CN101267835A - 降低含油佐剂和含表面活性剂抗原之间的干扰 - Google Patents

Abstract

疫苗组合物中包含脂肪族佐剂会引起难以包含某些抗原性组分，特别是包含表面活性剂组分的抗原。制备含有抗原和脂肪族佐剂的免疫原性组合物的方法包括在不存在表面活性剂的情况下基本纯化抗原。不能避免采用表面活性剂时，混合以下组分：(i)含有表面活性剂的抗原组分和(ii)脂肪族佐剂组分，得到所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000∶1的组合物。

Description

降低含油佐剂和含表面活性剂抗原之间的干扰

将本文引用的所有参考文献全文纳入作参考。

技术领域

本发明涉及生产含佐剂疫苗的领域。具体说，本发明涉及在生产基于含表面活性剂抗原的疫苗的过程中使用脂肪族佐剂。

背景技术

采用佐剂能提高对疫苗抗原的免疫应答是众所周知的(参见例如参考文献1和2)。许多年以来，批准人用的唯一佐剂是铝盐，但许多国家已经批准了含有MF59佐剂和RC-529佐剂的疫苗，包括意大利(在希龙公司(Chiron)的FLUAD^TM产品中)和阿根廷(在伯纳生物科技公司(Berna Biotech)的SUPERVAX^TM产品中)。处于后期人用实验阶段的其它佐剂包括胆固醇和皂苷、ISCOM、MPL^TM、AS04、病毒颗粒、SBA4等的混合物。

一些铝盐替代物的共有特征是存在脂肪族组分。例如，MF59佐剂包含鲨烯(油)，MPL^TM包含带有多个脂肪酸链连接于二葡糖胺主链的脱酰基化形式的单磷酰基脂质A。

本发明涉及避免这些脂肪族佐剂和含有表面活性剂组分的抗原之间可能发生的干扰。

发明概述

本发明者发现，疫苗组合物中的脂肪族佐剂可能与含有表面活性剂组分的抗原不相容。然而，在许多情况下，仍然需要合并脂肪族佐剂和抗原/表面活性剂混合物，本发明的目的之一是提供避免这样做的过程中可能产生的困难的方式。另一目的是提供合并佐剂和抗原的方法，该方法可以避免不相容。

为了避免使用一般采用表面活性剂纯化的抗原时的这些不相容问题，本发明的第一个方面提供了一种制备免疫原性组合物的方法，其中：(a)该组合物含有抗原和脂肪族佐剂；和(b)在不存在表面活性剂的情况下基本纯化该抗原。采用避免使用表面活性剂的替代方法来纯化抗原，可解决对脂肪族佐剂的任何不相容性问题。

然而，出于临床、历史或法规原因，可能无法在不采用表面活性剂的情况下纯化抗原，或者完全去除疫苗中的表面活性剂。在这种情况下，本发明通过降低组合物中油与表面活性剂的比例避免了干扰。典型MF59/HBsAg疫苗所含的油量远高于表面活性剂，油与表面活性剂的比例超过4000∶1(重量比)。本发明的目标是最大程度减少组合物中脂肪族佐剂的含量，在第二方面，本发明采用的油量为至多重量过量1000倍。因此，本发明提供了一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括合并(i)含有表面活性剂的抗原组分和(ii)脂肪族佐剂组分的步骤，以得到所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000∶1的组合物。相似地，本发明提供了免疫原性组合物，其中：(a)所述组合物含有抗原组分和脂肪族佐剂组分；(b)所述抗原组分含有表面活性剂；和(c)所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000∶1。

脂肪族佐剂

本发明的第一和第二方面都使用了脂肪族佐剂，即含有脂肪族分子的佐剂组分。典型的脂肪族佐剂含有可代谢油、脂肪酸和/或含有脂肪酸部分的分子。

两种优选脂肪族佐剂是称为′MF59′和′MPL′的佐剂。′MF59′是脂肪族佐剂，因为其含有作为可代谢油的鲨烯。′MPL′是脂肪族佐剂，因为它含有用多个脂肪酸链取代的二糖。除MF59以外，还可采用其它水包油乳剂佐剂。

因此，本发明优选组合物包含：(a)水包油乳剂，如含有鲨烯和聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(任选为山梨聚糖三油酸酯)的亚微米水包油乳剂；和/或(b)3-O-脱酰基化的单磷酰基脂质A。聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯也称为聚山梨酯80。

除′MF59′和′MPL′以外，可用于本发明的其它脂肪族佐剂包括但不限于：氨基葡萄糖苷磷酸酯衍生物；N-酰基-假二肽；来源于大肠杆菌(Escherichia coli)脂质A的可溶性佐剂′OM-174′；含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物；和无环合成脂质A类似物。

采用如MF59等水包油乳剂佐剂时，一般加入等体积的水性抗原组合物，以使该乳剂占组合物总体积的50％。采用3D-MPL佐剂时，剂量一般为25μg/ml-200μg/ml，如50-150μg/ml、75-125μg/ml、90-110μg/ml或约100μg/ml。通常每个剂量施用25-75μg的3D-MPL，如45-55μg，或每剂量约50μg 3D-MPL。如MF59等乳剂佐剂一般与抗原分开，在独立的容器中提供，在使用时临时混合；或者可以与抗原混合的状态提供乳剂佐剂。3D-MPL佐剂一般在销售给最终使用者之前就已经与抗原混合。

MF59

′Mp59′佐剂是由鲨烯、吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和Span 85(山梨聚糖三油酸酯)形成的水包油乳剂。使该乳剂微流化，以得到具有亚微米液滴尺寸的乳剂。MF59的制备最初报道于参考文献3，希龙公司生产和出售该产品。其它细节可参见参考文献2的第10章、参考文献1的第12章和参考文献4-6。MF59的体积组成为：5％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.5％Span 85。以重量计，这些比值变为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％Span 85。在本发明第二个方面，计算油：表面活性剂的比例时不计入MF59自身的表面活性剂含量，因为该比值基于抗原的表面活性剂含量。

MP59乳剂宜含有柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

其它水包油乳剂

作为MF59佐剂的替代物，可采用其它水包油乳剂。佐剂乳剂一般含有至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中油滴的直径通常小于5μm，一般为亚微米直径。可采用微流化床实现小液滴尺寸，以提供稳定的乳剂。优选小于220nm的液滴，因为可对它们进行过滤除菌。

乳剂可包括油，如来自动物(如鱼)或植物的油，而非矿物油。植物油的来源包括坚果、种子和谷粒。坚果油中，最常见的例子是花生油、大豆油、椰油和橄榄油。例如，也可采用获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种子油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油最常见，但也可采用其它谷粒如小麦、燕麦、大麦、水稻、画眉草、黑小麦等的油。虽然天然情况下种子油中不存在甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，但能以坚果油和种子油为原料，通过对其中适当的物质进行水解、分离和酯化来制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯净的油所必需的分离、纯化、皂化和其它步骤是本领域众所周知的。大多数鱼含有易于回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡等鲸油是可用于本发明的几种鱼油。以5-碳异戊二烯单元生化合成许多支链油，它们总称为类萜。鲨鱼肝油含有支链不饱和类萜，称为鲨烯、2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四己烯，它是本文尤其优选的类萜。鲨烯的饱和类似物鲨烷也是优选油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷，可购自商业来源，或者通过本领域已知方法获得。其它优选油是生育酚(见下)。可采用油的混合物。

可通过′HLB′(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂进行分类。本发明优选表面活性剂的HLB为至少10、优选至少15、更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂(通常称作吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，商品名为DOWFAX^TM，如直链EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚糖，其中重复的乙氧基(氧-1，2-乙烷二基)数量可以变化，特别感兴趣的是辛苯聚糖-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；如磷脂酰胆碱(卵磷脂)等磷脂；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(Brij 30)；和山梨聚糖酯(通常称作SPAN)，如山梨聚糖三油酸酯(Span 85)和山梨聚糖单月桂酸酯。乳剂中包含的表面活性剂优选为吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)、Span 85(山梨聚糖三油酸酯)、卵磷脂和TritonX-100。表面活性剂混合物可采用(例如)吐温80/Span 85混合物，或吐温80/Triton-X100混合物。

用于本发明的水包油乳剂佐剂包括但不限于：

·鲨烯、生育酚和吐温80的乳剂。该乳剂可包含磷酸盐缓冲盐水。它还可包含Span 85(如1％)和/或卵磷脂。这些乳剂可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯与生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳剂。可将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml这种溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯)的混合物混合，然后微流化该混合物，从而制备一种这类乳剂。得到的乳剂可含有亚微米油滴，例如平均直径为100-250nm，优选约180nm的油滴。

·鲨烯、生育酚和Triton去污剂(如Triton X-100)的乳剂。

·鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(″普朗尼克^TM L121″)的乳剂。可用磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4配制该乳剂。这种乳剂是可用于胞壁酰二肽的递送载体，已经在″SAF-I″佐剂[7](0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烷、2.5％普朗尼克L121和0.2％聚山梨酯80)中与苏氨酰基-MDP联用。还可采用不含Thr-MDP的佐剂，如″AF″佐剂[8](5％鲨烷，1.25％普朗尼克L121和0.2％聚山梨酯80)。优选微流化。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳剂。如参考文献9所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或Span80)的亚微米水包油乳剂。可包含添加剂，如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂肪族胺加到脱酰基皂苷上产生的GPI-0100，参见参考文献10)、二甲基二(十八烷基)溴化铵和/或N，N-二(十八烷基)-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)联结成螺旋胶束的乳剂[11]。

优选在临用前、递送时混合乳剂与抗原。因此，在包装或销售的疫苗中，一般将佐剂和抗原分开保存，在使用时配制成最终制剂。该抗原通常为水性形式，以便通过混合两种液体最终制备该疫苗。用于混合的两种液体的体积比可变(如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。

当组合物含有生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任一种，但优选α-生育酚。生育酚可以取数种形式，如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，此生育酚的优选盐是琥珀酸盐。

3D-MPL

3-O-脱酰基化的单磷酰基脂质A(3D-MPL；也被称为3脱-O-酰基化的单磷酰基脂质A或3-O-脱酰基-4′-单磷酰基脂质A)，它是已知佐剂。该名称表明，单磷酰基脂质A中的还原端葡糖胺的3位被脱酰基化。3D-MPL可由明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少对酸敏感的磷酰基和对碱敏感的酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞系的细胞，并刺激释放几种细胞因子，包括IL-1、IL-12、TNF-α和GM-CSF。最初在参考文献12中描述了3D-MPL的制备，该产品由科雷萨公司(Corixa Corporation)以商品名MPL生产并出售。其它详情可参见参考文献13-16。

3D-MPL可以取酰基化不同的相关分子(如具有3、4、5或6个酰基链，它们的长度可以不同)的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位(即2和2′位)碳上N-酰基化，3′位上也有O-酰基化。连接于碳2的基团化学式为：-NH-CO-CH₂-CR¹R^1′。连接于碳2′的基团化学式为：-NH-CO-CH₂-CR²R^2′。连接于碳3′的基团化学式为：-O-CO-CH₂-CR³R^3′。代表性结构是：

基团R¹、R²和R³各自独立地是-(CH₂)_n-CH₃。n值优选为8-16，更优选为9-12，最优选为10。

基团R^1′、R^2′和R³可以各自为：(a)-H；(b)-OH；或(c)-O-CO-R⁴，其中R⁴是-H或-(CH₂)_m-CH₃，其中m值优选为8-16，更优选为10、12或14。在2位上，m优选为14。在2′位上，m优选为10。在3′位上，m优选为12。因此基团R^1′、R^2′和R^3′优选为来自十二烷酸、十四烷酸或十六烷酸的-O-酰基。

R^1′、R^2′和R^3′均为-H时，3D-MPL仅含有3条酰基链(2、2′和3′位置上各有一条)。R^1′、R^2′和R^3′中仅有两个是-H时，3D-MPL可含有4条酰基链。R^1′、R^2′和R^3′中仅有一个是-H时，3D-MPL可含有5条酰基链。R^1′、R^2′和R^3′中没有一个是-H时，3D-MPL可含有6条酰基链。本发明所用的3D-MPL佐剂可以是含有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但混合物中优选包含具有6条酰基链的3D-MPL，具体说，保证6条酰基链的形式占3D-MPL总重的至少10％，例如≥20％、≥30％、≥40％、≥50％或更多。发现具有6条酰基链的3D-MPL是佐剂活性最高的形式。

因此，本发明组合物包含的3D-MPL的最优选形式是：

以混合物形式使用3D-MPL时，本发明组合物中3D-MPL的含量或浓度指混合物中合并的各种3D-MPL物质的总量或总浓度。

在水性条件下，3D-MPL可形成大小不同的胶束聚集体或颗粒，如直径＜150nm或＞500nm。本发明可以采用其中的一种或两种一起采用，可通过常规试验选择较好的颗粒。本发明优选采用较小颗粒(如小到足够产生澄清的3D-MPL水悬液)，因为其活性高[17]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm或小于150nm或小于120nm，平均直径甚至可小于100nm。然而，在大多数情况下，平均直径不小于50nm。这些颗粒小到足够适应过滤除菌。通过动态光散射的常规技术评估颗粒直径，该技术能揭示平均颗粒直径。称某颗粒的直径为x nm时，通常该颗粒在此平均值附近分布，但至少50％数量(例如＞60％、＞70％、＞80％、＞90％或更多)的颗粒直径在x±25％的范围内。

3D-MPL可单独用作佐剂，或者与一种或多种其它佐剂化合物联用。例如，已知将3D-MPL与QS21皂苷[18]；与QS21和水包油乳剂[19]；与磷酸铝[20]；与氢氧化铝[21]；或与皂苷和白介素-12[22]联用。

优选的佐剂混合物(特别是与HBsAg一起使用时)包括3D-MPL和铝盐的混合物，铝盐优选为磷酸铝。3D-MPL宜吸附于铝盐上。优选地，至少50％(以重量计)的3D-MPL吸附，例如＞60％、＞70％、＞80％、＞90％、＞95％、＞98％或更多。

目前使用的铝佐剂一般称为″氢氧化铝″或″磷酸铝″佐剂。然而，它们只是为了称呼方便，并不是对实际存在的化合物的准确描述(例如参见参考文献2的第9章)。为了与如3D-MPL等脂肪族佐剂联用，本发明可使用通常用作佐剂的″氢氧化物″或″磷酸盐″中的任何一种。

称为″氢氧化铝″的佐剂一般是羟基氧化铝盐，通常它至少部分为结晶。羟基氧化铝(化学式为AlO(OH))，通过红外(IR)光谱，可将其与如氢氧化铝Al(OH)₃等其它铝化合物区别开来，尤其是出现1070cm^-1处的吸收带和3090-3100cm^-1处的强肩(参考文献2的第9章)。

称为″磷酸铝″的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐。可通过沉淀获得它们，沉淀过程中的反应条件和浓度会影响磷酸取代该盐的羟基的程度。羟基磷酸盐的PO₄/Al摩尔比通常为0.3-0.99。由于存在羟基，可以将羟基磷酸盐与标准的AlPO₄区分开。例如，3164cm^-1处的IR谱带(例如加热到200℃)表明存在结构羟基(参考文献2的第9章)。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常为0.3-1.2，优选0.8-1.2，更优选0.95±0.1。磷酸铝通常为无定形，特别是羟基磷酸盐。典型佐剂是PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mg Al³⁺/ml。磷酸铝通常为颗粒。抗原吸附后颗粒的一般直径为0.5-20μm(如约5-10μm)。

磷酸铝的PZC与磷酸根取代羟基的程度逆相关，这种取代程度可能取决于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。还可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝酸性更强的PZC)，或加入如组氨酸缓冲液等缓冲液(使PZC碱性更强)，来改变PZC。用于本发明的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，如约5.7。

用于制备本发明组合物的磷酸铝溶液可含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)，但也不一定。磷酸铝溶液优选为无菌和无热原的。磷酸铝溶液可包括游离的水性磷酸根离子，例如浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM的磷酸根离子。磷酸铝溶液还可含有氯化钠。氯化钠浓度优选为0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml、1-20mg/ml、2-10mg/ml)，更优选为约3±1mg/ml。NaCl的存在有助于在抗原吸附前正确测定pH。

优选以水溶液形式使用磷酸铝，向溶液中加入3D-MPL(任选地，和抗原)(NB：通常将水性磷酸铝称为″溶液″，但从严格的物理化学观点来看，该盐不可溶，形成的是悬液)。优选将磷酸铝稀释至所需浓度，并保证在加入3D-MPL和/或抗原前为均一溶液。

N-酰基-假二肽

N-酰基-假二肽佐剂优选包含被中性或带电形式的酸基团酯化的羟基。酰基赋予假二肽脂肪族特征。该佐剂优选化学式为(I)：

其中：

-R₁是衍生自含有2-24个碳原子的饱和或不饱和的、直链或支链羧酸的酰基，所述羧酸未取代或用一种或多种选自下组的取代基取代：羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰基氨基、酰硫基和((C_1-24)烷基)硫基；

-R₂是衍生自含有2-24个碳原子的饱和或不饱和的、直链或支链羧酸的酰基，所述羧酸未取代或用一种或多种选自下组的取代基取代：羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰基氨基、酰硫基和((C_1-24)烷基)硫基；

-X是氢原子或者中性或带电形式的酸基团；

-Y是氢原子或者中性或带电形式的酸基团；

-A是氧原子、硫原子或亚氨基-NH-；

-B是氧原子、硫原子或亚氨基-NH-；

-m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

-n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

-p是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和

-q是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，

限制条件是取代基X或Y中至少一种为中性或离子形式的酸基团。

佐剂可以酸或盐形式，与有机或无机碱联用。

可用于治疗应用的成盐碱主要包括碱金属碱，如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂、铵盐；碱土金属碱，如氢氧化钙或氢氧化锶和镁盐；铁金属盐等；有机碱，如衍生自如甲胺、二乙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、苄胺、N-甲基苄胺、藜芦基胺、三甲氧基苄胺等伯、仲、叔胺的有机碱；碱性氨基酸，如赖氨酸和鸟氨酸或氨基糖。不可用于治疗应用的碱的例子是二甲马钱子碱、马钱子碱、鲱精胺、龙是肌碱、葡糖胺、N-甲基葡糖胺或N-甲基吗啉。

优选取代基X和Y选自：

-羧基[(C_1-5烷基]

-CH-[(CH₂)_rCOOH][(CH₂)_SCOOH]，其中：r是0、1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5

-膦酰基[(C_1-5)烷基]

-二羟基磷酰氧基[(C_1-5)烷基]

-二甲氧基磷酰基

-膦酰基

-羟基磺酰基

-羟基磺酰基[(C_1-5)烷基]

-羟基磺酰氧基[(C_1-5)烷基]

取代基X和/或Y为中性形式的酸基团时，指游离的羧酸、磺酸或磷酸形式。酸基团是带电形式时，指羧酸、磺酸或磷酸盐形式，即通过加入有机或无机碱形成的盐，所述碱优选为用于治疗应用的碱。当X和/或Y为羧基烷基、烯基双羧基、羟基磺酰基、羟基磺酰基烷基、羟基磺酰基-烷氧基、膦酰基烷基或磷酰基-烷氧基时，情况相似。

当m＝1和n＝0时，所述佐剂衍生自丝氨酸。当m＝2和n＝0时，所述佐剂衍生自高丝氨酸。如果m＝3且n＝0，指五-高丝氨酸化合物。如果m＝4和n＝0，指六-高丝氨酸化合物。

当p＝3和q＝1时，感兴趣的产物可以是瓜氨酸、鸟氨酸或精氨酸化合物。当p＝4和q＝1时，指高精氨酸或赖氨酸化合物。

R₁和R₂包括链长度不同、特性不同或相同的、饱和或不饱和的、直链或支链酰基衍生物，它们可以含有选自下组的一个或多个取代基：烷基、氨基、酰基氨基、羟基、烷氧基、酰氧基、酰硫基和烷硫基。

这类酰基化取代衍生物的例子有蓖麻油酰基、1，2-羟基硬脂酰基、2-羟基-3-甲基丁酰基、3-羟基-2-氨基戊酰基、棕榈酰基、反油酰基、油硬脂酰基(eleostearyl)、花生酰基、花生四烯酰基、顺9-二十碳烯酰基、山萮酰基、瓢儿菜基、8-甲基癸酰基、9-甲基癸酰基、二十二碳六烯酰基或二十碳五烯酰基。

优选佐剂化学式为(Ia)，其中A和B都是氧原子：

在化学式(Ia)中，X和Y优选为氢原子或膦酰基。

合适的佐剂化学式(Ia)包括：

-3-(3-十二酰氧基十四酰基氨基)9-(3-羟基十四酰基氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1和/或10-二氢磷酸酯，以及其与有机或无机碱形成的加成盐，

-3-(3-十二酰氧基-十四酰基氨基)9-(3-羟基十四酰基氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1，10-双(二氢磷酸)酯，以及其与有机或无机碱形成的加成盐，

-3-(3-羟基十四酰基氨基)9-(3-十二酰氧基十四酰基氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1，10-双(二氢磷酸)酯，以及其与有机或无机碱形成的加成盐，

-3-(3-十二酰氧基十四酰基氨基)9-(3-羟基十四酰基氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1-二氢磷酸酯，以及其与有机或无机碱形成的加成盐，

-3-(3-羟基十四酰基氨基)9-(3-十二酰氧基十四酰基氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1-二氢磷酸酯，以及其与有机或无机碱形成的加成盐，

-3-(3-羟基十四酰基氨基)9-(3-十二酰氧基十四酰基氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇10-二氢磷酸酯，以及其与有机或无机碱形成的加成盐。

参考文献23详细公开了合成化学式(I)的佐剂的方法，该方法包括以下步骤：分别通过易于进行酸解和氢解(hydrogolysis)的封端试剂保护二氨基酸(q+1)位和ω位的胺官能团；使游离的羧酸官能团与还原剂反应，产生相应的醇；使(q+1)位的胺官能团去保护，然后通过与化学式R₂OH的羧酸官能衍生物的反应酰基化，接着通过氢解释放游离的末端胺官能团，得到通式II的二氨基醇：

在惰性溶剂中肽缩合剂存在的情况下，将该氨基醇与通式III的ω-羟基、ω-氨基或ω-硫代氨基酸化合物一起缩合：

以提供化学式(IV)的二肽化合物：

如果有必要，其末端游离的醇官能团可以被保护(例如通过烷基或酰基，或任何其它合适的保护基)，或在偶联剂的存在下被取代(如果需要)。可对保护的醇进行催化氢化或其它脱保护处理，以获得通式I的衍生物。

参考文献23还详细公开了合成化学式(II)佐剂的方法，该方法包括以下步骤：分别通过易于进行酸解和氢解的保护试剂保护化学式H₂N(CH₂)_pCHNH₂(CH₂)_q+1COOH的二氨基酸(q+1)和ω位的胺官能团；使游离的羧酸官能团与还原剂反应，产生相应的醇；使(q+1)位的胺官能团去保护，然后通过与化学式R₂OH的羧酸官能衍生物的反应酰基化，接着通过氢解使末端胺官能团去保护，以获得通式II的氨基醇；在惰性溶剂中肽缩合剂存在的情况下，将该氨基醇与通式IIIa的ω-羟基氨基酸官能衍生物一起缩合：

其中X是化学式(RO)₂P-O的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰基，以得到化学式IVa的肽样化合物：

当R是易于进行氢解的基团时，如果需要，其中另一个醇官能团可以在偶联剂存在下用磷酸化试剂磷酸化。一方面可对保护的醇进行催化氢化，以使酰基R₂上任选存在的醇官能团去保护，另一方面，释放磷酸官能团，然后通过氢解使第二个任选存在的磷酸官能团去保护，以获得通式V的衍生物：

任选地进行下一步骤，与有机或无机碱反应形成盐。

最初使用的氨基酸构型决定了酰基氨基的手性中心的立体化学，而酰基氨基的立体化学取决于最初使用的脂肪酸构型。一个可以从具有L或D构型或者外消旋特性的二氨基酸开始。一个可以从L，D构型的羟化氨基酸或外消旋混合物开始。所有这类立体异构体或非对映异构体都包含在本发明的范围内。

特别优选的佐剂，尤其是单和双磷酸化的化合物，是称作″OM-294-MP″(化学式VI)和″OM-294-DP″(化学式VII)的化合物[23]：

OM-174

可通过化学合成获得OM-174，它保留了来自脂质A的三酰基结构单元。参考文献24-26更详细地进行了描述。参考文献26给出了OM-1745的化学式：

因此，和天然脂质A一样，OM-174具有1，4′-二磷酸化的β(1→6)-连接的二葡糖胺主链，。OM-174可以与胶束H1结构形成聚集体形式，即其中脂质分子包装时主链位于圆柱体表面上，而酰基链向内，圆柱体本身包装成六角形。可能不存在立体相。还可能不存在H₁₁相。

氨基葡萄糖苷磷酸酯衍生物

由于存在酰基链，氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)衍生物(如RC-529[27，28])是脂肪族佐剂。通常，这些衍生物可以为下述化学式[29]：

其中：

-X代表轴向位置或径向位置的氧或硫原子；

-Y代表氧原子或NH基团；

-″n″、″m″、″p″和″q″相同或不同，为0-6的整数；

-R₁、R₂和R₃，其可以相同或不同，是含有1-约20个碳原子的脂肪酰基残基，其中R₁、R₂或R₃之一任选为氢；

-R₄和R₅相同或不同，是氢或甲基；

-R₆和R₇相同或不同，是氢、羟基、烷氧基、膦酰基、膦酰氧基、磺基、磺氧基、氨基、巯基、氰基、硝基、甲酰基或羧基以及它们的酯和酰胺；

-R₈和R₉相同或不同，是膦酰基或氢，优选R₈和/或R₉中至少一个是膦酰基。

连接于正常脂肪酰基残基的3′立体发生中心的构型是R或S，但优选R。R₄或R₅连接的碳原子的立体化学可以是R或S。所有立体异构体、对映异构体和非对映异构体，以及它们的混合物，都落入本发明范围中。合适佐剂包括这些化合物的盐。

优选的AGP化合物是′RC-529′，可如参考文献30所述进行制备：

无环合成脂质A类似物

可用作本发明组合物的佐剂的脂质A类似物是ER-112022[31]，它是通过无环主链连接的磷脂二聚体：

ER-112022各单体单元含有3个间接结合于磷酸二酯的不同脂肪族基团。脂肪族基团包含10碳醚链，结合于醚链的不饱和12碳酰氧基链，和与磷酸二酯连接得较近的14-碳β-氧代-酰胺链。因此，与来自大肠杆菌(E.coli)的天然产生的脂质A相比，该化合物具有3个独特特征：(i)ER-112022不含环状糖主链；(ii)其次，磷酸酯是掺入结构主链界限内的磷酸二酯，与大肠杆菌脂质A上的磷酸酯不同；和(iii)结构对称(非糖主链上六个对称分布的脂肪酸)。

相似的有用化合物包括具有化学式XIV、XV或XVI的化合物，或其盐：

如参考文献32的定义，如′ER 803058′、′ER 803732′、′ER 804053′、ER 804058′、ER 804059′、′ER 804442′、′ER 804680′、′ER 804764′、′ER 803022′或′ER 804057′，例如：

含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物也可用作佐剂，如TLR4拮抗剂E5564[33，34]：

表面活性剂

本发明的第一个方面基本避免了在抗原纯化过程中采用表面活性剂，使得在本发明采用的抗原组分中未发现表面活性剂。然而，在第二个方面，采用表面活性剂，但相对于脂肪族佐剂其水平受到控制。

表面活性剂一般是非离子型表面活性剂，特别是已用于疫苗制剂的表面活性剂。优选有机表面活性剂。它们一般是环氧烷(如环氧乙烷)与脂肪醇、脂肪酸、烷基酚、烷基胺或含有至少一个活性氢原子的其它合适化合物的反应产物。在大多数表面活性剂中，最常见的醇、胺和酸的碳链长度为C₈-C₁₈。最常见的烷基酚是壬基酚和辛基酚。特别优选含有聚(氧乙烯)残基的表面活性剂。

例如，可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂(通常称为吐温)，尤其是聚山梨酯20和聚山梨酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，商品名为DOWFAX^TM，如直链EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚糖，其中重复的乙氧基(氧-1，2-乙烷二基)数量可变，特别感兴趣的是辛苯聚糖-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(Brij 30)；和山梨聚糖酯(总称为SPAN)，如山梨聚糖三油酸酯(Span 85)和山梨聚糖单月桂酸酯。

感兴趣的两种特定表面活性剂是Triton X-100和聚山梨酯20。因此，具体说，本发明第一方面的优选实施方式基本避免了采用这两种非离子型表面活性剂，优选基本避免采用任何非离子型表面活性剂。相似地，本发明第二方面的优选实施方式采用了含有这两种非离子型表面活性剂之一的抗原组分。

本发明特别适合采用聚山梨酯20。已经确定，这种表面活性剂能够安全地施用于人，包括在疫苗中的应用。

可通过′HLB′(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂进行分类。本发明表面活性剂的HLB优选为至少10、优选至少15、更优选至少16。

在本发明的第二方面，为了避免将大剂量的表面活性剂施用于患者，该组合物中表面活性剂的浓度优选应不大于50μg/ml，例如≤40μg/ml、≤35μg/ml、≤30μg/ml、≤25μg/ml、≤20μg/ml、≤15μg/ml、≤10μg/ml、≤5μg/ml等。优选≤20μg/ml的浓度。

抗原

本发明包括采用抗原。本发明特别适合使用通常采用表面活性剂纯化的抗原。这些抗原一般为亲脂性抗原。它们通常包含至少一个跨膜区，在体内该跨膜区有将抗原定位于脂质双分子层中的功能，例如在病原体表面上。本发明特别适合采用病毒表面抗原。

在本发明的第二个方面，该抗原组分包含表面活性剂。抗原和表面活性剂优选为复合物形式，而非简单的抗原和表面活性剂混合物。抗原/表面活性剂复合物包含含抗原的表面活性剂-稳定化的脂质体和非离子体(niosome)，它是由合成的非离子型两性化合物形成的囊泡。优选的抗原/表面活性剂复合物是在表面活性剂存在下纯化的颗粒型乙型肝炎表面抗原。参考文献35描述了重组HBsAg颗粒如何保留在其纯化过程中采用的吐温20(每100μg HBsAg至多25μg吐温20)。

因此，本发明第二方面采用的最优选的抗原是乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原，它是基本呈球形颗粒的形式(平均直径约为20nm)，包括含有磷脂和如聚山梨酯20等非离子型表面活性剂的脂质基质。在纯化过程中可将非离子型表面活性剂掺入颗粒中。

然而，在本发明的第一个方面，优选的HBsAg形式是不用非离子型表面活性剂纯化HBsAg的形式，以使HBsAg颗粒不掺入任何表面活性剂，从而避免了脂肪族佐剂的干扰。

乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的已知物质之一。HBV病毒颗粒由外部蛋白质外壳或衣壳包围的内部核心组成，病毒核心含有病毒DNA基因组。衣壳的主要组分是称为HBV表面抗原的蛋白质，或者更常称为是′HBsAg′，它一般是226个氨基酸的多肽，分子量为～24kDa。现有的所有乙型肝炎疫苗均含有HBsAg，当这种抗原施用于正常疫苗接种者时，它能刺激产生抗HBsAg抗体，从而保护不受HBV感染。

在疫苗生产中，可用两种方式制备HBsAg。第一种方法包括由慢性乙型肝炎携带者血浆纯化颗粒形式的抗原，因为在HBV感染过程中肝脏中合成了大量HBsAg并释放至血流中。第二种方式包括通过重组DNA方法表达蛋白质。本发明方法中采用的HBsAg是在酵母细胞中重组表达的。合适的酵母包括酵母(Saccharomyces)(如酿酒酵母(S.cerevisiae))、毕赤酵母(Pichia)(如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))或汉逊酵母(Hanensula)(如多形汉逊酵母(H.polymorpha))宿主。或者，可以用重组哺乳动物细胞(如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Bu3细胞等)、昆虫细胞(如采用杆状病毒载体)或植物细胞表达该抗原。然而，通常采用酵母表达。

酵母表达的HBsAg优选为非糖基化的。与天然HBsAg(即血浆纯化产物中的HBsAg)不同，酵母表达的HBsAg通常为非糖基化的，这是用于本发明的最优选的HBsAg形式，因为它具有高免疫原性，还可以在没有血液制品污染的风险的情况下制备。酵母表达的HBsAg颗粒可包含磷脂酰肌醇，这在天然HBV病毒体中是没有的。该颗粒还可包含无毒剂量的LPS，以刺激免疫系统[36]。

纯化HBsAg的许多方法是本领域所熟知的(例如参见参考文献37-62)。在这些方法中，本发明的第一个方面采用了未使用非离子型表面活性剂的方法。相反，本发明的第二个方面在纯化中采用了非离子型表面活性剂，以使表面活性剂掺入最终颗粒HBsAg产物中。在纯化开始时破坏重组酵母细胞的过程中，优选采用聚山梨酯20，以将表面活性剂引入HBsAg颗粒。

在破坏细胞后，优选的HBsAg纯化方法包括：超滤；大小排阻色谱；阴离子交换色谱；超速离心；脱盐；和过滤除菌。破坏细胞(例如用聚乙二醇破坏)后可沉淀裂解物，将HBsAg留在溶液中，准备进行超滤。在过滤除菌之前或之后，可能通过甲醛处理稳定HBsAg颗粒。随后可通过超滤或层析去除多余的甲醛。还可采用过滤除菌。

HBsAg优选来自HBV亚型adw2。

除′S′序列以外，表面抗原可包含所有或一部分前-S序列，如所有或一部分前-S1和/或前-S2序列。

可用于本发明的其它病毒表面抗原通常是来自包膜病毒的包膜糖蛋白。用于本发明的病毒表面抗原可包括但不限于：

-逆转录病毒科蛋白。逆转录病毒科包括慢病毒属和泡沫病毒属。感兴趣的病毒包括HTLV-I、HTLV-II、猫免疫缺陷病毒(FFV)、人体免疫缺陷病毒(HIV，包括HIV-I和HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、黑猩猩泡沫病毒和人泡沫病毒。

-副粘病毒科蛋白，如F蛋白。副粘病毒科包括(a)副粘病毒亚科，其包括副粘病毒属、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属，以及(b)肺炎病毒亚科，其包括肺炎病毒属。感兴趣的病毒包括副流感病毒(PIV)、人副粘病毒、牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、立百病毒、亨得拉病毒、马麻疹病毒(EMV)、狂犬病病毒和梅那格病毒(Menangle virus)。

-线状病毒科蛋白。线状病毒科包括马尔堡病毒属和埃博拉病毒属。

-冠状病毒科的突起糖蛋白。冠状病毒科包括冠状病毒属和环状病毒属。感兴趣的病毒包括人冠状病毒(包括SARS冠状病毒)、禽传染性支气管炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒、鼠肝炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪红细胞凝集型脑脊髓炎病毒、猪传染性肠胃炎病毒和皮蝇病毒。

-杆状病毒科蛋白，如G蛋白。杆状病毒科包括杆状病毒属、水泡病毒属、狂犬病病毒属、短时热病毒属、质型弹状病毒属和核型弹状病毒属。感兴趣的病毒包括水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒、莫科拉病毒、牛一日热病毒。

-披膜病毒科蛋白。披膜病毒科包括α病毒和风疹病毒。感兴趣的病毒包括辛德毕斯病毒、东方和西方脑炎病毒、塞姆利基森林病毒、风疹病毒、奥拉病毒、巴伴克病毒(Babanki virus)、巴马(Barmah)森林病毒avis-A、贝巴鲁病毒、巴基克里克病毒(Buggy Creek virus)、基孔肯雅病毒、沼泽地病毒、摩根堡病毒、格塔病毒、高地J病毒、科兹拉病毒(Kyzylagach virus)、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥科伯病毒(Ockelbo virus)、奥绒绒病毒、皮春纳病毒、罗斯河病毒、鹭山病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和沃达罗河病毒。

-黄病毒科的包膜(′E′)糖蛋白。黄病毒科包括黄病毒属、鼠疫病毒属和丙型肝炎病毒属。感兴趣的病毒包括登革热病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒、牛腹泻病毒和蜱媒脑炎(TBE)病毒。

-本扬病毒科蛋白。本扬病毒科包括本扬病毒属、内罗病毒属、白蛉病毒属、汉他病毒属和番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。感兴趣的病毒包括本扬病毒、布尼亚病毒、加州脑炎病毒、拉克锡病毒(La Cross virus)、汉坦病毒、辛诺柏病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、白蛉热西西里岛病毒和裂谷热病毒。

-沙粒病毒科蛋白。沙粒病毒科包括；淋巴细胞性绒毛膜脑膜炎病毒、伊派病毒和拉沙病毒。

-肝脱氧核糖核酸病毒科蛋白(包括HBsAg)。肝脱氧核糖核酸病毒科包括正肝脱氧核糖核酸病毒属和鸟类肝脱氧核糖核酸病毒属。除人乙型肝炎病毒外，此病毒科还包括地松鼠乙型肝炎病毒属、旱獭乙型肝炎病毒属、毛猴乙型肝炎病毒属、北极松鼠肝炎病毒属、鸭乙型肝炎病毒属、苍鹭乙型肝炎病毒属和罗斯鹅乙型肝炎病毒属。

-疱疹病毒科蛋白。疱疹病毒科包括单纯疱疹病毒属、水痘病毒属、玫瑰疹病毒属、巨细胞病毒属、鼠巨细胞病毒属、淋巴隐病毒属和拉地诺病毒属(Rhadino virus)。感兴趣的病毒包括如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)等人疱疹病毒。合适的抗原可选自gB、gC、gD和gH糖蛋白(如HSV中的糖蛋白)。特别优选HSV gD2。

-正粘病毒科蛋白。正粘病毒科包括流感病毒属和索戈托病毒属。优选来自流感病毒属(A、B或C型流感病毒)的抗原，包括表面抗原血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)。

一般用表面活性剂纯化这些病毒表面抗原，因此抗原组分可包含表面活性剂，特别是如果以含脂质的颗粒形式存在时。

本发明也可采用基于含有病毒表面抗原和异源抗原的杂交或融合蛋白的颗粒抗原。例如，已知将HBsAg序列与异源抗原融合，以便利用HBsAg的能力组装成颗粒。

例如，参考文献63报道了HIV-1 gp120与HBsAg的融合物，以得到自发组装成颗粒状的蛋白质，其颗粒大小和密度与天然HBsAg颗粒类似，其中脂质组成约占25％且每个颗粒含有约100个gp120。gp120能够在融合物中折叠成其天然构象，并保持其生物学活性。相似地，通过与HBsAg形成内部融合物可改进HIV gp41表位，融合蛋白在酵母中自身组装成22nm脂蛋白颗粒[64]。

还可将此方法用于疟疾疫苗。参考文献65报道，将来自疟疾gp190抗原的至多61aa的表位插入HBsAg序列中，表达的杂交颗粒可在动物中引发抗-gp190的免疫应答。参考文献66报道了一种蛋白质，该蛋白中含有16个重复的环孢子体蛋白的4单元序列与HBsAg一起作为融合蛋白表达。参考文献67报道，在酵母中产生由Pfs16与HBsAg融合组成的病毒样颗粒。参考文献68公开了环孢子体蛋白融合于HBsAg的杂交抗原。参考文献69公开了间日疟原虫(P.vivax)的裂殖子表面1蛋白的C末端区域的融合物，它形成了20-45nm大小的免疫原性颗粒。因此，以自身组装颗粒形式用HBsAg递呈疟疾抗原，是本领域所熟知的。

因此，本发明可采用含有病毒表面抗原和异源抗原的杂交抗原。异源抗原可以插入病毒表面抗原序列中，或者可融合于病毒表面抗原序列的N末端或C末端。如果天然病毒表面抗原可装配成颗粒(如HBsAg)，那么插入或融合都不会阻碍这种装配。

在这些杂交蛋白中，异源抗原可来自细菌、真菌、寄生物、病毒(但限定异源抗原不是HBsAg)等。杂交蛋白中可包含完整的异源抗原，但更常见是包含该抗原的抗原性片段。

具体说，当病毒表面抗原是HBsAg时，异源抗原可来自HIV、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)或卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。适用于制备HBsAg杂交体的HIV抗原包括包膜糖蛋白gp120或其抗原性片段[63]。适用于制备HBsAg杂交体的恶性疟原虫抗原可基于环孢子体表面抗原(″CSP″)的亚基，例如它们可包含3-20个重复的NANP基序(SEQ ID NO：2)，和/或它们可包含CSP的C-末端区域(但一般不含C末端的最后12个氨基酸)。例如，本发明可采用称为″RTS″的抗原，该抗原含有来自恶性疟原虫的NF54或7G8分离物的CSP的大部分C末端(氨基酸210-398，其包含19个NANP重复序列和氨基酸367-390处的T细胞表位区)，它通过HBsAg前S2部分的四个氨基酸与HBsAg的N末端融合。在酵母中表达时，RTS形成除蛋白质外还含有脂质(主要是磷脂)的颗粒。因此，RTS的序列可含有：(i)N末端甲硫氨酸残基；(ii)Met-Ala-Pro；(iii)对应于恶性疟原虫7G8的CS蛋白的氨基酸210-398或恶性疟原虫NF54的CS蛋白的氨基酸207-395的189个氨基酸；(iv)Arg或GIy；(v)来自乙型肝炎前-S2蛋白的Pro-Val-Thr-Asn；和(vi)HBsAg。来自7G8分离物的全长RTS的序列如参考文献70的SEQ ID NO：1所示(也参见参考文献71的图5)：

MMAPDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNA

NPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENNANNAVKNNNNEEPSDKHIEQYLKKIKNSISTEWSPCSVTCGNGIQ

VRIKPGSANKPKDELDYENDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSRPVTNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQS

LDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVC

PLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWF

VGLSPTVWLSAIWMNWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI(SEQ ID NO：1)

该杂交蛋白可以采用编码SEQ ID NO：1的序列在酵母中表达。优选杂交蛋白与正常HBsAg在酵母中共同表达。以前，这种方法过去已经用于RTS，共同表达的产物称为″RTS，S″。可以采用RTS∶S比例为约1∶4。优选在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达，所用质粒含有编码所述杂交蛋白的序列，并包含：(1)来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制编码序列的表达；和(2)该编码序列下游的ARG3转录终止子。该质粒一般还包含：(3)LEU2选择性标记物；(4)2μ质粒序列；和(5)在大肠杆菌(Escherichia coli)中有功能的复制起点。

RTS，S可与如血小板反应蛋白-相关性无名蛋白(TRAP)等其它疟疾抗原联用。与RTS，S联用的优选脂肪族佐剂包括水包油乳剂、3d-MPL和QS-21皂苷。

脂肪族佐剂和表面活性剂比例

在本发明的第二方面，组合物中脂肪族佐剂与抗原的表面活性剂的重量比小于1000∶1。

在MF59佐剂中，该重量比基于鲨烯含量。在抗原组分中含有0.1μg/ml表面活性剂的组合物中，鲨烯浓度小于100μg/ml。在抗原组分中含有1μg/ml表面活性剂的组合物中，鲨烯浓度小于1mg/ml。在抗原组分中含有10μg/ml表面活性剂的组合物中，鲨烯浓度小于10mg/ml，而在以MF59为佐剂的典型组合物中鲨烯浓度应为43mg/ml(即4300∶1)。

在3D-MPL佐剂中，重量比基于3D-MPL的总量，即包括可能存在的所有不同的酰基形式。在抗原组分中含有0.1μg/ml表面活性剂的组合物中，3D-MPL总浓度小于100μg/ml。在抗原组分中含有1μg/ml表面活性剂的组合物中，3D-MPL总浓度小于1mg/ml。

1000∶1的比值为最大值。为了进一步降低佐剂中油和抗原中表面活性剂之间干扰的可能性，可降低该比值。因此，该比值可≤500∶1、≤400∶1、≤300∶1、≤200∶1、≤100∶1、≤50∶1，或者甚至≤25∶1。比值≤100∶1时，抗原组分中含有10μg/ml表面活性剂的组合物中，油含量(如鲨烯或3D-MPL含量)可以≤1mg/ml。比值≤25∶1时，抗原组分中含有10μg/ml表面活性剂的组合物中，油含量(如鲨烯或3D-MPL含量)可以≤250μg/ml；相反，含有100μg/ml 3D-MPL的组合物中，其抗原部分含有不小于4μg/ml的表面活性剂。

该比例优选大于1.5∶1，例如≥2∶1、≥2.5∶1、≥3∶1、≥4∶1、≥5∶1或更高。

在3D-MPL中，优选比例为2.5∶1-25∶1，更优选为2.5∶1-10∶1，进一步更优选为2.5∶1-5∶1。因此，抗原组分中含有10μg/ml表面活性剂的组合物中，3D-MPL含量应该为25μg/ml-250μg/ml，优选为25μg/ml-100μg/ml，更优选为25μg/ml-50μg/ml；相反，含有100μg/ml 3D-MPL的组合物中，抗原中表面活性剂含量应该为4μg/ml-40μg/ml，优选为10μg/ml-40μg/ml，更优选为20μg/ml-40μg/ml。

免疫原性组合物

除了含有抗原和脂肪族佐剂(在第二个方面，低水平的表面活性剂)外，本发明组合物可含有载体、佐剂、赋形剂、缓冲液等，如下面进一步详述。这些非抗原性组分可以有各种来源。例如，它们可存在于生产过程中使用的抗原或佐剂材料之一中，或者可与这些组分分开加入。

优选的本发明组合物包含一种或多种药学载体和/或赋形剂。

为了控制张力，优选含有生理盐，如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可以是1-20mg/ml。

组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选属于280-320mOsm/kg的范围。以前报道，渗透压不会影响疫苗接种引起的疼痛[72]，但仍然优选将渗透压保持在此范围内。

本发明组合物可包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包含：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸盐缓冲液。缓冲液一般为5-50mM，优选5-20mM。

本发明组合物的pH通常为5.0-7.5，更一般为5.0-6.0以达到最佳稳定性，或者为6.0-7.0。因此，本发明方法可包括在包装到制剂容器之前调整散装疫苗的pH的步骤。含有白喉和破伤风类毒素的疫苗的pH优选≥6，以避免类毒素(尤其是白喉类毒素)毒性逆转的风险，因此含有类毒素和HBsAg抗原的疫苗的pH优选为6.0-7.0。对包含单价HBsAg的其它疫苗而言，可以接受pH＜6。

本发明组合物优选为无菌组合物。

本发明组合物优选为无热原组合物，例如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准衡量)，优选每剂量＜0.1EU。

本发明组合物优选为无谷蛋白的组合物。

如采用吸附的HBsAg时，最终的疫苗产品可能是外观混浊的悬液。这种外观意味着，不容易观察到微生物污染，因此，所述疫苗优选含有抗微生物剂。当疫苗包装到多剂量容器中这特别重要。优选包含的防腐剂是2-苯氧基乙醇和/或硫柳汞。然而，在本发明方法中推荐不采用含汞防腐剂，尽管在许多现有HBV疫苗中都有硫柳汞。然而，出于安全性考虑，优选最终组合物含有小于约25ng/ml汞。更优选地，最终疫苗产品不能检测到含有硫柳汞。本发明方法中，通常在将抗原制剂加入之前去除抗原制剂中的含汞防腐剂，或在制备用于生产该组合物的组分的过程中避免采用硫柳汞，从而实现上述目的。可对HBsAg进行透析(例如含有半胱氨酸)，以去除可能在HBsAg制备过程中采用的如硫柳汞等任何含汞防腐剂[73，74]。

在生产过程中，通常用WFI(注射用水)将组分稀释到所需最终浓度。

本发明组合物中任何磷酸铝的浓度(以Al³⁺的形式表示)优选小于5mg/ml，例如≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。

本发明组合物中HBsAg的浓度优选小于100μg/ml，例如≤90μg/ml、≤80μg/ml、≤70μg/ml、≤65μg/ml、≤60μg/ml、≤55μg/ml、≤50μg/ml、≤45μg/ml、≤40μg/ml等。一般约40μg/ml或约20μg/ml的浓度。

本发明组合物优选以0.5ml剂量施用于患者。应理解，0.5ml剂量包括正常差异，例如0.5ml±0.05ml。

本发明可提供适合包装成单独剂量的散装材料，所述单独剂量可销售给患者使用。上述浓度是通常最终包装剂量中的浓度，因此散装疫苗中的浓度可能更高(例如，可通过稀释降低到终浓度)。

本发明组合物通常为水性形式。

包装本发明组合物

混合所述抗原和佐剂后，本发明方法可包括取出0.5ml混合物样品并包装到容器中的步骤。在多剂量情况下，取出多个剂量并包装到单个容器中。如上所述，在另一种安排下，所述抗原和佐剂分开包装，在临用前临时混合。

本发明方法可包括将疫苗包装到容器中待用的额外步骤。合适容器包括药瓶和一次性注射器(优选无菌注射器)。

当本发明组合物包装到药瓶中时，它们优选由玻璃或塑料制成。优选在加入所述无菌组合物之前对所述药瓶进行无菌处理。为了避免乳胶-敏感型患者的问题，优选用无乳胶塞密封所述药瓶。药瓶可包含单个剂量的疫苗，或者可包含一个以上剂量(′多剂量′药瓶)，例如10个剂量。采用多剂量药瓶时，应在严格的无菌条件下用无菌针头和注射器抽出各个剂量，小心避免污染药瓶内容物。优选药瓶由无色玻璃制成。

药瓶可以有配合的帽(如针头锁接(Luer lock))，以便将预填充的注射器插入帽中，可将注射器内容物注入药瓶中，，然后将药瓶内容物抽回注射器中。从药瓶上取下注射器后，连接针头，将该组合物施用于患者。帽优选位于某密封物或覆盖物内，使得在进入该帽前，必须去除该密封物或覆盖物。

优选将组合物包装到注射器中，注射器通常不连有针头，但也可提供单独的针头，以便与注射器组装和一起使用。优选安全针头。一般是1-英寸23-号、1-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头。注射器可装有剥离型标签纸，上面打印着内容物的批号和过期日期，以帮助保存记录。注射器的活塞优选带有抑止装置，以防止该塞子在抽吸过程中意外脱落。优选丁基橡胶活塞抑止装置。该注射器可带有乳胶橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。该注射器通常带有尖端帽，以便在连接针头之前密封尖端，尖端帽优选由丁基橡胶制成。如果分开包装注射器和针头，那么该针头优选装入丁基橡胶护罩。优选灰色丁基橡胶。优选的注射器是商品名为″Tip-Lok″^TM的注射器。

采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用硼硅玻璃而非钠钙玻璃制成的容器。

将组合物包装到容器中后，将该容器封装到如纸板箱等箱子内进行销售，该箱子标有疫苗的详情，如商品名、疫苗中抗原的列表(例如′乙型肝炎重组物′等)、容器说明(例如′一次性预填充替普录克(Tip-Lok)注射器′或′10×0.5ml单剂量药瓶′)、其剂量(例如′各自含有一个0.5ml剂量′)、警告(例如′仅限成年人使用′或′仅限儿童使用′)、过期日期、适应症(例如′对年龄大于15岁的肾功能不全(包括血液透析前和血液透析)患者对所有已知亚型引起的乙型肝炎病毒(HBV)感染产生主动免疫′等)、专利号等。各箱子可含有一个以上的包装疫苗，例如五个或十个包装疫苗(具体是药瓶)。如果疫苗包含在注射器中，那么该箱子可显示注射器的图片。

该疫苗可与宣传单一起销售(例如在同一个箱子中)，所述宣传单包括疫苗详情，例如给药说明书、疫苗内的抗原详情等。说明书还可含有警告，例如准备肾上腺素溶液，以预防注射疫苗后的过敏反应等。

包装疫苗优选储存于2℃-8℃。不应冷冻。

治疗和施用疫苗的方法

本发明组合物适合施用于人类患者，本发明提供了引起患者免疫应答的方法，所述方法包括将本发明组合物施用于患者的步骤。

本发明还提供了用于药物的本发明组合物。

本发明还提供了(i)在不存在表面活性剂的情况下基本纯化的抗原和(ii)脂肪族佐剂，在生产施用于患者的药物中的应用。

本发明还提供了(i)包含表面活性剂的抗原组分和(ii)脂肪族佐剂在生产施用于患者的药物中的应用，其中(ii)中所述脂肪族佐剂与(i)中所述表面活性剂的重量比小于1000∶1。

本发明免疫原性组合物优选为疫苗，例如用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染的疫苗。在第一次免疫6周后测定，接受本发明组合物的患者的血清抗-HBsAg GM效价优选≥500mIU/ml。更优选地，12个月后测定时，该效价≥500mIU/ml。

该组合物特别适用于现有含佐剂疫苗(如ENGERIX B^TM产品)无效的患者，以保护其免于感染乙型肝炎病毒和/或治疗其乙型肝炎病毒感染。该组合物特别适合的患者亚群包括：免疫削弱患者；血液透析患者；血液透析前患者；肾功能不全患者；肾衰竭患者；需要血液透析之前的早期肾衰竭患者；等待肝移植(例如在排队名单中)的患者；末期肾衰竭患者；已接受器官移植(特别是肝移植)的患者，例如第一次施用本发明疫苗之前6个月接受器官移植的患者；正在接受(或已接受，例如在第一次施用本发明疫苗前6个月)乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)治疗的患者；HLADQ2单体型患者[75]；HLA DR3单体型患者[75]；HLA DR7单体型患者[75]；具有HLA等位基因DQB 1*0202的患者[76]；感染HIV的患者；慢性HBV携带者；最近接受输血的患者；接受免疫抑制药物的患者；AIDS患者；有腹水的患者；硬化症患者；脑病患者；接受干扰素特别是ifn-α治疗的患者；吸烟患者；吸雪茄烟的患者；体重指数≥30kg/m²的患者；和接受HBsAg疫苗但没有发生血清转变的患者(例如，标准的初步给药方案，如施用3剂ENGERIX B^TM后他们的血清抗-HBsAg效价＜10mIU/ml)。

这些患者肌酸酐清除率可能小于30ml/min(正常健康范围是男性～100-140ml/min，女性90-130ml/min)。患者优选至少15岁，例如15-40岁、15-60岁、40-60岁、或者甚至超过60岁。年龄超过55岁的患者无论存在任何疾病，均可有用地治疗。

本发明组合物可通过肌肉内注射来施用，例如三角肌内注射。

当本发明组合物包含铝基佐剂时，组分可能在储存期间沉淀下来。因此，在施用于患者前，应将该组合物摇匀。摇匀的组合物是混浊的白色悬液。

本发明优选方法和疫苗

制备免疫原性组合物的优选方法包括以下步骤：混合(i)包含聚山梨酯20的HBsAg组分和(ii)含有吸附于磷酸铝的3D-MPL的佐剂组分，得到3D-MPL与聚山梨酯20的重量比小于1000∶1的组合物。

优选的免疫原性组合物是满足以下条件的组合物：(a)该组合物包含HBsAg、聚山梨酯20、3D-MPL和磷酸铝佐剂；和(b)3D-MPL与聚山梨酯20的重量比小于1000∶1。3D-MPL和HBsAg优选吸附于磷酸铝。HBsAg浓度为约40μg/ml。3D-MPL浓度为约100μg/ml。Al³⁺浓度为约1mg/ml。

本发明的另一种优选组合物包含(i)由酿酒酵母(S.cerevisiae)纯化的HBsAg，和(ii)含有磷酸铝和3D-MPL的混合物的佐剂。HBsAg浓度为约40μg/ml。3D-MPL浓度为约100μg/ml。Al³⁺浓度为约1mg/ml。HBsAg包含聚山梨酯20，油∶表面活性剂重量比(即3D-MPL∶聚山梨酯20重量比)为2.5∶1-100∶1，即聚山梨酯20的浓度为1μg/ml-40μg/ml(即每100μg HBsAg含有2.5μg-100μg聚山梨酯20)。该比例优选为2.5∶1-25∶1，即聚山梨酯20的浓度为4μg/ml-40μg/ml。3D-MPL和HBsAg均吸附于磷酸铝。

概述

术语“含有”包括“包含”以及“由…组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

术语″基本上″不排除″完全″，如″基本上不含″Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语″基本上″。

术语“约”与数值x平均值相关，例如x±10％。

除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以先相互混合，然后将混合的组分再与第三种组分混合等。如上所述，各组分可以在生产过程中混合，或临用前混合。

将抗原描述为″吸附″于佐剂时，优选至少50％(重量比)的该抗原被吸附，例如50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更多。优选的是，HBsAg完全吸附，即上清液中检测不到。

当在细胞培养中使用动物源(特别是牛)材料时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)、特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。

丁基橡胶包括氯丁基橡胶和溴丁基橡胶。

应理解，可离子化基团可以本文化学式中所示的中性形式存在，或者可以带电形式存在，这取决于pH。因此，磷酸基团可以写作-P-O-(OH)₂，此化学式仅代表中性磷酸基团，本发明还包括其它带电形式。相似地，糖环可以开放或闭合的形式存在，虽然本文结构式中显示了闭合形式，但本发明还包括开放形式。

本发明的实施方式

研究了三种不同HBsAg制剂：

·在酿酒酵母细胞中表达、用非离子型表面活性剂纯化的HBsAg。

·在汉逊酵母(Hanensula)细胞中表达，用非离子型表面活性剂纯化的HBsAg。

·在CHO细胞中表达、含前S2序列、不用表面活性剂纯化的HBsAg。

研究了两种不同佐剂：

·氢氧化铝(1mg/ml)

·用柠檬酸盐缓冲液配制的MF59(13mM)

制备六种制剂，各自含有20μg/ml HBsAg，0.15M NaCl和0.01％硫柳汞(merthiolate)：

	A	B	C	D	E	F
							HBsAg	CHO	CHO	汉逊酵母	汉逊酵母	酿酒酵母	酿酒酵母
佐剂	氢氧化铝	MF59	氢氧化铝	MF59	氢氧化铝	MF59
							NaCl	0.15M	0.15M	0.15M	0.15M	0.15M	0.15M
硫柳汞	0.01％	0.01％	0.01％	0.01％	0.01％	0.01％
							表面活性剂	-	-	+	+	+	+

已报道，MF59能提高灵长动物对重组HBsAg的抗体应答[77]。用制剂A-D免疫非洲绿猴。每组6只猴子在第0天和第28天接受肌肉内免疫。在时间0点采血，然后每2周采血一次，直到第8周，用ELISA测定抗-HBsAg效价(GMT)。将各组第14天的效价值标准化至1.0，标准化后的结果如下：

	A	B	C	D
					宿主	CHO	CHO	酵母	酵母
佐剂	氢氧化铝	MF59	氢氧化铝	MF59
					表面活性剂	-	-	+	+
第14天	1.0	1.0	1.0	1.0
					第28天	0.9	0.8	1.3	0.4
第42天	19.2	159.8	108.8	85.2
					第56天	10.8	32.6	61.3	24.5

观察第42天和第56天效价，这些数据显示，对CHO-表达抗原，MF59佐剂能比铝佐剂更显著地提高了效价(第42天分别提高160倍与20倍)，但汉逊酵母表达抗原的情况正好相反(第42天分别提高85倍与110倍)。

采用制剂B、E和F以狒狒进行相似实验。在第一次注射14天后测定相对于F组值的GMT值，如下所示：

	A	B	E	F
					表面活性剂	-	-	+	+
佐剂	氢氧化铝	MF59	氢氧化铝	MF59
					第14天	-	13.5	4.5	1.0

在本文中，虽然预计会提高应答(B组和参考文献77)，但用MF59代替铝佐剂导致GMT应答较低(比较E组和F组)。

采用制剂E和F第一次注射28天后，比较猕猴、非洲绿猴和C3H小鼠的抗-HBsAg应答(NB：小鼠接受60％HBsAg剂量)。除了测定GMT值以外，还测定应答者的数量，即效价＞10mIU/ml的动物数。相对F组数据进行标准化后的结果如下：

因此，与小鼠相反，对酿酒酵母-表达的HBsAg而言，在灵长动物中用MF59作为佐剂导致GMT值和应答者水平显著下降。

最终，在血清阳性反应的非洲绿猴中检测用制剂E和F加强免疫接种产生的GMT提高。在加强免疫前和加强免疫28天后测定效价，效价提高如下：

组	佐剂	提高(x)
			E	氢氧化铝	91.5x
F	MF59	19.1x

除了比氢氧化铝佐剂引起的提高倍数低以外，施用加强免疫剂量28天后，MF59产生的GMT值也较低。

因此，总体来看，与氢氧化铝相比，在灵长动物中对酵母表达的HBsAg而言MF59似乎是较差的佐剂，但对CHO-表达的HBsAg而言是较佳的佐剂。这些结果可解释为(a)由酵母纯化的HBsAg中残留的表面活性剂和(b)MF59佐剂中的过量鲨烯油之间的相互作用。作为油，鲨烯在水性条件下与表面活性剂相作用，反之亦然，建议抗原中的表面活性剂与佐剂中的油不相容。可在不用去污剂的情况下纯化HBsAg(例如，在CHO-表达材料中)，或保证油的过量程度不至于干扰抗原中的表面活性剂，从而解决这种不相容性。

在以MF59为佐剂的HBsAg组合物中，将一体积的MF59与一体积的抗原溶液混合。因此，在100ml体积中，含有50ml MF59和50ml HBsAg溶液。此100ml含有2.15g来自MF59的鲨烯，HBsAg浓度为40μg/ml，它含有2mg HBsAg。每100μgHBsAg中聚山梨酯20浓度为25μg[35]时，这100ml含有0.5mg聚山梨酯20。以MF59为佐剂的疫苗中油∶表面活性剂比例一般是4300∶1。通过将过量的油减少到小于1000∶1，可大大降低佐剂中油和抗原中表面活性剂的相互作用，从而减少干扰。

应理解，仅以举例方式描述了本发明，可以在不超出本发明范围和构思的情况下进行修改。

参考文献(将其内容纳入本文作参考)

[1]Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols(疫苗佐剂：制备方法和研究方案)(Methods in Molecular Medicine series(分子药物丛书)第42卷)。ISBN：1-59259-083-7。O′Hagan编辑。

[2]Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设计：亚基和佐剂方法)(Powell和Newman编)Plenum Press(普兰出版社)1995(ISBN 0-306-44867-X)。

[3]WO90/14837。

[4]Podda和Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccine 2：197-203。

[5]美国专利第6,299,884号。

[6]美国专利第6,451,325号。

[7]Allison和Byars(1992)Res Immunol 143：519-25。

[8]Hariharan等(1995)Cancer Res 55：3486-9。

[9]WO95/11700。

[10]美国专利第6,080,725号。

[11]WO2005/097181。

[12]英国专利申请第GB-A-2220211号。

[13]Myers等(1990)Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions(内毒素反应的细胞和分子机制)，第145-156页。

[14]Ulrich(2000)参考文献1的第16章(第273-282页)。

[15]Johnson等(1999)J Med Chem 42：4640-9。

[16]Baldrick等(2002)Regulatory Toxicol Pharmacol 35：398-413。

[17]WO 94/21292。

[18]WO94/00153。

[19]WO97/01640/

[20]WO96/26741。

[21]WO93/19780。

[22]美国专利第6,375,945号。

[23]WO00/00462。

[24]Meraldi等(2003)Vaccine 21：2485-2491。

[25]Pajak等(2003)Vaccine 21：836-842。

[26]Brandenburg等(2000)Eur J Biochem 267：3370-7。

[27]Johnson等(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278。

[28]Evans等(2003)Expert Rev Vaccine 2：219-229。

[29]美国专利第6,764,840号。

[30]美国专利申请第2005/0107600号。

[31]Lien等(200I)J Biol.Chem 276：1873-80。

[32]WO03/011223。

[33]Wong等(2003)J Clin Pharmacol 43(7)：735-42。

[34]US2005/0215517。

[35]Costa等(1997)Rev.Inst.Med.trop.S.Paulo第39卷，第1期

Paulo Ene。

[36]Vanlandschoot等(2005)J Gen Virol 86：323-31。

[37]Hilleman(1993)Hepatitis B vaccines in clinical practice(临床实践中的乙肝疫苗)，第17-40页，ISBN 0-8247-8780-3。

[38]Gerin等(1969)J Virol 4：163。

[39]Gerin等(1969)J Virol 7：569。

[40]Siebke等(1972)Acta Pathol Microbiol Scan sect B 80：935。

[41]Pillot等(1976)J Clin Microbiol 4：205。

[42]Duimel和Krijnen(1972)Vox Sang 23：249。

[43]Neurath等(1974)PNAS USA 71：2663。

[44]Charm和Wong(1975)Biotechnol Bioeng 16：593。

[45]美国专利第4,857,317号。

[46]美国专利第4,683,294号。

[47]Houwen等{Y91S)J Immunol Methods 8：185。

[48]Sitrin等(1993)Hepatitis B vaccines in clinical practice(临床实践中的乙肝疫苗)，第83-101页，ISBN 0-8247-8780-3。

[49]Wampler等(1985)PNAS USA 82：6830-4。

[50]Chi等(1994)Ann N Y Acad Sci 721：365-73。

[51]Agraz等(1994)J Chromatogr A 672：25-33。

[52]Mason等(1992)PNAS USA 89：11745-9。

[53]Demi等(1999)J Virol Methods 79：205-17。

[54]Ibarra等(1999)J Chromatogr B Biomed Sci Appl 735：271-7。

[55]WO90/10058。

[56]日本专利申请第JP63239234号。

[57]美国专利第4,694,074号。

[58]EP-0341733。

[59]美国专利第5,242,812号。

[60]俄罗斯专利申请第RU-2128707号。

[61]Hardy等(2000)J Biotechnol 77：157-67。

[62]Dogan等(2000)Biotechnol Prog 16：435-41。

[63]Berkower等(2004)Virology 321(1)：75-S6。

[64]Eckhart等(1996)J Gen Virol 77：2001-8。

[65]von Brunn等(1991)Vaccine 9(7)：477-84。

[66]Vreden等(1991)Am J Trop MedHyg 45(5)：533-8。

[67]Moelans等(1995)MolBiochem Parasitol 72(1-2)：179-92。

[68]Stoute等(1997)N Engl J Med 336(2)：86-91。

[69]Wunderlich和del Portillo(2000)Mol Med 6(3)：238-45。

[70]美国专利第5,928,902号

[71]WO93/10152。

[72]Nony等(2001)Vaccine 27：3645-51。

[73]WO02/12287。

[74]WO03/066094。

[75]Desombere等(1998)Tissue Antigens 51：593-604。

[76]McDermott等(1997)Tissue Antigens 50：8-14。

[77]Traquina等(1996)J Infect Dis 174：1168-75。

序列表

<110>诺华疫苗和诊断有限公司(NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS SRL)

     M.肯托尼(CONTORNI Mario)

<120>降低含油佐剂和含表面活性剂抗原之间的干扰

<130>P041598WO

<140>PCT/IB2006/YYYYYY

<141>2006-08-02

<150>GB-0515906.6

<151>2005-08-02

<150>GB-0522599.0

<151>2005-11-04

<150>GB-0523923.1

<151>2005-11-24

<160>2

<170>SeqWin99，version 1.02

<210>1

<211>4

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>1

Asn Ala Asn Pro

1

<210>2

<211>423

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>2

Met Met Ala Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

1               5                   10                  15

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

            20                  25                  30

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

        35                  40                  45

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

    50                  55                  60

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

65                  70                  75                  80

Asn Pro Asn Lys Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro

                85                  90                  95

Asn Asp Pro Asn Arg Asn Val Asp Glu Asn Asn Ala Asn Asn Ala Val

            100                 105                 110

Lys Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr

        115                 120                 125

Leu Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser

    130                 135                 140

Val Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala

145                 150                 155                 160

Asn Lys Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Glu Asn Asp Ile Glu Lys Lys

                165                 170                 175

Ile Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser

            180                 185                 190

Arg Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro

        195                 200                 205

Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr

    210                 215                 220

Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn

                245                 250                 255

His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met

            260                 265                 270

Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu

        275                 280                 285

Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys

    290                 295                 300

Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr

305                 310                 315                 320

Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys

                325                 330                 335

Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser

            340                 345                 350

Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser

        355                 360                 365

Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser

    370                 375                 380

Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro

385                 390                 395                 400

Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe

                405                 410                 415

Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile

            420

Claims (36)

1. 一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤，混合(i)含有表面活性剂的抗原性组分和(ii)脂肪族佐剂组分，得到所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000∶1的组合物。

2. 一种免疫原性组合物，其中：(a)所述组合物包含抗原组分和脂肪族佐剂组分；(b)所述抗原组分包含表面活性剂；和(c)所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000∶1。

3. 如权利要求1或2所述的方法或组合物，其特征在于，所述脂肪族佐剂包含可代谢油。

4. 如权利要求3所述的方法或组合物，其特征在于，所述脂肪族佐剂包含鲨烯和聚山梨酯80的亚微米水包油乳剂。

5. 如权利要求1或2所述的方法或组合物，其特征在于，所述脂肪族佐剂包含含有脂肪酸部分的分子。

6. 如权利要求5所述的方法或组合物，其特征在于，所述脂肪族佐剂是3-脱氧酰基化的单磷酰基脂质A(′3D-MPL′)。

7. 如权利要求6所述的方法或组合物，其特征在于，所述3D-MPL是酰基化程度不同的分子的混合物。

8. 如权利要求6或7所述的方法或组合物，其特征在于，所述脂肪族佐剂包括：

9. 如权利要求6-8中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述3D-MPL是颗粒形式。

10. 如权利要求9所述的方法或组合物，其特征在于，所述颗粒可过滤除菌。

11. 如权利要求6-10中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述3D-MPL与铝盐联用。

12. 如权利要求11所述的方法或组合物，其特征在于，所述铝盐是磷酸铝。

13. 如权利要求12所述的方法或组合物，其特征在于，所述3D-MPL吸附于所述铝盐上。

14. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述表面活性剂是聚氧乙烯山梨聚糖酯。

15. 如权利要求14所述的方法或组合物，其特征在于，所述酯是聚山梨酯20。

16. 如权利要求14或15所述的方法或组合物，其特征在于，所述表面活性剂的浓度不高于50μg/ml。

17. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述抗原是病毒表面抗原。

18. 如权利要求17所述的方法或组合物，其特征在于，所述抗原是在表面活性剂存在下纯化的颗粒乙型肝炎表面抗原(′HBsAg′)。

19. 如权利要求18所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBsAg是在酵母细胞中表达的。

20. 如权利要求19所述的方法或组合物，其特征在于，所述酵母是酿酒酵母。

21. 如权利要求18-20中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBsAg是非糖基化的，和/或包括磷脂酰肌醇。

22. 如权利要求18-21中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBsAg来自乙型肝炎病毒的adw2亚型。

23. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述抗原是包含病毒表面抗原和异源抗原的杂交蛋白。

24. 如权利要求23所述的方法或组合物，其特征在于，所述病毒表面抗原是HBsAg，所述异源抗原是疟疾抗原。

25. 如权利要求24所述的方法或组合物，其特征在于，所述杂交蛋白包含HBsAg和恶性疟原虫的环孢子体蛋白的片段。

26. 如权利要求25所述的方法或组合物，其特征在于，所述杂交蛋白包含恶性疟原虫环孢子体蛋白的C端部分、环孢子体蛋白优势免疫区的四个或多个串联重复序列和HBsAg。

27. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于500∶1。

28. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于50∶1。

29. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述脂肪族佐剂是3D-MPL，所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比为2.5∶1-25∶1。

30. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物的渗透压为200mOsm/kg-400mOsm/kg。

31. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物包含磷酸盐缓冲液。

32. 如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物的pH为6.0-7.0。

33. (i)包含表面活性剂的抗原组分和(ii)脂肪族佐剂在生产施用于患者的药物中的应用，其中(ii)中所述脂肪族佐剂与(i)中所述表面活性剂的重量比小于1000∶1。

34. 一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：混合(i)含有聚山梨酯20的HBsAg组分和(ii)含有吸附于磷酸铝的3D-MPL的佐剂组分，得到所述3D-MPL与聚山梨酯20的重量比小于1000∶1的组合物。

35. 一种免疫原性组合物，其中：(a)所述组合物含有HBsAg、聚山梨酯20、3D-MPL和磷酸铝佐剂；和(b)所述3D-MPL与聚山梨酯20的重量比小于1000∶1。

36. 一种制备免疫原性组合物的方法，其中：(a)所述组合物包含抗原和脂肪族佐剂；和(b)在不存在表面活性剂的情况下基本纯化所述抗原。