CN101265478B

CN101265478B - 一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法

Info

Publication number: CN101265478B
Application number: CN2008100366737A
Authority: CN
Inventors: 江文正; 樊燕; 闻洁君; 郝文丽
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2028-04-25
Also published as: CN101265478A

Abstract

本发明公开了一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，其构建流程是：根据Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列，选取编码区第361～379位核苷酸序列为靶序列设计并合成引物，通过引物退火，连接至干扰载体pAS，即得本发明构建的真核表达载体shRNA-B7-DC。本发明所构建的真核表达载体，不仅能特异性靶向并抑制小鼠骨髓来源的树突状细胞中B7-DC基因的表达，还可以大量扩增，并可将其有效片段克隆至其它更好的载体上，具有操作简单、应用方便、毒副作用小、成本低等优点，可以为研究B7-DC基因的功能、增强树突状细胞诱导的免疫应答中的应用研究提供一个有效工具。

Description

一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体说，是涉及一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法。

背景技术

近年来大量的研究表明，T细胞的激活受正向和负向信号之间平衡的调节。T细胞上的共刺激或共抑制受体或配体与抗原提呈细胞上相应的配体或受体相互作用维持了这种平衡，并且最终决定T细胞的激活。B7-DC是共刺激分子B7家族的一个成员，近来被鉴定是免疫抑制性受体程序性死亡蛋白1(PD-1)的配体。B7-DC主要表达于单核细胞上，并在树突状细胞上呈选择性表达。外周单核细胞经GM-CSF和IL-4诱导，产生的树突状细胞可高表达B7-DC。树突状细胞是目前功能最强的抗原提呈细胞，能够起始和调节T细胞免疫。树突状细胞一旦激活后能够表达大量的组织相容性复合体I类、II类分子，共刺激分子和粘附分子，这些分子为活化T细胞提供了第二信号。因此，人们日益关注用树突状细胞作为疫苗来治疗慢性病毒感染和肿瘤。目前B7-DC对T细胞在体内的调节作用还不是完全清楚，但大量的研究表明B7-DC对T细胞反应具有负向调节作用。因此，抑制负向调节信号分子B7-DC可能会增强树突状细胞诱导的免疫应答的作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(doublestrand RNA，dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。这一现象属于转录后的基因沉默机制(Posttranscriptional gene silencing，PTGS)。研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割成21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)。一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA，使目标mRNA不能翻译，因而沉默。

作为研究基因功能的新工具，RNAi在细胞中具有抑制或灭活特异的基因的功能，可以产生类似基因“敲除”的效应，是功能基因组研究的有效工具，这一技术比基因敲除技术具有明显投入少、周期短、操作简单等优势，它的应用为基因功能的研究开辟了新的途径。siRNA获取常用5种方法：(1)化学合成siRNA法；(2)体外转录siRNA法；(3)长片段dsRNA经RNase III类酶的降解法；(4)siRNA表达载体或病毒载体在细胞内的表达；(5)使用PCR法制备的siRNA表达框在细胞中的表达法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，为研究B7-DC基因的功能、增强树突状细胞诱导的免疫应答中的应用研究提供一个有效工具。

本发明所提供的抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，包括以下步骤：

A)根据Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列，从编码区中选取第361～379位核苷酸序列GCTTCTTACATGAGGATAG为靶序列，设计并合成引物，引物为：

siRNA1-Oligo1：5′-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATC

CTCATGTAAGAAGCTTTTTGGAAA-3′

siRNA1-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTT

GAACTATCCTCATGTAAGAAGCGG-3′

siRNA2-Oligo1：5′-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGA

ACATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA-3′

siRNA2-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTT

GAACCAGAACATGCAGCTGAAGGG-3′；

B)将载体pAS经BgIII、HindIII双酶切，用回收试剂盒回收；

C)siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火，即：用三蒸水稀释引物至10μmol/μl，取siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2各1μl，加TE补至20μl，95℃5分钟，70℃10分钟，10℃20分钟；

D)取5μl siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火产物，加入1μl pAS经BgIII、Hind III双酶切回收后的产物，1μl T4连接酶和2μl 10×连接缓冲液，加双蒸水补至20μl体系，置于4℃反应过夜；

E)将步骤D)所得的连接产物转化至大肠杆菌DH5α，即：取连接产物20μl，加入200μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃90秒，再冰浴2分钟，加入800μlLB液体培养基，37℃、225rpm振摇60分钟，取200μl菌液均匀涂在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜；

F)挑取单个克隆菌落，置于3ml含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基上，37℃培养过夜；

G)提取步骤F)获得的菌液的质粒DNA；

H)所提质粒DNA经EcoR I和Hind III酶切鉴定，选出正确质粒，命名为shRNA1-B7-DC；

I)按照步骤A)至步骤H)的操作构建质粒shRNA2-B7-DC。

所述LB液体培养基的配方优选为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠，用双蒸水溶解至1000ml。

所述LB固体培养基的配方优选为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、15g琼脂粉，用双蒸水溶解至1000ml。

所述氨苄青霉素的浓度优选为100μg/ml。

本发明所构建的抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体，不仅能特异性靶向并抑制小鼠骨髓来源的树突状细胞中B7-DC基因的表达，还可以大量扩增，并可将其有效片段克隆至其它更好的载体上，具有操作简单、应用方便、毒副作用小、成本低等优点。所述载体上还带有与人H1启动子共表达的绿色荧光蛋白Rluc-GFP基因，可以通过绿色荧光来判断转染效率。本发明采用的是siRNA表达载体法，可以为研究B7-DC基因的功能、增强树突状细胞诱导的免疫应答中的应用研究提供一个有效工具。

附图说明

图1为本发明的shRNA真核表达载体的构建流程图；

图2为本发明的shRNA真核表达载体体外增强小鼠骨髓来源的树突状细胞刺激T细胞增殖能力的示意图，图中：菱形图标代表正常的小鼠骨髓来源的树突状细胞刺激T细胞增殖的能力；正方形图标代表空载体pAS转染细胞组刺激T细胞增殖的能力；三角形图标代表shRNA1-B7-DC转染细胞组刺激T细胞增殖的能力；圆形图标代表shRNA2-B7-DC转染细胞组刺激T细胞增殖的能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建流程如图1所示，具体操作如下：

A)按照siRNA靶序列的选取原则，根据Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列(NM_021396)，从编码区中选取第361～379位核苷酸序列GCTTCTTACATGAGGATAG为靶序列，设计并合成引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，引物为：

siRNA1-Oligo1：5′-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATC

CTCATGTAAGAAGCTTTTTGGAAA-3′

siRNA1-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTT

GAACTATCCTCATGTAAGAAGCGG-3′

siRNA2-Oligo1：5′-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGA

ACATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA-3′

siRNA2-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTT

GAACCAGAACATGCAGCTGAAGGG-3′

B)将载体pAS经BgIII、HindIII双酶切，用回收试剂盒(北京鼎国生物技术有限责任公司)回收；

C)siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火，即：用三蒸水稀释引物至10μmol/μl，取siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2各1μl，加TE补至20μl，95℃5分钟，70℃10分钟，10℃20分钟，退火后产物两端带有BgIII和HindIII酶切位点；

D)取5μl siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火产物，加入1μl pAS经BgIII、Hind III双酶切回收后的产物，1μl T4连接酶和2μl 10×连接缓冲液(TaKaRa公司)，加双蒸水补至20μl体系，置于4℃反应过夜；

E)将步骤D)所得的连接产物转化至大肠杆菌DH5α，即：取连接产物20μl，加入200μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃90秒，再冰浴2分钟，加入800μl LB液体培养基(LB液体培养基的配方为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠，用双蒸水溶解至1000ml)，37℃、225rpm振摇60分钟，取200μl菌液均匀涂在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上(LB固体培养基的配方为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、15g琼脂粉，用双蒸水溶解至1000ml；所含氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)，37℃培养过夜；

F)挑取单个克隆菌落，置于3ml含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基上(LB液体培养基的配方与上述相同，所含氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)，37℃培养过夜；

G)提取步骤F)获得的菌液的质粒DNA；

H)所提质粒DNA经EcoRI和HindIII酶切鉴定，选出正确质粒，命名为shRNA1-B7-DC；

I)按照步骤A)至步骤H)的操作构建质粒shRNA2-B7-DC。

本实施例所构建的真核表达载体shRNA-B7-DC为闭合环状质粒，大小约为6295bp。载体pAS带有人H1启动子，不仅可以在体内由RNA聚合酶PolIII表达插入的序列，形成shRNA；还有与人H1启动子共表达的绿色荧光蛋白Rluc-GFP基因，可以通过绿色荧光来判断转染效率。

实施例2

将实施例1所构建的真核表达载体shRNA-B7-DC应用于体外抑制小鼠骨髓来源的树突状细胞中B7-DC基因的表达，具体步骤如下：

①大量制备shRNA-B7-DC高纯质粒；

②小鼠骨髓来源的树突状细胞的制备：按Inaba等介绍的常规方法进行；

③转染当天接种5×10⁵个生长状态良好的小鼠骨髓来源的树突状细胞于六孔板内，待其丰度达到70～80％时，参照Lipofecter脂质体转染试剂(碧云天生物技术研究所)说明书，将质粒shRNA-B7-DC转染至树突状细胞，其中：质粒DNA(μg)∶Lipofecter脂质体转染试剂(μl)为1.5μg∶4μl；

④转染48小时后，离心取细胞，每5～10×10⁶细胞加入1ml Trizol(美国Invitrogen公司)裂解细胞，获得细胞总RNA；

⑤RNA逆转录PCR扩增(RT-PCR)：以上述获得的细胞总RNA为模板，以oligo dT(20)为引物进行反转录，反应条件为42℃20分钟，99℃ 5分钟；取逆转录产物为模板直接进行常规PCR扩增；小鼠B7-DC基因上游引物序列为5′-GGAATTCCCTAAAGAAGTGTACACCG-3′，下游引物序列为5′-CCGCTCGAGTTAGACTTTGGGTT-3′。内参GAPDH上游引物序列为5′-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3′，下游序列为5′-CATTGGGGGTAGGAACACGGAAGG-3′；将上游引物10μM、下游引物10μM、由北京天为时代科技有限公司提供的2×Taq Plus PCR MasterMix 12.5μl及逆转录产物3μl，加ddH₂O补至25μl，将其放入PCR仪中，反应条件为95℃2分钟，94℃ 30秒，55℃30秒，72℃1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，得到小鼠B7-DC基因的PCR片段。

采用RT-PCR法从mRNA水平分析抑制效率，由Quantity One软件分析得知：小鼠骨髓来源的树突状细胞中B7-DC基因的表达在转染shRNA1-B7-DC、shRNA2-B7-DC质粒后分别被抑制了61.4％、45.9％。

实施例3

将实施例1所构建的真核表达载体shRNA-B7-DC应用于体外增强小鼠骨髓来源的树突状细胞刺激T细胞的增殖，具体步骤如下：

①大量制备shRNA-B7-DC高纯质粒；

③转染当天接种5×10⁵个生长状态良好的小鼠骨髓来源的树突状细胞于六孔板内，待其丰度达到70～80％时，参照Lipofecter脂质体转染试剂(碧云天生物技术研究所)说明书，将质粒shRNA-B7-DC及空载体pAS转染至树突状细胞，其中：质粒DNA(μg)∶Lipofecter脂质体转染试剂(μl)为1.5μg∶4μl；

④转染48小时，每孔加入丝裂霉素C(终浓度为30μg/ml)，在37℃继续孵育45分钟后，离心收集细胞，用RPMI 1640培养基(HyClone公司)洗4次，RPMI1640完全培养基重悬细胞；

⑤小鼠脾细胞的制备：取C57BL/6小鼠脾脏铜网研磨，用5ml Tris-NH₄Cl(3.735gNH₄Cl、1.3g Tris，加双蒸水至500ml，过滤除菌)缓冲液破坏红细胞，5min后加入PBS(10×PBS：16g NaCl、0.4g KH₂PO₄、5.8g Na₂HPO₄.12H₂O、0.4g KCl，加双蒸水定容至200ml，使用时十倍稀释)洗涤细胞2次，以RPMI 1640完全培养基重悬，加入96孔板，每孔1×10⁵个细胞；

⑥在96孔板内分别加入上述收集的转染和未转染的树突状细胞5×10³、1×10⁴、2×10⁴和1×10⁵个细胞/孔，每孔终体积200μl，各组设3个复孔，并设T细胞对照组和空白对照组，37℃，5％CO₂培养72h，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)检测T细胞增殖状况。

检测结果显示：shRNA-B7-DC转染细胞组刺激指数值(SI)均比空载体pAS转染细胞组和正常细胞组高(见图2所示)，说明shRNA-B7-DC转染的树突状细胞具有更强的刺激T细胞增殖的能力。

核苷酸序列表

<110>华东师范大学

<120>一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列设计和人工合成而得，用作引物。

<400>1

gatcccgctt cttacatgag gatagttcaa gagactatcc tcatgtaaga agctttttgg 60

aaa 63

<210>2

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>2

agcttttcca aaaagcttct tacatgagga tagtctcttg aactatcctc atgtaagaag 60

cgg 63

<210>3

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>3

gatccccttc agctgcatgt tctggttcaa gagaccagaa catgcagctg aagtttttgg 60

aaa 63

<210>4

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>4

agcttttcea aaaacttcag ctgcatgttc tggtctcttg aaccagaaca tgcagctgaa 60

ggg 63

Claims

1.一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

siRNA1-Oligo1：5′-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATCCTCATGTAAGAAGCTTTTTGGAAA-3′

siRNA1-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTTGAACTATCCTCATGTAAGAAGCGG-3′；

B)将载体pAS经BgI II、Hind III双酶切，用回收试剂盒回收；

D)取5μl siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火产物，加入1μl pAS经BgI II、Hind III酶切回收后的产物，1μl T4连接酶和2μl 10×连接缓冲液，加双蒸水补至20μl体系，置于4℃反应过夜；

E)将步骤D)所得的连接产物转化至大肠杆菌DH5α，即：取连接产物20μl，加入200μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃90秒，再冰浴2分钟，加入800μlLB液体培养基，37℃、225rpm振摇60分钟，取200μl菌液均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜；

F)挑取单个克隆菌落，置于3ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基上，37℃培养过夜；

G)用步骤F)获得的菌液提取质粒DNA；

H)所提质粒DNA经EcoR I和Hind III酶切鉴定，选出正确质粒，命名为shRNA1-B7-DC。

2.一种抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

siRNA2-Oligo1：5′-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGAACATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA-3′

siRNA2-Oligo2：5′-AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTTGAACCAGAACATGCAGCTGAAGGG-3′；

B)将载体pAS经BgI II、Hind III双酶切，用回收试剂盒回收；

C)siRNA2-Oligo1与siRNA2-Oligo2退火，即：用三蒸水稀释引物至10μmol/μl，取siRNA2-Oligo1与siRNA2-Oligo2各1μl，加TE补至20μl，95℃5分钟，70℃10分钟，10℃20分钟；

D)取5μl siRNA2-Oligo1与siRNA2-Oligo2退火产物，加入1μl pAS经BgI II、Hind III双酶切回收后的产物，1μl T4连接酶和2μl 10×连接缓冲液，加双蒸水补至20μl体系，置于4℃反应过夜；

G)用步骤F)获得的菌液提取质粒DNA；

H)所提质粒DNA经EcoR I和Hind III酶切鉴定，选出正确质粒，命名为shRNA2-B7-DC。

3.根据权利要求1或2所述的抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述LB液体培养基的配方为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠，用双蒸水溶解至1000ml。

4.根据权利要求1或2所述的抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述LB固体培养基的配方为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、15g琼脂粉，用双蒸水溶解至1000ml。

5.根据权利要求1或2所述的抑制小鼠B7-DC基因表达的shRNA真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述含有氨苄青霉素的LB液体培养基中氨苄青霉素的浓度为100μg/ml。