CN101266242B

CN101266242B - 用于检测葡萄糖转运蛋白4上膜的探针和方法

Info

Publication number: CN101266242B
Application number: CN200710064381XA
Authority: CN
Inventors: 徐涛; 徐平勇; 范俊梅; 姜丽
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Beijing Universal Asset Management Co Ltd
Priority date: 2007-03-14
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2027-03-14
Also published as: CN101266242A

Abstract

本发明涉及一种可用于检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)上膜的探针和方法，可实现高通量筛选。该探针用红色荧光蛋白TDimer2和pH敏感的荧光蛋白pHluorin标记胰岛素敏感的IRAP蛋白(TDimer2-IRAP-pHluorin)，建立稳定表达TDimer2-IRAP-pHluorin蛋白的脂肪细胞系和骨骼肌细胞系，通过简单的荧光比值测定即可判断胰岛素作用与靶细胞的效应。因此，本发明通过检测药物刺激后pHluorin与TDimer2荧光强度的比值变化来实现刺激GLUT4上膜的药物的高通量筛选。该方法简单，灵敏度高，易于高通量筛选和工业化生产。

Description

用于检测葡萄糖转运蛋白4上膜的探针和方法

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白探针，更具体地涉及用于检测葡萄糖转运蛋白4(Glucose Transporter4，GLUT4)上膜(即，向细胞膜的转运)的探针，以及一种检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)上膜的高通量筛选方法。利用该探针和方法可以快速、高效地从已有的化学药物库、中药库等资源库中筛选出具有调节体内血糖浓度并治疗糖尿病的促GLUT4上膜类药物。

背景技术

糖尿病与GLUT4

众所周知，葡萄糖是动物体的基本能量来源，它的代谢、合成以及储存都受严格而又复杂的调控。以人类而言，血糖浓度被严格的控制在4-7mM之间。偏离这一区间都会导致疾病的产生，例如低血糖会导致昏迷、死亡，高血糖会导致糖尿病从而引发肾衰竭、白内障、神经病及心血管疾病[1]。在体内，葡萄糖主要在肌肉组织和脂肪组织中被吸收利用，在这个过程中，由于极性的碳水化合物分子受到细胞膜疏水核心的排斥，葡萄糖及其他的糖类分子都需要一系列的转运机制来帮助它们通过脂双分子层被细胞吸收。哺乳动物利用Na⁺—依赖的协同转运和单向转运摄取葡萄糖[1]。在对葡萄糖的摄取过程中葡萄糖转运蛋白家族发挥了重要的作用。胰岛素对血糖的调控主要通过调节葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转运上膜，刺激肌肉组织和脂肪组织对葡萄糖的摄取以降低血糖浓度。

糖尿病治疗药物简介

糖尿病已成为威胁人类健康的常见病、多发病。在糖尿病患者中90％的都是二型糖尿病，不论在发展中国家还是在发达国家病患的人数都在不断增加，预计到2025年II型糖尿病患者的人数将达到3亿[2]。世界卫生组织的资料显示，糖尿病在发达国家和发展中国家增加的幅度明显不同，欧美国家为45％，而发展中国家可达到200％。这意味着糖尿病将在逐步走向富裕的国家肆虐。据了解，我国1994年花在糖尿病和心血管病的医疗费用大约是419亿元人民币，到2000年猛增到1216亿元。如何控制糖尿病的增长和有效治疗糖尿病已属卫生界和医药界的当务之急。

(1)抗胰岛素抗性药物是治疗2型糖尿病的主要药物

糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的一种常见病，临床以高血糖为主要标志，常见症状有多饮、多尿、多食以及消瘦等。糖尿病患者若得不到有效的治疗，可引起身体多个系统的损害。

糖尿病分1型糖尿病和2型糖尿病。其中1型糖尿病多发生于青少年，其胰岛素分泌缺乏，必须依赖胰岛素治疗维持生命。2型糖尿病多见于30岁以后中、老年人，其胰岛素的分泌量并不低甚至还偏高，病因主要是机体对胰岛素不敏感(即胰岛素抗性)。胰岛素抗性是指体内周围组织对胰岛素的敏感性降低，组织对胰岛素不敏感，在胰岛素的刺激下外周组织如肌肉、脂肪中的GLUT4的上膜转运异常，因而对葡萄糖的摄取产生了“抗性”。胰岛素抗性是2型糖尿病的基本发病机制，另外，胰岛素抗性与心血管病变的一些传统危险因素如肥胖、动脉粥样硬化、糖脂代谢异常和高血压等有着密切的关系。

目前市售的抗糖尿病药物主要有磺酰脲类药物、双胍类药物(如盐酸二甲双胍、盐酸二甲双胍缓释片)、α-葡萄糖苷酶抑制剂等口服抗胰岛素药物和胰岛素制剂。其中抗胰岛素抗性药物成为治疗2型糖尿病的主要药物，例如，胰岛素增敏剂可增加机体对自身胰岛素的敏感性，使自身的胰岛素得以“复活”而充分发挥作用，这样就可使血糖能够重新被机体组织细胞所摄取和利用，使血糖下降，达到长期稳定和全面地控制血糖的目的，使人体可长久享用自身分泌的胰岛素。90年代以来，国际上很重视2型糖尿病的胰岛素抗性及研究胰岛素致敏剂。开发新型、高效的抗胰岛素抗性药物有望成为治愈2型糖尿病治疗的最主要途径。

(2)利用药物筛选的方法从现有的化学药物库、植物以及中药库中筛选出具有抗胰岛素抗性的新药具有良好的开发前景，但是缺乏方便、可靠的高通量检测方法。

各国研究人员一直在寻找治疗糖尿病的新药。科学家们试图从现有的合成的化学药物库中筛选出具有治疗糖尿病的新药，另外，人们也从植物中筛选能降血糖的药物。国家新药筛选中心胡立宏博士等研究人员一直在寻找治疗糖尿病的新药。他们从山茱萸这一植物中找到的抑制剂，对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制效果十分明显。实验证明：加入这种抑制剂后，蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的量可得到明显控制，或控制在正常的范围。一般人们是以糖尿病小鼠等为研究模型，通过进食这些药物后测量血糖浓度以及胰岛素的耐受性，来检测这些药物的降糖活性。

糖尿病是一种慢性病，其最大特点是病程长且复杂、难根治。从目前临床所用或即将应用的降糖药物来看，各种西药都有一定的局限性和不良反应，甚至是很严重的不良反应，如导致低血糖、乳酸性酸中毒等。因此，有专家提出用中药抗糖尿病治疗，并做了相关的研究。许多单味药或复方制剂都显示了多种降糖机制，如同时具有刺激胰岛β细胞分泌胰岛素、抑制胰升糖素的分泌、增加胰岛素受体的敏感性、抑制葡萄糖的肠吸收、改善脂肪酸代谢等。据统计，我国已经申报的抗糖尿病药物中中药制剂仅占了极小的市场份额，随着世界“回归天然”热潮的逐步形成，以及对糖尿病药物需求的不断增加，从中药库中筛选出具有多种降糖机制的中药新药具有良好的开发前景。然而目前中药制剂缺乏疗效肯定的、临床医生和患者都乐于接受的降糖药物。

除了中药外，各国研究人员还试图从现有的合成的化学药物库中筛选出具有治疗糖尿病的新药，另外，人们也从植物中筛选能降血糖的药物，例如，国家新药筛选中心胡立宏博士等研究人员从山茱萸这一植物中找到蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制剂，通过对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制来调控糖尿病病人血糖的浓度。一般人们是以糖尿病小鼠等为研究模型，通过测量小鼠进食这些药物后血糖浓度以及胰岛素的耐受性，来检测这些药物的降糖活性。利用这种方法很难实现高通量，而且费时费力。因此，虽然有很多资源库可供开发具有潜在药效的糖尿病治疗类药物，但是由于没有高效、准确并可以高通量检测的方法，这些潜在药物的开发和应用受到了极大的限制。

葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)

由于胰岛素对血糖的调控主要通过调节葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转运上膜，刺激肌肉组织和脂肪组织对葡萄糖的摄取降低血糖浓度。研究表明，GLUT4蛋白在脂肪细胞和肌肉细胞中大量表达，用胰岛素刺激后发现该蛋白转运上膜。最新的研究表明，早期2型糖尿病病人诊断中发现胰岛素信号转导途径正常，但是胰岛素刺激GLUT4的上膜转运出现异常[3]。因此，发明一种能检测GLUT4转运上膜的探针对于2型糖尿病的早期诊断和治疗具有非常重要的意义。

目前有关GLUT4上膜转运的机制已经成为2型糖尿病研究的热点，但是无论是理论研究还是用于疾病治疗的早期诊断，尚没有合适的探针用于检测胰岛素刺激后GLUT4的上膜转运。因此，也没有以GLUT4上膜转运为靶标的药物筛选方法。现有的用于检测GLUT4上膜的方法，主要有两种，一种是用生化的方法提取细胞膜，利用GLUT4的抗体检测胰岛素刺激后GLUT4的上膜；另一种方法是用绿色荧光蛋白GFP标记GLUT4并检测其上膜。利用生化抗体检测的方法具有很多缺点，例如操作很麻烦；所需要的样品量很大，很难得到较纯的细胞膜成分；这些都会影响测定的结果，而且很难实现药物的高通量筛选。用GFP标记GLUT4来检测GLUT4的方法也存在一些缺点，GLUT4蛋白是多次跨膜蛋白，氨基端和羧基端都在胞浆中，因此GFP无论是标记在GLUT4的氨基端还是羧基端，GFP都会位于GLUT4囊泡的胞浆侧，在488nm波长激光激发下都会发光，因此很难量化胰岛素刺激后GLUT4的上膜量。

发明内容

本发明的目的就是要找到一种方法，能够方便准确地检测哪些化合物或药物能刺激脂肪细胞或者肌肉细胞中GLUT4的上膜转运，进而调控体内的血糖代谢，这些药物即为具有医药应用前景的治疗糖尿病的药物，而且有可能是那些不依赖胰岛素而使GLUT4转运上膜的胰岛素抗性药物。本发明的目的之二是设计和构建一种探针，反映脂肪和肌肉细胞响应胰岛素的刺激后GLUT4的转运，直接用于检测胰岛素等药物的药效，或药物对胰岛素抵抗的改善效果。

具体而言，本发明包括以下各个方面：

1.一种用于检测葡萄糖转运蛋白4上膜的探针，该探针是胰岛素响应氨肽酶(IRAP)或其片段与pH敏感的荧光蛋白的融合蛋白。优选pH敏感的荧光蛋白被融合在IRAP的羧基末端。优选所述pH敏感的荧光蛋白在酸性条件下(pH<7.0)和在中性条件下(pH＝7.0)的荧光强度显著不同、更优选在酸性条件下不发荧光而在中性条件下发荧光，最优选所述pH敏感的荧光蛋白为pHluorin。优选所述胰岛素响应氨肽酶片段是它的第1-131个氨基酸。

2.根据以上1的探针，其中将所述胰岛素响应氨肽酶或其片段的两端分别用pH敏感的荧光蛋白和pH不敏感的荧光蛋白标记，优选所述pH敏感的荧光蛋白是pHluorin并且所述pH不敏感的荧光蛋白是TDimer2，更优选所述探针为TDimer2-IRAP-pHluorin(SEQ ID No.1)。

3.制备根据以上2的探针的重组表达质粒，其为保藏号为CGMCC No.1898的pTDimer2-IRAP-pHluorin。

4.瞬时转染或稳定表达根据以上1或2的探针的细胞以及所述探针的转基因动物，所述细胞包括脂肪细胞和肌肉细胞，例如3T3-L1细胞系(ATCC：CL-173)及其分化的脂肪细胞、L6(ATCC：CRL-1458)和C2C12细胞系(ATCC：CRL-1772)及其分化的肌肉细胞，所述转基因动物如鼠类。

5.一种鉴定影响葡萄糖转运蛋白4上膜的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.获得瞬时转染或稳定表达根据以上1或2的探针的细胞；

b.将化合物与所述细胞温育，和

c.比较在与所述化合物温育前后检测到的探针的荧光强度。

在荧光强度是与葡萄糖转运蛋白4上膜的量成正相关的情况下，荧光强度增加表明所述化合物能够增强葡萄糖转运蛋白4上膜。

6.根据以上5的方法，其中所述探针是TDimer2-IRAP-pHluorin，并且在步骤c中比较在与所述化合物温育前后pHluorin与TDimer2的荧光强度比值的变化，该比值增加表明所述化合物增强葡萄糖转运蛋白4向细胞膜的转运。优选在将化合物与所述细胞温育30分钟之后检测荧光强度的比值。

7.根据以上6的方法筛选得到的化合物，其中增加所述比值的化合物可以用于制备治疗胰岛素抗性的候选药物。

8.一种检测细胞胰岛素抗性的方法，所述方法包括以下步骤：

a.获得瞬时转染或稳定表达根据以上1或2的探针的待测细胞；

b.将胰岛素与所述细胞温育，和

c.比较在与胰岛素温育前后检测到的探针的荧光强度。

9.根据以上8的方法，其中所述探针是TDimer2-IRAP-pHluorin，并且在步骤c中比较在与胰岛素温育前后pHluorin与TDimer2的荧光强度比值的变化，如果该比值没有显著变化则表明所述细胞具有胰岛素抗性。优选在将胰岛素与所述细胞温育30分钟之后检测荧光强度的比值。

10.根据以上9的方法，其中所述细胞是脂肪细胞或肌肉细胞。

发明详述

我们用两种荧光蛋白pHluorin和TDimer2标记与GLUT4完全共定位的胰岛素响应氨肽酶(IRAP)蛋白的1-131氨基酸(使用全长IRAP也获得了完全类似的实验结果，数据未显示)。我们在IRAP131(IRAP蛋白的1-131氨基酸)的前面融合有对pH值敏感的荧光蛋白pHluorin，在它的后面融合有对pH不敏感的红色荧光蛋白TDimer2，获得融合蛋白TDimer2-IRAP-pHluorin。pHluorin在酸性的环境下不发光，在中性或者接近中性的环境下在488nm的光激发下发绿色荧光。将构建好的荧光蛋白通过脂质体或者电转化的方法导入脂肪细胞(系)或者肌肉细胞(系)中表达，并建立稳定细胞系。在胰岛素等药物刺激前，pHluorin处于酸性的GLUT4囊泡中，因此在488nm波长的光激发下细胞只观测到红色荧光蛋白TDimer2的红色荧光，在细胞外液中加入胰岛素等药物后，TDimer2-IRAP-pHluorin转运上膜，此时pHluorin荧光蛋白暴露在细胞外，在488nm激光激发下发绿色荧光，同时TDimer2发红色荧光，因此通过测定胰岛素等药物刺激前后绿色荧光与红色荧光的比值可以表征TDimer2-IRAP-pHluorin的上膜量，也即表征了GLUT4响应胰岛素药物的上膜量。通过筛选出刺激TDimer2-IRAP-pHluorin上膜量提高的药物即筛选出了高效的治疗糖尿病的药物。

pHluorin

pHluorin是一个pH敏感的荧光蛋白，在pH5.5的环境下不发荧光，在中性pH7.0环境下发绿色荧光。如果能将pHluorin定位于GLUT4囊泡内，这样在胰岛素刺激以前，pHluorin由于定位在酸性的囊泡内而不发光，胰岛素刺激后GLUT4转运上膜，pHluorin就会定位在细胞外中性的环境中而发荧光，这样通过pHluorin荧光强度的升高就能检测GLUT4的上膜量。由于GLUT4蛋白是多次跨膜蛋白，其N端和C端都在胞浆，要使pHluorin能定位于GLUT4囊泡内，pHluorin必须插入GLUT4的loop环上，势必会影响GLUT4的转运和功能。

胰岛素响应氨肽酶(IRAP)

胰岛素响应氨肽酶(Insulin responsive aminopeptidase，IRAP)是GLUT4存贮囊泡(GSV)的标记物，是唯一一种响应胰岛素刺激后同GLUT4一起转运的蛋白。IRAP是单次跨膜蛋白，C端在GLUT4囊泡内，因此可以用pHluorin标记IRAP的羧基末端，在胰岛素刺激前，IRAP-pHluorin不发荧光，胰岛素刺激后IRAP-pHluorin跟GLUT4一起转运到细胞膜上，此时pHluorin暴露在细胞外，在488nm激发下发绿色荧光，因此可以用来检测GLUT4的转运上膜量。

为了达到更好的信噪比，本发明中我们用荧光蛋白pHluorin和TDimer2双标记与GLUT4共定位的IRAP蛋白的1-131氨基酸(TDimer2-IRAP-pHluorin)，记录胰岛素刺激前后pHluorin与TDimer2荧光的比值，也即记录GLUT4响应胰岛素刺激的上膜量。因此探针TDimer2-IRAP131-pH的上膜检测能反应脂肪和肌肉细胞对胰岛素的响应，可用于胰岛素替代药物的筛选和检测。

另外，除了有更好的信噪比外，双荧光标记的TDimer2-IRAP-pHluorin探针可用于动物体内的GLUT4响应胰岛素刺激的上膜检测。在动物的活体(in vivo)检测中，荧光蛋白的荧光强度会随着位置的改变而发生变化，因此仅用pHluorin标记IRAP并记录荧光强度的变化不能正确反应GLUT4的上膜。而同时用Tdimer2红色荧光蛋白标记IRAP，通过记录两荧光蛋白的强度比值的变化就可以真实地检测胰岛素等药物刺激后活体动物体内GLUT4的上膜情况。

胰岛素刺激引起的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的上膜对于维持体内血糖浓度具有重要的生理意义。最新的研究表明，早期2型糖尿病病人诊断中发现胰岛素信号转导途径正常，但是GLUT4的上膜转运出现了异常。因此，发明一种能检测GLUT4转运上膜的探针对于2型糖尿病的早期诊断和治疗具有非常重要的意义。本发明涉及一种可用于检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)上膜的探针和方法，可实现高通量筛选。本发明构造了一个新的探针，通过简单的荧光比值测定即可判断胰岛素作用与靶细胞的效应。该探针用红色荧光蛋白TDimer2和pH敏感的荧光蛋白pHluorin标记胰岛素敏感的IRAP蛋白(TDimer2-IRAP-pHluorin)，建立稳定表达TDimer2-IRAP-pHluorin蛋白的脂肪细胞系和骨骼肌细胞系。在胰岛素等药物的刺激下，TDimer2-IRAP-pHluorin蛋白能从胞内转运到细胞膜上，由于荧光蛋白所处的环境pH值发生改变，pHluorin与TDimer2的荧光比值呈现大幅度地升高。因此该发明通过检测药物刺激后pHluorin与TDimer2荧光强度的比值变化来实现刺激GLUT4上膜的药物的高通量筛选。该方法简单，灵敏度高，易于高通量筛选和工业化生产。

序列表说明

SEQ ID No.1：TDimer2-IRAP131-pHluorin融合蛋白的氨基酸全序列；

SEQ ID No.2：Tdimer2的编码核苷酸序列；

SEQ ID No.3：IRAP的编码核苷酸序列；

SEQ ID No.4：pHluorin的编码核苷酸序列。

附图说明

图1.融合蛋白GLUT4-EGFP与TDimer2-IRAP-pHluorin(在本文中有时也称为TD2-IRAP-pH或TDimer2-IRAP131-pHluorin)共定位于脂肪细胞(左：GLUT4-EGFP的定位图像；中：TDimer2-IRAP-pHluorin的定位图像；右：GLUT4-EGFP图像和TDimer2-IRAP-pHluorin定位图像的重合)；

图2.响应胰岛素刺激后TDimer2-IRAP-pHluorin在脂肪细胞中转运上膜；

图3.胰岛素刺激后TDimer2-IRAP-pHluorin在488nm光激发下pHluorin与TDimer2荧光强度比值随着时间的变化曲线(注：说明书和图中pHluorin代表荧光蛋白pHluorin)；

图4.pTDimer2-IRAP-pHluorin的质粒谱图；

图5.质粒pTDimer2-IRAP-pHluorin的构建示意图。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

1.质粒构建

先用RNA小提试剂盒RNeasy Mini Kit(Qiagen，GmbH，Germany)从3T3-L1细胞(美国ATCC CL-173)中提总RNA，通过RT-PCR试剂盒(Qiagen，GmbH，Germany)扩出GLUT4的cDNA编码基因(GenBankAccession Number：NM_009204)，

GLUT4上游引物序列：

5’-TACCGCTCGAGACAAGATGCCGTCGGGTTTCCAGCAGATCG-3’；

GLUT4下游引物序列：

5’-GCTAGGATCCCCGTCATTCTCATCTGGCCCTAAGTATTCAAG-3’。

所用PCR条件：1、50℃30分；2、95℃3分；3、95℃30秒；4、55℃30秒5、72℃1分30秒6、33次to37、72℃10分。把扩增出来的PCR产物经EcoRI和BamHI酶切后连入哺乳动物表达载体pEGFP-N1(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)的EcoRI和BamHI酶切位点中，获得pGLUT4-EGFP。

质粒pTDimer2-IRAP-pHluorin的构建参见图5，主要分为三步：首先，构建pHluorin-N1载体，以对pH值敏感的绿色荧光蛋白pHluorin(受赠于Dr.James Rothman[4])替换pEGFP-N1载体中的EGFP。pHluorin的引物是：上游5’-GATCGGATCCCACCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’和下游5’-GATCGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATG-3’.把扩增出来的PCR产物与哺乳动物表达载体pEGFP-N1一起做BamH1与Not1双酶切后，做连接，将扩增出来的PCR产物连入载体，获得重组载体pHluorin-N1。

然后，使用RNA小提试剂盒RNeasy Mini Kit(Qiagen，GmbH，Germany)从3T3-L1细胞(美国ATCC CL-173)中提总RNA，通过RT-PCR扩出IRAP的cDNA(GenBankAccession Number：NM_172827)，所用上下游引物分别为：

5’-GATCCTCGAGCATGGAGTCCTTTACCAATGATCGGCTTCAG-3’(上游)和

5’-GCAAGGATCCTTCAGCCACTGGGAGAGCGTTTTCAG ATTC-3’(下游)。

再以此为模板做PCR扩出IRAP蛋白N端393bp的碱基，上下游引物为：上游5’-GATCCTCGAGCCACCACCATGGAGTCCTTTACCAATGATCGG-3’

和下游5’-GCAAGGATCCGGCAGTAGATAAATCACCATGATTACAGAG ACC-3’。

通过XholI和BamHI酶切接入pHluorin-N1载体中，从而构建出重组载体pIRAP-pHluorin。IRAP131片段的DNA序列如下：

5’-atggagtcctttaccaatgatcggcttcagcttccaaggaatatgatcgaaaacagcatgtttgaagaagagccagatgtggtagatttagccaaagaaccttgtttacatcctctggaacccgatgaagtggaatatgagccccgaggttcgaggcttctggtgcgaggtcttggtgagcatgagatggacgaggatgaagaggattatgagtcctctgcgaagctgctgggcatgtccttcatgaacagaagctcaggcctgcggaacagtgcagcaggctacaggcagagtccagatgggacttgttcattaccctctgccaggaccttagtgatctgtgtttttgtcattgtggttgcggtctctgtaatcatggtgatttatctactg-3’

最后，以pcDNA3.1-TDimer2[5]为模板通过PCR将Tdimer2(受赠于Dr.James Rothman[5])扩增出来，其上下游引物为：上游5’-GAAGCTAGCGACCATGGTGGCCTCCTCCGAGGACG-3’和下游5’-GCTGGATATCTGCAAGATCTCAGGAACAGGTGGTGG-3’。将PCR产物经Nhe I和Bgl II酶切连入重组载体pIRAP-pHluorin中，置于IRAP131片段前面，从而构建出pTDimer2-IRAP-pHluorin。实验中PCR用的是高保真的pfu DNA聚合酶(Stratagen，La Jolla，CA)。构建的片段最终送于英骏公司(北京，中国)测序证实无误。携带有重组表达质粒pTDimer2-IRAP-pHluorin的大肠杆菌(Escherichia coli)已经于2006年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1898。

2.脂肪细胞系细胞3T3-L1的培养与分化

3T3-L1(购自美国ATCC CL-173)的培养基为含有10％新生牛血清(Gibco，Carlsbad，CA，U.S.A)的高糖DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′smedium)(Gibco)，培养条件为37℃，5％CO₂。细胞呈梭型或树枝状，是单层培养细胞，当细胞密度长至70％时即可用于传代。用预先温浴(37℃)的PBS洗两次，在用0.05％的胰酶(Gibco)消化至细胞脱壁立刻用含有血清的上述培养基终止消化，按10：1(体积比)的比例传代，每隔2-3天换液。当细胞长满汇合后，即可用于分化，分化时将培养基换成含有1μM胰岛素(Sigma No.10516)、0.5mM3-isobutyl-1-methylxanthine(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)和0.25μM地塞米松、10％胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM(Gibco)。两天后换成含有10％胎牛血清(Gibco)，1μM胰岛素的培养基，再过两天换成仅含有10％胎牛血清(Gibco)的培养基。分化后的细胞一直用10％胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM(Gibco)培养。通常开始分化7天后，细胞会呈现明显脂肪细胞的性状，细胞变圆有明显脂滴。

3.转染分化的脂肪细胞3T3-L1

取分化7天后的脂肪细胞，用0.05％的胰酶(Gibco)消化至细胞脱壁，立刻用含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，在室温1500转/分钟离心收获细胞，然后用OPTI-MEM液体培养基(Gibco No.31985-070)洗一次除去残留的培养基成分，最后重悬细胞加入30μg质粒使终体积800μl。将细胞悬液加入4mm电击池，冰浴，用BTX830电转仪(Biocompare，South San Francisco，CA，U.S.A)电击，电压定为310V，时间10ms。电击后将细胞滴在涂有多聚赖氨酸(Sigma No.25988-63-0)的玻片上，待15-20分钟后细胞贴壁即可加入含有10％胎牛血清的培养基。细胞贴壁两天即可用于实验。实验前，细胞必须经过2小时以上无血清培养基的饥饿。实验中的外液(单位mM)：129NaCl、4.7KCl、1.2KH₂PO₄、5NaHCO3、10HEPES、3Glucose、2.5CaCl₂、1.2MgSO₄和0.1％牛血清白蛋白)(pH7.4)。实验中用到的外液中的胰岛素浓度均为100nm。除了特殊注明的外，所有试剂均购于Sigma公司。

4.图像采集

所用共聚焦显微镜为Olympus IX81，控制软件FV500.

全内反射荧光成像系统(TIRFM)以Olympus公司的IX-81型倒置显微镜为基础，在显微镜的背面接上全内反射的光路系统并结合了多个激光光源通过AOTF对激发光的波长进行选择。物镜为德国ZEISS objective“fluar”100X/(OA)1.45油镜(n＝1.518)。由于EGFP和Tdimer2分别可以被488nm和561nm波长的激发光激发，我们选择了z488/561rpc的二次分光镜(chroma No.109793a)和LP505nm的发射光滤光片以便在视野中可以同时看见绿色和红色的荧光。为了能将红色和绿色的信号分开同时记录到两种不同的信号，我们在显微镜右侧出光口放置了一个Dual-ViewMicro-Imager(Optical-Insights，Tucson，AZ，USA)，通过里面的二次分光镜和不同的滤光片将红绿两种信号分开，分别投影到CCD的两个部分。PCO风冷电子增益CCD，分辨率可达67nm，采样频率为5HZ，曝光时间100ms，由TillVison控制。实验中消散场的穿透深度为113nm。光路部分和控制软件、硬件均为德国Till公司的产品，该系统能更好的实现多光源的同时激发。

5.实验结果

1)GLUT4-EGFP与TDimer2-IRAP-pHluorin共定位于脂肪细胞电转两天后，将共转了质粒pGLUT4-EGFP与pTDimer2-IRAP-pHluorin的脂肪细胞进行通透，固定：先将细胞用PBS洗两次，每次三分钟，室温加入现配的4％多聚甲醛(PBS中)固定20分钟，PBS洗两次；加入新鲜现配含0.1％Triton X-100的PBS室温5分钟，PBS洗一次，重复通透三次，最后PBS洗两次。将处理后的细胞置于全内反射荧光显微镜下，细胞外液换成pH5.5的外液：129mmol NaCl、4.7mmolKCl、1.2mmol KH₂PO₄、5mmol NaHCO₃、10mmol MES hydrate、3mmol葡萄糖、2.5mmol CaCl₂、1.2mmol MgSO₄和0.1％BSA(pH5.5)，将蛋白TDimer2-IRAP-pHluorin中绿色荧光蛋白pHluorin淬灭，激光激发后该蛋白只发射红色荧光，而GLUT4-EGFP在激光激发后发射绿色荧光。同时用488nm与561nm激光激发，对红绿发射光同时采集，可以观测到GLUT4-EGFP与TDimer2-IRAP-pHluorin完全共定位。该结果表明探针TDimer2-IRAP-pHluorin可以完全替代GLUT4的上膜而用于检测胰岛素等药物刺激后GLUT4的上膜转运效率(图1)

2)响应胰岛素刺激后TDimer2-IRAP-pHluorin在脂肪细胞中转运上膜

取分化好的脂肪细胞转染质粒pTD2-IRAP131-pH两天后做共聚焦荧光显微成像实验(共聚焦显微镜为Olympus IX81，控制软件为FV500)，用488nm波长的激光激发，收集510±20nm发射波谱，即为pHluorin的发射光谱。将细胞首先置于正常外液中(pH7.4)，此时只有已经上膜的pHluorin处于pH7.4的环境中，因此膜上可见有少量的荧光。然后将外液换成pH5.5的外液，由于pHluorin在酸性环境中不发光，因此膜上的荧光迅速被淬灭掉，而胞内由于氢离子不能渗透，处于胞内酸性囊泡中的pHluorin发出很微弱的荧光。紧接着将细胞外液换成可渗透的pH7.4的氯化铵外液，此时由于整个细胞都处在pH7.4的环境中，因此，所有的pHluorin都发出很强的荧光。细胞从中性环境转换到pH5.5外液时膜上被淬灭掉的荧光可以反映蛋白TDimer2-IRAP-pHluorin的上膜量，也即反应了GLUT4的上膜量。图中a表示胰岛素刺激后不同的时间内改变细胞外液pH值后细胞的荧光成像图。b表示随着pH值的改变荧光强度的变化曲线。c表示胰岛素刺激后TDimer2-IRAP-pHluorin的上膜量的柱状统计图。

实验结果表明胰岛素刺激30分钟后，TDimer2-IRAP-pHluorin的上膜量由刺激前的20％的上膜量升高为刺激后的60％的上膜量。

3)TDimer2-IRAP-pHluorin在胰岛素刺激下pHluorin与TDimer2荧光强度随着时间的变化

取分化好的脂肪细胞电转，转入质粒TD2-IRAP131-pH两天后做宽场荧光实验与全内反射荧光成像系统共用一套显微镜，光源为氙灯(till-photonics polychrome V)，测该蛋白上膜导致红绿两蛋白荧光值比值变化。加胰岛素前五分钟至加胰岛素后三十分钟每隔一分钟采单张图片。由于pHluorin与Tdimer2均可在488nm的光激发下发光，pHluorin在细胞内酸性环境下发光很弱，上膜后由于接触到胞外中性环境荧光突然变亮，Tdimer2是pH不敏感的红色荧光蛋白，当外部环境由酸性变为中性后，荧光亮度几乎不变。所以蛋白TD2-IRAP13l-pH在胰岛素刺激下上膜后，细胞pHluorin蛋白在氙灯488nm的光激发下，荧光显著增加，而Tdimer2荧光几乎不变，仅有微弱的淬灭。二者荧光比值可以很好得描述蛋白TD2-IRAP131-pH在胰岛素刺激下的上膜情况。实验结果如图3所示。其中a、b图为同一个细胞同次实验，a图给出加胰岛素后每十分钟细胞荧光图，上排表示pHluorin随胰岛素刺激荧光变化图，下排表示Tdimer2随胰岛素刺激荧光变化图。b图是给出加胰岛素后每三分钟细胞红绿荧光值，及二者比值。c图是对多个细胞红绿荧光值比值拟合。

实验结果表明在胰岛素药物刺激下TDimer2-IRAP-pHluorin转运上膜，pHluorin与TDimer2荧光强度的比值升高，30分钟左右趋于稳定。因此，筛选糖尿病治疗药物时可在往细胞中加入药物30分钟后检测绿色和红色荧光强度的比值。

工业适用性

本发明的探针和方法可以检测哪些药物能刺激脂肪细胞或者肌肉细胞中GLUT4的上膜转运，进而调控体内的血糖代谢，这些药物即为具有医药应用前景的糖尿病治疗候选药物。

参考文献

[1]Watson，R.T.，Kanzaki，M.和Pessin，J.E.Regulated membranetrafficking of the insulin-responsive glucose transporter 4 in adipocytes.Endocr Rev，2004，25(2)：177-204

[2]Dugani，C.B.和Klip，A.Glucose transporter4：cycling，compartmentsand controversies.EMBO Rep，2005，6(12)：1137-1142

[3]Karlsson，H.K.，Ahlsen，M.，Zierath，J.R.，Wallberg-Henriksson，H.，&Koistinen，H.A.Insulin signaling and glucose transport in skeletal muscle fromfirst-degree relatives of type 2 diabetic patients.Diabetes 55，1283-1288(2006).

[4]Gero Miesenbo¨ck，Dino A.De Angelis & James E.RothmanVisualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive greenfluorescent proteins Nature，Vol394，9 July1998.

[5]Yang，X.，Xu，P.，and Xu，T.(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.330，914-920

序列表

<110>中国科学院生物物理研究所

<120>用于检测葡萄糖转运蛋白4上膜的探针和方法

<130>IB070363

<160>4

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>839

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>1395

<212>DNA

<213>质粒

<400>2

<210>3

<211>3078

<212>DNA

<213>基因组

<400>3

<210>4

<211>717

<212>DNA

<213>质粒

<400>4

Claims

1.一种用于检测葡萄糖转运蛋白4上膜的探针，该探针是胰岛素响应氨肽酶(IRAP)与pH敏感的荧光蛋白的融合蛋白，所述上膜是指向细胞膜的转运，其中将所述胰岛素响应氨肽酶的两端分别用pH敏感的荧光蛋白和pH不敏感的荧光蛋白标记，其中所述pH敏感的荧光蛋白是pHluorin并且所述pH不敏感的荧光蛋白是TDimer2。

2.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针为氨基酸序列为SEQ IDNo.1的TDimer2-IRAP-pHluorin。

3.制备根据权利要求1的探针的重组表达质粒，其为保藏号为CGMCC No.1898的大肠杆菌菌株中的质粒pTDimer2-IRAP-pHluorin。

4.瞬时转染或稳定表达根据权利要求1的探针的细胞，所述细胞是脂肪细胞或肌肉细胞。

5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述脂肪细胞是保藏编号为ATCC CL-173的3T3-L1细胞系及其分化的脂肪细胞。

6.根据权利要求4所述的细胞，其中所述肌肉细胞是保藏编号为ATCC CRL-1458的L6细胞系及其分化的肌肉细胞。

7.根据权利要求4所述的细胞，其中所述肌肉细胞是保藏编号为ATCC CRL-1772的C2C12细胞系及其分化的肌肉细胞。

8.一种鉴定增强葡萄糖转运蛋白4上膜的化合物的方法，所述上膜是指向细胞膜的转运，所述方法包括以下步骤：

a.获得瞬时转染或稳定表达根据权利要求1的探针的细胞；

b.将化合物与所述细胞温育，和

c.比较在与所述化合物温育前后检测到的探针的荧光强度。

9.根据权利要求8的方法，其中所述探针是氨基酸序列为SEQ ID No.1的TDimer2-IRAP-pHluorin，并且在步骤c中比较在与所述化合物温育前后pHluorin与TDimer2的荧光强度比值的变化，该比值增加表明所述化合物增强葡萄糖转运蛋白4向细胞膜的转运。

10.一种检测细胞胰岛素抗性的方法，所述方法包括以下步骤：

a.获得瞬时转染或稳定表达根据权利要求1的探针的待测细胞；

b.将胰岛素与所述细胞温育，和

c.比较在与胰岛素温育前后检测到的探针的荧光强度。

11.根据权利要求10的方法，其中所述探针是氨基酸序列为SEQ IDNo.1的TDimer2-IRAP-pHluorin，并且在步骤c中比较在与胰岛素温育前后pHluorin与TDimer2的荧光强度比值的变化，如果该比值没有显著变化则表明所述细胞具有胰岛素抗性。

12.根据权利要求11的方法，其中所述细胞是脂肪细胞或肌肉细胞。