CN101290308A - 一种高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法 - Google Patents

一种高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法，包括：(1)预处理：在亚硫酰氯催化下，阿魏酸与无水乙醇回流加热反应，溶于乙醚，碳酸氢钠萃取，得阿魏酸乙酯；在30～50℃下，叔丁醇为反应介质，将阿魏酸乙酯、丁酸甘油酯和Novozym435脂肪酶在空气浴振荡反应，得阿魏酸丁酸甘油酯；取上述产品溶于甲醇，过滤，再经HPLC级甲醇稀释；(2)分离分析：采用色谱柱(Ph－3 column Inertsil，ID×250mm)，柱温为室温。固定相采用硅胶填料，紫外检测波长280～325nm；流动相为甲醇与水的梯度混合；进样量5μL，流速1mL/min。本发明方法根据待分离物质的性质选择色谱柱填料和特定紫外扫描波长，快速、高效、准确，便于工业分析应用。

Description

一种高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法
技术领域
本发明属色谱分离领域，特别是涉及一种高效液相色谱法(HPLC)分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法。
背景技术
阿魏酸丁酸甘油酯是天然酚酸类物质阿魏酸(Ferulic acid)的衍生物，它是阿魏酸乙酯与三丁酸甘油酯(tributyrin，TB)通过转酯反应生成的阿魏酸单丁酸甘油酯、阿魏酸双丁酸甘油酯及阿魏酸甘油酯的混合物，它们都具有阿魏酸与丁酸诸多的生理活性，同时克服了由于其烷烃链短而无法在油脂工业中应用的弊端，因而可以在食品、药品及化妆品行业得到广泛的应用。将脂溶性较强的三丁酸甘油酯和水溶性较强的阿魏酸乙酯合成阿魏酸丁酸甘油酯，不仅可以达到相互保护，降低氧化变性水平，提高它们的化学稳定性，而且还可以通过新型的双功能分子达到彼此增强原有疗效的双重目的。然而由于其反应过程难以控制，且生成的混合物极性相似，甚至存在同分异构体的现象，在分析分离的过程中难以找到合适的分离条件，给研究者带来了极大的困扰，并阻碍了对这些化合物性质的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱(HPLC)法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法，该方法快速，高效，准确，便于工业应用分析。
本发明的一种高效液相色谱(HPLC)法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法，包括：
(1)预处理：
在亚硫酰氯SOCl2(3mL)催化下，阿魏酸(1-5g)与无水乙醇(10-50mL)于60-80℃温度下回流加热反应后，溶于乙醚(10-30mL)，饱和碳酸氢钠萃取，室温静止析出结晶，得阿魏酸乙酯；
在30～50℃温度下，以5mL叔丁醇为反应介质，将1～2.0mmoL纯化的阿魏酸乙酯、2～4.0mmoL丁酸甘油酯和100～150mg Novozym435脂肪酶，在摇床转速150-210rpm，空气浴振荡反应80～120h，再经后处理，得到不同形式阿魏酸丁酸甘油酯；
取上述阿魏酸丁酸甘油酯1mg溶于1mL甲醇，通过0.45μm孔径的微孔滤膜过滤后，再取10μL，用HPLC级甲醇稀释至1mL，待用；
(2)分离分析：
采用的色谱柱(Ph-3column Inertsil，ID×250mm)，柱温为室温。固定相采用硅胶填料，紫外检测波长为280～325nm；
流动相为甲醇与水的梯度混合，梯度洗脱程序：0-5min内保持50％甲醇，5-15min内甲醇浓度从50％逐渐变成100％，保持10min；
进样量5μL，流速1mL/min。
所述的步骤(1)中阿魏酸乙酯与丁酸甘油酯、叔丁醇的体积用量比为1∶1-3∶5。
所述的步骤(1)中后处理是通过过滤除去脂肪酶，旋转蒸发除去反应介质，用体积比为4∶1的无水乙醚/正己烷抽提未反应的三丁酸甘油酯，氮气吹扫除去反应体系残余的有机介质。
所述的步骤(2)中所述的步骤(2)中紫外检测波长为325nm。
所述的步骤(2)中固定相采用苯基inertsil ph-3键合的硅胶填料。
本发明利用高效液相色谱法对阿魏酸丁酸甘油酯进行分离分析，根据待分离物质的性质选择色谱柱填料和特定紫外扫描波长，利用阿魏酸在325nm处有紫外吸收，而此波长处对其它物质没有紫外吸收，且能与特定苯基(inertsil ph-3)键合的硅胶柱有紧密结合的特点，达到快速准确分离混合物的目的。
有益效果
(1)本发明方法大大简化物质的分离纯化步骤，减少实验次数，快速、高效；
(2)与传统方法相比较，高效液相色谱与特殊填料的苯基柱联用分析方法简单快捷，适合工业化生产中定性定量分析时间，可以应用于酚酸类衍生物的分离纯化过程。
附图说明
图1为本发明高效液相色谱法对阿魏酸丁酸甘油酯的分离纯化图；
图2为传统高效液相色谱法对阿魏酸丁酸甘油酯的分离纯化图；
图3为制备阿魏酸丁酸甘油酯的反应流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.阿魏酸丁酸甘油酯的制备
酶催化反应在25mL的具塞三角瓶中，加入1.0mmoL阿魏酸乙酯，3.0mmoL丁酸甘油酯，120mg Novozym435脂肪酶，5mL叔丁醇，50℃度下空气浴振荡150r/min进行反应120h，通过过滤的方法除去酶。
2.阿魏酸丁酸甘油酯高效液相色谱法分析的前处理
将通过以上反应的混合物旋转蒸发除去反应介质异丁醇，用无水乙醚/正己烷(80/20，V/V)抽提未反应的三丁酸甘油酯。最后通过氮气吹扫的方法除去反应体系的残余的有机介质。取混合产物1mg溶于1mL甲醇中，通过0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，待用。
3.高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸混合物
(1)取10μL反应样品，用HPLC级甲醇稀释至1mL后，通过微量进样器取5μL样品加入到进样阀。
(2)流动相条件：甲醇与水的梯度混合，0-5min内保持50％甲醇，5-15min内甲醇浓度从50％逐渐变成100％，保持10min。流速为1mL/min。紫外检测波长325nm。
实施例2
本实例中仅用普遍采用的检测阿魏酸衍生物的高效液相色谱法，即采用普通C18反相色谱柱，检测波长在280nm，其它方法与实施例1相同。

Claims (5)

1.一种高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法，包括：
(1)预处理：
在亚硫酰氯SOCl2(3mL)催化下，阿魏酸(1-5g)与无水乙醇(10-50mL)于60-80℃温度下回流加热反应后，溶于乙醚(10-30mL)，饱和碳酸氢钠萃取，室温静止析出结晶，得阿魏酸乙酯；
在30～50℃温度下，以5mL叔丁醇为反应介质，将1～2.0mmoL纯化的阿魏酸乙酯、2～4.0mmoL丁酸甘油酯和100～150mg Novozym435脂肪酶，在摇床转速150-210rpm，空气浴振荡反应80～120h，再经后处理，得到不同形式阿魏酸丁酸甘油酯；
取上述阿魏酸丁酸甘油酯1mg溶于1mL甲醇，通过0.45μm孔径的微孔滤膜过滤后，再取10μL，用HPLC级甲醇稀释至1mL，待用；
(2)分离分析：
采用的色谱柱(Ph-3 column Inertsil，ID×250mm)，柱温为室温。
固定相采用硅胶填料，紫外检测；
流动相为甲醇与水的梯度混合，梯度洗脱程序：0-5min内保持50％甲醇，5-15min内甲醇浓度从50％逐渐变成100％，保持10min；
进样量5μL，流速1mL/min。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中阿魏酸乙酯与丁酸甘油酯、叔丁醇的体积用量比为1∶1-3∶5。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中后处理是通过过滤除去脂肪酶，旋转蒸发除去反应介质，用体积比为4∶1的无水乙醚/正己烷抽提未反应的三丁酸甘油酯，氮气吹扫除去反应体系残余的有机介质。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中紫外检测波长为325nm。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离分析阿魏酸丁酸甘油酯的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中固定相采用苯基inertsil ph-3键合的硅胶填料。
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