CN101289485A

CN101289485A - 在低盐条件下使核酸吸附到固相

Info

Publication number: CN101289485A
Application number: CNA2008100933408A
Authority: CN
Inventors: C·伯克纳
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2008-10-22
Anticipated expiration: 2028-04-18
Also published as: EP1992693A1; US20090012285A1; JP2008263981A; CA2629586C; CN101289485B; JP5325447B2; EP1992693B1; CA2629586A1; US7803935B2; HK1125112A1

Abstract

本发明涉及在低盐条件下使核酸吸附到固相。本文公开了促使核酸从水溶液吸附到固相如硅石的双阳离子有机化合物。吸附在低盐浓度下进行。还公开了适合从水溶液中离析核酸的方法和试剂盒。

Description

在低盐条件下使核酸吸附到固相

技术领域

本发明涉及核酸的提纯。

背景技术

技术上公开了多种从样品材料离析核酸的方法。为此目的，样品制备的方法极其重要。

特别有用的方法是这样达到这一目的的：溶胞(lysing)样品材料，并使核酸在离液物质(chaotropic substance)存在下吸附到固相(例如，硅石基体)上。通过将选择相从剩余溶胞产物(lysate)中分离出来，随后从固相上解吸核酸，可有效地离析核酸。

吸附过程期间，离液物质引起水分子从溶解的核酸分子的水合物壳以及从固相(例如，硅石基体)的表面的脱除。结果，硅石基体的-Si-OH基团与核酸主链的磷酸-二酯基团之间的直接离子相互作用变得可能(Melzak，K.，A.，等，J.Coll.Interf.Sci.181(1996)635-644)。

在现有技术中，离液物质以1M～6M或更高的非常高浓度施加。硅石基体中存在的添加剂，例如，其他元素如硼、铁、磷、铝之类，可能影响固相结合核酸的能力。

所描述的离液效应伴随着熵的增加。因此，平衡朝着核酸结合到固相表面的方向移动。然而，作为先决条件，固相的表面必须处于中性状态。尤其是对于硅石材料的表面，吸附核酸的优选pH范围介于pH 4～pH 6。

离液效应可通过加入其他脱水物质来加强。例如，有机溶剂，例如，醇的加入导致改善核酸吸附到玻璃表面。醇浓度一般介于30％～60％(体积)。另外，醇看来，以其他有机化合物为代价，使选择性朝结合核酸的方向移动。

另外，洗涤剂(detergent)以高浓度加入(例如，Triton X-100，20％[体积])，以便促进样品材料的溶胞(lysis)。同时，洗涤剂还可对吸附核酸到固相的过程产生正面影响。

高浓度的离液物质的另一个优点是抑制溶胞产物(lysate)中可能存在的核酸酶。此一特定效应可通过加入还原化合物如DTT得到加强。

现有技术存在许多缺点。为实现核酸在固相上要求的吸附，必须形成一种非常复杂的组合物，它包含各种试剂——特别是一或多种盐——以非常高的浓度存在，才能达到充分的结合和选择性。取决于处理前样品材料的复杂性，不希望的成分，特别是蛋白质，必须予以专门预处理。为此，样品材料通常借助蛋白酶，例如，Proteinase(蛋白酶)K.，进行消化。然而，离液物质的高浓度抑制了蛋白酶活性。尽管这一缺点可以通过施加大量蛋白水解酶(proteolytic enzyme)加以克服，但是此做法增加样品制备的成本，因为蛋白酶需要有非常高的品质，就是说，它不得含核酸酶。另一个缺点常常需要可燃的醇，因而要求安全防范措施。除了涉及醇的实验室安全的担忧之外，该有机化合物在吸移时还带来额外的问题。醇如乙醇或异丙醇的蒸汽压是一个涉及液体自动化处理的特殊技术问题。

因此，本发明的目的是提供一种用于从液相吸附核酸到固相的替代组合物。本发明的一项具体目的是提供一种组合物，它具有克服醇的至少某些缺点的有机添加剂。本发明另一个具体目的是提供一种组合物，它允许在低于现有技术中的盐浓度之下使核酸吸附到固相。

发明内容

本发明第一方面是一种使核酸结合到固相上的双阳离子有机化合物的应用。本发明的应用，其中双阳离子化合物选自双-苯并咪唑阳离子(bis-benzimidazolium cation)、双-咪唑阳离子(bis-imidazolium)和双胍阳离子(bis-guanidinium cation)。本发明另一方面是一种用于使核酸吸附到固相的含水组合物，其特征在于，该组合物是一种包括以下化合物的溶液：(a)缓冲盐；(b)双阳离子有机化合物；(c)核酸；其中盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子，介于5mM～300mM之间。一种提纯核酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)提供下列组分；(i)能可逆地结合核酸的固相；(ii)含核酸和双阳离子有机化合物的缓冲水溶液；(b)令所提供的组分在适合使核酸吸附到固相上的条件下进行接触；(c)从溶液中分离出具有被吸附的核酸的固相；(d)从固相上洗脱核酸；从而提纯了该核酸。用于离析(isolate)核酸的试剂盒(kit of parts)，包括能可逆地结合核酸的固相和包含双阳离子化合物的缓冲溶液的小瓶。本发明的试剂盒(kit)，其特征在于，固相是硅石羊毛状物(silica fleece)或包覆有(coated with)硅石的磁性颗粒。

附图说明

图1：MBITS(1H-苯并咪唑，1，1′-(1，4-丁二基)双[3-甲基])阳离子。

图2：BGDS(胍，N，N′″-1，4-丁二基)阳离子。

图3：MITS(1H-咪唑，1，1′-(1，4-丁二基)双[3-甲基-])阳离子。

图4：BITS(1H-咪唑，1，1′-(1，4-丁二基)双[3-丁基-])阳离子。

具体实施方式

本发明提供一种用于提纯核酸的新组合物和方法。某些术语，在本发明的说明书中，以具有特定的含义使用，或者，首次进行定义。为了本发明的目的，所使用的术语按照其在技术上接受的定义，若存在的话，来定义，除非那些定义与下文给出的定义抵触或部分地抵触。在定义上出现不一致时，术语的含义首先由下文给出的定义来定义。

术语“包括(comprising)”在本发明的说明书和权利要求书中被用来指“包括，但非必需限于”。

冠词“a”和“an”在这里被用来指一或多于1个(即，至少1个)该冠词的语法宾语。例如，“化合物(a compound)”指1种化合物或多于1种化合物。

当指定数值范围，例如，浓度范围时，该范围由单词“之间(between)”及以后的第一个值n1与第二个值n2所指出。指定范围的下限应理解为等于或高于第一个值。指定范围的上限应理解为等于或小于第二个值。因此，数值x的指定范围由n1≤x≤n2给出。

另外，应当理解，术语“(大)约”与数值n的组合指出，x在该数值的数值±5％所给出的区间内，即，n-0.05*n≤x≤n+0.05*n。在术语“(大)约”与数值n组合描述一种本发明的优选实施方案的情况下，n的数值是最优选的，除非另行指出。

术语吸附核酸的“固相”应理解为不溶于本发明组合物中的基质(substrate)。优选的固相是一种其表面能与核酸主链的磷酸根基团相互作用的基质。该固相可采取多孔或无孔颗粒、粉末化颗粒或纤维的形式。由包含大量非织造纤维的羊毛状材料组成的固相也包括在内。优选的固相由玻璃组成。优选的固相为多孔或无孔矿物基质，例如，硅石、石英、C盐(celite)或其他具有氧化表面(包括，例如，氧化锆、氧化铝和其他金属氧化物)的材料或其混合物。还有，术语“固相”涵盖包覆有硅石、玻璃、石英或C盐的磁性-可吸引颗粒。另外，要知道，“粉末”或“粉末化”材料形式的基质指的是一种精细分散的材料，当分散在本发明液体组合物中时，生成一种悬浮体。术语“粉末”或“粉末化”材料意在涵盖这样的片剂，其中粉末化材料虽已经聚集在一起，但当与液相混合时依然产生悬浮体。

术语“硅石(silica)”在本申请中被用来指主要由硅和氧组成的材料。这些材料包括硅石、二氧化硅、硅胶、热解法硅胶(fumed silica gel)、硅藻土、C盐、滑石、石英、玻璃、玻璃颗粒，包括任何不同形状的这些材料。玻璃颗粒，例如，可包括结晶二氧化硅、钠钙玻璃、硼硅酸盐玻璃的颗粒和纤维状、非织造玻璃。

术语“磁性颗粒”指的是具有顺磁或超顺磁性能的颗粒。就是说，该颗粒为磁性-可置换的(displaceable)，但在没有外加磁场的存在下不保留任何磁化。

术语“样品”(或“样品材料”)在这里被用来指一种复杂样品，更优选地，一种生物样品。复杂样品可包含大量要求从核酸中分离出去的有机和无机化合物。术语“样品”也涵盖包含由其他来源衍生的核酸的水溶液，例如，来自化学或酶反应混合物，或来自以前的生物样品材料的提纯。术语，从中提纯出核酸的“生物样品”涵盖这样的样品，它包括病毒或细菌细胞，乃至从多细胞生物体如人类和动物细胞以及组织和细胞培养物中离析的细胞。特别是，样品可包含白血球(leucocytes)，以及其他免疫活性细胞，低和/或高分子量的化学化合物，例如，半抗原、抗原、抗体以及核酸。样品可以是全血、血浆、血清、脑液(cerebral fluid)、唾液(sputum)、大便(stool)、活检标本(biopsy specimens)、骨髓(bonemarrow)、口腔漱液(oral rinses)、组织(tissues)、尿(urine)或其混合物。本发明还包括生物样品如来自人或动物体的流体；优选的是，生物样品是血液、血浆、血清或尿。血浆优选的是EDTA、肝素(heparin)或柠檬酸盐血浆。在本发明的一种实施方案中，生物样品包括细菌细胞、真核细胞、病毒或其混合物。上面例举的生物样品，优选处于加工过的形式者，例如，溶胞产物，可以是要将其中的(目标)核酸吸附到基质上去的组合物的一部分。术语“生物样品”也涵盖来自植物、真菌(fungi)乃至单细胞生物体的细胞。

本发明优选的样品是溶胞产物。“溶胞产物(lysate)”或“溶胞(lysed)样品”可从其中材料结构完整性已被瓦解的含组织、细胞、细菌或病毒的复杂样品和/或生物样品材料获得。为释放细胞、组织的内容物或，更一般地，释放构成生物样品材料的颗粒，可用酶或化学品来处理这些材料以便溶解、降解此类生物体的细胞壁和细胞膜或使之变性。该方法用术语“溶胞(lysis)”来涵盖。通常，当溶胞过程中释放出核酸时，使用离液剂如胍盐和/或阴离子、阳离子、两性离子或非离子洗涤剂。也有利的是，使用快速降解具有溶核活性的酶和其它不需要的蛋白质的蛋白酶。在溶胞过程后仍残留颗粒物，即，样品材料的未溶解物质的情况下，通常从溶胞产物中分离出颗粒物以获得一种澄清的溶胞产物。这可以，例如，通过过滤或离心来实现。在此种工况中，澄清的溶胞产物接受进一步加工，例如，通过本发明的方法。于是，术语“溶胞样品”涵盖澄清的溶胞产物。

本发明的“离液剂”是任何一种破坏液体水的有序结构的化学物质。离液剂还促使蛋白质的解折叠(unfolding)、伸展(extension)和解离(dissociation)(Dandliker，W.，B.，and de Saussure，V.，A.，In：TheChemistry of Biosurfaces，Hair，M.，L.，ed.，Marcel Dekker，Inc.New York(1971)p.18)。优选的离液盐是碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或盐酸胍。另一种优选的离液剂是脲。

术语“含水”、“水”相和“水”溶液描述一种液相，其中溶剂部分包括水。但是，其他溶剂如水-可混溶的有机溶剂也可存在于溶剂部分中。考虑到其他溶剂的存在，当溶剂部分的30％～100％，按体积计，是水时，就认为该溶液是“含水”的。

术语“核酸”当用于本申请时表示天然和合成来源的DNA和RNA多核苷酸。这包括改性核苷酸，例如，二-脱氧核糖核苷酸、具有改性糖残基的核苷碱基(nucleobase)和具有改性碱部分的核苷碱基(参见例如Scheit，K.，H.，Nucleotide Analogs，John Wiley和Sons，N.Y.(1980)；Uhlmann，E.，和Peyman，A.，Chem.Rev.90(1990)543-584)。特别是，包括基因组DNA、互补DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、转化DNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)和微RNA(miRNA)。

术语“吸附”一般指由于浸没在溶液中的固体与溶质之间的互相吸引作用，使分子或离子(“溶质”)粘附或附着到外表面或界面，以致使固体表面附近的溶质浓度增加，超过溶液本体中的浓度。结合到表面通常很弱且可逆。它是一种表面过程，使得积累的分子实际上没有渗透它们于其上形成的物质。该术语不应与吸收混淆，后者指的是固体内孔隙的充填。

核酸的离析和提纯常常与离液剂如胍盐(高浓度)的使用相联系，以便使核酸吸附到固相如硅石基体(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619；Marko，M.，A.，等，Anal.Biochem.121(1982)382-387)。

离液盐的例子是胍盐，例如，硫氰酸胍、异硫氰酸胍和盐酸胍，以及碘化钠、高氯酸钠。其他本领域技术人员公知的化合物也是可能的。离液物质引起水分子从溶解核酸分子的水合物壳，以及从固相(例如硅石基体)的表面上脱除。结果，在此种特定工况中，硅石基体的-Si-OH基团与核酸主链的磷酸二酯基团之间的直接离子相互作用成为可能(Melzak，K.，A.，et al.，J.Coll.Interf.Sci.181(1996)635-644)。

所描述的离液效应伴随着熵的增加。于是，平衡朝着核酸结合到固相表面的方向移动。作为先决条件，固相表面必须处于中性状态。尤其对于硅石材料的表面来说，吸附核酸的优选pH范围介于pH 4～pH 6之间。在硅石基体中存在的添加剂，例如，其他元素如硼、铁、磷、铝和类似物，可使适宜条件发生移动。离液效应可通过加入其他脱水物质予以增强。例如，有机溶剂如醇的加入改善了核酸吸附到玻璃表面。

本发明人吃惊地发现，某些离子液体具有类似于离液剂作用的效应。本发明人可证明，双阳离子有机化合物能有效地促进核酸从水溶液到固相的吸附。

因此，本发明的第一方面是双阳离子有机化合物用于使核酸结合到固相的应用。优选的是，双阳离子化合物选自双-苯并咪唑阳离子、双-咪唑阳离子和双胍阳离子。进一步优选的是，双阳离子化合物选自MBITS、BGDS、MITS和BITS。

优选的是，本发明的双阳离子化合物以二-甲苯磺酰磺酸盐(ditosylsulfonates)的形式使用。然而，其他反离子也是可能的。

本发明的双阳离子有机化合物能促进核酸吸附到固相，优选地具有硅石表面的固相，并优选地在酸性条件下，无需进一步的离液物质。

更加令人惊奇的是，在双阳离子有机化合物存在下的吸附甚至在低于500mM的盐浓度进行。

当提到本发明吸附溶液中的盐浓度，例如，低盐浓度时，应当理解，双阳离子有机化合物(其包括其一或多种反离子)的浓度不算在内。因此，盐浓度包括所有其他盐，例如，无机盐(例如，样品如生物样品中所包括的盐)，以及缓冲盐。

优选的是，吸附溶液中的盐浓度介于约10mM～约250mM。进一步优选的是，盐浓度介于约20mM～约150mM。进一步优选的是，盐浓度介于约25mM～约100mM。

因此，本发明的另一方面是一种用于使核酸吸附到固相的含水组合物，其特征在于，该组合物是包括以下化合物的溶液：(a)缓冲盐；(b)双阳离子有机化合物；(c)核酸；其中盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子，介于5mM～300mM。更优选的是，盐浓度介于10mM～250mM，进一步优选介于20mM～200mM。

本发明的含水组合物亦称作“吸附溶液”。

优选的是，本发明组合物的pH调节到约pH 4.0～约7.5之间的值。更优选的是，pH介于约4.0～6.5，也非常优选的是，介于5.5～6.5。本领域技术人员清楚如何生产合适的缓冲水溶液。适合分子生物学用途的缓冲体系可见诸于，例如，Sambrook，J.，et al，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第三版，CSHL Press(2001)Cold Spring Harbor，NewYork。优选的缓冲物质是三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、2-吗啉代乙磺酸(MES)磷酸盐、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、乙酸酯(acetate)，其盐，以及其他合适的物质。

本发明另一方面是一种提纯核酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)提供下列组分：(i)能可逆地结合核酸的固相；(ii)含核酸和双阳离子有机化合物的缓冲水溶液；(b)令所提供的组分在适合核酸吸附到固相的条件下进行接触；(c)从溶液中分离出具有被吸附的核酸的固相；(d)从固相上洗脱核酸；从而提纯了该核酸。在步骤(c)中，核酸被从双阳离子化合物中分离出来。优选的是，在步骤(c)以后和实施步骤(d)之前，具有结合的核酸的固相接受洗涤步骤，其中洗涤溶液包含醇。

一般而言，采用本发明组合物和方法吸附核酸的优选的固相包括多孔或无孔固体基质。非常优选的是硅石基质。更优选的是，该硅石基质选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维和C盐。也优选的是，该固相包括多孔或无孔矿物基质，其选自金属氧化物和/或混合金属氧化物、氧化铝、二氧化钛和氧化锆，以及主要由玻璃组成的材料。

也优选的是，该固相的粒度(particle size)介于0.1μm～100μm。也优选的是，多孔固相材料，当使用时，其孔隙尺寸(pore size)介于2～1,000nm。更优选的是，多孔或无孔固相材料，尤其是C盐，处于疏松堆积(loosepackings)的形式。进一步优选的是，固相由以下组成(consists of)：玻璃形式的过滤片材、石英或陶瓷过滤片材、和/或含硅胶的膜和/或矿物质的颗粒或纤维及石英或玻璃棉(glass wool)(即，纤维状非织造玻璃)的织物。

也优选的是，固相包括磁性可吸引的颗粒。更优选的是，磁性可吸引的颗粒包覆有选自硅石、玻璃、石英和C盐的矿物质。进一步优选的是，基质包括包覆有玻璃的磁性可吸引的颗粒。本发明中使用的磁性玻璃颗粒可以不同的配方供应。它们可以片剂、粉末或悬浮体的形式提供。非常优选的是，磁性玻璃颗粒悬浮在本发明的液体组合物中。优选的是，这些悬浮体包含5～100mg/ml的磁性玻璃颗粒(MGP)。也优选的是，该含硅石的材料悬浮在缓冲水溶液中，所述水溶液可任选地含有本发明的离子液体。

核酸可被包括在样品材料中。因此，样品材料可以是步骤(a)(ii)的组合物的一部分。在实施步骤(b)之前，样品材料优选地被均化在组合物中。样品材料可包括生物材料。另外，在此种工况中，均化步骤也优选在步骤(b)之前实施。需要的话，均化后，残留颗粒物质如细胞碎片借助离心从剩余的均化的样品材料中分离，上层清液进一步通过实施步骤(b)进行处理。除离心之外，备选的分离技术是公知的，包括过滤。

本发明方法的提纯效果来源于DNA或RNA在这些条件下，即，在本发明组合物的存在下，结合到固相材料上的性质。为使样品与基质，即，具有对核酸亲和力的材料，发生接触，将样品与该材料混合并培养一段足以发生结合的时间。本领域技术人员通常从如现有技术中所述的在例如醇和离液盐存在下有关实施可比的固相处理的程序可得知培养步骤的持续时间。该步骤可通过测定不同时间点固相表面上所固定的核酸数量加以优化。介于10s～30min的培养时间对于核酸来说可能是适当的。在培养后，被吸附的目标组分从液相中分离出来。这通常可依靠重力来实现。

在结合到磁性玻璃颗粒的核酸的合适情况下，分离步骤借助对具有吸附的核酸材料的磁性颗粒施加磁场来进行。例如，可将磁性颗粒拽到其中进行培养的容器的壁。随后可将含有未结合到磁性颗粒的样品内容物的液体移出。所采用的移出程序取决于其中进行培养的容器的类型。合适的步骤包括通过吸移管或抽吸移出液体。

另一种优选的方法是采用所谓的“旋转柱(spin columns)”或“旋转滤柱”，其是市售供应的，例如获自Roche Diagnostics GmbH Mannheim，Germany的HIGH PURE^TM柱。旋转滤柱管通常包含位于柱底并覆盖底部开口的非织造玻璃纤维的羊毛状物。含核酸的吸附溶液被转移到柱中并通过施加力使其通过羊毛状物。术语“力”包括重力以及，优选地，离心力。非常优选这样的“旋转柱”程序：其中吸附溶液在离心所施加的力作用下通过过滤器。其它使吸附溶液通过羊毛状物的方法包括施加压力或者抽吸。

随后，具有吸附的核酸的固相可用洗涤溶液洗涤至少一次。该一或多个洗涤步骤是任选的。使用的洗涤溶液没有导致目标组分从材料表面释放，但尽可能彻底地洗掉不希望的污染物。该洗涤步骤优选地通过以洗涤溶液培养具有结合的目标核酸的材料来完成。在此步骤期间，优选地将该材料再悬浮。也优选的是，如果材料是柱内的玻璃羊毛状物和填料，洗涤步骤通过以洗涤溶液清洗该柱来完成。优选的是，洗涤溶液借助施加压力、抽吸、离心力或重力，通过该柱。合适的洗涤溶液是本领域技术人员公知的，可包含盐、离液物质和/或有机溶剂如醇。受污染的洗涤溶液优选地恰如在上述用于使核酸吸附到固相的步骤中移出。在最后的洗涤步骤后，分离出的具有吸附的核酸的固相材料可在真空中短时间干燥，或者可让流体蒸发。也可实施采用丙酮的预处理步骤。

以后，改变条件以便从固相释放核酸。该步骤亦称作“洗脱”核酸。具有被固定的生物材料的固相在没有或仅有少量离液剂和/或有机溶剂和/或液体离子的情况下与水溶液进行接触。或者，该悬浮体可以用不含或仅含少量离液剂和/或有机溶剂和/或液体离子的溶液进行稀释。此性质的缓冲液乃是本领域技术人员公知的，例如，可见诸于DE 3724442和Jakobi，R.，等，Anal.Biochem.175(1988)196-201。具有低盐含量的洗脱缓冲液，具体地说，是含量小于0.2mol/l的缓冲液。优选的是，洗脱缓冲液含有起缓冲作用的物质Tris。也优选的是，洗脱缓冲液是去离子水。含有提纯的核酸的溶液现在可用于其他反应。任选地，该核酸可利用，例如，乙醇或异丙醇从溶液中沉淀出来。该沉淀物也可进行进一步的洗涤步骤。此种方法乃是本领域技术人员熟知的，详细描述在Sambrook，J.，等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，CSHLPress(2001)Cold Spring Harbor，New York中。

本发明还预期了一种试剂盒。技术上公知的此类试剂盒包括可用于样品制备程序的塑料件。其例子是，例如由Eppendorf，Hamburg，Germany制造的96或384孔规格的微孔滴定板或仅是普通反应管。本发明的试剂盒还包括某些或全部其他用于实施本发明方法的试剂。因此，试剂盒可另外包含固相，即，具有对核酸亲和力的材料。优选的是，固相包括具有硅石表面的材料。非常优选的是，固相包括玻璃或石英纤维。也非常优选的是，固相是包括磁性玻璃颗粒，即，包覆有玻璃的磁性可吸引的颗粒的组合物。试剂盒可进一步或另外包括含有本发明双阳离子有机化合物、洗涤剂或其混合物的溶胞缓冲液。本发明试剂盒的这些组分可分别在试管或贮存容器中提供。视组分的性质而定，这些可甚至在单一试管或贮存容器中提供。试剂盒可进一步或另外包括适合固相洗涤步骤的洗涤溶液，当其上结合了DNA或RNA或二者时。该洗涤溶液可包含一或多种具有酸性pH的缓冲溶液中的离液剂。另外，洗涤溶液可包含C1～C5醇。优选的是，该醇是乙醇或异丙醇。

通常，洗涤溶液或其他溶液以使用前需要稀释的储备溶液(stocksolution)的形式提供。试剂盒可进一步或另外包括解吸溶液，即，洗脱缓冲液，即，一种用于将核酸从固相上解吸下来的溶液。优选的解吸溶液可以是缓冲液(例如，10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)或纯水。再有，可存在可用于核酸(即DNA或RNA)的提纯加工的附加试剂或缓冲溶液。于是，本发明另一方面是一种用于从含核酸材料中离析核酸的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括能可逆地结合核酸的固相和含有双阳离子化合物的缓冲溶液的小瓶。优选的是，固相是硅石羊毛状物或包覆有硅石的磁性颗粒。非常优选的是，双阳离子化合物选自MBITS、BGDS、MITS和BITS。

更详细地，本发明包括以下要点：

1.一种双阳离子有机化合物用于使核酸结合到固相上的用途。

2.要点1的用途，在没有胍盐的存在下。

3.要点1的用途，在没有一或多种选自碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍和脲的化合物的存在下。

4.要点1～3中任何一项的用途，在没有乙醇和异丙醇的存在下。

5.要点1～3中任何一项的用途，在没有C1～C5脂族醇的存在下。

6.要点1～5中任何一项的用途，其特征在于，核酸是DNA或RNA。

7.要点1～6中任何一项的用途，在一或多种盐的存在下，其中一或多种盐以低于500mM的浓度存在。

8.要点1～6中任何一项的用途，在一或多种盐的存在下，其中一或多种盐以1mM～400mM的浓度存在。

9.要点8的用途，在一或多种盐的存在下，其中一或多种盐以5mM～300mM的浓度存在。

10.要点9的用途，在一或多种盐的存在下，其中一或多种盐以10mM～250mM的浓度存在。

11.要点10的用途，在一或多种盐的存在下，其中一或多种盐以20mM～150mM的浓度存在。

12.要点10的用途，在一或多种盐的存在下，其中一或多种盐以25mM～100mM的浓度存在。

13.要点1～12中任何一项的用途，其特征在于，双阳离子化合物选自双-苯并咪唑阳离子、双-咪唑阳离子和双胍阳离子。

14.一种用于使核酸吸附到固相的含水组合物，其特征在于，该组合物是包含以下化合物的溶液：

(a)缓冲盐；

(b)双阳离子有机化合物；

(c)核酸；

其中盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子在内，低于500mM。

15.要点14的含水组合物，其特征在于，该组合物是除胍盐以外的化合物的溶液。

16.要点14的含水组合物，其特征在于，该组合物是除一或多种选自碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍和脲的化合物以外的化合物的溶液。

17.要点14的含水组合物，其特征在于，该组合物是除一或多种离液剂以外的化合物的溶液。

18.要点14～17中任何一项的含水组合物，其特征在于，该组合物是除乙醇和异丙醇以外的化合物的溶液。

19.要点14～17中任何一项的含水组合物，其特征在于，该组合物是除C1～C5脂族醇以外的化合物的溶液。

20.要点14～19中任何一项的含水组合物，其特征在于，核酸是DNA或RNA。

21.要点14～20中任何一项的含水组合物，其特征在于，盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子在内，介于1mM～400mM。

22.要点21的含水组合物，其特征在于，盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子在内，介于5mM～300mM。

23.要点22的含水组合物，其特征在于，盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子在内，介于10mM～250mM。

24.要点23的含水组合物，其特征在于，盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子在内，介于20mM～150mM。

25.要点24的含水组合物，其特征在于，盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子在内，介于25mM～100mM。

26.要点14～25中任何一项的含水组合物，其特征在于，双阳离子化合物选自双-苯并咪唑阳离子、双-咪唑阳离子和双胍阳离子。

27.一种提纯核酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(a)提供下列组分：

(i)能可逆地结合核酸的固相；

(ii)含核酸和双阳离子有机化合物的缓冲水溶液；

(b)令所提供的组分在适合核酸吸附到固相的条件下进行接触；

(c)从溶液中分离出具有被吸附的核酸的固相；

(d)从固相上洗脱核酸；

从而提纯了该核酸。

28.要点27的方法，其特征在于，步骤(a)中(ii)的缓冲水溶液含有浓度低于500mM的一或多种盐。

29.要点28的方法，其特征在于，缓冲水溶液中的盐浓度介于1mM～400mM。

30.要点29的方法，其特征在于，缓冲水溶液中的盐浓度介于5mM～300mM。

31.要点30的方法，其特征在于，缓冲水溶液中的盐浓度介于10mM～250mM。

32.要点31的方法，其特征在于，缓冲水溶液中的盐浓度介于20mM～150mM。

33.要点32的方法，其特征在于，缓冲水溶液中的盐浓度介于25mM～100mM。

34.要点27～33中任何一项的方法，其特征在于，步骤(a)中(ii)的缓冲水溶液是除胍盐以外的化合物的溶液。

35.要点27～33中任何一项的方法，其特征在于，步骤(a)中(ii)的缓冲水溶液是除一或多种选自碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍和脲的化合物以外的化合物的溶液。

36.要点27～33中任何一项的方法，其特征在于，步骤(a)中(ii)的缓冲水溶液是除一或多种离液剂以外的化合物的溶液。

37.要点27～36中任何一项的方法，其特征在于，该组合物是除乙醇和异丙醇以外的化合物的溶液。

38.要点27～36中任何一项的方法，其特征在于，该组合物是除C1～C5脂族醇以外的化合物的溶液。

39.要点27～38中任何一项的方法，其特征在于，核酸是DNA或RNA。

40.要点27～39中任何一项的方法，其特征在于，双阳离子化合物选自双-苯并咪唑阳离子、双-咪唑阳离子和双胍阳离子。

41.一种用于离析核酸的试剂盒，其包括能可逆地结合核酸的固相，和含有双阳离子化合物的缓冲溶液的小瓶。

42.要点41的试剂盒，其特征在于，固相是硅石羊毛状物或包覆有硅石的磁性颗粒。

43.要点41和42中任何一项的试剂盒，其特征在于，双阳离子化合物选自双-苯并咪唑阳离子、双-咪唑阳离子和双胍阳离子。

下面的实施例和附图旨在用来帮助对本发明的理解，本发明的真正范围将在所附权利要求中给出。要知道，在给出的程序之内尚可制定出各种修改方案，而不偏离本发明的精神。

实施例1

核酸吸附到玻璃羊毛状物

在市售可得的HIGH PURE^TM旋转柱(获自Roche Diagnostics GmbH的试剂盒，Applied Science，Cat.No.11796828001；Roche DiagnosticsGmbH Mannheim)内，提供玻璃羊毛状物作为固相。被吸附到玻璃羊毛状物上的核酸是牛胸腺(Calf Thymus)DNA(Roche Diagnostics GmbH，Applied Science，Id.No.10041785，它也是Roche Diagnostics GmbH，Germany销售的不同试剂盒的一部分)。除了吸附溶液之外，核酸提纯的所有步骤都是按照制造商的建议实施的。

测试的吸附溶液的组成载于表1。每种吸附溶液中溶解50μg的数量，结果获得500μl体积的等分部分。每个等分部分被施加到旋转柱上，并且利用离心使液体在旋转柱底部通过玻璃羊毛状物。

洗脱缓冲液和条件在随试剂盒提供的用户手册中给出，(即：采用500μl洗脱缓冲液的等分部分、10mM Tris-HCl缓冲液，pH 8，进行洗脱)。

在吸附步骤前利用PICO GREEN分析(Invitrogen，Cat.No.P7589)测定吸附溶液中DNA的浓度。另外，利用PICO GREEN分析，测定了在通过玻璃羊毛状物后(即：吸附步骤后)的每种吸附缓冲液中的残余DNA浓度。利用这些测量值，为每种吸附溶液测量结合到固相的DNA的相对数量。

另外，测定了洗脱液中的DNA浓度，但利用在260nm的光度测定。

表1：

吸附溶液	结合到固相的DNA	洗脱的DNA
吸附溶液	结合到固相的DNA	洗脱的DNA	MBITS，50mM；MES缓冲液，50mM pH 6.0	99.98％	74.30％
BGDS，37mMMES缓冲液，50mM pH 6.0	99.40％	62.40％	MBITS，50mM；MES缓冲液，50mM pH 6.0	99.98％	74.30％
BGDS，37mMMES缓冲液，50mM pH 6.0	99.40％	62.40％	MITS，50mMMES缓冲液，50mM pH 6.0	100.00％	58.20％
BITS，50mMMES缓冲液，50mM pH 6.0	99.94％	59.46％	MITS，50mMMES缓冲液，50mM pH 6.0	100.00％	58.20％
BITS，50mMMES缓冲液，50mM pH 6.0	99.94％	59.46％	对照：硫氰酸胍，1MMES缓冲液，50mM pH 6.0	98.72％	68.4％

结果表明，双阳离子化合物表现得与传统吸附溶液一样好。

Claims

2.权利要求1的用途，其中双阳离子化合物选自双-苯并咪唑阳离子、双-咪唑阳离子和双胍阳离子。

3.一种用于使核酸吸附到固相的含水组合物，其特征在于，该组合物是包含以下化合物的溶液：

(a)缓冲盐；

(b)双阳离子有机化合物；

(c)核酸；

其中盐在组合物中的浓度，不包括双阳离子化合物及其一或多种反离子在内，介于5mM～300mM。

4.一种提纯核酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：