CN101277711A - 来自白锥花(Gomphostema niveum)的生物活性水级分 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从印度东北部常见的名为白锥花(Gomphostema niveum)的草药的叶中获得的新的生物活性水级分，其可用于抑制疟疾寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的生长。本发明还涉及提取所述生物活性级分的方法。本发明还涉及使用这种生物活性水级分治疗疟疾的方法，以及这种生物活性水级分在治疗疟疾中的用途。

Description

来自白锥花(Gomphostema niveum)的生物活性水级分
技术领域
本发明涉及从印度东北部常见的名为白锥花(Gomphostemaniveum)的草药的叶中获得的新的生物活性水级分，其可用于抑制疟疾寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的生长。本发明还涉及提取这种生物活性级分的方法。本发明还涉及使用所述生物活性水级分治疗疟疾的方法，以及这种生物活性水级分在治疗疟疾中的用途。
背景技术
疟疾是虫媒疾病中最流行的，其造成每年报道的由恶性疟原虫导致(Depote et al.Trends in parasitology(20)，4，165-198，(2004))的4亿病例中超过两百万死亡(Greenwood et.al.，Nature 9415)，670(2002))。超过半数的世界人口生活在仍然具有感染疟疾风险的地区(Sachs et al.，Nature，(415)，686(2002))。重要抗疟化合物的衍生开始于1820年金鸡纳树皮粉(奎宁)的发现(Brooking，GB 106430，(1917))。接着，第一次世界大战后是在保存民族植物记录上进行了大量工作的阶段，其中奎宁仍然是用于治疗疟疾的药物的选择。在1940年，合成了另一种抗疟药物氯喹(Ringwald et al，Bulletin of theworld health organization，77(1)，34，(1999))，直到最近，它还是唯一用于治疗疟疾的药物。令人遗憾的是，在早期的成功之后，疟原虫尤其是恶性疟原虫对氯喹产生抗药性。对氯喹抗性的疟疾的治疗(White et al.Delaying anti-malarial drug resistance withcombination chemotherapy Parasitologia，(41)，301-308，(1999))是由相当昂贵且有时具有毒性的替代药物或药物组合(Tulp et.al，Drugdiscovery today(9)450，(2004))来完成的。另外，由于对大多数抗疟药物作用的代谢和作用机制了解不足，这些组合并不总是依据药物动力学原理。在过去数年中，从中国植物黄花蒿(Artimisinin annua)(Klayman，Science(228)，1049，(1985)，Bharel et al.Fitoterapia，(67)，387-399，(1996))中分离的基于植物的抗疟疾药物证明具有很高的抗恶性疟原虫活性。但是，由于其相对高的成本、符合GMP标准的生产有限以及对毒性的报道，青蒿素(Artemisinin)(一种内过氧化物倍半萜内酯)的应用多少受到了限制(Haynes et al.Curr.Opin.Infect.Dis，(14)，719-726，(2001))。目前青蒿素的全合成途径(US6,710,074(2004))对商业化生产来说过于复杂(Schmid et al J.Am.Chem.Soc.(105)，624-625，(1983))。目前，通过大规模从黄花蒿(sweet warwood)中提取来制备青蒿素，其衍生物例如蒿甲醚(artemether)、青蒿酯(artesunate)、蒿乙醚(arteether)和双氢青蒿素(dihydroartemisinin)系从纯化的提取物中半合成制备的。另外，在高质量材料的生产中也遇到了困难(Haynes et al.Curr.Opin.Infect.Dis.，(14)，719-726，(2001))。
因此，疟原虫对大多数药物的普遍抗性使得需要开发新的药物(Wiesner et al.Angew.Chem.Int.Ed.(42)，5274-5293，(2003))，其结构应该不同于传统化合物，其具有新的作用机制以克服抗性问题。最近，Ihara等公开了具有抗疟活性的由合成而来的化合物(US6,710,074(2002))。最近，还报道了不同类型的具有抗疟活性的化合物，例如取代的1，2，4三噁烷(US 6,737,438(2002))、类黄酮(WO2004000306(2003))、萘基异喹啉(US6,627,641(2003))、吲哚并喹唑(US6,531,487(2003))、三氧戊环类(trioxolanes)(US6,486,199(2002))、β-咔啉生物碱(US6,143,756(2000))、vocamine(WO9948501(1999))、乙酰葡萄糖胺衍生物(DE3220426(1983))等。最近许多专利例如US6,710,074、WO2004000319、US5,264,726、US2003212098、WO2004000306、EP1076057、WO9948501、US5,290,553、US6,143,756和US6,627,641公开了具有抗恶性疟原虫活性的来自天然来源(主要是植物)的化合物。因此，已证明用于寻找新抗疟药的民族药理学方法是更加可预测的。
作为正在进行的生物资源研究项目的一部分，我们筛选了来自东北部地区的大量植物以进行抗疟抑制研究。植物的选择主要基于多个标准，例如化学分类学数据、现场观察和随机采集。
疟疾是由疟原虫属(Plasmodium)的原生动物所引起的。因为其流行性、致病性和抗药性，所以它是人类所遇到的最为严重和广泛传播的寄生虫病。广泛用于治疗疾病的药物供应不充分以及缺乏负担得起的新药是抵抗疟疾中的限制性因素，其增强了对开发新药的研究的持续需要。
因此，需要开发新的活性化合物作为氯喹的替代物，尤其是青蒿素的替代物，所述青蒿素是分离自中国植物黄花蒿的基于植物的抗疟药。迫切需要使用新的民族药理学方法研究天然来源以寻找新的抗疟药，尤其是来自印度东北部的迄今为止尚未被筛选过的天然来源。另外需要开发从具有抗疟特性的植物提取物中提取、分离和鉴定生物活性成分的合适方法。最近开发的新的分离和表征技术以及新药理学检测方法的发展已经引起了对作为新药来源的植物的兴趣。但是，需要一种有前景的方法，以使用这些药剂作为模板以设计具有改进特性的新的衍生物。
发明目的
本发明的一个主要目的是从天然来源开发新的抗疟剂，其抑制氯喹抗性和氯喹敏感性疟原虫的生长。
本发明的另一个目的是研究印度东北部地区印度药用植物的抗疟特性，以治疗疟疾(所述植物的选择基于化学分类数据)。
更具体的一个目的是开发从印度药用植物中提取、分离和鉴定活性成分的简单有效的方法。
另一个目的是对粗提取物进行抗疟原虫生长的体外生物测定。
本发明的另一个目的是开发用于常规监测粗提取物的可重复的指纹HPLC方法。
本发明的另一个目的是提供适于鉴定、评价和监测体外抗疟活性的技术。
本发明的另一个目的是进行不同粗提取物的温度稳定性研究，这将有助于生物活性级分的保存。
另一个目的是评价多种施用途径，以及在体内分析中确定它们在体液中的稳定性、毒性和以足够浓度到达感染组织的能力。
发明内容
因此，本发明提供得自白锥花的叶的新的生物活性水级分。
本发明还提供用于制备来自白锥花的新的生物活性级分的方法，其包括风干所述植物的叶，使所述风干的叶粉末化，以及用水提取所述粉末，过滤所述提取物并在减压下浓缩至干以获得所述生物活性水提取物。
在本发明的一个实施方案中，进行3次水提取。
在本发明的另一个实施方案中，通过索氏提取方法(Soxhletextraction method)在回流温度下提取8个小时。
在本发明的另一个实施方案中，使用三次蒸馏水进行提取。
在本发明的另一个实施方案中，在约46℃下使用旋转蒸发器在约86psi的减压下将所述过滤后提取物浓缩至干。
在本发明的另一个实施方案中，通过液-液萃取法，根据极性的增加，使用选自己烷、乙醚、氯仿和乙醇的溶剂将所得的水提取物进一步分级分离，然后将所述提取物在约30℃的温度下和约150psi的减压下浓缩至干。
本发明还提供治疗疟疾的药用组合物，其包含白锥花的生物活性水提取物和一种或多种可药用添加剂。
在本发明的一个实施方案中，所述可药用添加剂选自载体、稀释剂、稳定剂、溶剂、调味剂等。
附图说明
图1是本发明粗提取物的HPLC谱。
图2是进一步分级分离后的所述粗提取物的总离子色谱图。
具体实施方式
恶性疟原虫对目前可用药物(例如氯喹)的日益增加的抗药性带来了对疟疾治疗的挑战，所述可用药物仍然是一种对疟疾的治疗，疟疾仍然是世界上的主要死亡原因之一。因此，迫切需要新的药剂用于治疗所述生物。
本发明提供了名为GN-W的生物活性水级分，其得自植物白锥花的叶，具有对氯喹抗性和氯喹敏感性疟原虫的抑制活性。根据本发明的另一个实施方案，提供了从晒干/风干的白锥花的叶中提取、分离和鉴定生物活性化合物的简单有效的方法。
根据本发明的另一个实施方案，还开发了用于常规监测粗提取物的指纹高效液相色谱(HPLC)方法。另外，本发明提供用于体外和体内生物评价粗提取物的合适技术。
本发明的另一个实施方案中，还研究了所述粗提取物在体外和体内抗疟生物测定情况下的协同效应。本发明还给出了所述生物活性级分与溶解性和温度相关的稳定性研究。本发明还描述了在体外生物测定中对多种施用途径、其在体液中的稳定性、毒性、以足够浓度到达感染组织的能力的评价。因此，本发明提供了名为GN-W的药物制剂，其显示出优异的抗疟活性。
尽管参考优选实施方案，已对本发明进行了详细描述，但是应理解本发明的以上描述可由本领域技术人员进行相当大的修改、变化和改动，这些应视为在本发明的范围和精神以内。
本发明的详细描述提供了得自植物白锥花的名为GN-W的生物活性水级分，其具有对氯喹抗性和氯喹敏感性疟原虫的抑制活性。
下面通过实施例显示生物活性水级分的制备工艺，其是举例性的，不作为对本发明范围的任何限制。
所述工艺包括以下步骤：
步骤1
为了分离和鉴定更有效的具有抗氯喹抗性疟原虫活性的天然化合物，我们对从印度药用植物白锥花的叶制备的水提取物进行系统的生物导引的分级分离。在Defence Research Laboratory，Texpur的帮助下，在6月和9月从印度东北部的Dhemaji Assam采集植物材料(叶)。在阴处将叶干燥48小时并磨成细粉末。
步骤2
使用索氏提取方法，在回流温度(100℃)用500ml三次蒸馏水提取100克的干叶8小时。分别使用500ml三次蒸馏水重复提取三次。然后过滤所述提取物，合并在一起，使用旋转蒸发器在减压下(86psi和46℃)浓缩至干。浓缩的级分称为GN-W(25克)。
步骤3
根据增加的极性使用不同溶剂如己烷(200ml)、乙醚(200ml)、氯仿(200ml)和乙醇(200ml)，通过液-液萃取将所述水提取物GN-W(25克)进一步分级分离。将各提取物分别合并，并在减压下(150psi，30℃)浓缩至干，并命名为GN-E(10克)、GN-C(2克)和GN-ET(6克)。测试所有这些级分对疟原虫的抑制作用。结果显示醚/氯仿级分显示出最大的抗疟原虫生物活性。醚/氯仿级分的抑制百分数是86-90％。可观察到有趣的特性，即乙醇级分不抑制疟原虫的生长。因此，我们猜想所述醚提取物可能含有一些能够抑制疟原虫生长的活性成分。因此，针对醚/氯仿级分(GN-E)使用柱色谱法分离生物活性成分。所制备的提取物和实验室过程在表1中列出。
表1
步骤4
为了从醚/氯仿提取物中纯化活性成分，进行了硅胶柱色谱法。任何本领域技术人员可操作此技术。将约10g的醚级分加载到硅胶(100克，200-400目)柱上，然后分析级分对恶性疟原虫的体外抑制活性。结果表明，使用乙酸乙酯中50-60％的己烷洗脱的柱级分能抑制疟原虫并因此具有治疗疟疾的能力。用于从醚部分洗脱不同成分的溶剂的量如下：己烷100-500ml(级分1-8)、在己烷中的10-20％乙酸乙酯25-50ml(1-2lit)、在己烷中的40-50％乙酸乙酯25-50ml(1-2lit)、在己烷中的50-60％乙酸乙酯25-50ml(1.5-2.5lit)。
步骤5
还进行了平行提取：取50-60克叶，使用己烷(100-200ml)、乙醚/氯仿(100-200ml)、氯仿(100-200ml)和乙醇(100-200ml)在回流温度下并且也在室温下提取8-10小时。然后过滤提取物，合并，使用旋转蒸发器在减压下(150-200psi，30℃)浓缩至干。比较浓缩级分的HPLC谱，还进行体外评价。
步骤6
使用UV检测器，在Waters HPLC仪器上进行所述提取物中成分的分离。还开发了用于所述粗提取物常规监测的指纹方法。HPLC条件如下：
柱：NOVAPAK C-18，   泵：Water’s LC-600
150×3.9MM，5MICRON  UV检测器：Water’s 486
流动相：             反相等度系统
乙腈∶水(60∶40)     流速：1MI/分
检测波长：254NM
步骤7
生物活性醚级分(GN-E)的液相色谱法和质谱分析。
精确称量样品的等分试样，稀释到100μg/ml的最终分析浓度。但是在某些情况下，必须将未指定量的全部成分重新溶解于1ml合适溶剂(如样品提交详细说明中所规定的)中，并进行100∶1稀释以用于分析。
LC条件(等度)
柱：Waters Symmetry C18 2.1×100mm
流动相：A＝水 B＝乙腈
梯度：等度60/40A∶B
流速：400μl/分，4∶1分流进样
注入体积：20μl
U.V.检测器：二极管阵列220-300nm(提取254nm)
LC条件(梯度)
柱：Waters Symmetry C18 2.1×100mm
流动相：A＝水+0.1％甲酸
        B＝乙腈+0.1％甲酸
梯度：在15分钟内5％到95％B，保持到20分钟，然后在30分钟重新平衡到5％B
流速：400μl/分，4∶1分流进样  注入体积：20μl
U.V.检测器：二极管阵列220-300nm(提取254nm)
MS条件
离子模式：电喷雾+ve
采集：80-800Da，1谱/秒，在35微秒时手动推进器(manual pusher)实时准确质量中心模式
锁定喷射(Lockspray)：参考质量(磺胺二甲氧嘧啶311.0814Da)
分辨率：6000FWHM  采样锥：40V
碰撞气体：氩气
碰撞能量：MS Survey＝5ev(无碎片)
MSMS条件
离子模式：电喷雾+ve
采集：80-800Da，1谱/秒，在35微秒时手动推进器实时准确质量中心模式
锁定喷射：参考质量(磺胺二甲氧嘧啶311.0814Da)
分辨率：6000FWHM  采样锥：40V碰撞气体：
碰撞能量：10eV到40eV(针对单个成分进行优化)
步骤8
抗疟活性的体外评价
将两株氯喹敏感株和一株分离自Jagadalpur地区患者的恶性疟原虫分离株适应并在体外维持。按照以前所述标准培养方法培养所述培养物。疟原虫生长在加入了添加10％人血清的RPMI 1640培养基的O+ve人RBC中。将所述细胞培养在37℃、5％CO2气氛中，24小时后检查寄生虫血，更换培养基。当寄生虫血超过10％感染有寄生虫的细胞时，向培养物中加入新鲜RBC。通过山梨醇裂解法使所述寄生虫的生长同步化，将同步化的环状体期寄生虫用于测试。体外测试在每孔添加了具有2％环状期寄生虫的10μl红细胞的100μl完全培养基中进行。所有测试以一式两份在96孔平底组织培养板中进行，将每种测试化合物制成倍比稀释液，单个对照孔中仅含有RPMI 1640和人血清添加物。通过检测孵育24小时后制成的姬姆萨(giemsa)染色血涂片，监测在各种测试化合物、氯喹存在下以及对照孔中的寄生虫生长。对200个无性生殖寄生虫中存在的成熟裂殖体进行计数，通过公式(1-Nt/Nc)×100计算裂殖体成熟抑制平均值，其中Nt和Nc分别代表测试和对照中存在的裂殖体的数目。通过使用商业统计软件包Sigmastat计算IC50、IC90和IC99值。
体外抗疟抑制研究
  化合物GN-WGN-E氯喹   IC50153.23μg/ml103.53μg/ml0.025μM   IC90752.29μg/ml388.24μg/ml0.046μM

Claims (13)

1.一种得自白锥花(Gomphostema niveum)叶的新的生物活性水级分。
2.一种用于制备来自白锥花的新的生物活性级分的方法，其包括风干所述植物的叶，使所述风干的叶粉末化，以及用水提取所述粉末，过滤所述提取物并在减压下浓缩至干以获得所述生物活性水提取物。
3.根据权利要求2的方法，其中进行三次所述水提取。
4.根据权利要求2或3的方法，其中所述每次提取通过索氏提取方法在回流温度下进行8个小时。
5.根据权利要求2或3的方法，其中使用三次蒸馏水进行每次提取。
6.根据权利要求2到5的方法，其中使用旋转蒸发器在约46℃的温度下、在约86psi的减压下将所述过滤后提取物浓缩至干。
7.根据权利要求6的方法，其中根据极性的增加使用选自己烷、乙醚、氯仿和乙醇的溶剂，通过液-液萃取将所得水提取物进一步分级分离，然后将所述提取物在约30℃的温度下和约150psi的减压下浓缩至干。
8.一种用于治疗疟疾的药物组合物，其包含白锥花的生物活性水提取物和一种或多种可药用添加剂。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述可药用添加剂选自载体、稀释剂、稳定剂、溶剂、调味剂、粘合剂、润滑剂等。
10.根据权利要求8或9的药物组合物，其中所述组合物优选通过将其成分分散于蜂蜜中而与蜂蜜相混合。
11.一种得自白锥花的新的生物活性级分，其基本上如前文所述并参考前述实施例和附图。
12.一种制备得自白锥花的新的生物活性级分的方法，其基本上如前文所述并参考前述实施例和附图。
13.一种含有得自白锥花的新的生物活性级分的药物组合物，其基本上如前文所述并参考前述实施例和附图。
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