CN101271070A - 微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置 - Google Patents

Abstract

一种微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，包括液芯波导毛细管、激发光光源、光电检测器、高压电源、电极、储液池、试样管、针孔光阑、滤光片和遮光板，该装置利用液芯波导现象，使用同一根液芯波导毛细管既用于毛细管电泳分离通道，又用于荧光信号传导。本发明中，激发光光源发出的光可不必经过透镜聚焦，而直接经针孔光阑垂直照射在液芯波导毛细管上；液芯波导毛细管出口端导出的荧光可不必经透镜收集，而直接经滤光片进入光电检测器。使用液芯波导毛细管，同时作为微流控毛细管电泳分离通道和光传导通道，最大限度地减少光学元件，简化光学系统，并使装置结构更加紧凑，从而为研制小型化的微流控分析仪器提供一条可行的技术路线。

Description

微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置

技术领域

本发明属于微流控分析技术领域，特别涉及一种微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置。

背景技术

微流控技术(或称微流控学)是在微米级结构中操控纳升(nl)至皮升(pl)体积流体的技术与科学[方肇伦，微流控分析芯片的制作及应用，化学工业出版社，2005，4]。以微流控学为核心技术的微流控分析已成为当代分析科学发展的前沿领域。微流控分析具有分析速度快、试样和试剂消耗少、集成化程度高、体积小等明显的优越性，已逐渐在化学和生物检验中发挥重要作用。

分析系统的微型化对检测器提出了相应的要求，更少的试样体积要求更灵敏的检测器与之相适应，微型化的分离、反应等系统要求微型化的检测器与之相匹配。荧光检测器具有灵敏度高、选择性好、响应速度快等特点，在微流控分析领域得到广泛应用。微流控分析荧光检测器常用的光源包括激光器和发光二极管(LED)，无论使用那种光源，常常需要复杂的光学系统，实现对光传播方向进行控制，有效消除噪声干扰，提高荧光收集效率。因此，若要减小荧光检测器的体积，必须将相应的光学系统进行微型化。目前报道的光学系统微型化方法，一种是通过微加工技术，将部分或全部光学元件直接加工在微流控分析芯片上[PatrickDumais，Claire L.Callender，Christopher J.Ledderhof，Julian P.Noad，Applied Optics，Vol.45，No.36，2006，9182-9190]，这种方法可以达到微型化和集成化的目的，但需要精细的芯片加工技术和昂贵的加工设备，使芯片成本大大提高；另一种方法是通过简化光学系统，如使用光纤[徐章润，王世立，樊晓峰，王福仁，方肇伦，分析化学，Vol.31，No.12，2003，1527-1530]、改变光路等[Jinglin Fu，Qun Fang，Ting Zhang，Xinhua Jin，Zhaolun Fang，Analytical Chemistry，Vol.78，No.11，2006，3827-3834]，达到检测系统小型化的目的，但仍需要较多光学元件，难以实现微型化。

液芯波导现象是由于光线在管道内发生全反射产生的。当管道内的液体折射率高于管道壁材质的折射率，且入射光线的入射角大于临界入射角时，光线在液体与管道壁的界面上发生全反射，在一定角度内的光将沿液芯轴向传播，即形成液芯波导现象。液芯波导作为一种光传导方式，已被应用于长光程吸收检测、化学发光检测、荧光检测、拉曼光谱检测等各种光学检测系统[Tim Dallas，Pumendu K.Dasgupta，Trends in Analytical Chemistry，Vol.23，No.5，2004，385-392]。在微流控分析领域，液芯波导已在微流控分析长光程吸收光度检测中得到成功应用[Wenbin Du，Qun Fang，Qiaohong He，Zhaolun Fang，Analytical Chemistry，Vol.77，No.5，2005，1330-1337]。但在简化光学系统，使微流控分析仪器小型化方面的应用研究仍然较少。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供一种微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置。通过使用同一根液芯波导管既作为毛细管电泳分离通道，又作为光源激发光和荧光信号分离、荧光信号传导的光学元件，建立体积小、灵敏度高的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置。

本发明的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，包括液芯波导毛细管、激发光光源、光电检测器、高压电源、电极、储液池、试样管、针孔光阑、滤光片和遮光板。其中光电检测器为光电倍增管、光电二极管或电荷耦合器件(CCD)，其光信号接收端连接遮光板，遮光板由不透光塑料或金属材料制成，厚度为0.1～2毫米，可打开和关闭光电检测器光窗，对光电检测器起保护作用；遮光板后紧贴滤光片，滤光片为光学干涉滤光片或有色玻璃滤光片；滤光片后紧贴储液池壁，储液池壁材质为透明塑料或玻璃材料，厚度为50微米～5毫米，其厚度越小，检测效果越好。

液芯波导毛细管的出口端插入储液池中，并接近储液池壁和光电检测器光窗，以提高检测灵敏度；液芯波导毛细管为透明毛细管或位于透明平板内的微管道，其外壁有涂层材料，管壁或其外壁的涂层材料的折射率小于管内溶液的折射率；管孔的横截面为圆形、椭圆形、矩形或梯形，管长为1厘米～2米，内径为1微米～1毫米，为提高分离分析速度，常使用长度不大于20厘米的液芯波导毛细管；液芯波导毛细管的入口端插入试样管中；储液池、试样管和液芯波导毛细管内部连通。

储液池的上方有一个注射器连接开口和电极插口，注射器连接开口为圆台型，可与医用注射器连接，通过注射器推动空气，在液面上施加压力，从而使溶液或凝胶进入液芯波导毛细管中，起到冲洗液芯波导毛细管或灌胶的作用。

液芯波导毛细管靠近储液池外壁处连接针孔光阑，针孔光阑距离液芯波导毛细管的出口1毫米～10厘米，针孔光阑距离液芯波导毛细管的入口端为液芯波导毛细管电泳有效分离长度；针孔光阑和液芯波导毛细管固定在同一基片上，确保针孔光阑上的针孔和液芯波导毛细管的相对位置保持不变；针孔由钻头或激光在金属或不透光塑料片上打孔而得，针孔的孔径为1微米～1毫米，针孔中心正对液芯波导毛细管轴线；针孔尽可能贴近于液芯波导毛细管，以减少光衍射对分离度的影响。

针孔光阑的另一侧正对激发光光源，激发光光源为发光二极管、激光器或发光二极管阵列，激发光光源发出的光可垂直射入液芯波导毛细管。

由荧光染料标记的样品溶液在直流电源电场的作用下，由液芯波导毛细管入口端流向出口端；激发光光源发出的光通过针孔光阑垂直照射液芯波导毛细管，荧光染料标记的样品经过针孔光阑时被激发而发射出荧光，入射角大于临界角的荧光在液芯波导毛细管管壁或外壁涂层上发生全反射，荧光沿液芯波导毛细管轴向传导，光源发出的光则垂直通过或被反射，不沿轴向传导，从而实现光源发出的光和激发产生的荧光的分离；从液芯波导毛细管传导出的荧光，通过储液池壁、滤光片由光电检测器接收。

本发明中液芯波导毛细管出口端导出的荧光可不必经透镜收集，而直接经滤光片进入光电检测器，使装置结构更加紧凑；也可由透镜或光纤收集后，经滤光片进入光电检测器。本发明根据液芯波导现象，采用由外壁有涂层材料的透明毛细管或位于透明平板内的微管道，设计制作本发明。

本发明的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，不但具有高灵敏度、选择性好、速度快的特点，实现对激发荧光传播方向进行控制，提高荧光收集效率，而且最大限度地减少使用光学元件，简化光学系统，从而为研制小型化的微流控分析仪器提供一条可行的技术路线。

附图说明

图1为本发明优选实施例的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置构造示意图。其中1激光光源(激光器)，2激光束，3针孔光阑，4外壁涂覆无定形聚四氟乙烯(Teflon AF)涂层的石英毛细管(液芯波导毛细管)，5储液池，6储液池壁(透明光窗)，7滤光片，8光电倍增管(光电检测器)，9试样管，10直流高压电源，11电源正极铂丝，12电源负极铂丝，13注射器连接开口，14遮光板。

图2为荧光信号在液芯波导管内传导的光路示意图。其中2激光束，3针孔光阑，15液芯波导毛细管通道，16激发荧光大于临界角80.05°的光线，17液芯波导毛细管管壁，18液芯波导毛细管管壁涂层(Teflon AF涂层)。

图3为安装图1实施例结构的分析系统分离检测ΦX174-Hae III酶水解液DNA标准样品的记录谱图。

图4为安装图1实施例结构的分析系统分离检测氨基酸混合试样的记录谱图。

具体实施方式

附图1为本发明优选实施例的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置构造示意图，光电检测器8为光电倍增管，其光信号接收端为遮光板14，遮光板14为厚度0.5毫米的黑色塑料片；遮光板14紧贴滤光片7，滤光片7为截止波长560纳米的长波通光学干涉滤光片；滤光片7紧贴储液池5，储液池5的储液池壁6材质为玻璃，厚度为0.5毫米，用环氧树脂胶将储液池壁6和储液池5粘接在一起，储液池壁6除与液芯波导毛细管出口端对应处外，其它地方涂刷黑色油漆，未涂黑的地方作为传导荧光的透明光窗；储液池5内插入液芯波导毛细管4的出口端，用环氧树脂胶固定，液芯波导毛细管4为外壁涂覆无定形聚四氟乙烯(TeflonAF)涂层的石英毛细管，内径为50微米，外径为365微米，长度为7厘米，液芯波导毛细管4的出口端正对作为透明光窗的储液池壁6，间距200微米；液芯波导毛细管4的入口端插入试样管9中，试样管9为0.2毫升的塑料离心管，储液池5、试样管9和液芯波导毛细管4内部连通；储液池5上方为注射器连接开口13。

直流高压电源10的电源正极铂丝11插入储液池5中，电源负极铂丝12插入试样管9中，直流高压电源10为实验室自制直流高压电源，可在液芯波导毛细管4内产生150伏/厘米的电场强度。

液芯波导毛细管4靠近储液池5外壁处连接针孔光阑3，针孔光阑3的针孔孔径为200微米，用麻花钻在金属片上打孔制得，金属片事先用黑色油漆涂成黑色，针孔光阑3距离液芯波导毛细管4出口端15毫米，和液芯波导毛细管固定在同一基片上，针孔光阑3上的针孔中心正对液芯波导毛细管轴线。

针孔光阑3的另一侧正对激光光源1，激光光源1产生的激光束2可垂直射入液芯波导毛细管4。

附图2为本发明中微流控电泳液芯波导检测装置中的光路示意图，在液芯波导毛细管通道15内，荧光染料标记的被测试样品溶液的折射率为1.33，液芯波导毛细管壁17的折射率为1.52，无定形聚四氟乙烯(Teflon AF)涂层18的折射率为1.31。当大于临界角80.05°的荧光信号光线16在通道内传导时，光线在无定形聚四氟乙烯(Teflon AF)涂层18内壁就会发生全反射现象，沿液芯波导毛细管4轴向传导。激光束2通过针孔3垂直照射到液芯波导毛细管4的管壁17和涂层18上，不会沿液芯波导毛细管4轴向传播；而激发产生的荧光，其中入射角大于80.05°的光线则沿液芯波导毛细管通道轴向传导，从而实现了光源激光2和荧光信号光线16的分离。

图3为安装了图1实施例装置的微流控毛细管电泳分析系统对ΦX174-Hae III酶水解液DNA标准样品分离检测的谱图，样品浓度为5ng/μL，使用中心波长532nm、功率10mW的二极管激光器作为光源，4.0％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为筛分介质，荧光染料为SYTOX Orange，分离场强150V/cm，11个DNA片段在5min内均被有效分离和检测，603bpDNA片段的理论塔板数达7.3×10⁶/米，检出限为0.4ng/μL(S/N＝3)。

图4为安装了图1实施例装置的微流控毛细管电泳分析系统对氨酸、亮氨酸、甘氨酸3种氨基酸混合试样的分离检测谱图。混合氨基酸样品中精氨酸、亮氨酸和甘氨酸的浓度分别为0.1、0.2、0.1μmol/L，使用中心波长473nm、功率10mW的二极管激光器作为光源，荧光染料为异硫氰酸荧光素，分离场强为320V/cm，3种氨基酸在3min内被基线分离，其中精氨酸的塔板高度为6.0微米，检出限为3.0nmol/L(S/N＝3)。

Claims (8)

1.一种微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，其特征在于：该装置主要包括液芯波导毛细管、激发光光源、光电检测器、高压电源、电极、储液池、试样管、针孔光阑、滤光片和遮光板，其中光电检测器的光信号接收端连接遮光板，遮光板后紧贴滤光片，滤光片后紧贴储液池壁，液芯波导毛细管的两端分别插入储液池和试样管中，高压电源的两个电极分别接铂丝插入储液池和试样管中，液芯波导毛细管靠近储液池外壁处连接针孔光阑；利用液芯波导现象，使用同一根液芯波导毛细管既用于毛细管电泳分离通道，又用于荧光信号传导。

2.根据权利要求1所述的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，其特征在于所述液芯波导毛细管：液芯波导毛细管为透明毛细管或位于平板上的透明微管道，其通道横截面为圆形、椭圆形、矩形或梯形，管长为1厘米～2米，内径为1微米～1毫米。

3.根据权利要求2所述的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，其特征在于所述液芯波导毛细管：其外壁涂覆涂料，当液芯波导毛细管道有样品液体流动时，由于涂料的折射率小于液芯波导毛细管内液体的折射率，所以大于临界角的入射光和液芯波导毛细管内产生的大于临界角的光，在液芯波导毛细管壁上发生内全反射，使其在液芯波导管内沿轴向传导。

4.根据权利要求1所述的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，其特征在于所述储液池壁：液芯波导毛细管出口端正对的储液池壁为透明塑料或透明玻璃材料，储液池壁的厚度为50微米～5毫米。

5.根据权利要求4所述的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，其特征在于所述储液池：储液池其上端的注射器连接开口为圆台形，可与注射器连接，通过注射器推动空气，在液面上施加压力，从而使凝胶或溶液进入毛细管中。

6.根据权利要求1所述的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，其特征在于激发光光源和针孔光阑：激发光光源为发光二极管、激光器或发光二极管阵列，激发光光源产生的光通过聚焦或直接通过针孔光阑上的针孔垂直照射在毛细管上，针孔光阑和液芯波导毛细管固定在同一基片上，并贴近液芯波导毛细管，针孔中心正对液芯波导毛细管内孔轴线，针孔的直径为1微米～1毫米。

7.根据权利要求1所述的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，其特征在于光电检测器：液芯波导毛细管出口端导出的激发荧光直接经滤光片进入光电检测器，或由透镜收集后经滤光片进入光电检测器；所用光电检测器为光电二极管、光电倍增管、电荷耦合器件。

8.根据权利要求7所述的微流控毛细管电泳液芯波导荧光检测装置，其特征在于液芯波导毛细管出口：液芯波导毛细管出口端应接近光电检测器光窗，以提高检测灵敏度。

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