CN101284914B - 一种糖基化有序多孔膜的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖基化有序多孔膜的制备方法及其用途。包括如下步骤：1)将含糖嵌段共聚物溶于溶剂中，得到重量百分比为0.5～15％的聚合物溶液；2)将上述聚合物溶液在相对湿度为50～90％，温度为5～50摄氏度下浇铸成膜，得到孔径在0.2～20微米的糖基化有序多孔膜。糖基化有序多孔膜用于蛋白质检测。本发明利用亲水性含糖基团在水滴诱导作用下向膜表面的迁移，获得一种在特定区域内糖基高度富集的有序表面，充分发挥糖基识别蛋白质的集簇效应，显著提高蛋白质的检测灵敏度。本发明所制备的糖基化有序多孔膜具有制备方法简单、工艺条件温和、生产成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及有序多孔膜，具体涉及一种糖基化有序多孔膜的制备方法及其用途。
背景技术
有序多孔材料在催化剂负载、气体传感器件、光电器件、细胞培养基材、分离或吸附介质等方面具有广泛的应用前景。人们已经开发了一系列制备有序多孔材料的方法，如石板印刷法、刻蚀法、模板法、自组装法以及水辅助法等。水辅助法又称作水蒸气诱导法或水滴模板法，即在高湿度环境下以冷凝水为模板，在固体基板上制备孔径分布均一、排列紧密的有序多孔薄膜。自Francois首次以星形聚苯乙烯为膜材质，在高湿度环境中获得蜂窝孔结构以来(参见G.Widawski，M.Rawiso，B.Francois，“Self-organized honeycomb morphology ofstar-polymer polystyrene films”，Nature，1994，369：387-389.)，水辅助法因其工艺简单、实验条件温和以及结构规整可控等优点而受到了国内外研究者的广泛关注。JP 2002335949、JP 2002347107、JP 2003128832通过水辅助法制备了两亲性聚合物的有序多孔膜，可以用作细胞培养材料和显示器件；CN 1869109在剥离衬底上浇筑聚合物溶液，制备了有序多孔复合薄膜，极大提高了多孔膜的机械性能；于春玲等以4-十二烷基苯磺酸掺杂的聚苯胺为成膜材料，制备了具有导电性的蜂窝状有序多孔薄膜(参见于春玲等，“掺杂态聚苯胺蜂窝状有许多孔薄膜的制备及形成机制的探讨”，《高等学校化学学报》，2004，25：1322-1324)；赵晓勇等以氯仿为溶剂制备了丙交酯-乙交酯共聚物的有序多孔膜，并研究了膜材质亲水性、环境湿度及溶液浓度等对膜孔结构的影响(参见赵晓勇等，“水蒸气辅助法制备LA-GA共聚物蜂窝状多孔膜”，《膜科学与技术》，2004，24：1-6)。
糖广泛存在于生物界中，它们与蛋白质的识别作用与生命活动息息相关，许多至关重要的生理过程如受精、免疫应答、细胞生长增殖和分化等等都通过糖和蛋白质的特异性识别作用来完成。近年来，糖基化材料在医药、临床诊断、蛋白质分离等领域得到广泛应用。CN 1417347将糖配体共价链接于基质表面，用于鉴定病原微生物及其毒性蛋白；CN 1030005将二乙胺乙基葡聚糖包被在二氧化硅颗粒上，通过吸附和洗脱从乳清中选择性地提取金属蛋白质；CN 1843592采用静电纺丝法制备了糖基改性的纳米纤维膜。但是，糖基与蛋白质的识别过程需要实现“集簇效应(cluster effect)”来增强糖基对蛋白质识别的强度和特异性，以用于蛋白质的高灵敏度检测，现有工艺均未通过糖基富集来实现其集簇效应，存在不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，要提供一种糖基化有序多孔膜的制备方法及其在蛋白质检测方面的应用。
糖基化有序多孔膜的制备方法包括如下步骤：
1)将含糖嵌段共聚物溶于溶剂中，得到重量百分比为0.5～15％的聚合物溶液；
2)将上述聚合物溶液在相对湿度为50～90％，温度为5～50摄氏度下浇铸成膜，得到孔径在0.2～20微米的糖基化有序多孔膜。
所述含糖嵌段共聚物为葡萄糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物、甘露糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物或半乳糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物；含糖嵌段共聚物中糖基的摩尔百分数为0.5～30％，含糖嵌段共聚物分子量为1～40万；溶剂为二硫化碳、甲苯、氯仿中的一种或几种。
糖基化有序多孔膜用于蛋白质检测。
本发明采用的工艺设备简单，方法操作便利，条件温和，可控性强，周期短，得到的孔结构规整。以含糖聚合物作为亲水链段，在水滴诱导作用下，含糖链段向表面迁移，得到在特定区域内糖基高密度富集的有序表面，能够极大增强糖基对蛋白质识别的集簇效应。糖与蛋白质之间存在一一对应的识别能力，通过不同种类的糖基化，可以实现对特定蛋白质的选择性吸附和检测，也为糖与蛋白质相互作用的研究提供了一个良好的载体。同时，糖基化膜能够通过对蛋白质的脱吸附而重复利用，大大降低了生产成本。本发明适用于多种糖基化的有序多孔膜，在分离检测等方面具有良好的应用前景。
具体实施方式
本发明所述含糖嵌段共聚物为葡萄糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物(见结构式(I))、甘露糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物(见结构式(II))或半乳糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物(见结构式(III))。
糖基化有序多孔膜用于蛋白质检测的过程：将制得的糖基化有序多孔膜浸入到荧光素标记的蛋白质溶液中，在室温(25摄氏度)下检测5分钟至2小时，然后测定糖基化膜的荧光强度，可达到检测特定蛋白质含量的目的。
所述蛋白质为：伴刀豆球蛋白、扁豆凝聚素、小麦菌凝聚素、马铃薯凝聚素、豌豆凝聚素、雪铃花凝聚素、苦参凝聚素、蓖麻毒蛋白、花生凝聚素、大豆凝聚素、槐米凝聚素，上述蛋白质均为荧光标记蛋白质。
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实例不构成对本发明的限制。
实施例1
将分子量为40万，糖基摩尔百分含量为0.5％的葡萄糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于二硫化碳，配成重量百分浓度为15％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在50％相对湿度、5摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径0.2±0.05微米。
将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径0.2±0.05微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的花生凝聚素/荧光标记伴刀豆球蛋白(PNA/FL-Con A)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为108；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径0.2±0.05微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记花生凝聚素/伴刀豆球蛋白(FL-PNA/Con A)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为4。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的伴刀豆球蛋白。
实施例2
将分子量为10万，糖基摩尔百分含量为5％的甘露糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于二硫化碳中，配成重量百分浓度为5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在70％相对湿度、25摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径5.3±0.7微米。
将上述甘露糖糖基化有序多孔膜(孔径5.3±0.7微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的大豆凝集素/荧光标记豌豆凝集素(SBA/FL-PSA)溶液中，25摄氏度下恒温5分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为133；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径5.3±0.7微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记大豆凝集素/豌豆凝集素(FL-SBA/PSA)溶液中，25摄氏度下恒温5分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为6。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的豌豆凝聚素。
实施例3
将分子量为1万，糖基摩尔百分含量为30％的半乳糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于二硫化碳，配成重量百分浓度为0.5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在90％相对湿度、50摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径19.8±2.3微米。
将上述半乳糖糖基化有序多孔膜(孔径19.8±2.3微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的伴刀豆球蛋白/荧光标记花生凝聚素(Con A/FL-PNA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为194；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径19.8±2.3微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记伴刀豆球蛋白/花生凝聚素(FL-Con A/PNA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为8。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的花生凝聚素。
实施例4
将分子量为40万，糖基摩尔百分含量为0.5％的葡萄糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于甲苯，配成重量百分浓度为15％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在70％相对湿度、25摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径1.5±0.3微米。
将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径1.5±0.3微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的花生凝聚素/荧光标记扁豆凝聚素(PNA/FL-LCA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为116；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径1.5±0.3微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记花生凝聚素/扁豆凝聚素(FL-PNA/LCA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为4。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的扁豆凝聚素。
实施例5
将分子量为10万，糖基摩尔百分含量为5％的甘露糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于甲苯，配成重量百分浓度为5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在70％相对湿度、25摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径5.8±0.9微米。
将上述甘露糖糖基化有序多孔膜(孔径5.8±0.9微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的蓖麻毒蛋白/荧光标记雪铃花凝聚素(RCA/FL-GNA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为146；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径5.8±0.9微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记蓖麻毒蛋白/雪铃花凝聚素(FL-RCA/GNA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为6。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的雪铃花凝聚素。
实施例6
将分子量为1万，糖基摩尔百分含量为15％的半乳糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于甲苯，配成重量百分浓度为0.5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在70％相对湿度、25摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径13.5±2.0微米。
将上述半乳糖糖基化有序多孔膜(孔径13.5±2.0微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的马铃薯凝聚素/荧光标记大豆凝聚素(STA/FL-SBA)溶液中，25摄氏度下恒温120分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为176；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径13.5±2.0微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记马铃薯凝聚素/大豆凝聚素(FL-STA/SBA)溶液中，25摄氏度下恒温120分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为8。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的大豆凝聚素。
实施例7
将分子量为10万，糖基摩尔百分含量为5％的葡萄糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于氯仿，配成重量百分浓度为15％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在90％相对湿度、15摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径3.2±0.6微米。
将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径3.2±0.6微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的槐米凝聚素/荧光标记小麦菌凝聚素(SJA/FL-WGA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为135；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径3.2±0.6微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记槐米凝聚素/小麦菌凝聚素(FL-SJA/WGA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为5。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的小麦菌凝聚素。
实施例8
将分子量为10万，糖基摩尔百分含量为5％的甘露糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于氯仿，配成重量百分浓度为5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在90％相对湿度、15摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径7.8±1.3微米。
将上述甘露糖糖基化有序多孔膜(孔径7.8±1.3微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的蓖麻毒蛋白/荧光标记苦参凝聚素(RCA/FL-SFA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为150；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径7.8±1.3微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记蓖麻毒蛋白/苦参凝聚素(FL-RCA/SFA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为6。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的苦参凝聚素。
实施例9
将分子量为10万，糖基摩尔百分含量为15％的半乳糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于氯仿，配成重量百分浓度为5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在70％相对湿度、15摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径5.6±0.8微米。
将上述半乳糖糖基化有序多孔膜(孔径5.6±0.8微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的扁豆凝聚素/荧光标记蓖麻毒蛋白(LCA/FL-RCA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为144；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径5.6±0.8微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记扁豆凝聚素/蓖麻毒蛋白(FL-LCA/RCA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为7。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的蓖麻毒蛋白。
实施例10
将分子量为10万，糖基摩尔百分含量为5％的葡萄糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于二硫化碳与氯仿的混合溶剂(二硫化碳与氯仿体积比为1∶1)，配成重量百分浓度为5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在70％相对湿度、25摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径4.6±0.7微米。
将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径4.6±0.7微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的槐米凝聚素/荧光标记马铃薯凝聚素(SJA/FL-STA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为149；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径4.6±0.7微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记槐米凝聚素/马铃薯凝聚素(FL-SJA/STA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为5。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的马铃薯凝聚素。
实施例11
将分子量为10万，糖基摩尔百分含量为15％的甘露糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于二硫化碳与甲苯的混合溶剂(二硫化碳与甲苯体积比为1∶1)，配成重量百分浓度为5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在90％相对湿度、25摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径9.3±1.5微米。
将上述甘露糖糖基化有序多孔膜(孔径9.3±1.5微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的蓖麻毒蛋白/荧光标记扁豆凝聚素(RCA/FL-LCA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为171；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径9.3±1.5微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记蓖麻毒蛋白/扁豆凝聚素(FL-RCA/LCA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为7。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的扁豆凝聚素。
实施例12
将分子量为10万，糖基摩尔百分含量为15％的半乳糖基化的苯乙烯嵌段共聚物溶于甲苯与氯仿的混合溶剂(甲苯与氯仿体积比为1∶1)，配成重量百分浓度为5％的溶液。取1毫升上述溶液涂覆到清洁玻璃表面，在70％相对湿度、25摄氏度下成膜，获得具有有序多孔结构的薄膜。用扫描电子显微镜观察多孔膜，微孔直径8.2±1.3微米。
将上述半乳糖糖基化有序多孔膜(孔径8.2±1.3微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的扁豆凝聚素/荧光标记槐米凝聚素(LCA/FL-SJA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为163；将上述葡萄糖糖基化有序多孔膜(孔径8.2±1.3微米)浸入1毫升浓度均为0.1克/升的荧光标记扁豆凝聚素/槐米凝聚素(FL-LCA/SJA)溶液中，25摄氏度下恒温10分钟，取出多孔膜，测得荧光强度相对值为6。荧光强度的差别说明上述多孔膜可检测溶液中的槐米凝聚素。
Claims (3)
1.一种糖基化有序多孔膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将含糖嵌段共聚物溶于溶剂中，得到重量百分比为0.5～15％的聚合物溶液；
2)将上述聚合物溶液在相对湿度为50～90％，温度为5～50摄氏度下浇铸成膜，得到孔径在0.2～20微米的糖基化有序多孔膜；
所述含糖嵌段共聚物为：葡萄糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物、甘露糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物或半乳糖糖基化的苯乙烯嵌段共聚物，含糖嵌段共聚物中糖基的摩尔百分数为0.5～30％，含糖嵌段共聚物分子量为1～40万。
2.根据权利要求1所述的一种糖基化有序多孔膜的制备方法，其特征在于所述溶剂为二硫化碳、甲苯、氯仿中的一种或几种。
3.一种如权利要求1所述方法制备的糖基化有序多孔膜的用途，其特征在于糖基化有序多孔膜用于蛋白质检测。
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