CN101281157B - 过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极及其制备方法和应用，属于生物传感器领域。本发明的过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极包括过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白层和电极层，其中蛋白质分子固定于过渡金属取代的层状氧化钛纳米片之间，形成类似三明治结构，其组成式为Hb/Ti_2-yM_yO₄，Hb为蛋白质分子，y为掺杂实际组分，0.25≤y≤0.6，M为Co，Ni，Cu，Zn，Mn(III)，Fe(III)。本发明工艺简单，所需生产设备简单，易于实现工业化生产，并可在强酸溶液中使用。

Description

过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极

技术领域

本发明涉及一种过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极及其制备方法和应用，属于生物传感器领域。

背景技术

生物传感器是一种以生物活性物质(如酶、抗体、核酸、细胞等)为敏感基元，并将其固定在信号转换器上，构成生物转化器，并通过把生物化学信号转换为相应的物理化学信号的仪器。生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低等特点，其在生物、医学、环境监测、食品、医药与军事医学领域有着重要的应用价值，已引起世界各国的极大的关注。遗憾的是，在生物传感器中，蛋白质在电极表面通常易被吸附，可能造成构像变化和丧失活性，从而使得蛋白质在电极表面的电子传递能力受到抑制。为了要实现这些缺乏长程电子通道的蛋白质的直接电子转移，就需要达到如下目的：1)使蛋白质的活性中心尽可能的接近电极表面；2)使蛋白质分子适当变形但不失活；3)使电极表面与蛋白质分子充分接触；4)通过修饰电极打开电子通道。要达到这些目的方法有很多，其中一个比较有效的方法就是用适当的材料固定蛋白质于电极上，从而促进蛋白质与电极的直接电子传递。

很多材料，如聚合物膜、纳米材料、表面活性剂、类脂膜等都被用于固定蛋白质以制造生物传感器。在这些材料中，纳米结构的氧化钛材料也被广泛用于固定蛋白质制造生物传感器。氧化钛纳米材料具有高比表面积、强的吸附能力、良好的生物相容性以及优异的热和化学稳定性等一系列优良特性。许多课题组都报道了利用各种纳米结构氧化钛材料作为主体负载蛋白质制造生物传感器的方法。这些纳米结构，包括氧化钛纳米颗粒、氧化钛纳米管、介孔氧化钛等。由这些不同结构并且利用不同固定方法固定蛋白质的得到的生物传感器，其性能随着载体结构和固定方法的不同有所不同。目前，在本领域中，研究并制备基于纳米氧化钛固定蛋白质的生物传感器的活动依然十分活跃。其目的在于，一方面提高传感器的响应性能，另一方面也为拓展传感器的使用环境。

本发明在上述研究基础上，利用过渡金属部分取代的层状氧化钛固定蛋白，用此新制备的复合材料修饰电极，制备得到一类新颖的生物传感器，目前国内外还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极及其制备方法和应用。过渡金属元素和组分的不同可以得到一系列的修饰电极，通过调整氧化钛的组成，可以制备性能不同的修饰电极。

本发明中材料制备步骤依次如下：

(1)首先将碱金属碳酸盐，二氧化钛和过渡金属氧化物按化学式A_xTi_2-yM_yO₄称量，混合，其中，A为元素K，Rb，Cs；x，y为掺杂实际组分，0.7≤x≤0.9，0.25≤y≤0.6；M为Co，Ni，Cu，Zn，Mn(III)，Fe(III)。然后在600-1200℃下焙烧20-40小时，冷却至室温并研磨，重复高温反应一次并再次室温研磨，得到层状钛酸盐。

(2)上面所述的层状钛酸盐与1.0-2.0mol/L无机强酸(如盐酸、硝酸和硫酸)以固液比(10-20)g/L的比例进行质子交换反应，室温搅拌20小时以上，为了使质子化充分化，需要重复上述步骤三次以上，最后经过离心、水洗、在室温下风干，得到质子化的层状钛酸盐。

(3)(a)将所得产物与季铵碱按0.2-1∶1的酸碱摩尔比混合搅拌，反应1-8天后，将所得的悬浮液离心分离，去除下层沉淀后，得到上层半透明溶胶；

(b)或者将所得产物与氨基十一酸或氨基十酸或氨基十二酸按0.2-0.4∶1的质量比在水中混合，加热至沸后保持10-20分钟，然后剧烈搅拌，离心，热水洗，风干，得到产物按固液比1g-2g/1L在pH值为8.0-9.0的水溶液中分散，超声反应2小时以上，将所得的悬浮液离心分离，去除下层沉淀后，得到上层半透明溶胶。

(4)将上面(a)或(b)所得的半透明溶胶用0.5-2.0mol/L有机弱酸(如醋酸、柠檬酸、丙酸等)调pH至7.0-9.0，然后，将蛋白质分子与该调节后的半透明溶胶按1-10∶1的质量比在室温搅拌混合，逐滴加入有机酸直到引发沉淀生成过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白。

(5)将上述所得的过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白涂覆在电极(包括热解石墨电极、玻碳电极或者ITO电极)上，在空气中干燥，得到层状氧化钛固定蛋白修饰电极，并对其进行各种电化学分析。

此过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极包括过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白层和电极层，其中蛋白质分子固定于过渡金属取代的层状氧化钛纳米片之间，形成类似三明治结构，其组成式为Hb/Ti_2-yM_yO₄，Hb为蛋白质分子，y为掺杂实际组分，0.25≤y≤0.6，M为Co，Ni，Cu，Zn，Mn(III)，Fe(III)。

过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白层涂覆在电极层的表面。

所述的电极层包括热解石墨电极或玻碳电极或ITO电极。

所述的蛋白质分子优选血红蛋白。

本发明提供的过渡金属部分取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极的特点是：

1)在温和的条件下将蛋白固定在层状氧化钛的层中间。

2)修饰电极的结构图如图1所示。蛋白分子固定于氧化钛纳米片之间，类似于三明治的结构，蛋白和氧化钛纳米片的复合物涂覆在电极的表面。

3)本发明工艺简单，所需生产设备简单，易于实现工业化生产。

4)由于层状结构对生物分子的保护作用，使得该传感器可以在强酸溶液中使用分析。

5)通过调变氧化钛的组成，可以得到了一种响应相对更灵敏的生物传感器。例如：以K_0.8Ti_1.6Ni_0.4O₄和K_0.8Ti_1.2Fe_0.8O₄为初始材料制的酶电极，分别记为Hb/Ti_1.6Ni_0.4O₄和Hb/Ti_1.2Fe_0.8O₄，结果表明Hb/Ti_1.2Fe_0.8O₄的响应更为灵敏。

附图说明

图1过渡金属部分取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极结构示意图。

图2过渡金属部分取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极的小角X射线衍射图。

图3修饰电极的循环伏安图，扫描速度为0.06mV。a)为固定蛋白修饰电极；b)为氧化钛纳米片晶溶胶修饰电极。

图4在1.0mol/l pH分别为2.0，5.0，7.0的缓冲溶液中，在-400mV的电压下固定蛋白修饰电极对双氧水的时间电流响应曲线，每次加入双氧水的浓度为50μM。

图5原料组成为K_0.8Ti_1.2Fe_0.8O₄的层状氧化钛固定蛋白分子修饰电极的循环伏安图，扫描速度为0.06mV。

具体实施方式

通过实施例详述本发明，但本发明绝非仅局限于实施例。

实施例1  原料组成为K_0.8Ti_1.6Ni_0.4O₄的层状氧化钛固定血红蛋白分子修饰电极。

称取K₂CO₃ 2.0g、NiO 1.03g和TiO₂ 4.4g，混合，然后研磨均匀，放入石英坩埚中，直接敞口放入马弗炉中在1100℃下加热20小时，冷却后再次研磨均匀，再次放入马弗炉中在1100℃下加热20小时，冷却得到固体粉末。取上述粉末2.0g放入1.0mol/L盐酸200ml中搅拌24小时，进行质子交换反应，为了使质子化充分需要重复上述步骤三次，最后经过离心、水洗、在室温下风干，得到质子化的层状钛酸盐。取0.4g质子化的层状钛酸盐加入100ml含8ml 40％四丁基氢氧化铵的水溶液中，室温搅拌8天后，在8000rpm下离心分离，取上层溶胶备用。取氧化钛层板含量为0.5mg/ml的胶体10ml与2mg/ml血红蛋白溶液10ml混合，用1mol/l醋酸调节pH为5.5左右，引起自组装的产生，生成绛红色沉淀。热解石墨分别经粗细砂纸打磨，用导电胶将铂丝和热解石墨电极相连，然后再放置于130度的烘箱干燥3小时。将上述得到的红色沉淀在搅拌均匀，取0.35ml悬浮液直接滴涂到制备好的石墨电极上，在空气中干燥10-12小时，并得到了固定的血红蛋白修饰电极。小角X射线衍射在低角度出现比较强的衍射峰(图2)，说明血红蛋白固定在氧化钛无机层的中间。XRD分析表明对于此种样品，层间距为7.1nm，减去氧化钛单层厚度0.75nm，为6.35nm，略小于蛋白质分子(5.3×5.4×6.5nm)最大轴6.5nm，蛋白质在层间属于单层排列。图3a显示的是在浓度为1.0mol/l pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中此修饰电极的循环伏安曲线。由图表明此电极有一对形状相似，大小相当的氧化还原峰，分别在-204和-285mV，说明存在着可逆的电子转移。图4a显示此修饰电极在pH为5的缓冲溶液中对双氧水的电化学响应测试。测试在室温下的三电极电解池中进行，修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极。向工作电极加-0.4V的电压，直到得到稳态电流，然后向浓度为1.0mol/lpH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中连续的加入双氧水，记录电流随时间的变化。在测试之前，用高纯氮气向溶液中鼓泡30分钟除氧，测试时用氮气保护，以排除氧气的干扰。图3显示随着双氧水不断的加入，会产生阶梯状的电流跃迁，并且电流响应迅速，在5s中内就能达到95％的稳态电流。由图4可知，此修饰电极的灵敏度为27μAmM^-1cm^-2。

对比例1  纳米片晶溶胶直接修饰电极

将上述方法合成的由组成为K_0.8Ti_1.6Ni_0.4O₄的层状氧化钛剥离得到的纳米片晶溶胶直接滴涂在热解石墨电极上，在空气中过夜干燥，得到的修饰电极用于与实施例1中的酶修饰电极对比。由图3b所示，此电极在与实施例1相同条件下做循环伏安扫描，没有观察到还原峰和氧化峰，说明实施例1中的氧化还原峰来源于血红蛋白分子，而不是纳米片晶。

对比例2  原料组成为K_0.8Ti_1.6Ni_0.4O₄的层状氧化钛固定血红蛋白分子修饰电极在强酸溶液中对双氧水的电化学响应测试。

图4b、4c分别为pH值为2.0和7.0的溶液中修饰电极的对双氧水的电流响应曲线。由图可知随着pH值的减小，灵敏度反而变大。这是因为氧化钛片层对酶分子出色的保护，即使在pH值为2的情况下，依然能很好地保持活性。显示了此修饰电极在酸性体系中极好的应用前景。

实施例2  原料组成为Rb_0.8Ti_1.6Co_0.4O₄的层状氧化钛固定血红蛋白分子修饰电极

称取Rb₂CO₃ 23.1g、CoO 7.5g和TiO₂ 32.0g，混合，然后研磨均匀，放入石英坩埚中，直接敞口放入马弗炉中在1100℃下加热20小时，冷却后再次研磨均匀，再次放入马弗炉中在1100℃下加热20小时，冷却得到固体粉末。其他制备方法同实施例1，可以得到原料为Rb_0.8Ti_1.6Co_0.4O₄的层状氧化钛固定血红蛋白修饰电极。

实施例3  原料组成为K_0.8Ti_1.2Fe_0.8O₄的层状氧化钛固定血红蛋白分子修饰电极

称取K₂CO₃ 2.0g，Fe₂O₃ 2.3g和TiO₂ 3.5g，混合，然后研磨均匀，放入石英坩埚中，直接敞口放入马弗炉中在1100℃下加热20小时，冷却后再次研磨均匀，再次放入马弗炉中在1100℃下加热20小时，冷却得到固体粉末K_0.8Ti_1.2Fe_0.8O₄。取上述粉末2.0g放入1.0mol/L盐酸200ml中搅拌24小时，进行质子交换反应，为了使质子化充分需要重复上述步骤三次，最后经过离心、水洗、在室温下风干，得到质子化的层状钛酸盐。取1g质子化的层状钛酸盐加入100ml含10ml 40％四丁基氢氧化铵的水溶液中，室温搅拌10天后，在8000rpm下离心分离，取上层溶胶备用。取氧化钛含量为0.5mg/ml的胶体10ml与2mg/ml血红蛋白溶液10ml混合，用1mol/l醋酸调节pH为5.5左右，引起自组装的产生，生成绛红色沉淀。图5显示的是在浓度为1.0mol/l pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中此修饰电极的循环伏安曲线。由图表明此电极有一对形状相似，大小相当的氧化还原峰，分别在-200和-289mV，说明存在着可逆的电子转移。同时，氧化还原峰电流比实例1的大一倍左右。这是因为层板掺入Fe以后导电性增加导致的。

Claims (6)

1.一种过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极，包括过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白层和电极层，其特征在于过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白层中蛋白质分子固定于过渡金属取代的层状氧化钛纳米片之间，形成类似三明治结构，其组成式为Hb/Ti_1.2Fe_0.8O₄，或Hb/Ti_2-yM_yO₄，Hb为蛋白质分子，y为掺杂实际组分，0.25≤y≤0.6，M为Co或Ni或Cu或Zn或Mn(Ⅲ)或Fe(Ⅲ)；过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白层涂覆在电极层的表面；电极层为热解石墨电极或玻碳电极或ITO电极。

2.按权利要求1所述的一种过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极，其特征在于所述蛋白质分子为血红蛋白。

3.按权利要求1或2所述的过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)将碱金属碳酸盐，二氧化钛和过渡金属氧化物按化学式A_xTi_2-yM_yO₄称量，混合，其中，A为元素K，Rb，Cs；x，y为掺杂实际组分，0.7≤x≤0.9，0.25≤y≤0.6；M为Co或Ni或Cu或Zn或Mn(Ⅲ)或Fe(Ⅲ)，然后在600-1200℃下焙烧20-40小时；

(2)将步骤(1)所得产物与无机强酸进行质子交换反应；

(3)将步骤(2)所得产物与季铵碱按0.2-1∶1的摩尔比混合搅拌，反应后分离得到上层半透明溶胶；

(4)将步骤(3)分离所得产物用有机弱酸调pH至7.0-9.0，将蛋白质分子与该调节后的半透明溶胶按1-10∶1的质量比在室温搅拌混合，逐滴加入有机酸；

(5)将步骤(4)所得产物涂覆在电极上并干燥。

4.按权利要求1或2所述的一种过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极的制备方法包括下述步骤：

(1)将碱金属碳酸盐，二氧化钛和过渡金属氧化物按化学式A_xTi_2-yM_yO₄称量，混合，其中，A为元素K，Rb，Cs；x，y为掺杂实际组分，0.7≤x≤0.9，0.25≤y≤0.6；M为Co或Ni或Cu或Zn或Mn(III)或Fe(III)，然后在600-1200℃下焙烧20-40小时；

(2)将步骤(1)所得产物与无机强酸进行质子交换反应； 

(3)将步骤(2)所得产物与氨基十一酸或氨基十酸或氨基十二酸与水混合，加热至沸，然后剧烈搅拌、离心分离、水洗、干燥、分散、离心分离得到上层半透明溶胶；

(4)将步骤(3)分离所得产物用有机弱酸调pH至7.0-9.0，将蛋白质分子与该调节后的半透明溶胶按1-10∶1的质量比在室温搅拌混合，逐滴加入有机酸；

(5)将步骤(4)所得产物涂覆在电极上并干燥。

5.按权利要求3或4所述的过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的无机强酸为盐酸或硝酸或硫酸，浓度为1.0-2.0mol/L，固液比为10-20g/L。

6.按权利要求3或4所述的过渡金属取代的层状氧化钛固定蛋白修饰电极的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的有机弱酸为醋酸或柠檬酸或丙酸，浓度为0.5-2.0mol/L。 

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