우 공포 발현이 변화될 수 있다는 가정하에, 정상적으로 약한 공포 조건화를 일으킨 후 장기약화를 저해하기 위해 편도체 측핵-배측 ITC 경로를 광유전학적으로 조작하였다. 그 결과, 편도체 측핵에 rAAV5-CamKIIα-hChR2-eYFP를 주입한 마우스의 편도체 조직절편에서 세타 파열 자극(theta burst stimulation; TBS)과 유사한 반복적인 빛 조명에 의해 도파민 의존적 장기약화가 저해되는 것을 확인하였다(도 6B). 이는 편도체 측핵-배측 ITC 경로에서 TBS가 NMDAR(N-methyl-Daspartic acid receptor)-의존적 장기 강화를 유도하였음을 보여준다. 이러한 광학적 TBS가 도파민 의존적 장기약화에 영향을 미쳤는지 조사하였고, TBS에 의해 유도되는 장기약화 저해 또한 NMDAR 활성에 의존적임을 NMDAR의 길항제인 APV(2-amino-5-phosphonopentanoic acid)를 사용함으로써 확인하였다.
배측 ITC 위에 광섬유를 이식하여 광유전학적 TBS를 적용하였고, 배측 ITC 신경세포의 활성증가를 측정하였다. 그 결과, 광유전학적 TBS가 공포 기억 테스트 사이에 가해질 때(도 6C), rAAV5-CamKIIα-hChR2-eYFP가 주입된 마우스는 첫 번째 테스트와 비교하여 두 번째 테스트에서 조건자극에 대해 현저히 증가된 공포 행동 반응을 나타내었다. 반면에 rAAV5-CamKIIα-eYFP가 주입된 마우스에서는 광유전학적 TBS가 행동학적 변화를 유도하지 않았다(도 6D).
이러한 결과는, 배측 ITC에서의 장기약화가 학습된 공포를 제어할 수 있는 중요한 세포 기질이 될 수 있음을 알 수 있다.
2-7. 외상 후 스트레스 장애(
PTSD
) 유사 동물모델에서
배측
ITC의 손상된 장기약화 확인
D4R 억제 및 장기 약화의 변경은 공포 발현을 증가시키므로, 외상 후 스트레스 장애 모델의 배측 ITC에서 장기약화가 영향을 받을 수 있다. 대부분의 외상 후 스트레스 장애 동물모델은 다양한 스트레스에 노출시켜 제작하지만, 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 투여함으로써 제작할 수도 있다. 외상 후 스트레스 장애와 유사한 공포 기억의 손상은 증가된 공포 반응뿐만 아니라 위험 및 안전-예상 자극을 구별하지 못하는 증상을 나타낸다.
본 실시예에서는 약한 공포 조건화를 겪은 마우스에 글루코코르티코이드의 하나인 코르티코르테론(corticosterone; CORT)을 5 mg/kg의 농도로 투여한 결과, 약한 공포 조건화 24시간 후에 공포 기억에 있어서 외상 후 스트레스 장애와 유사한 손상을 관찰하였고, 조건화 신호는 역치 이하의 전기충격과 청각 신호/cotext의 페어링에 관계없이 vehicle을 주입한 마우스에 비해 CORT 주입 마우스에서 더 높은 수준의 공포 행동 반응을 유발한다는 것을 확인하였다(도 7A). 특히, 상기 마우스들은 단지 신호 조건화만을 겪었음에도 불구하고 CORT를 주입한 마우스에서 context 또한 공포 행동 수준을 증가시켰다(도 7B).
다음으로, CORT를 주입한 마우스에서 외상 후 스트레스 장애와 유사한 공포 기억의 손상을 검증한 결과, CORT를 투여한 마우스의 경우 공포 조건화와 관계없이 배측 ITC에서 장기약화가 유도되지 않음을 확인하였고, 반면 vehicle이 투여된 마우스에서는 정상적으로 장기약화가 유도되는 것을 확인하였다(도 7C).
또한, 글루코코르티코이드 수용체의 길항제인 RU38486를 처리한 경우, 정상 마우스 및 약한 공포 조건화를 겪은 마우스에서 도파민 의존적 장기약화가 모두 억제되었다. 이러한 결과는 D4R이 글루코코르티코이드 수용체의 하위 신호전달 경로에 관여할 수 있음을 의미한다.
또한, CORT 및 D4R에 의한 신호전달의 기능적 중복과 상응하게, 배측 ITC에서 D4R의 발현이 저해된 Dlx5/6-Cre (+) 마우스에서는 Dlx5/6-Cre (-) 마우스와 비교하여 상관성 없는 context가 공포 행동 수준을 증가시키는 것을 확인하였다(도 7D).
또한, 장기약화 손상에 대한 메커니즘을 분석하기 위해, 야기된 이중시냅스의 억제성 후-시냅스 전위에 대한 input-output 곡선을 얻었다. CORT를 투여한 마우스에서 이중시냅스의 억제성 후-시냅스 전위는 약한 공포 조건화 후에도 변화하지 않았으나, vehicle을 투여한 마우스에서는 현저히 증가하였다(도 7E). 따라서 CORT를 투여한 마우스에서 장기약화 손상은 배측 ITC 신경세포로의 억제성 신호의 손상으로부터 나타나는 것을 확인하였다.
2-8. 외상 후 스트레스 장애(
PTSD
) 치료 가능성 제시
상기 실시예 2-7의 결과는, D4R 매개의 신호전달 이상, 편도체 억제성 회로의 시냅스 가소성 손상이 외상 후 스트레스 장애를 일으킬 수 있음을 의미하므로, 본 실시예에서는 외상 후 스트레스 장애(PTSD) 유사 행동을 보이는 마우스에서 도파민 수용체 타입 4(D4R)의 작용제(agonist)를 처리할 경우 PTSD가 완화될 수 있는지 실험하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, cue 공포 조건화된 마우스에 D4R의 작용제로서 PD-168077(N-([4-(2-시아노페닐)피페라진-1-일]메틸)-3-메틸벤즈아미드)를 처리하여 수용체의 기능을 증가시킨 결과, 대조군(vehicle)에 비하여 공포 행동 반응(freezing)이 50% 이상 현저히 감소됨을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 D4R 작용제에 의하면 편도체 배측 ITC에서 장기 시냅스 저하(LTD)를 유도하여 공포반응을 억제시킬 수 있으므로, PTSD 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
Claims (4)
- 도파민 수용체 타입 4가 손상 또는 결핍된, 인간을 제외한 외상후 스트레스 장애(PTSD) 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하기 위한 동물모델.
- 제 1 항에 있어서, 상기 도파민 수용체 타입 4의 손상 또는 결핍에 의해 장기 시냅스 저하(LTD)가 억제된 것을 특징으로 하는, 동물모델.
- 제 2 항에 있어서, 상기 장기 시냅스 저하(LTD) 억제에 의해 과도한 공포 반응이 유도된 것을 특징으로 하는, 동물모델.
- 인간을 제외한 포유류에 도파민 수용체 타입 4 유전자를 넉다운(knock-down) 또는 넉아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하기 위한 동물모델 제조방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020180115207A KR101975716B1 (ko) | 2018-09-27 | 2018-09-27 | 외상후 스트레스 장애(ptsd) 질환 동물모델 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180115207A KR101975716B1 (ko) | 2018-09-27 | 2018-09-27 | 외상후 스트레스 장애(ptsd) 질환 동물모델 |
Related Parent Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| US20080311657A1 (en) | 2005-08-03 | 2008-12-18 | Mia Levite | Killing Human Lymphoma and Leukemia Cancer Cells and Tcr-Activated Normal Human Cells By Dopamine D1r Agonists |
| US20160220563A1 (en) | 2013-09-13 | 2016-08-04 | Florida State University Research Foundation | Selective dopamine d4 receptor agonists for treatment of working memory deficits |
| US20160317474A1 (en) | 2013-12-18 | 2016-11-03 | Emory University | Managing Visual Dysfunction or Loss of Vision for Diabetic Subjects |
-
2018
- 2018-09-27 KR KR1020180115207A patent/KR101975716B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
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| Title |
|---|
| BMB Rep. vol. 49(1), pp. 1-2(2016년 1월 공개) |
| Cell, vol.90, pp.991-1001(1997.09.19.) |
| Frontiers in Neuroscience, vol. 7, Article 89(2013년 5월 31일 공개) |
| The Journal of Neuroscience, vol. 19(21), pp. 9550-9556(1999.11.01. 공개)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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