CN101260104A

CN101260104A - 抑制磷酸肌醇3-激酶β

Info

Publication number: CN101260104A
Application number: CNA2008100955731A
Authority: CN
Inventors: S·P·杰克逊; A·D·罗伯逊; V·肯切; P·汤普逊; H·普拉巴哈兰; K·安德逊; B·阿博特; I·贡卡尔夫斯; W·内斯比特; S·舍恩维尔德; D·赛利克
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2003-08-18
Publication date: 2008-09-10
Also published as: CN100430389C; CN1688575A

Abstract

本发明涉及磷酸肌醇(PI)3－激酶β的选择性抑制剂，所述选择性抑制剂在抗血栓形成疗法中的应用，以及通过检测化合物的PI 3－激酶β的选择性抑制活性来筛选可用于新的抗血栓形成疗法的化合物的方法。

Description

抑制磷酸肌醇3-激酶β

本申请是申请日为2003年8月18日、申请号为03824362.8、发明名称为“抑制磷酸肌醇3-激酶β”的PCT中国申请的分案申请。

发明背景

I.发明领域

本发明广泛涉及一种新的抗血栓形成疗法和用于新疗法的化合物。更特别的是，本发明涉及磷酸肌醇(PI)3-激酶β的选择性抑制剂，该选择性抑制剂在抗血栓形成疗法中的应用，以及通过检测化合物的PI 3-激酶β的选择性抑制活性来筛选可用于该新的抗血栓形成疗法的化合物的方法。

II.相关领域的描述

血小板是特殊的粘着细胞，它们在止血过程中起重要的作用。在正常情况下，血小板即不粘着，也不被血管内皮激活。然而，内皮的损伤或者斑块的破裂，使流动的血液暴露于各种血栓形成因素包括胶原、纤连蛋白和冯维勒布兰德因子(vWF)中。循环的血小板承受这些血栓形成因素的受体。凝血酶，血清素，和血管收缩神经血栓烷A2(TxA2).在血管损伤的情况下，经由糖蛋白(GP)Ib受体，在破裂的扁平区部位，血小板粘着于特定的内皮下粘着蛋白例如冯维勒布兰德因子(vWF)(血小板粘着)，变为激活状态(血小板激活)，产生若干物质包括腺苷二磷酸(ADP)、凝血酶、血清素和血管收缩神经血栓烷A2(TxA2)。被激活的ADP受体反过来将血小板表面上的GP IIb/IIIa受体激活。这些受体变成纤维蛋白桥的部位，将血小板连接在一起(血小板聚集)并随后形成血栓。

因此，先期形成的动脉粥样硬化斑块的突然破裂或裂开，引起过度的血小板粘着反应，导致血管闭塞的血小板血栓的形成。在冠状或脑循环中这些血栓的形成分别导致心肌梗塞和中风，它们合起来代表工业化社会中死亡的首要原因。血小板血栓形成也导致多种其它的临床症状，包括不稳定性心绞痛、猝死、暂时性局部缺血发作、暂时性黑内障以及四肢和内部器官的急性局部缺血。若干因素对破裂斑块的血栓形成可能性的增加有影响，包括(1)斑块中粘着性基底的高反应性，(2)损伤中组织因子的存在，以及(3)由粥样血栓形成过程造成血管内腔变窄而引起的高剪切的直接的血小板激活效应。

现有的抗血栓形成疗法主要以血栓形成过程中的一个或多个关键步骤为目标。通过给予合适的抗凝血药，包括一种或多种香豆素衍生物(例如华法林和双香豆素)或带电的聚集物(例如肝素、水蛭素或水蛭素类似物)，或通过使用抗血小板药(例如阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定、双嘧达莫或几种GPIIb/IIIa受体拮抗剂中的一种)，在许多情况下能够减少或消除血块。然而，由于副作用例如出血、再闭塞、“白血块”综合征、刺激、生育缺陷、血小板减少和肝功能障碍的原因，抗凝血药和血小板抑制剂受到很大的限制。此外，长期给予抗凝血药和血小板抑制剂能够显著增加威胁生命的疾病或出血的风险。

因此，为了避免现有抗血栓形成的前述缺陷，需要开发一种选择性地以对病理学血栓形成具有关键意义的过程为目标而又不妨碍正常止血的新的抗血栓形成疗法。

流变学紊乱(高剪切和湍流)在促进病理学血栓中起着主要作用，因此这样的一个策略应该是，通过以血小板中的机械性感觉要素为目标，削弱血小板高剪切应力的激活效应。然而，在本发明之前，对于切应力诱导的血小板活化而不是对止血具有重要意义的信号作用，还没有被确认。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供瓦解在高剪切状态下发生的血小板聚集以及粘着的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的选择性PI 3-激酶抑制剂。

本发明的另一个目的是提供一种抗血栓形成方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的选择性PI 3-激酶β抑制剂。按照该方法，通过靶向作用于对由剪切诱导的血小板活化具有重要意义的PI3-激酶β，能够实现对血栓形成的特异性抑制而不影响正常止血。因此本发明不会牵涉由正常止血破坏而引起的副作用例如出血时间的延长。

因此，本发明的另一个目的是提供抑制由剪切诱导的血小板活化的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的选择性PI3-激酶β抑制剂。通过向有此需要的患者给药有效量的PI3-激酶β抑制剂，提供预防或治疗心血管疾病例如冠状动脉阻塞、中风、急性冠状动脉综合症、急性心肌梗塞、再狭窄、动脉粥样硬化和不稳定型心绞痛的方法，也是本发明的一个目的。在此方法中，PI3-激酶β抑制剂的使用能够避免由破坏正常止血引起的副作用例如出血时间的延长。

本发明优选使用通过下述方法确定的选择性PI 3-激酶β抑制剂，所述方法包括将候选化合物与分离的PI 3-激酶同种型接触，检测所述化合物对每一同种型的抑制效果，其中所述化合物对每一同种型的检测效果的比较决定所述化合物作为选择性PI 3-激酶β抑制剂。

因此，本发明的另一个目的是提供PI 3-激酶β的筛选方法，所述方法包括将候选化合物与分离的PI 3-激酶同种型接触，检测所述化合物对每一同种型的抑制效果，其中所述化合物对每一同种型的检测效果的比较决定所述化合物作为选择性PI 3-激酶β抑制剂。

在生化测定中，相对于其它类型的I PI 3-激酶同种型，选择性PI 3-激酶β抑制剂对PI 3-激酶β抑制的选择性优选是至少约≥10倍，更优选≥20倍，更优选≥30倍。这样的其它类型的选择性I PI 3-激酶包括PI 3-激酶α、γ和δ。

本发明的另一个目的涉及抗血栓形成的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的选择性PI 3-激酶β抑制剂，

条件是所述抑制剂不是式(II)化合物：

其中，

R是H、OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、芳基或(CH₂)_n-芳基；

R¹是H、OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR³)_n-芳基、NR³-C₁-C₆烷基、NR³-环烷基、NR³-(CHR³)_n-芳基、(CHR³)_n-NR³-烷基、(CHR³)_n-NR³-环烷基、(CHR³)_n-O-芳基、(CHR³)_n-O-烷基、(CHR³)_n-O-环烷基、O-(CHR³)_n-芳基、S-(CHR³)_n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1、或2，且所述烷基、环烷基或芳基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R³、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OR³、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR³、NHSO₂R³、CONHR³或SO₂NHR³；并且

R³是H、或取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基

但是选自下列的式(II)化合物除外：

9-(3-吡啶基甲基)氧基-2-吗啉基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-140)；

7-甲基-9-苯基氨基甲基-2-吗啉基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-183)；

8-(4-甲基苯基)2-)4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-113)；

8-(4-氟苯氧基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-121)；

2-吗啉基-8-(苯基甲基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-90)；

2-(4-吗啉基)-8-(4-氟-2-甲基苯基)氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-184)；

9-[[(2-氯苯基)-甲基]氨基-7-甲基-2-(4-吗啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-167)；

9-[[(2-甲氧基苯基)-甲基]氨基]-7-甲基-2-(4-吗啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-137)；

7-甲基-2-(4-吗啉基)-9-[(苯基甲基)氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-126)；

9-[[(4-氟-2-甲基苯基)氨基]-7-甲基-2-(4-吗啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-170)；

7-甲基-2-(4-吗啉基)-9-[[(1R)-l-苯基乙基]氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-123)；

7-甲基-2-(4-吗啉基)-9-[(2-吡啶基甲基)氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-161)；

9-[[(4-氯苯基)甲基]氨基]-7-甲基-2-(4-吗啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-108)；

2-(4-吗啉基)-9-(苯基甲基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-040)；

7-甲基-9-(N-甲基-N-苯基)氨基甲基-2-(4-吗啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-195)；

2-(4-吗啉基)-8-(苯基甲基)氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-102)；

2-(4-吗啉基)-8-(苯基甲基)氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-204)；

2-(4-吗啉基)-8-苯基氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-324)；

8-(3-氯苯基)氧基-2-(4-吗啉基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-259)；

8-(3-甲基苯基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-127)；

8-(2-氟苯基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-143)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(3-吡啶基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-304)。

在本发明的另一个目的中，抗血栓形成的方法涉及施用式(I)的选择性PI 3-激酶β抑制剂：

其中

R是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

R₁是H、OH、OCH₃、OCF₃、F、Cl、CF₃、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

R₂是R或S构型的H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

R₃是一个或多个H、F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCH₃、OCH₂F、OCHF₂、OCF₃、OR、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO₂R、CONHR或SO₂NHR；

X是C或N，且Y是N或O。

在本发明的另一目的中，抗血栓形成的方法涉及施用式(III)的选择性PI 3-激酶β抑制剂：

其中X和Y分别是C和O，或分别是C和NH，或都是N；

R是H、OH、OCH₃、OCF₃、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、芳基或(CH₂)_n-芳基；

R₁、R₂和R₃独立地为H、OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’³)_n-芳基、NR’³-C₁-C₆烷基、NR’³-环烷基、NR’³-(CHR’³)_n-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-烷基、(CHR’³)_n-NR’³-环烷基、(CHR’³)_n-O-芳基、(CHR’³)_n-O-烷基、(CHR’³)_n-O-环烷基、O-(CHR’³)_n-芳基、S-(CHR’³)_n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，且所述烷基、环烷基或芳基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R’³、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OR’³、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’³、NHSO₂R’³、CONHR’³或SO₂NHR’³；并且

R’³是H、或取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基。

本发明的一个目的涉及具有式(III)的新化合物：

其中X和Y分别是C和O，或分别是C和NH，或都是N；

在本发明的另一目的中，抗血栓形成的方法涉及给药式(I)的2-吗啉代取代的衍生物，其中：

R是H、C₁-C₆支链或直链烷基或芳基；

R₁是H、OH、OCH₃、OCF₃、F、Cl、CF₃、C₁-C₆支链或直链烷基；

R₂是R或S构型的H、C₁-C₆支链或直链烷基或芳基；

R₃是一个或多个H、F、Cl、Br、CN、CO₂H、CO₂R、NO₂、CF₃、支链或直链C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCH₃、OCH₂F、OCHF₂、OCF₃、OR、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO₂R、CONHR或SO₂NHR；

X是C或N，并且Y是N或O。

在本发明的另一目的中，抗血栓形成的方法涉及给药选自下列的PI 3-激酶抑制剂：

(±)-7-甲基-9-{[甲基(苯基)氨基]甲基}-2-吗啉-4-基吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-195)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-221)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(4-氟苯基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-224)；

(±)-9-[1-(3，4-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-237)；

(±)-9-[1-(2，5-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-238)；

(±)-9-[1-(3，5-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-239)；

(±)-9-[1-(4-氟-2-甲基苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-240)；

(±)-9-[1-(4-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-243)；

(±)-9-[1-(3，4-二氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-244)；

(±)-9-[1-(3-氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-247)；

(±)-9-[1-(3-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-248)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(2-噻唑基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-261)；

(±)-7-甲基-9-[1-(3-甲基苯基氨基)乙基]-2-吗啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-262)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(3-三氟甲基苯基氨基)乙基]-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-264)；和

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(2-吡啶基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-295)；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸(KN-309)；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯(KN-321)；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苄腈(KN-320)；

(±)-7-甲基-2-(吗啉-4-基)-9-(1-{[2-(2H-四唑-5-基)苯基]氨基}乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-325)；

(±)-2-(4-吗啉基)-8[1-(苯基氨基)乙基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-280)。

本发明的一个目的是提供式(III)化合物，其中R¹选自CH₃、C₂H₅、

还涉及一种具体的式(III)化合物，其中R是甲基，且R¹是

还涉及一种具体的式(III)化合物，其中R是甲基，且R¹是

还涉及一种具体的式(III)化合物，其中R是H，且R¹是

还涉及一种具体的式(III)化合物，其中R是H，且R¹是

本发明也涉及一种抑制患者中的磷酸肌醇3-激酶的方法，所述方法包括向患者给药一定量的能有效抑制患者中磷酸肌醇3-激酶的式(III)化合物。

本发明也涉及预防或治疗心血管疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的式(III)化合物。

本发明也涉及预防或治疗呼吸疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的式(III)化合物。

本发明也涉及预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的式(III)化合物。

本发明也涉及预防或治疗与白细胞功能障碍有关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药有效量的式(III)化合物。

本发明方法的一个目的涉及给药下面的抑制剂：

本发明方法的一个目的涉及给药6-甲基-8-[1-(苯基氨基)乙基]-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-4-酮。

本发明的一个目的涉及给药6-甲基-8-{1-[(2-氨基苯基)氨基]乙基}-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-4-酮。

本发明也涉及选自下列的新化合物：

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苄腈；

(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯和

(±)-7-甲基-2-(吗啉-4-基)-9-(1-{[2-(2H-四唑--基)苯基]氨基}乙基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮。

因此，提供抑制PI 3-激酶β的方法，包括向患者给药一定量的一种具有式(I)的化合物，其中所述的量能够有效抑制患者中的PI 3-激酶β，仍然是本发明另外一个目的。

附图简述

图1A-1E代表证实用LY294002或渥曼青霉素抑制PI 3-激酶消除血小板对加速剪切的反应的试验结果。应用基于体外流动的粘着测定能够使我们同时分析血小板粘着动力学和在固定的von Willebrand因子(vWf)上的活化(通过监测胞质钙流量)。简单的说，将分离的血小板经由vWf(100μg/ml)包被的微毛细管灌注，并用共焦显微镜实时分析胞质钙流量。

图1A图解显示，在各种血流状态下与vWf相互作用的形成不可逆粘着的血小板的比例。在图(i)中，将分离的血小板以恒定的剪切速率(600、1800或10,000s^-1)灌注到vWf基质上，在图(ii)中，让分离的血小板在vWf基质上沉积，并随后使之以10,000.s^-2的剪切速率梯度(↑Δγ)加速。

图1B显示单个血小板在固定的vWf表面上的状况；该图表示胞质钙流量(Δ[Ca²⁺]_c)曲线和单个血小板随时间(秒)的伴随置换(μm)关系曲线。在施加加速剪切速率(↑Δγ)之前，以1秒的间隔让分离的血小板在vWf表面上沉积。箭头(↓)表示剪切施加点：持续的，表示血小板经历与固定粘着相联系的摆动的Δ[Ca²⁺]_c；短暂的，表示血小板经历伴随短暂固定粘着的Δ[Ca²⁺]_c峰值；波动的，表示血小板显示最小的Δ[Ca²⁺]_c和在vWf表面上的快速移位。

图1C图解显示，在用载体(DMSO＜0.25％v/v)、0.5U/ml腺苷三磷酸双磷酸酶、1mM阿司匹林或25μM LY294002预处理后，表现持续、短暂或波动状态的vWf粘着的血小板的比例。

图1D显示代表性单个血小板记录，说明用GPIb/V/IX结合调节体、利托菌素(1mg/ml)处理后在固定的vWf表面上的GPIb/V/IX依赖性Δ[Ca²⁺]_c。在分析之前，将血小板用整合素α_IIbβ₃拮抗剂、Aggrastat(200nM)处理10分钟：固定的，表示在37℃没有剪切的情况下将血小板在vWf包被的板条表面上放置10分钟。在10分钟时将Δ[Ca²⁺]_c监测1.5分钟；恒定γ，表示以1800.s^-1的恒定剪切速率下将血小板灌注到vWf基质上；↑Δγ(0-10,000.s^-1)，表示让血小板在固定vWf表面上沉积，随后以1秒的间隔使γ逐渐增加至10,000.s^-1。箭头(↓)表示剪切施加点；+LY294002，表示用20μM PI 3-激酶抑制剂LY294002预处理10分钟后，将↑Δγ施加于血小板上。

图1E显示GPIb/V/IX粘着血小板的比例，表现以1秒或60秒间隔高频率Δ[Ca²⁺]_c对↑Δγ的反应。

新PI 3-激酶β同种型选择性抑制剂的特性

图2A显示TGX 221的选择性，使用分离的PI 3-激酶同种型进行，其中通过产生PI 3-激酶产物磷脂酰肌醇3-磷酸(PtdIns(3)P)测定活性。上部条形图说明用薄层色谱法检测PtdIns(3)P的生成以及由p110α和p110β同种型中的TGX-221产生的剂量反应抑制。曲线图表示三个主要血小板PI 3-激酶同种型p110α、p110β和p110γ的TGX-221抑制剂量反应曲线。

TGX-221的功能分析

图3A说明表示在锥-板粘度计中由剪切(5000sec^-1，2分钟)激活后，TGX-221对血小板中脂质产生的剂量反应抑制的条形图。施加于锥板装置后，随之吸取血小板样本并用Sysmex KN-21N血液学分析仪分析单个血小板计数。

图3B表示说明在各种TGX-221浓度中，相对于未处理(对照)的样本，单个血小板计数的成比例增加。

通过用HPLC初始分离脂质以及用明确的PtdIns(4，5)P₂和PtdIns(3，4)P₂标准物鉴定脂质峰值，来测定在完整血小板中的脂质产物PtdIns(4，5)P₂和PtdIns(3，4)P₂。脂质被积分和标准化成施加的总脂质，并作为未处理(对照)样本的分数表示。

证明由TGX-221抑制PI 3-激酶消除血小板对加速剪切的反应

图4A显示群体分析的条形图，说明用0.5μM TGX-221处理对vWf粘着血小板的比例的影响，表示以1秒的间隔暴露于最高达10,000.s^-1的剪切速率梯度(↑Δγ)后的持续、短暂或波动状态(上面所述)。

图4B显示代表性信号血小板记录，说明在vWf表面上的GPIb/V/IX依赖性Δ[Ca²⁺]_c。如上所述，恒定γ；血小板暴露于1800s^-1的剪切速率，↑Δγ(10,000.s^-2)；血小板暴露于剪切加速，↑Δγ(10,000.s^-2)+TGX-221(0.5μM)；将↑Δγ施加于用0.5μm TXG-221预处理10分钟的血小板。

图4C显示FACS分析，说明生理学激动剂刺激后整合素α_IIbβ₃的活化水平(通过PAC-1结合确定)以及P-选择蛋白的表面表达：对照，血小板被再悬浮于Tyrodes缓冲液+1mM CaCl₂/MgCl₂中(无激动剂处理)；DMSO，激动剂刺激之前将血小板用0.25％DMSO(载体)预处理；TGX-221，激动剂刺激之前将血小板用0.5mM TGX-221预处理10分钟。激动剂：凝血酶，1U/ml；ADP，12.5mM；U46619，1μM；可溶性胶原10μg/ml。

TGX-221的体内抗血栓形成活性

图5A显示，在Folts模型中，每30分钟期间，给药前(a；-30-0分钟)和给药后(b-d；分别1-30、31-60&61-90分钟)，在戊巴比妥麻醉的大鼠(A)和兔(B)中，载体(丙二醇)或TGX-221对循环的脑动脉血流减低(CFR)的平均数量的影响。在给药和给药后90分钟，对CFR监测30分钟。n：动物数量。误差范围是±1SEM。

图5B显示，在电解模型中，在戊巴比妥麻醉的大鼠中，在电解损伤后(7mA电流4分钟(时间-4-0分钟)零血流；在0分钟放开动脉夹具)载体(丙二醇)或TGX-221对颈动脉血流(ml/分钟每100g体重)的影响。在时间9分钟(即施加电流5分钟以前)以静脉内快速浓注方式给予治疗。误差范围是来自重复测定ANOVA的平均SEM。图5B插入图说明，在戊巴比妥麻醉的大鼠中，电解损伤后治疗对颈动脉血流体积(刺激后60分钟期间内血流曲线下面积)的影响。误差范围是±1SEM。

图5C显示，在分别用TGX-221、TGX-221+肝素、阿司匹林、氯吡格雷、氯吡格雷+肝素、氯吡格雷+肝素+TGX-221、阿司匹林+肝素、和阿司匹林+肝素+TGX-221治疗的氟烷麻醉的大鼠中，大鼠尾巴出血时间的比较。

图6A和6B显示各种浓度的TGX-286对ROS反应的作用。

图7显示各种浓度的TGX-286对弹性蛋白酶释放的作用。

优选实施例的详细描述

两个主要的血小板粘着受体GPIb/V/IX(“GPIb”)和整合素α_IIbβ₃在流体学扰动状态下(高剪切和剪切快速加速)相对于血小板活化具有独特的机械性感觉功能。本发明者发现，通过两个受体的信号传输受到剪切速率快速加速(↑Δγ)的调节，包括通过PI 3-激酶依赖性信号传输过程的血小板激活。

因此，本发明者阐明了在高剪切状态下的决定性信号传输机制，从而确认在病理学血流状态下PI 3-激酶β作为引起血小板活化的因素。阻断特定血小板粘着受体的现有抗血小板治疗法不能在病理学和正常的止血血小板活化之间进行识别。因此，本发明者的这一发现，即PI 3-激酶β的选自性抑制能够避免由剪切速率的病理学增加引起的血小板活化而又不影响由生理学激动剂引起的血小板活化，为抗血栓形成治疗法提供了一种新的独特的方法，包括用于这种疗法的新的化合物。

如图1A所说明，剪切环境调节血小板的活化和血小板对vWf的粘着。与暴露于稳定状态剪切的血小板比较，暴露于剪切速率加速(↑Δγ)导致更多的血小板活化和稳定的粘着接触。通过监测胞质钙流量而对血小板活化进行的更为周密的检查，揭示↑Δγ对GPIb和整合素α_IIbβ₃钙信号传输具有特殊而令人称道的影响。在整合素钙信号传输的情况下，↑Δγ引起特定在血小板中保持的能够继续稳固地粘着于vWf的快速启动钙信号传输。这种由剪切调节的整合素α_IIbβ₃钙信号的发生与血小板激动剂(ADP和TXA₂)无关，但完全取决于PI 3-激酶(图1B和1C)。↑Δγ引起新的GPIb钙信号，其与先前在Nesbit等人，2002，J.Biol.Chen.，277：2965.中所辨别的GPIb钙瞬态截然不同(图1D)。↑ΔγGPIb钙信号的三个定义特征包括(1)它对于γ的加速速率的严格依赖(图1E)，(2)钙响应的增加的频率(图1D)，和(3)它对PI 3-激酶抑制剂的敏感性(1D)。

因为GPIb和整合素α_IIbβ₃钙信号传输取决于PI 3-激酶，所以PI 3-激酶导致由剪切速率(↑Δγ)触发的GPIb和整合素α_IIbβ₃钙信号的消除。

结构非相关的PI 3-激酶抑制剂例如LY294002或渥曼青霉素(见下文)阻止剪切引起的血小板聚集的能力的初始研究，对于剪切引起的血小板活化，提出PI 3-激酶的一个重要的机械性感觉信号传输功能的设想。由于这些化合物在各种PI 3-激酶同种型中没有显示，所以，仍然不清楚哪一个特别的PI 3-激酶同种型或同种型涉及与剪切有关的血小板活化。

本发明选择性抑制PI 3激酶β的例证性化合物显示于下：

式(I)的2-吗啉代取代的衍生物定义于下：

其中

X是C或N，Y是N或O；

R是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

R₃是一个或多个H、F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCH₃、OCH₂F、OCHF₂、OCF₃、OR、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO₂R、CONHR或SO₂NHR。

除了作为PI 3-激酶β活性抑制剂的式(I)化合物以外，新的选择性抑制PI 3-激酶β的式(III)化合物定义如下：

其中X和Y分别是C和O，或分别是C和NH，或都是N；

用于本发明方法的优选的化合物包括式(I)的2-吗啉代取代的吡啶并嘧啶衍生物，其中

R是H、C₁-C₆支链或直链烷基或芳基；

R₂是R或S构型的H、C₁-C₆支链或直链烷基或芳基；

X是C或N，并且Y是N或O。

某些具体式(I)抑制剂的实例包括：

(±)-9-[1-(3，5-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-吗啉-4-基吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-239)；

(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-[1-(2-吡啶基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-295)。

在本描述的上下文中，术语“烷基”指直链或支链的饱和脂族烃基。优选地，烷基具有1-6个碳原子，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基任选被一个或多个选自下列的基团取代：F、Cl、Br或I；CN；CO₂R₃；NO₂；CF₃；取代或未取代的C₁-C₆烷基；取代或未取代的C₃-C₆环烷基；取代或未取代的芳基；OCF₃、OR₃、取代或未取代的胺；NHCOR₃；NHSO₂R₃；CONHR₃；或SO₂NHR₃，其中R₃是H、取代或未取代C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基。

术语“环烷基”指非杂环(例如碳环)或杂环。在这方面，非杂环的实例是取代或未取代的环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环己烷二酮、环戊烷二酮、醌等。适宜的杂环烷基基团包括取代或未取代的吡咯烷、哌啶、哌嗪、2-哌啶酮、氮杂环己-2-酮和吗啉基团。环烷基任选在一个或多个位置上被下列基团取代：卤素例如F、Cl、Br或I；CN；CO₂R₃；NO₂；CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基；取代或未取代的C₃-C₆环烷基；取代或未取代的芳基；OCF₃、OR₃、取代或未取代的胺；NHCOR₃；NHSO₂R₃；CONHR₃；或SO₂NHR₃，其中R₃是H、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基。

术语“芳基”指芳族或芳族杂环。芳基的实例是吡咯烷、噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、呋喃、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，2，5-噁二唑、1，3，4-噁二唑、1，2，3，4-恶三唑、1，2，3，5-恶三唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，2，5-噻二唑、1，3，4-噻二唑、1，2，3，4-噻三唑、1，2，3，5-噻三唑、四唑、苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、茚、萘、吲哚、异吲哚、中氮茚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、2，3-二氮杂萘、喹唑啉、喹喔啉、1，5-二氮杂萘、蝶啶、芴、咔啉、吖啶、吩嗪、和蒽。芳基基团任选在一个或多个位置上被下列基团取代：卤素例如F、Cl、Br或I；CN；CO₂R₃；NO₂；CF₃；取代或未取代的C₁-C₆烷基；取代或未取代的C₃-C₆环烷基；取代或未取代的芳基；OCF₃、OR₃、取代或未取代的胺；NHCOR₃；NHSO₂R₃；CONHR₃；或SO₂NHR₃，其中R₃是H、取代或未取代C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基。

此中所用的术语“选择性PI 3-激酶β抑制剂”指一种化合物，其对PI 3-激酶β的抑制效果至少比PI 3-激酶家族的其它同种型≥10倍，优选≥20倍，更优选≥30倍。与传统上和通常称为PI 3-激酶抑制剂例如LY294002或渥曼青霉素的化合物相比，“选择性PI 3-激酶β抑制剂”化合物被认为对PI 3-激酶β更具选择性。选择地抑制PI 3-激酶β表现或活性的任何类型的化合物都能够被用作本发明方法的选择性PI3-激酶β抑制剂。

已经发现本发明吡啶取代的化合物能够抑制脂质信号传输酶PI 3-激酶，其在高剪切血流状态下调节血小板粘着过程，并因而表现出抗血栓形成活性以及下面相信描述的其它药理学特性。PI 3-激酶产生3-磷酸化PI第二信息，包括磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI(3)P)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PI(3，4)P₂)、磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PI(3，4，5)P₃)。这些第二信息被认为调节不同范围的细胞现象，包括葡萄糖输送、脱噬作用阻止、细胞生长和细胞支架重组。

关于在病理生理学相关流动状态下PI 3-激酶β抑制剂对血小板粘着的影响，没有发表的报告。尽管如此，已经发现PI 3-激酶，特别是在生理学流动状态下，在调节血小板粘着方面起关键作用。因此，用本发明化合物的血小板治疗来抑制PI 3-激酶、(PI(3)P)、(PI(3，4)P₂)和(PI(3，4，5)P₃)的磷酸化脂质的形成，在降低流动状态下血小板粘着到vWf模型方面产生显著的效果。这种血小板粘着的降低与异常的血小板扩展和血栓形成相联系。因为与剪切有关的血小板粘着和活化在动脉血栓形成中具有重要意义，所以PI 3-激酶对于心血管疾病的治疗介入是一个重要的靶目标。

这些PI 3-激酶抑制剂在其它各种疾病中也具有潜在治疗应用意义。例如，在血管分支即血管平滑肌细胞中，Thyberg，1998，EuropeanJournal of Cell Biology 76(1)：33-42，和在肺(气管平滑肌细胞)中，Krymskaya等人，1999，American Journal of Physiology 277：65-78，PI 3-激酶在促进平滑肌的增生中起重要作用。血管平滑肌细胞的过度增殖在动脉粥样硬化血小板的形成和在侵袭性血管处置后新血管内膜增生的发展中起重要作用。Scwartz等人，1984，Progress inCardiovascular Disease 26：355-372；Colwes等人，1978，LaboratoryInvestigations 39：141-150。而且，在气喘和慢性气管炎中，气管平滑肌细胞的过度增生导致COPD的发展。因此PI 3-激酶抑制剂可以被用来预防血管再狭窄、动脉粥样硬化和COPD。

PI 3-激酶也在调节肿瘤细胞和在这些细胞经历脱噬作用生长中起重要作用。Sellers等人，1999，The Journal of Clinical Investigation104：1655-1661。另外，由脂质磷酸酶PTEN造成的PI 3-激酶脂质产物PI(3，4，5)P₃和PI(3，4)P₂的调节失控，在许多人恶性肿瘤的发展中起重要作用。Leevers等人，1999，Current Opinion in Cell Biology11：219-225。因此，PI 3-激酶抑制剂可以被用于人肿瘤的治疗。

PI 3-激酶在白细胞功能(Fuller等，1999，The Journal ofImmunology 162(11)：6337-6340；Eder等，1998，The Journal ofBiological Chemistry 273(43)：28025-31)和淋巴细胞功能(Vicente-Manzanares等，1999，The Journal of Immunology 163(7)：4001-4012)中也起重要作用。例如，粘着于发炎的内皮的白细胞涉及通过与PI 3-激酶有关的信号传输过程激活内源性白细胞整联蛋白。另外，嗜中性白细胞中的氧化爆发(Nishioka等，1998，FEBS Letters 441(1)：63-66)和细胞骨架再组织(Kirsch等，1999，Proceedings NationalAcademy of Sciences 96(11)：6211-6216)似乎涉及PI 3-激酶的信号传输。因此，PI 3-激酶抑制剂可用于减少白细胞粘着和炎症部位的激活，因此可用于治疗急性和/或慢性炎性疾病。PI 3-激酶也在淋巴细胞增殖和激活中起重要作用。Fruman等，1999，Science 283(5400)：393-397。已知淋巴细胞在自身免疫疾病中的重要作用，PI 3-激酶抑制剂可用于治疗这类疾病。

通过例如根据预先确定的程度测定每一化合物抑制活性的浓度然后将结果加以比较，可以确定作为酶活性的抑制剂的化合物的相对效能。通常，优选的测定是在生化分析中抑制50％活性的浓度，即50％抑制浓度或“IC₅₀”。IC₅₀可以用本领域已知的技术进行测定。

按照本发明，已经确认血小板中的PI 3-激酶β具有关键的和剪切引起的血小板激活和闭塞性血栓形成有关的机械性感觉功能。PI 3-激酶β抑制剂TGX-221通过GPIb和整合素α_IIbβ₃对机械性传导作用的分析，证明对于通过两个受体的↑Δγ引起的钙流出，PI 3-激酶β是绝对的必要条件(图4A和图4B)。TGX-221对钙流出的作用是剪切选择性的，因为它不抑制γ依赖的GPIb钙信号传输(图4B)。二氢，其它由凝血酶、胶原和ADP引起的血小板的活化反应，例如整合素α_IIbβ₃活化(PAC-1结合)和α颗粒分泌(P-选择蛋白表达)，不受TGX-221影响(图4C)。

PI 3-激酶β的信号传输控制两个主要血小板粘着受体GPIb和整合素α_IIbβ₃的下流，在流变学扰动条件下促进胞质液的钙流出和血小板活化。由于这些受体的机械性感觉功能，PI 3-激酶β的抑制能够消除闭塞性血栓形成而不妨碍止血所要求的的正常血小板功能反应。

为了研究本化合物的抗血栓形成潜能，使用两个截然不同的血栓形成模型；修改的Folts鼠和兔模型(Folts等人，1991，Circulation，IV-3-IV-14)和鼠电解损伤颈动脉模型(Bush等人，1991，Faseb J.，4：3087)。用2mg/kg发明化合物例如TGX-221注射试验动物，在两个模型中(图5A和图5B)完全阻止闭塞性血栓的形成而同时在损伤后60分钟期间维持肠颈动脉血流体积(图5B插入图)。而且，在Folts和电解研究的损伤的颈动脉中，TGX-221对基线动脉血压、心律或血流都没有影响(没有显示数据)。意义重要的是，如对由尾巴或耳朵出血时间或者当联合给药时由其它抗凝血剂例如肝磷脂、阿司匹林或氯吡格雷引起的延长出血进行的分析，TGX-221对这些动物中的正常止血没有不利影响。

于此概述的本发明解释了与剪切引起的血小板活化和闭塞性血栓形成有关的血小板中的PI 3-激酶β的关键机械性感觉功能。在不干涉与止血有关的正常血小板的功能性反应的情况下，PI 3-激酶β抑制剂TGX-221消除闭塞性血栓形成的证明，解释这种新颖的脂质激酶抑制剂作为用于抗血栓形成疗法的一种重要的新药剂。

有利的是，在预防或治疗疾病的本发明方法中，可以将一种本化合物的有效量以剂量的形式给药。在优选的实施方案中，剂量优选以片剂(例如用于口服、舌下和口腔给药而制成的片剂)、胶囊(例如含有粉末、液体或控制释放剂型的胶囊)、静脉内制剂、鼻内制剂、肌肉注射制剂、糖浆、栓剂、气雾剂、舌下制剂、经皮制剂、或阴道栓剂。优选地，剂量含有约5-50mg化合物，更优选含有约25-300mg化合物。

本发明的另一个方面涉及含有吡啶取代的本发明化合物以及一种或多种可药用载体和/或溶剂的药物组合物。下文，术语“活性成分”可以是任何吡啶取代的本发明化合物，或者它们的可药用盐、溶剂化物、或功能性衍生物。

这种药物组合物的给药优选用任何方便的方法进行。剂量的给药可以每天、周、月或在其它适宜的时间间隔，经由例如口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、皮内、或栓剂或通过植入途径(例如用缓慢释放分子)进行。如果活性化合物以片剂形式给药，该片剂含有粘合剂例如西黄蓍胶、玉米淀粉、或明胶；崩解剂，例如藻酸；和滑润剂例如硬脂酸镁。

适宜注射用的药物组合物包括无菌水溶液或分散液，和用于无菌注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末，或者以乳剂或其它适宜于局部施用的形式。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、它们的适宜的混合物、和菜籽油。例如，通过使用包衣例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所要求的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。使用各种抗菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以避免由微生物造成的污染。优选可以包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸附剂例如一硬脂酸铝和明胶，可以延长注射组合物的吸附。

通过以要求的量将活性化合物与上面列举的各种其它成分在适宜的容积中混合，制备无菌注射溶液。一般地，通过将各种灭菌的活性化合物混合到含有基础分散介质的无菌载体和一种或多种上述的成分中，制备分散液。在无菌粉末的情况下制备无菌注射溶液，优选的制备方法是，将真空干燥和冻干产生的活性化合物粉末加上从先前无菌过滤溶液得到的所要求的任何辅助成分。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可以含有结合剂例如树脂、阿拉伯胶、玉米淀粉或凝胶；赋形剂例如磷酸二钙、崩解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；滑润剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精；或者调味剂例如薄荷油、冬青油或樱桃香料。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，其可以含有液体载体。各种各样的其它材料可以作为包衣以改善剂型单位的物理外形。例如可以将片剂、丸剂或胶囊用虫胶、糖或两者包衣。糖浆剂或酏剂也含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、染料和调味剂例如樱桃或桔子香料。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应当是药物学纯净的并且在使用量上基本无毒性。另外，可以将活性化合物混合到延迟释放制剂和剂型中。

通过参考下面仅作为例证说明而陈述的实施例，对本发明予以进一步描述。这些实施例中的任何东西都不应当被作为本发明全体范围的限制。

合成实施例

实施例1.合成(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-221：R₁＝CH₃，R₂＝CH₃，R₃＝H)

化合物2：在冰冷的温度下向2-氨基-3-溴-5-甲基吡啶(1)(45g，0.45mol)在二氯甲烷(500mL)内的溶液中加入丙二酰二氯(25mL，0.25mol)。在室温将混合物搅拌48小时。通过过滤收集沉淀的淡黄色固体，用二氯甲烷(3×100mL)洗涤，然后在真空下干燥，得到产物2(52.5g)。将滤液减压浓缩。将所得残余物悬浮于水中并搅拌1小时。把溶液过滤，然后将滤液用固体NaNCO₃中和，得到未反应的2-氨基-3-溴-5-甲基吡啶(6g)。无需进一步纯化将粗制化合物用于下一合成步骤。

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.72(s，1H)，8.28(s，1H)，5.50(s，1H)，2.33(s，3H).

化合物3：在冰冷温度下，向化合物2(12.75g，0.05mol)在二氯甲烷(300mL)内的悬浮液中加入三乙胺(14mL，0.1mol)，然后加入甲磺酰氯(5.42mL，0.07mol)。然后在室温下将反应混合物搅拌0.5小时。加入吗啉(13mL，0.15mol)后，将反应混合物在回流温度下搅拌24小时。将混合物减压浓缩，然后用H₂O(300mL)稀释，得到淡黄色沉淀物。把固体过滤，在减压干燥，鉴定为酮3(6.8g，通过HPLC分析纯度＞80％)。无需进一步纯化将产物3用于下一反应步骤。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.69(s，1H)，7.84(s，1H)，5.58(s，1H)，3.80(m，4H)，3.70(m，4H)，2.32(s，3H).

化合物4：向溴化物3(35mol)在DMF(70mL)内的溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(18mL)、丁基乙烯基醚(13mL)和二氯化1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁钯(II)(1.09g，1.5mol)。在120℃下把悬浮液(20分钟后变为均相)搅拌16小时。将反应混合物冷却并倒入1M HCl(200mL)的冰冷溶液中，然后搅拌1小时。用二氯甲烷萃取该溶液，然后将有机层用水洗涤，在Na₂SO₄上干燥(^＊避免用NaCl水溶液洗涤，因为溶液会变成乳液)。在真空中浓缩后，将黑色残余物用柱色谱法纯化(硅胶、3∶1乙酸乙酯/石油醚)，得到淡黄色固体。¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ8.86(s，1H)，7.84(s，1H)，5.63(s，1H)，3.79(m，4H)，3.62(m，4H)，2.77(s，3H)，2.36(s，3H).

TGX 221：向酮4(1mmol)在甲苯(10mL)内的的溶液加入苯胺(3mmol)并回流4小时。将反应混合物逐渐冷却，然后在冰冷温度下加入硼氢化钠(1mmol)。在室温下将反应混合物进一步搅拌1小时。用二氯甲烷(30mL)稀释该溶液，将有机层用水、盐水洗涤，然后在Na₂SO₄上干燥。真空干燥后，将残余物用柱色谱法(硅胶、3∶1乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到淡黄色固体(产率＞60％)。

¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ8.65(s，1H)，7.58(s，1H)，(7.11br t，2H)，6.68(t，J＝7.5Hz，1H)，6.46(br t，2H)，5.66(s，1H)，5.12(m，1H)，4.24(br s，-NH，1H)，3.80(m，4H)，3.68(m，4H)，2.26(s，3H)，1.57(d，J＝6.7Hz，3H).

实施例2.制备吡啶取代的苯并吡喃酮衍生物

按照下面由Cushman和Nagarathnam，1990，Tetrahedron Letters31：6497改进的一般方法制备8-(取代的)-2-(4-吡啶基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮。简单地说，将各种前体2-羟基苯乙酮(1)用异烟酸甲酯和衍生物处理，然后通过环合脱水处理作用，制得吡啶取代的产物(3)。然后通过各种偶联反应在R₁上导入特定取代基。

在苯乙酮(R)上的取代基可以包括但不限于溴、羟基、乙酰氨基、甲氧基甲基、甲基、乙基、甲氧基、三氟甲磺酰氧基和乙酰基取代基。在异烟酸酯(R’)上的取代基包括但不限于氯、甲基和氨基取代基。用于缩合反应的试剂包括使用在溶剂例如四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺中的二(三甲基甲硅烷基)氨基锂、氢化钠、1，8-二氮杂二环[2.2.2]十一烷、丁醇钠或甲醇钠。可以使用试剂混合物例如乙醇中的硫酸、甲醇中的盐酸、DMF中的1，8-二氮杂二环[2.2.2]十一烷、二氯甲烷中的三氟甲磺酸酐进行环合脱水作用。

产物(3)的进一步反应可以包括在R上的钯催化的交联反应，其中R是卤化物或三氟甲磺酰氧基以获得其中R是芳基、芳基氨基、烷基氨基或乙酰基的产物。在R是乙酰基官能团的情况下，进一步的反应可以包括还原或还原胺化以得到其中R是羟基乙基或氨基乙基的产物。在R是甲氧基烷基或羟基烷基官能团的情况下，进一步的反应可以得到其中R是溴烷基的产物。在R是溴烷基的情况下，进一步的反应可以得到其中R是芳基氨基烷基或芳氧基烷基的产物。在R是羟基的情况下，进一步的反应可以得到其中R＝芳氧基或烷氧基的产物。在R是氨基的情况下，进一步的反应可以得到其中R是芳基氨基或烷基氨基的产物。

下面的实施例进一步用来说明本发明。

中间体的制备

实施例2a：6-甲基-8-乙酰基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮

3′-乙酰基-2′-羟基-5′-甲基苯乙酮

将2-羟基-5-甲基苯乙酮(15g，0.1mol)在二氯甲烷(100ml)中的混合物用三乙胺(13.9ml)、二甲基氨基吡啶(1.22g)和乙酸酐(9.5ml)处理，然后在室温下搅拌过夜。然后把混合物倒入水(300ml)中并用二氯甲烷(3×60ml)萃取。将合并的混合物用饱和NaHCO₃水溶液洗涤，干燥(Na₂SO₄)并除去溶剂，得到无色油状物(19.5g)。

在0℃下把该产物溶解入二氯甲烷(200ml)中，并用氯化铝(19.5g)处理，然后在室温下搅拌5天。将溶液用冰(50g)和2N盐酸(50ml)处理，然后在室温下搅拌1小时。把二氯甲烷层分离，将水层用二氯甲烷(2×60ml)萃取。将合并的萃取物用饱和NaCl水溶液洗涤，干燥(Na₂SO₄)，并把溶剂除去，得到粗产物。将产物用柱色谱法纯化(0-25％乙酸乙酯在汽油中混合物)，得到黄/绿色固体(11.4g)。

8-乙酰基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮

在-78℃于氮气氛下，向3′-乙酰基-2′-羟基-5′-甲基苯乙酮(3.0g，15.6mmol)在无水THF(100ml)内的溶液中加入二(二甲基甲硅烷基)氨基锂(1.0M在THF中的溶液，50ml，50mmol)，然后在0℃下将混合物搅拌1小时。把混合物冷却至-78℃，并加入异烟酸甲酯(2.14ml，15.6mmol)。将反应混合物加热至室温并继续搅拌过夜。把混合物倒入1N盐酸溶液(200ml)，在真空下除去THF。将混合物用1N氢氧化钠水溶液中和然后过滤。将滤饼在高度真空下干燥过夜。

将所得固体(3.0g)依次用乙酸(40ml)和浓硫酸(2ml)处理，然后在80℃加热3小时。在冷却下将混合物用水(100ml)稀释，用1N氢氧化钠水溶液中和。将沉淀过滤，用水洗涤并在高度真空下干燥。将粗产物通过柱色谱法纯化，用0-20％甲醇在乙酸乙酯中的混合物进行梯度洗脱，得到棕褐色固体。

ES-MS：280.36(M+H)

以相似的方法也制得了：

由2，3-二羟基苯乙酮制得8-羟基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；ES-MS：240.2(M+H)；

由3-溴-5-甲基-2-羟基苯乙酮制得8-溴-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；ES-MS：316.2，318.2(M+H)；

由2，4-二羟基苯乙酮制得7-羟基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；ES-MS：240.15(M+H)；

由3-乙酰氨基-2-羟基苯乙酮制得8-乙酰氨基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；ES-MS：281.2(M+H)；

由3-乙酰氨基-2-羟基苯乙酮制得8-氨基-2-(4-吡啶基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮；ES-MS：239.2(M+H)；

8-乙酰基-6-甲基-2-(2-氯-6-甲基-4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮ES-MS：328.12，330.12(M+H)；

8-乙酰基-6-甲基-2-(2-氨基-4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮ES-MS：295.5(M+H)；

6-甲基-8-乙酰基-2-(3-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮ES-MS：280.3(M+H)；和

6-甲氧基-8-甲氧基甲基-2-(3-吡啶基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮ES-MS：316.2(M+H)。

实施例2b：溴-色酮的Heck偶联

8-乙酰基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(另一方法)

6-甲基-8-(乙酰基)-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮

将8-溴-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(0.12g，0.36mmol)、正丁基乙烯基醚(0.047ml，0.36mmol)、三乙胺(0.050ml，0.36mmol)在DMF(5ml)中的混合物用N₂清扫，然后用PdCl₂(dppf)(27mg，0.036mmol)处理。将混合物在90℃加热过夜。将混合物冷却至室温，用1N盐酸(30ml)处理，然后搅拌过夜。将该混合物用水(50ml)稀释并冻干。将残余物经由C8-HPLC柱洗脱，并将产物分离出来，得到白色固体(2.5mg)。该产物与上面所述产物完全一样。

实施例2c：乙酰基色酮的还原：8-(1-羟基乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮

将8-乙酰基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4.6g，16.5mmol)在甲醇(100ml)中的混合物用硼氢化钠(1.22g、33mmol)处理并加热回流过夜。在冷却下加入水(2ml)，然后真空下将溶液浓缩至接近干燥。加入水(100ml)，将形成的沉淀物过滤，得到灰白色固体(4.0g)。

实施例2d：醇的溴化：8-(1-溴乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮

将8-(1-羟基乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4.0g)在冰醋酸(45ml)中的混合物用48％的氢溴酸水溶液(34ml)处理并在80℃加热过夜，在冷却下把混合物倒入冰冷的水中，用50％氢氧化钠中和，用二氯甲烷(3×40ml)萃取。将合并的萃取物干燥并除去溶剂。将残余物经由硅胶柱色谱纯化，用0-10％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脱，得到灰白色固体(1.1g)。ESI-MS：344.1，346.1(M+H)(作为选择，该产物可以通过用PBr₃在二氯甲烷中的混合物处理醇来获得)。

实施例2e：醇的甲磺酰化：8-(1-甲磺酰氧基乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮

将在冰浴中的8-(1-羟基乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(2.4g)在二氯甲烷(100ml)中的混合物先用三乙胺(1.3ml)而后用甲磺酰氯(0.67ml)处理，然后把混合物在0℃下搅拌30分钟。然后将溶液用1N盐酸(2×30ml)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，除去溶剂，得到油状棕色固体，无需将其进一步纯化。

实施例2f：6-甲基-8-溴甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮：6-甲基-8-溴甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮

2’-羟基-5’-甲基-3′-甲氧甲基苯乙酮

将2’-羟基-5’-甲基苯乙酮(1.0g，6.7mmol)用低聚甲醛(0.18g)和浓盐酸(5ml)处理，然后在60℃加热过夜。在冷却下，用甲苯(3×30ml)萃取混合物，将合并的萃取物干燥(Na₂SO₄)并除去溶剂，得到黄色油状物。将油状物用甲醇(30ml)处理并加热回流1小时。在冷却下，把溶液蒸发至接近干燥，将残余物在硅胶柱上色谱纯化，用0-10％乙酸乙酯在石油醚中的混合物洗脱。获得的纯化产物为白色粉末。

8-溴甲基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮

在-78℃下向苯乙酮(0.76g，3.9mmol)在THF(30ml)内的溶液中加入二(三甲基甲硅烷基)氨基锂(1.0M在THF中的溶液，11.8ml，11.8mmol)，然后将混合物在0℃下搅拌1小时。将混合物冷却至-78℃，然后加入异烟酸甲酯(0.53ml，3.9mmol)。把反应混合物加热至室温并继续搅拌过夜。将混合物注入1N盐酸溶液(200ml)，在真空中除去THF。将混合物用1N氢氧化钠水溶液中和，然后过滤。把滤饼在真空下干燥过夜。

将残余物先用乙酸(6ml)而后用氢溴酸(48％在水中的溶液，6ml)处理，并将混合物在80℃下加热过夜。在冷却下，用2N氢氧化钠溶液将混合物调至pH5。把所得沉淀物过滤，并在真空下干燥。将残余物经由硅胶柱色谱纯化，用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脱，将产物分离出来得到灰白色固体(310mg)。LC-MS：332，334(M+H)

实施例2g：8-三氟甲磺酰氧基-2-(4-吡啶基)--4H-1-苯并吡喃-4-酮

向8-羟基-2-(4-吡啶基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(10mg)在乙腈(2ml)内的混合物中加入二异丙基乙胺(20uL)，然后加入N-phenyltriflimide(20mg)，然后在室温下将混合物搅拌2小时。将混合物在硅胶上吸附，用乙酸乙酯作为洗脱剂经由硅胶柱洗脱，得到为棕褐色固体的本标题化合物(10mg)。ESI-MS：372.1(M+H)。

实施例2h：酮的还原胺化：8-1-(苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-286)

向8-乙酰基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(0.28g)在甲醇(30ml)内的悬浮液中加入冰醋酸(2.5ml)、苯胺(2.5ml)和氰基硼氢化钠(62mg)，然后将混合物在70℃加热过夜。在冷却下，将混合物吸附到硅胶上并用柱色谱法纯化，用0-10％甲醇在乙酸乙酯中的混合物进行梯度洗脱，得到棕褐色固体(200mg)。

1H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ1.65(d，3H，J＝1.2Hz)，2.39(s，3H)，5.186(m，1H)，6.51(d，2H，J＝7.8Hz)，6.69(t，1H，J＝7.5Hz)，6.94(s，1H)，7.11(t，J＝8.1Hz)，7.65(d，1H，J＝1.8Hz)，7.73(d，2H，J＝6Hz)，7.90(s，1H)，8.80(d，2H，J＝6Hz).

ES-MS：357.3(M+H)，264.3.

以类似的方法也制备了：

8-1-(4-氟-2-甲基苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-303)；ES-MS：389.3(M+H)

8-1-(苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(3-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-305)；ES-MS 357.3(M+H)

8-1-(6-甲基吡啶-2-基氨基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-310)；ES-MS：372.3(M+H)

8-1-(3-三氟甲基苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-322)；ES-MS：425.0(M+H)

8-1-(苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(2-氯-6-甲基-4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-340)；ES-MS：405.44，407.42(M+H)

实施例2i：溴烷基取代的色酮与苯酚或苯胺的反应：6-甲基-8-苯基氨基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-312)

将8-溴甲基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(48mg，0.15mmol)在乙腈(5ml)中的混合物用苯胺(48uL，0.52mmol)处理，然后将该混合物在70℃加热4小时。在冷却下，将该混合物用固体碳酸钾(60mg)处理，将该混合物吸附到硅胶(1.0g)上，然后除去溶剂。将残余物施加于硅胶柱上，把产物用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脱。将产物分离出来，得到黄色粉末(25mg)。

1H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ2.41(s，3H)，4.19(s，1H)，4.71(s，2H)，6.68(d，2H，J＝8.4Hz)，6.77(t，1H，J＝7.2Hz)，6.9(s，1H)，7.21(t，2H，7.5Hz)，7.59(s，1H)，7.67(d，2H，4.8Hz)，7.91(s，1H)，8.74(s，2H).

LC-MS：343.08(M+H)，249.98

以类似的方法也制备了：

6-甲基-8-苯氧基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-313)ES-MS 344.1

6-甲基-8-(2-吡啶基)氨基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(KN-315)ES-MS：344.1

6-甲基-8-1-(苯氧基)乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-317)ES-MS 358.1

6-甲基-8-(2-羧基)苯基氨基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-323)ES-MS 387.04(M+H)

6-甲基-8-(2-乙酰氨基)苯基氨基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-326)ES-MS：413.9(M+H)

6-甲基-8-[1-(2-羧基)苯基氨基]乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(KN-334)ES-MS：401.4

实施例2j：8-(1-(2-氨基苯基氨基)乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮

将8-(1-甲磺酰氧基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(2.4g)在乙腈(50ml)中的混合物用碳酸钾(2.4g)和单-Boc苯二胺(2.7g)处理，然后把混合物在70℃加热过夜。在冷却下将混合物用二氯甲烷处理并吸附到硅胶上。除去溶剂，把残余物施加于硅胶柱上，然后将产物用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脱。使产物分离出来，得到黄色油状物(0.9g)。

ES-MS：472.3(M+H)

将8-(1-(Boc-2-氨基苯基氨基)乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(0.9g)在二氯甲烷(12ml)中的混合物用三氟乙酸(8ml)处理，然后在室温下搅拌1小时。将混合物用二氯甲烷(30ml)稀释，先用水(30ml)然后用1N浓盐酸(30ml)萃取。把合并的含水萃取物用氢氧化钠中和，并用二氯甲烷(3×50ml)萃取。然后将合并的有机萃取物用0.3N盐酸水溶液(2×50ml)再萃取。然后把合并的含水提取物冻干至干燥，得到红褐色固体(0.61g)。

ES-MS：372.3

以类似的方法制备了：

6-甲基-8-1-(2-三氟甲基-苯并咪唑-1-基)-乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-328)ES-MS：450(M+H)

实施例2k：8-苄氧基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-335)

将8-羟基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(52mg)和无水碳酸钾(117mg)在乙腈中的混合物用苄基溴处理，并加热回流过夜。在冷却下将混合物用二氯甲烷处理，吸附到硅胶上，并施加于硅色谱柱上。把产物用0-4％甲烷在乙酸乙酯中的混合物洗脱，将所要求的产物分离出来，得到褐色固体(17mg)。

ES-MS：330.2(M+H)

以类似的方法制备了：

7-苄氧基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-342)ES-MS：330.5(M+H)

实施例21：8-苄基氨基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-336)

将8-氨基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(16mg)、苯甲醛(40μL)和乙酸(20μL)在甲醇(5ml)中的混合物用氰基硼氢化钠(5mg)处理，并在70℃加热过夜。在冷却下把溶液吸附到硅胶上，经由硅胶色谱纯化，用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物梯度洗脱。将所要求的产物分离出来，得到黄色固体。ES-MS：329.3(M+H)

实施例2m：8-苯基氨基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-341)

将8-氨基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(20mg)、苯基硼酸(30mg，0.25mmol)和三乙胺(70uL，0.5mmol)在二氯甲烷(5ml)中的混合物用乙酸铜(45mg，0.25mmol)处理，并在室温下将混合物搅拌过夜。把混合物吸附到硅胶上，施加于硅胶柱上并用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脱。获得所要求的化合物，为黄色固体(4mg)。

ES-MS：315.5(M+H)。

以相似的方法制备了：

8-(3-氟苯基氨基)-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(KN-351)ES-MS：333.3(M+H)

实施例2n：8-苯基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(TGX-25S)

将8-溴-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(0.1g，0.32mmol)、磷酸钾(0.2g，0.95mmol)、苯基硼酸(0.042g，0.35mmol)和PdCl₂(dppf)(7.8mg，0.009mmol)在二氧杂环己烷(6ml)中的氮气吹扫的混合物加热回流过夜。在冷却下过滤混合物，并将滤液浓缩至干燥。将残余物经由C8 HPLC柱色谱纯化，用0-60％乙腈在0.1％浓TFA中的混合物作为洗脱剂。将纯化的级分合并，得到黄色粉末(53.4mg)。

1H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ2.53(s，3H)，7.03(s，1H)，7.55(m，6H)，7.80(d，J＝5.7Hz，2H)，8.04(s，1H)，8.80(d，J＝5.7Hz，2H).ES-MS：314.3(M+H)

实施例2o：合成6-甲基-8-溴-3-羟基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮

向3′-溴-2′-羟基-5′-甲基苯乙酮(1.15g)和吡啶-4-甲醛(0.54g)在乙醇(10ml)内的混合物中滴加50％氢氧化钠溶液，并在室温下把混合物搅拌4小时。将混合物用冰冷的冰醋酸处理至pH5.5，形成沉淀物，过滤得到查耳酮中间体，作为黄色固体(0.85g)。

在0℃下将查耳酮(0.132g)在甲醇(2.3ml)中的溶液先用2N氢氧化钠(2.1ml)而后用30％(v/v)过氧化氢溶液(189μL)处理。在4℃下将该混合物搅拌过夜。用2N硫酸中和该混合物并形成沉淀物，将其过滤得到棕褐色固体。ES-MS：332.0，334.0(M+H)

实施例3.制备吡啶取代的喹诺酮衍生物

按照下面一般方法制备本发明吡啶取代的喹诺酮化合物：

试剂：i.对甲苯磺酸、甲苯，回流；ii.Ph₂O，加热。

i.酯中间体(化合物3)的合成：将β-氧代-4-吡啶丙酸乙酯(化合物1，4.35mmol)[Lesher等人，1984，J.Heterocycl.Chem.21(6)：1849]、苯胺(化合物2，3.35mmol)和对甲苯磺酸(0.54mmol)在甲苯(30mL)中的混合物在回流温度下加热18小时，共沸除去水。将溶剂减压蒸发，得到粗制的黄色油状物，在用石油醚/乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱剂的快速色谱纯化后，得到酯中间体(化合物3，70-80％)。

ii.喹诺酮(化合物4)的合成：将酯中间体(化合物3)(2.58mmol)在二苯基醚(3mL)中回流20分钟，冷却至室温然后用石油醚处理得到膏状固体。将沉淀物过滤，用石油醚洗涤数次，然后经由快速色谱纯化，用乙酸乙酯/甲醇(9∶1)作为洗脱剂，得到所要求的喹诺酮化合物4(60-70％)。

8-苯氧基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-319)

通过在甲苯中回流将酯中间体(化合物3，其中R是OPh)在原位环合，得到喹诺酮(化合物4)(步骤i)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ6.64(d，J＝1.9Hz，1H)，7.06(dd，J＝8.0，1.1Hz，1H)，7.15(dd，J＝7.7，0.7Hz，2H)，7.20-7.31(m，2H)，7.44(td，J＝7.7，0.7Hz，2H)，7.57(dd，J＝5.0，1.4Hz，2H)，8.06(dd，J＝8.0，1.1Hz，1H)，8.80(d，J＝5.0Hz，2H)，8.88(br.s，NH)；MS-ES m/e 315(M+H).

8-溴-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-343)

酯中间体(化合物3，其中R是Br)：

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ1.33(t，J＝7.1Hz，3H)，4.25(q，J＝7.1Hz，2H)，5.17(s，1H)，6.31(dd，J＝7.7，1.6Hz，1H)，6.81(td，J＝7.7，1.6Hz，1H)，6.89(td，J＝7.7，1.6Hz，1H)，7.21(d，J＝5.2Hz，2H)，7.54(dd，J＝7.7，1.6Hz，1H)，8.56(d，J＝5.2Hz，2H)，10.16(br s，NH)；MS-ES m/e 347(M+H).

喹诺酮(化合物4)：

¹H NMR(400MHz，(CD₃)₂SO)δ7.45(t，J＝7.9Hz，1H)，7.49(s，1H)，8.12(d，J＝5.2Hz，2H)，8.14(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，8.19(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，8.78(d，J＝5.2Hz，2H)，12.02(br.s，NH)；MS-ES m/e301(M+H).

在各种其它吡啶取代的喹诺酮类似物的合成中KN-343是中间体。

8-(4-氟-2-甲基苯氧基)-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-337)

酯中间体(化合物3，其中R是4-氟-2-甲基苯氧基)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.29(t，J＝7.1Hz，3H)，2.26(s，3H)，4.20(q，J＝7.1Hz，2H)，5.07(s，1H)，6.41(dd，J＝7.7，1.9Hz，1H)，6.56(dd，J＝7.7，1.9Hz，1H)，6.69(td，J＝7.7，1.9Hz，1H)，7.76(dd，J＝8.9，5.0Hz，1H)，6.81-6.86(m，2H)，6.97(dd，J＝8.9，3.1Hz，1H)，7.27(dd，J＝4.5，1.5Hz，2H)，8.57(dd，J＝4.5，1.5Hz，2H)，10.25(s，NH)；MS-ES m/e393(M+H).

喹诺酮(化合物4)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ2.23(s，3H)，6.67(d，J＝2.1Hz，1H)，6.76(dd，J＝8.1，1.0Hz，1H)，6.98(td，J＝8.2，2.8Hz，1H)，7.03-7.07(m，2H)，7.20(t，J＝8.1Hz，1H)，7.62(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，8.02(dd，J＝8.1，1.0Hz，1H)，8.84(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，8.86(s，NH)；MS-ES m/e 347(M+H).

8-甲氧基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-344)

通过在甲苯中回流将酯中间体(化合物3，其中R是OMe)在原位环合，得到喹诺酮(化合物4)(步骤i)：

¹H NMR(400MHz，(CD₃)₂SO)δ3.99(s，3H)，6.66(s，1H)，7.25(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，7.32(t，J＝7.9Hz，1H)，7.70(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，7.82(dd，J＝4.4，1.7Hz，2H)，8.72(dd，J＝4.4，1.7Hz，2H)；MS-ES m/e253(M+H).

在各种其它吡啶取代的喹诺酮类似物中KN-344是关键的中间体。

8-苯基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-345)

通过在甲苯中回流将酯中间体(化合物，其中R是苯基)在原位环合，得到喹诺酮(化合物4)(步骤i)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.65(d，J＝2.0Hz，1H)，7.38(dd，J＝4.5，1.7Hz，2H)，7.46(td，J＝8.1，1.6Hz，1H)，7.52-7.56(m，3H)，7.58-7.63(m，2H)，8.42(dd，J＝8.1，1.6Hz，2H)，8.75(dd，J＝4.5，1.7Hz，2H)；MS-ES m/e 299(M+H).

8-苄基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-346)

通过在甲苯中回流将酯中间体(化合物3，其中R是苄基)在原位环合，得到喹诺酮(化合物4)(步骤i)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ4.34(s，2H)，6.52(s，1H)，7.27-7.33(m，3H)，7.37-7.44(m，4H)，7.63(d，J＝6.9Hz，2H)，8.35(d，J＝8.3Hz，1H)，8.67(br.s，2H)；MS-ES m/e 313(M+H).

8-硝基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-352)

在合成喹诺酮(化合物4)中，使用无需进一步纯化的粗制酯中间体(化合物3，其中R是硝基)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.77(d，J＝2Hz，1H)，7.51(t，J＝7.9Hz，1H)7.65(dd，J＝4.5，1.7Hz，2H)，8.72(dd，J＝7.9，1.6Hz，1H)8.80(ddd，J＝7.9，1.6，0.6Hz，1H)8.89(dd，J＝4.5，1.7Hz，2H)；MS-ESm/e 268(M+H).

8-氨基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-353)

用Pd/C在乙醇中的混合物将8-硝基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-352)氢化，得到本标题化合物：MS-ES m/e 238(M+H)。

8-萘基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹诺酮(KN-350)

酯中间体(化合物3，其中R是萘氧基)：

¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.23(t，J＝7.1Hz，3H)，4.13(q，J＝7.1Hz，2H)，5.01(d，J＝1.6Hz，1H)，6.56(dd，J＝7.8，1.6Hz，1H)，6.77-6.82(m，3H)，6.88(td，J＝7.8，1.6Hz，1H)，7.27(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，7.37(t，J＝8.1Hz，1H)，7.50-7.54(m，2H)，7.62(d，J＝8.1Hz，1H)，7.85-7.89(m，1H)，8.18-8.21(m，1H)，8.57(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，10.24(s，NH)；MS-ES m/e 410(M+H).

喹诺酮(化合物4)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ6.69(d，J＝2.1Hz，1H)，6.97(dd，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.16(dd，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.21(t，J＝8.1Hz，1H)，7.48(t，J＝7.9Hz，1H)，7.52-7.55(m，2H)，7.59(td，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.78(d，J＝8.1Hz，1H)，7.96(d，J＝7.9Hz，1H)，8.07(d，J＝7.9Hz，1H)，8.08(d，J＝8.1Hz，1H)，8.79(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，8.94(br.s，NH)；MS-ES m/e 365(M+H).

实施例4.制备吡啶取代的吡啶并嘧啶酮衍生物

实施例4a

一般试验方法：将胺(3.00mmol)和γ-氧代-4-吡啶丙酸乙酯(3.00mmol)的混合物在180-200℃下加热20-45分钟。随后将该粗产物进行柱色谱纯化(SiO₂，EtOAc)，得到所要求的嘧啶化合物。反应产物在10-20％之间。

9-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-347)

¹H NMR(CDCl₃，200MHz)δ2.75(s，3H)；7.03(s，1H)；7.15(t，J＝6.97Hz，1H)，7.69-7.73(bd，J＝6.91Hz，1H)；8.12-8.15(bd，J＝6.05Hz，2H)；8.82-8.84(bd，J＝4.73Hz，2H)；9.01-9.05(bd，J＝7.40Hz，1H).LCMS m/z 238M⁺+H).

9-苄基-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-349)：

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ4.50(s，2H)；7.03(s，1H)；7.16(t，J＝7.03Hz，1H)；7.28-7.39(m，5H)；7.56-7.58(m，1H)；8.21(bs，2H)；8.83(bs，2H)；9.02-9.05(m，1H).LCMS m/z314(M⁺+H).

9-苯基-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-348)

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ2.50(d，J＝1.07Hz，3H)；7.00(s，1H)；7.48-7.56(m，4H)；7.71-7.75(m，4H)；7.90(bs，2H)；8.96(m，1H).LCMS m/z 314(M⁺+H).

9-溴-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮

¹H NMR(DMSO，300MHz)δ2.42(m，3H)；7.23(s，1H)；8.19(dd，J＝4.48，1.66Hz，2H)；8.40(d，J＝1.95Hz，1H)；8.77(dd，J＝4.56，1.65Hz，2H)；8.83(m，1H).LCMS m/z316(M⁺).

实施例4b：9-(2-苯乙基)氨基-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-316)

在回流温度于氮气氛下，将溴衍生物1(324mg，1mmol)、(R)-(+)-α-甲基苄胺2(122mg，1mmol)、叔丁醇钾(225mg，2mmol)和PdCl₂(dppf)(35mg，0.05mmol)在THF中的混合物搅拌20小时。把反应混合物冷却并用乙酸乙酯稀释。将有机层用水、盐水洗涤并在Na₂SO₄上干燥。在真空下将乙酸乙酯层浓缩，并将残余物经由柱色谱法(硅胶，乙酸乙酯)纯化，得到所要求的产物3。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ8.78(br s，2H)，8.21(s，1H)，7.92(d，J＝5.9Hz，2H)，7.4-7.26(m，5H)，6.90(s，1H)，6.50(d，J＝5.5Hz，1H，-NH)，6.27(s，1H)，4.60(m，1H)，2.23(s，3H)，1.71(d，J＝6.9Hz，3H).MS(m/z)＝357.13(m+1).

实施例4c：9-溴-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮

将异烟酸乙酯(5.0ml，25.91mmol)和4-乙酰基吗啉(3.0ml，25.91mmol)在THF(25ml)中的溶液用二(三甲基甲硅烷基)氨基锂(7.0g，41.83mmol)在THF(25ml)中的溶液处理。在室温下把该溶液搅拌24小时。过滤该溶液并用乙醚(3×50ml)洗涤。把滤液溶解于水(100ml)中，用冰醋酸酸化，用CH₂Cl₂(3×30ml)萃取，干燥(Na₂SO₄)，过滤并蒸发至干燥。将粗制的反应混合物经由柱色谱法(SiO₂，乙酸乙酯)纯化，得到为黄色粘性油状物的化合物5，其在静置下固化。¹HNMR(CDCl₃，300MHz)酮与烯醇醚的合并的NMR δ3.47-3.57(bm，8H)；3.95和5.77(s，1H)；7.44和7.61(dd，J＝4.43，1.62Hz，2H)；8.49(bd，J＝5.93Hz)和8.64(dd，J＝4.44，1.62Hz)2H.LCMS m/z235(M⁺+H).

将2-氨基-3-溴-5-甲基吡啶(1.00g，4.30mmol)、化合物5(1.20g，6.40mmol)和对甲苯磺酸一水合物(203.0mg，1.07mmol)在甲苯(50ml)中的混合物回流4天。在真空中除去甲苯，将所得粗制反应混合物经由柱色谱法(SiO₂，乙酸乙酯)纯化，得到化合物5，为黄色沉淀物(0.66g，65％)。

实施例4d：

在90-100℃于氮气氛下下，将9-溴-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮1(232.1mg，0.73mmol)、丁基乙烯基醚(0.19ml，1.08mmol)，碳酸钾(149.2g，1.49mmol)和Pd(OAc)₂(4.8mg，21.6μmol)在无水DMF(6ml)中的溶液搅拌2小时。用1M盐酸处理该溶液直至混合物呈酸性(～pH4)，然后在室温下将该后成溶液搅拌3小时。将反应物用水(10ml)稀释，用NaHCO₃中和并将水层用CH₂C1₂(3×15ml)萃取。把合并的有机萃取液用水(3×15ml)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并浓缩至干，得到褐色沉淀物。将该固体用乙醚研制，过滤，用另外的乙醚(3×15ml)洗涤，然后空气干燥，得到所要求的酮6，其为黄色沉淀物(61.4mg，30％)。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ2.50(d，J＝3.29Hz，3H)；2.93(s，3H)；7.03(s，1H)；8.03(d，J＝2.18Hz，1H)；8.16(bd，J＝6.37Hz，2H)；8.83(bs，2H)；9.03(m，1H).LCMS m/z280(M⁺+H).

生物学试验

实施例1.PI 3-激酶β的选择性

使用体外酶分析来测定相对于其它I型PI 3-激酶家族成员或其它相关激酶家族酶，TGX-221选择性抑制PI 3-激酶β活性的能力。

为了测定TGX-221对PI 3-激酶α、β、或δ同种型或PI4激酶的抑制活性，将洗涤的血小板用1×溶胞缓冲液(10Mm Tris，pH 7.6，10mM PMSF，5mM EDTA，2mM苄脒，0.1％Triton X-100)溶解，然后通过以15,000×g离心分离5分钟将全部细胞溶解物澄清。对于每一免疫沉淀，在4℃下将1mg溶解产物用抗-p110α(1μg)、抗-p110β(1μg)、抗-p110δ(1μg)或抗-PI激酶抗体(2-5μg)和50μl 50％A蛋白球浆液培养过夜。对于PI 3-激酶测定，将A蛋白球免疫混合物用溶胞缓冲液洗涤两次并用1x PI 3-激酶测定缓冲液(20mM Hepes，pH7.2，5mM MgCl₂，0.25mM EDTA)洗涤两次以上，然后用40μl PI 3-激酶酶底物磷脂酰肌醇(PtdIns)、10μ1ATP混合液(0.5μlγ³²P-ATP+0.5μl10mM ATP)、10μl 10x激酶缓冲液、15μl milliQ H₂O和1μl TGX-221(0-10μM)在室温下培养25μl免疫沉淀的p110α或β同种型。对于PI4激酶测定，将A蛋白球免疫混合物也用溶胞缓冲液洗涤两次，然后用1X PI4激酶测定缓冲液(20mM Hepes，pH7.5，10mM MgCl₂，0.3％Tron X-100)洗涤两次，并加入其它测定组合物，如上面所述。通过加入100μl 1M HCl、200μl氯仿/甲醇(1∶1)和500μl 2M KCl和通过以15,000x g离心分离2分钟萃取的脂质，结束全部反应。通过TLC分析确定PI3或PI4激酶脂质产物PtdIns(3)P和PtdIns(4)P的产生。然后从TLC板上除去脂质点斑点并量化放射性水平以准确测定PtdIns(3)P/PtdIns(3)P产生的水平。

为测定TGX-221抑制PI 3-激酶γ同种型的能力，将0.5μl p110γ重组蛋白用10μl 10X激酶缓冲液(2.5mM EDTA，200mM HEPES，50mM MgCl₂pH7.2)、30μl milliQ H₂O、40μl PI(150μl/ml)、10μl ATP混合液(0.5μl γ³²P-ATP+0.5μl 10mM ATP)和1μl TGX-221(0-10μM)在室温培养20分钟。如上面所述的其它PI 3-激酶同种型测定，结束反应并分析脂质产物。

TGX-221对其它酪氨酸和Ser/Thr激酶的抑制活性经由MDSPharma Services(Panlabs，Taiwan)进行。

TGX 221PI对3-激酶β显示5nM的IC₅₀，对血小板中的两种其它主要类型I PI 3-激酶同种型(PI 3-激酶α和PI 3-激酶γ)显示＞100倍的选择性。

E.酶	TGX-221IC₅₀(μM)
E.酶	TGX-221IC₅₀(μM)	脂质激酶p110α-PI3Kp110β-PI3Kp110γ-PI3Kp110δ-PI3KPI4K酪氨酸激酶Ab1EGF受体FynHER2受体胰岛素受体Ser/Thr激酶酪蛋白激酶2Cdk2/细胞周期蛋白AERK1P38αP70⁸⁶PKA非选择性PKC非选择性CaMK	50.005＞100.1＞10＞10＞10＞10＞10＞10＞10＞10＞10＞10＞10＞10＞10＞10

在范围广泛的蛋白激酶中，TGX-221对PI 3-激酶β显示＞1000倍的选择性。此结果显示于图2D。TGX-221显示对PI4激酶最小的抑制效果(图2D)，并选择性地抑制体内PI 3-激酶脂质产生(图3A)，而不改变常规的磷酸肌醇、PtdIns、PtdIns(4)P(未显示数据)和PtdIns(4，5)P₂(图3A)。

每一试验化合物的抑制浓度列于下表。

表I：选择的化合物抗PI 3-激酶同种型的活性

实施例2.剪切引起的血小板聚集研究

使用定制的锥-板装置来测定TGX-221抑制PI 3-激酶脂质产物和由剪切病理学水平引起的血小板聚集。

对于该分析，在抗凝血剂[6体积血液：1体积抗凝血剂(90柠檬酸钠，7mM柠檬酸，pH4.6，140mM葡萄糖和70mM茶碱)]存在的情况下采集血液，并将血小板离析，用改进的Baezinger和Majerus方法(1974)洗涤。简单的说，通过以200χg将全血离心分离30分钟，获得富含血小板的血浆(PRP)。然后通过在2,000χg下离心分离PRP 10分钟，使血小板球状化。把血小板球再悬浮于血小板洗涤缓冲液(PWB)[4.3Mm K₂HPO₄，4.3mM Na₂HPO₄，24.3mM NaH₂PO₄，pH6.5，113mM NaCl，5.5mM葡萄糖，0.5％牛血清(BSA)和10mM茶碱]中。用含有血小板活化抑制剂茶碱(10mM)的无磷酸盐Tyrode缓冲液洗涤血小板两次，然后在37℃下用0.3mCi/ml无机³²P标记2小时。在有茶碱(10mM)存在的情况下通过用无磷酸盐Tyrode缓冲液洗涤血小板两次将未溶合的³²P除去，然后把血小板再悬浮于含有1mM钙的无磷酸盐Tyrode缓冲液中。在增加TGX-221(0-500nM)浓度的同时在37℃下将放射性标记的血小板培养30分钟。迅速加入vWf(10μg/ml)，然后使血小板经受5000s^-1的病理学剪切速率2分钟。按照Stephens等人(1997，Cell，89：105-114)，通过HPLC分析，将血小板溶解，萃取并分离。将与市售PtdIns(3，4)P₂和PtdIns(4，5)P₂标准物一起洗脱下来的脂质峰积分和标准化成施加的总脂质，并作为对照样本的分数表示。

为了测定TGX-221对由病理学剪切速率引起的血小板聚集的作用，在增加TGX-221(0-1μM)浓度的同时，将悬浮于含有1mM钙(350×109)的Tyrode缓冲液中的洗涤的血小板在37℃下培养10分钟。立即加入vWf(10μg/ml)，然后使血小板经受5000s^-1的病理学剪切速率5分钟。抽出血小板样本，通过使用Sysmex^TM KN-21N血液学分析仪分析未溶合的单个血小板的数目，确定血小板聚集的水平。将全部数据归一化至对照试验数据，并表达为相对于对照样本的比例增加。TGX-221在浓度范围(ICso＝0.05-0.1μM)有效地抑制剪切引起的血小板聚集，与抑制3-磷酸化的脂质(图3B)相差不大。

实施例3.FACS分析

用FACS分析确定来TGX-221对粘合素活化和血小板活化的作用。将悬浮于含有1mM CaCl2/1mM MgCl2的Tyrode缓冲液中的洗涤的血小板，用抗-P选择素或1μg/ml PAC-1抗体和单独的载体或0.5μMTGX-221，在37℃下培养10分钟。将血小板用凝血酶(1U/ml)、ADP(12.5mM)、U46619(1AM)或胶原质(10μg/ml)在室温下刺激20分钟，然后在室温下用2％多聚甲醛固定45分钟。将固定的血小板用Tyrode缓冲液洗涤两次，用1μg/ml FITC-缀合的抗小鼠(ab)₂’抗体培养15分钟，用Tyrode缓冲液洗涤两次，再悬浮于Tyrode缓冲液中至500μl的最终体积，并用FACS进行分析。

实施例4.体内流动研究

用基于流动的粘着分析来测定TGX-221对血小板钙流出的作用。将悬浮于PWB中的洗涤的血小板(1.5×109)用钙指示剂颜料、OregonGreen 488BAPTA-1、AM(1μM)和Fura Red、AM(1.25μM)在37℃下培养30分钟。再悬浮于含有1mM钙的Tyrode缓冲液之前，用PWB洗涤血小板两次。在进行静态或基于流动的粘着测定之前，将血小板用单独的载体、TGX-221(0.5μM)、LY294002(20μM)、阿司匹林(1mM)、腺苷三磷酸双磷酸酶(0.5U/ml)或Aggrastat(200nM)培养10分钟。

对于静态粘着测定，在37℃下把血小板在vWf包衣的盖玻片的表面上放置30分钟。对于流动测定，在600、1800或10,000s^-1的恒定剪切速率下将血小板灌注到vWf包衣的微毛细管上，或者把血小板放置在vWf包衣的微毛细管的表面上，然后在1秒间隔使其通过10,000s^-1的剪切梯度。对于静态和基于流动的测定，分别在30分钟培养期间以1秒间隔，或以0.586间隔直到175秒，监测实时血小板钙流出。

实施例5.在改进的Folts模型中的测定

在麻醉大鼠和兔子中，用改良的folts模型研究TGX-221的体内抗血栓形成活性。研究由University of Melbourne Animal EthicsCommittee按照National Health&Medical Research Council ofAustralia的准则验收。对于Sprague-Dawley大鼠(260-400g)用戊巴比妥钠(Nembutal；60mg/kg i.p.；Merial Australia Pty.Ltd.，Sydney，NSW，Australia)进行麻醉，对于New Zealand白兔(2-3kg)用戊巴比通(15mg/kg i.v.)和芬太奴(6Rg/kg i.v.；David Bull Laboratories，Mulgrave，VIC，Australia)进行麻醉。对动物用补充以O₂的室内空气予以机械通风(Ugo Basile通风机，Comerio，VA，Italy)。在试验过程中保持体温。通过将股动脉连接到压力传感器(Model 1050.1，AD仪器，Sydney，NSW)来测量动脉血压，并在每一(对照和试验)动脉周围设置血流探针(1mm i.d.用于大鼠&2.5mm i.d.用于兔子；流量计T206，Transonic Systems Inc.，Ithaca，NY，USA)；将全部参数记录于PowerLab数据系统(8SP；AD仪器)。将丝缝合线围绕流动探针末梢的1动脉扎紧，用于随后的狭窄。试验前5分钟静脉给药克赛(0.24mg/kg大鼠&1mg/kg兔子；依诺肝素钠；Aventis Australia Pty.Ltd.，Sydney，NSW，Australia)。将缝合线扎紧引起狭窄，使动脉血流减少50％。然后通过用镊子在缝合线上夹压动脉5次，将狭窄下的动脉段去内皮细胞。监测颈动脉血流直至其达到0ml/min，标志在狭窄处形成凝块。1分钟后，将狭窄处轻轻弹动，使凝块消失并恢复血流。再一次监测血流直至其达到0ml/min并记录时间。给药前30分钟，观察循环流动的减少量(CFRs)。30分钟后，大剂量给药25ml/kg作为载体的丙二醇或2mg/kg TGX-221，并对血压继续测量90分钟。在此期间，如果CFR没有消失，或者消失一段时间后恢复，每一次血流达到零时用物理法消除(通过轻弹血管)，以便恢复CFRs。TGX-221在100％大鼠(n＝8)和兔子(n＝9)中(图5A)。

实施例6.电解模型中的测定

在左颈动脉血流探针末端，把一片Parafilm嵌入血管下面用于电离析。把动脉放在钩状白金电极上，然后，在末端将其固定到电极上以闭塞血流，用连接到Grass SD9刺激仪的(Model CCU1，Grass仪器，Quincy，MA，USA)通以7mA电流4分钟。刺激结束后对血流监测60分钟。通过血流降至零可以确定血栓形成。在用大鼠电解损伤颈动脉模型的(Bush & Shebuski，1990)中，与载体治疗的大鼠(7l＝10)(图5B)90％的闭塞率相比，损伤前5分钟注射TGX-221(2mg/kg在PG中的溶液)完全阻止闭塞性血栓形成(n＝6)，并且在损伤后60分钟保持血流体积(图5B插入图)。在Folts和电解研究中，TGX-221对原始血压、心律或未损伤的颈动脉中的血流没有影响。

实施例7.大鼠中尾巴出血研究

在补充以O₂的室内空气中用氟烷将大鼠麻醉。给药前15分钟(-15)分钟以及给药后5和30分钟，测量尾巴出血时间。对于有关用阿司匹林和氯吡格雷预处理的试验，在第一次灌食法给药前的-25小时，也对尾巴出血时间进行测量。在每一时间点，将尾巴上割以5mm长和1mm深的切口，并且每30秒监测出血情况，直到停止出血为止(＝尾巴出血时间)。

如图5中所示，对大鼠的研究显示，当以＞20倍最小治疗浓度给药时TGX-221不增加出血时间。重要的是，当将TGX-221(20mg/kg注射)单独或与肝素(100U/kg注射)一起给药时，大鼠尾巴出血时间未受影响(5C)。在与氯吡格雷(10mg/kg口服)+肝素(100U/kg注射)或阿司匹林(200mg/kg口服)+肝素(100U/kg注射)合并用药时，TGX-221(2mg/kg注射)并不加剧延长由这些药剂引起的出血时间(图5C)。当与氯吡格雷或阿司匹林合并给药时，TGX-221(2mg/kg注射)也不影响出血时间。

实施例8.体内PI 3-激酶测定

用体内PI 3-激酶测定来确定吡啶取代的化合物对PI 3-激酶活性的作用。用由人血小板免疫沉淀的PI 3-激酶作为酶和PI作为酶作用物进行此测定。如前面所述(Susa等人，1992，The Journal of BiologicalChemistry 267(32)：22951-22956.)，通过测量酶结合[³²p]进入PI形成PI([32P]-3)P，来测量PI 3-激酶活性。

将洗涤的人血小板溶解于Triton X-100溶解缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷，pH 7.4，1％Triton X-100，2mM EDTA，1mM PMSF)中30分钟。通过以15,000g离心分离细胞溶解物10分钟，除去TritonX-100不能溶解的级分。通过将500μg细胞溶解物与1μg抗PI 3-激酶的p85/110形式的兔抗大鼠抗体和30μ150％蛋白质A-琼脂糖凝胶珠在4℃下混合2小时，来免疫沉淀PI 3-激酶。通过以15,000g将凝胶珠粒化5秒钟，用冰冷的Triton X-100溶解缓冲液洗涤3次，然后用PI 3-激酶测定缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4，1mM EGTA，5mMMgCl2)洗涤4次，将蛋白质A-琼脂糖凝胶结合的PI 3-激酶离析。

在N₂下将贮存于CHC1₃的PI干燥，以330μg/ml的最终浓度再悬浮于脂质缓冲液(50mM HEPES，pH 7.2，1mM EDTA)中，并在冰上超声处理6分钟。通过将免疫沉淀的PI 3-激酶与40μl PI、10μ1ATP(1mM)和³²P-r-ATP(0.5μCi，1μCi/nmol)、10μl l0x激酶缓冲液在用H₂O调整的100μl最终测定体积中混合，产生PI([³²P]-3)P。在加入ATP之前，将TGX用PI 3-激酶预培养5分钟。用100μ11NHC1结束测定，并且用200μl氯仿：甲醇(1∶1)和500μl 2M KC1萃取PI([³²P]-3)P产物。通过薄层色谱法，用含有CHCl₃∶MeOH∶HAC∶H₂O(43∶38∶5∶7)(v∶v∶v∶v)的溶剂系将氯仿相中的PI([³²P]-3)P溶解，并用自动射线照像显示。然后从TLC盘上刮去The PI([³²P]-3)P斑点，在53℃下用1ml甲胺∶丁醇∶甲醇(42∶9∶47)(v∶v∶v)脱乙酰化4小时，用脂质闪烁计数器(LKB 1209RackBETA)测定数值。

实施例9.基于流动的重组测定

用基于流动的粘着测定来确定TGX-286对血小板粘着的影响。在红细胞重组至50％血细胞比容之前，在37℃下将洗涤的血小板用10、25、或50nM TGX-286或对照缓冲液(0.1％DMSO)预处理30分钟。把血小板和重组的红血细胞以1800s^-1的剪切速率灌注通过vWf-包衣的玻璃微载玻片1分钟。通过在1800^s-1下洗涤10分钟除去微粘着的细胞，测定粘着血小板的数目并表达为平均±SEM。TGX-286以剂量依赖的方式抑制血小板粘着的能力，当将血小板用10、25和50nMTGX-286预处理时，显示51、67和86％的血小板粘着降低。

实施例10.富含血小板的血浆的CD9-抗体引起的血小板聚集

在富含血小板的血浆(PRP)中确定TGX286和KN327对由抗体CD9引起的血小板聚集的作用。将PRP悬浮液用20-100nM TGX286或对照缓冲液(0.1％DMSO)培养，然后用抗体可分量处理。在4通道的集合度计中对搅拌下的聚集监测10分钟。把聚集水平作为光线透射通过样本细胞中的变化测量。IC50浓度推导为PRP聚集受到50％抑制的试验化合物的浓度。

全血流动测定

由于通过洗涤的血小板形成的血栓小而且不易再生，所以用全血流动测定来确定TGX-286对血小板血栓形成的抑制作用。在以1800s^-1的剪切速率灌注通过vWf包衣的玻璃微载玻片2分钟之前，将抗凝的全血用50、100、或200nM TGX-286或对照缓冲液(0.1％DMSO)培养30分钟并附以轻轻摇晃。通过在1800s^-1下洗涤10分钟除去未粘着的血小板，然后用1％草酸铵将粘着的红血球溶解。通过用分光光度测定法测量整体细胞溶解物的血小板LDH(U/L)水平，直接测量血栓形成水平。全血灌注2分钟后，在微载玻片的表面上观察到富含血小板的血栓。用TGX-286预处理以剂量依赖的方式在vWf区域抑制血小板血栓形成的能力。相对于对照，用50、100和200nM TGX-286预处理全血，导致血栓形成降低25、53和80％

实施例11.颈内动脉闭塞的动物模型

在适当建立的Folts等人，1982，Circulation 65：248-255的动脉血栓动物模型中，确定TGX-286的抑制作用。这种模型用于研究体内抗凝血药物对响应压碎损伤继之以动脉狭窄的凝固时间的影响。

把麻醉的大鼠的颈动脉解剖出来，将电磁流动探针围绕动脉置放以测量血流。紧靠流动探针，将动脉用包裹以硅胶管的手术钳夹住以对血管壁引起中度损害。将结扎线或适当内径的塑料筒围绕动脉束紧以产生动脉直径的70％减少。

血小板在狭窄的损伤的动脉血管区域聚集，逐渐形成闭塞性血小板血栓，视作血流方面的减少。当血栓形成时，血压升高，在靠近狭窄部位引起血栓破裂和栓塞发生。如果血栓没有自然发生栓塞，将狭窄区域轻轻摇动以使血栓移动。这引起血流的突然恢复。血小板在狭窄区域再次聚集并损害动脉血管，重复血栓-栓塞形成模式。这种剧烈的以血小板为媒介的血栓形成继之以栓塞发生，在血流中造成循环流动减少(CFR)。一旦大鼠产生经常性的CFR，经由颈静脉给药抗血栓形成化合物或载体对照。

以2.5mg/kg和4mg/kg的剂量经由静脉给药TGX-286或KN327，并记录血流稳定性。以14.0mg/kg给药的TGX-286和KN327在10分钟内使80％的治疗动物恢复基线，表示该化合物在治疗冠状动脉闭塞方面有效。

实施例12.TGX-286和KN-327对于在流动下血小板血栓形成的影响在37℃将加柠檬酸盐的全血用50、100或200nM TGX-286、KN-327或对照缓冲液(0.1％DMSO)预处理10分钟。以600s^-1将血液灌注通过von Willebrand因子-(vWf)包被的微毛细管2分钟。通过以600s-1灌注缓冲液2分钟除去未粘着的细胞，通过用1％草酸铵处理将任何粘着的红血球溶解。然后通过加入1％Triton X-100将粘着的血小板溶解，并用分光光度测定法分析乳酸脱氢酶(LDH)水平(U/L)。与对照相比，用50、100、200nM TGX-286预处理全血导致血栓形成的降低。

实施例13.同种型选择性的体外PI3K酶测定

进行体外酶测定作为确定药物的选择同种型的亲合性和特异性的primary screen。用得自Santa Cruz Biotechnology的能够识别p100α(sc-7174)和β(sc-603)同种型的抗体，将PI3K的α和β同种型从血小板溶胞产物中免疫沉淀出来。在Kinacia实验室γ同种型是作为重组体蛋白质制得的。以类似的方法，用δ特异抗体(sc-7176)从THP-1细胞中免疫沉淀出δ同种型。在有或没有抑制剂的情况下，用使用磷脂酰肌醇和³²p的标准磷酸化作用分析，测量酶在免疫沉淀中的活性。在抑制剂浓度的一定范围中确定酶的活性来确定IC₅₀值。

PI3激酶抑制剂LY294002(8-苯基-2-(4-吗啉基)-4H苯并吡喃-4-酮、Sigma &num；L9908)抑制PI3K的各种同种型的IC₅₀，与先前报道的值(0.5-1.5pM相同。

实施例14.嗜中性白细胞ROS响应

由人血液制备白血球

把3ml无防腐剂的全血放入50ml锥管中。在25℃下加入48ml红血球溶解液并在血液学nutator上逆向轻轻混合10分钟，随后在桌面离心机中25℃下以350xg离心分离10分钟。把富含白血球的丸再悬浮于补充以10％w/v凝胶(PBS-凝胶)的磷酸盐缓冲的生理盐水中，并如上面所述进行分离。将白血球丸用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤一次，以2×10⁶/ml的最终细胞数再悬浮并立即使用。

测量得自嗜中性白细胞的ROS产生

反应性氧类(ROS)的产生是嗜中性白细胞活性的标志。若干趋化因子和细胞因子通过嗜中性白细胞促进ROS的产生。测量用趋化肽刺激后的PI3K抑制剂TGX-286对ROS产生的作用。经由荧光激活细胞分选术(FACS)，通过修改Robinson等人，(pp 9.7.5-9.7.9，Curr.Protocols in Cytometry(1997))的方法，监测细胞内二氢罗丹明123(DHR)的氧化，来测量ROS的产生。将白血球悬浮液松散负载以2μl 50mM DHR/ml细胞(最终是50mM)，并在37℃下培养12分钟。将500℃可分量的DHR负载的细胞用5μl100uM fmlp作用液在37℃下刺激20分钟，并随后在冰上猝灭。使用用于DHR散发的520±20nm通带将流式细胞仪设定为激发波长为488nm。使用未刺激的对照样本来鉴别和门控嗜中性白细胞种群并经由抗-CD14免疫染色校正。用这些门控对照白血球校正荧光基线数据。分析刺激细胞样本，并且对每一样本的5000门控白血球监测绿色荧光(DHR)。为了测量ROS的相对值，将由对照样本获得的值从总数值中减去，并归一化至由单独的fmlp样本(无抑制剂)获得的值。

实施例15.嗜中性白细胞弹性蛋白酶释放

由人血液制备嗜中性白细胞

将等份试样(24ml)的得自健康志愿者的肝素化血液铺在Histopaque-119和Histopaque-1077

(Sigma)的12ml垫上，然后在25℃以700×g离心分离30分钟。收集Histopaque-119垫正上面的富含嗜中性白细胞的条带并用HBSS洗涤。用0.2％NaCl通过低渗溶胞作用除去残余红血球。将嗜中性白细胞标本用HBSS洗涤两次并立即使用。

嗜中性白细胞弹性蛋白酶胞吐作用的测定

激活的嗜中性白细胞通过释放一定的蛋白酶对一系列刺激物作出反应而，而这种蛋白酶在发炎过程中是造成组织和胞外基质破坏的主要原因。作为蛋白酶释放的指示，测量TGX-286对嗜中性弹性蛋白酶胞吐作用。通过修改Ciesla等人，(The Journal of Trauma，48(3)：388-395(2000))的方法，对弹性蛋白酶胞吐作用予以量化，如下所述。通过裂解特异弹性蛋白酶基质AAPV-pNA来测量嗜中性白细胞弹性蛋白酶的释放。将分离的嗜中性白细胞(6.25×10⁵细胞)在37℃下预培养5分钟，然后用0.11M fmlp刺激20分钟。随后将细胞悬浮液以400×g离心作用5分钟，然后抽出所得上清液并保留之。

通过向96孔微板上的、含有0.33mM特异弹性蛋白酶生色底物AAPV-pNA在33.3mM羟基亚乙基哌嗪乙磺酸盐和0.17mM NaCl中的混合物的单个孔中加入100μl没有细胞的上清液，测定弹性蛋白酶的释放。空孔也含有弹性蛋白酶抑制剂AAPV-CK(0.17mM)。总反应体积为150μL，每个试验用单独的AAPV-CK空白以一式两份进行。将96孔平板在37℃下培养60分钟，并测量在405nm的吸光度。为了测量弹性蛋白酶的相对释放率，将得自对照样本的数值从总值中减去，并归一化至由单独的fmlp样本(无抑制剂)获得的数值。

实施例16.细胞增殖测定

测定TGX-286对U937(单核)细胞系的抗增殖活性。持续4天通过计算细胞数目监测化合物的细胞毒性，并用代谢活动的比色测定来测定细胞的生存能力。

试验化合物在每一生物活性中的抑制剂浓度(nM)列于下面表II。

表II

表III

	P110α同种型	P110β同种型	血小板聚集对CD9抗体	血栓形成抑制	从嗜中性白细胞中的ROS释放	抗增殖活性对U937细胞
	P110α同种型	P110β同种型	血小板聚集对CD9抗体	血栓形成抑制	从嗜中性白细胞中的ROS释放	抗增殖活性对U937细胞	方法	实施例13	实施例13	实施例10	实施例12	实施例14	实施例16
#	IC50/(nM)	IC50/(nM)	IC50/(nM)	IC50/(nM)	IC50/(nM)	IC50/(nM)	方法	实施例13	实施例13	实施例10	实施例12	实施例14	实施例16
#	IC50/(nM)	IC50/(nM)	IC50/(nM)	IC50/(nM)	IC50/(nM)	IC50/(nM)	TGX-286	5000	2	100	500	5	5
KN-327			200	250	78	20	TGX-286	5000	2	100	500	5	5

制剂实施例

实施例1.含有吡啶取代的化合物的药物组合物的制备和给药

本发明某些优选的药物制剂描述如下。

用于口服给药的片剂：

用于口服给药的片剂的组分列于下面表IV中。片剂A、B和C是这样制得的：将表IV中列出的前6种组分与聚乙烯吡咯烷酮一起进行湿式制粒，然后加入硬脂酸镁，随后压片。

用于舌下给药的片剂：

用于舌下给药的两种片剂的组分列在下面表V中。片剂A和B是这样制得的：将表V中列出的前6种组分与聚乙烯吡咯烷酮一起进行湿式制粒，然后加入硬脂酸镁，随后压片。

用于颊给药的片剂：

用于颊给药的片剂是这样制得的：将下面表VI中列出的组分混合，然后将混合的组分直接压片。

粉末填充的胶囊剂：

两种粉末填充的胶囊剂的组分列在下面表VII中。胶囊A和B是这样制得的：将组分混合，用所得混合物填充两半式硬明胶胶囊。

液体填充的胶囊剂：

两种液体填充的胶囊剂的组分列在下面表VIII中。胶囊A是这样制得的：将Macrogol 4000BP熔化，把活性组分分散在该熔化物中，用其填充两半式硬明胶胶囊。胶囊B是这样制得的：将活性组分分散在卵磷脂和花生油中，用所得分散液填充软的弹性明胶胶囊。

控释胶囊剂：

用于控释的胶囊剂是这样制得的：将下面表IX中列出的前4种组分混合和挤出，将所得挤出物球化和干燥。将干燥的小丸用作为控释膜的乙基纤维素包衣，将所得小丸填充到两半式硬明胶胶囊中。

静脉内给药用制剂：

含有下面表X中列出的组分的静脉内给药用制剂是这样制得的：将活性组分置于柠檬酸盐缓冲液中，然后用盐酸将该溶液的pH调节至pH7。将所得溶液补足至所要的体积，然后经由微孔滤器过滤到密封的无菌玻璃瓶中，填充后再次密封。

鼻内给药用制剂：

含有下面表XI中列出的组分的鼻内给药用制剂是这样制得的：将活性组分置于羟基苯甲酸盐的混合物中，用在柠檬酸盐缓冲液中的盐酸将所得溶液的pH调节至pH7。将所得溶液补足至所要的体积，然后经由微孔滤器过滤到密封的无菌玻璃瓶中，填充后再次密封。

肌内注射用制剂：

含有下面表XII中列出的组分的肌内注射用制剂是这样制得的：将活性组分溶解在Glycofurol中。然后加入苯甲醇并溶解，加入水至最终体积为3ml。然后将该混合物经由微孔滤器过滤到密封的无菌玻璃瓶中，填充后再次密封。

糖浆剂：

含有在下面表XIII中列出的组分的糖浆剂是这样制得的：将苯甲酸钠溶解在一部分纯化水中，然后加入山梨醇溶液。加入活性组分并溶解。然后将所得溶液与甘油混合，用纯化水补足至所要的体积。

栓剂：

含有在下面表XIV中列出的组分的栓剂是这样制得的：将五分之一Witepsol在蒸汽夹套的锅内于45℃的最高温度熔化。然后将活性组分经由200μm筛网过筛，使用装配有切头的Silverson混合器与熔化的基质混合，直至获得平滑的分散液。保持45℃的温度，向悬浮液中加入其余Witepsol H15，将其搅拌以保证均匀混合。然后将整个悬浮液过250μm不锈钢筛网，在持续搅拌下冷却至40℃。在38-40℃的温度下，将2.0g等份试样的混合物填充到合适的塑料模子内。让所得栓剂冷却至室温。

¹所用的活性组分是粉末，其中至少90％颗粒的直径为63μm或更低。

气雾剂：

含有在下面表XV中列出的组分的气雾剂是这样制得的：将活性化合物与乙醇混合，加入注射用水。然后将该溶液加到一部分Propellant22中，冷却至-30℃，并转移到填充装置中。然后将所需量进料到不锈钢容器中，用其余推进剂稀释。然后将阀门装配到容器上。

子宫托制剂：

子宫托制剂是通过将在下面表XVI中列出的组分直接混合而制得的。子宫托是通过将所得混合物压缩而制得的。

Claims

1.选择性PI 3-激酶β抑制剂在制备用于瓦解在高剪切状态下发生的血小板聚集以及粘着的药物中的用途。

2.选择性PI 3-激酶β抑制剂在制备用于抗血栓形成的药物中的用途，

条件是所述抑制剂不是式(II)化合物：

其中，

X和Y分别是C和O，或分别是C和NH，或都是N；

R是H、OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、芳基或(CH₂)_n-芳基；

R₁是H、OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR³)_n-芳基、NR³-C₁-C₆烷基、NR³-环烷基、NR³-(CHR³)_n-芳基、(CHR³)_n-NR³-烷基、(CHR³)_n-NR³-环烷基、(CHR³)_n-O-芳基、(CHR³)_n-O-烷基、(CHR³)_n-O-环烷基、O-(CHR³)_n-芳基、S-(CHR³)_n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1、或2，且所述烷基、环烷基或芳基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R³、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OR³、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR³、NHSO₂R³、CONHR³或SO₂NHR³；并且

R³是H、或取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基；

但是选自下列的式(II)化合物除外：

8-(4-甲基苯基)2-)4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-113)；

8-(4-氟苯氧基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-121)；

2-吗啉基-8-(苯基甲基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-90)；

2-(4-吗啉基)-8-(苯基甲基)氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-204)；

2-(4-吗啉基)-8-苯基氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-324)；

8-(3-氯苯基)氧基-2-(4-吗啉基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-259)；

8-(3-甲基苯基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-127)；

8-(2-氟苯基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-143)；

3.权利要求2的用途，其中所述选择性PI 3-激酶β抑制剂是式(I)化合物：

其中

R是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

R₂是R或S构型的C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

X是C或N，且Y是N或O。

4.权利要求2的用途，其中所述选择性PI 3-激酶β抑制剂是式(III)化合物：

(A)其中X和Y分别是C和O；

R₁是H、OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’³)_n-芳基、NR’³-C₁-C₆烷基、NR’³-环烷基、NR’³-(CHR’³)_n-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-烷基、(CHR’³)_n-NR’³-环烷基、(CHR’³)_n-O-芳基、(CHR’³)_n-O-环烷基、O-(CHR’³)_n-芳基、S-(CHR’³)_n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，(CHR’³)_m-O-烷基，其中m是1或2，并且所述环烷基或芳基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R’³、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OR’³、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’³、NHSO₂R’³、CONHR’³或SO₂NHR’³，并且所述烷基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’³、NHSO₂R’³、CONHR’³或SO₂NHR’³；

R₂和R₃独立地为H、OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’³)_n-芳基、NR’³-C₁-C₆烷基、NR’³-环烷基、NR’³-(CHR’³)_n-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-烷基、(CHR’³)_n-NR’³-环烷基、(CHR’³)_n-O-芳基、(CHR’³)_n-O-烷基、(CHR’³)_n-O-环烷基、O-(CHR’³)_n-芳基、S-(CHR’³)_n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，且所述烷基、环烷基或芳基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R’³、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OR’³、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’³、NHSO₂R’³、CONHR’³或SO₂NHR’³；并且

R，³是H、或取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基，或者

(B)其中X和Y分别是C和NH；

R’³是H、或取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基，或者。

5.具有式(III)的化合物：

(A)其中X和Y分别是C和O；

R₁是OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’³)_n-芳基、NR’³-C₁-C₆烷基、NR’³-环烷基、NR’³-(CHR’³)_n-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-烷基、(CHR’³)_n-NR’³-环烷基、(CHR’³)_n-O-芳基、(CHR’³)_n-O-环烷基、O-(CHR’³)_n-芳基、S-(CHR’³)_n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，(CHR’³)_m-O-烷基，其中m是1或2，并且所述环烷基或芳基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R’³、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OR’³、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’³、NHSO₂R’³、CONHR’³或SO₂NHR’³，并且所述烷基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’³、NHSO₂R’³、CONHR’³或SO₂NHR’³；

R’³是H、或取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的芳基，或者

(B)其中X和Y分别是C和NH；

R₁是OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’³)_n-芳基、NR’³-C₁-C₆烷基、NR’³-环烷基、NR’³-(CHR’³)_n-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-芳基、(CHR’³)_n-NR’³-烷基、(CHR’³)_n-NR’³-环烷基、(CHR’³)_n-O-芳基、(CHR’³)_n-O-烷基、(CHR’³)_n-O-环烷基、O-(CHR’³)_n-芳基、S-(CHR’³)_n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，且所述烷基、环烷基或芳基任选被以下基团取代：F、Cl、Br、I、CN、CO₂H、CO₂R’³、NO₂、CF₃、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、OCF₃、OR’³、OSO₂-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’³、NHSO₂R’³、CONHR’³或SO₂NHR’³；

6.权利要求2的用途，所述方法包括施用式(I)的2-吗啉代取代的衍生物，其中：

R是H、C₁-C₆支链或直链烷基或芳基；

R₂是R或S构型的C₁-C₆支链或直链烷基或芳基；

X是C或N，并且Y是N或O。

7.权利要求2的用途，其中所施用的抑制剂选自：

8.权利要求5的化合物，其中R¹选自CH₃、C₂H₅、

9.权利要求5的化合物，其中R是甲基，且R¹是

10.权利要求5的化合物在制备用于抑制磷酸肌醇3-激酶，预防或治疗心血管疾病，预防或治疗呼吸疾病，预防或治疗癌症，预防或治疗与白细胞功能障碍有关的疾病的药物中用途。

11.权利要求4的用途，其中所施用的抑制剂是6-甲基-8-[1-(苯基氨基)乙基]-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-4-酮或者是6-甲基-8-{1-[(2-氨基苯基)氨基]乙基}-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-4-酮。

12.下列化合物：(±)-7-甲基-2-吗啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸，(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苄腈，(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯，或(±)-7-甲基-2-(吗啉-4-基)-9-(1-{[2-(2H-四唑-5-基)苯基]氨基}乙基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮。

13.式(I)化合物：

其中

R是H、C₁-C₆支链或直链烷基、或芳基或(CH₂)_n-芳基；

X是C或N，且Y是N或O。

14.权利要求13的化合物在制备用于抑制磷酸肌醇3-激酶，预防或治疗心血管疾病，预防或治疗呼吸疾病，预防或治疗癌症，或预防或治疗与白细胞功能障碍有关的疾病的药物中的用途

15.权利要求14的用途，所述方法包括施用式(I)的2-吗啉代取代的衍生物，其中：

R是H、C₁-C₆支链或直链烷基或芳基；

R₂是R或S构型的C₁-C₆支链或直链烷基或芳基；

X是C或N，并且Y是N或O。

16.权利要求14的用途，其中所施用的抑制剂选自：

17.选择性PI 3-激酶抑制剂在制备用于抑制磷酸肌醇3-激酶，预防或治疗心血管疾病，预防或治疗呼吸疾病，预防或治疗癌症，或预防或治疗与白细胞功能障碍有关的疾病的药物中的用途，条件是所述抑制剂不是式(II)化合物：

其中，

X和Y分别是C和O，或分别是C和NH，或都是N；

R是H、OH、F、Cl、Br、I、C₁-C₆烷基、芳基或(CH₂)_n-芳基；

但是选自下列的式(II)化合物除外：

8-(4-甲基苯基)2-)4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-113)；

8-(4-氟苯氧基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-121)；

2-吗啉基-8-(苯基甲基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-90)；

2-(4-吗啉基)-8-(苯基甲基)氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-204)；

2-(4-吗啉基)-8-苯基氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-324)；

8-(3-氯苯基)氧基-2-(4-吗啉基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-259)；

8-(3-甲基苯基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-127)；

8-(2-氟苯基)-2-(4-吗啉基)-4(1H)-喹诺酮(TGX-143)；