CN101258834A - 一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法 - Google Patents

一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法 Download PDF

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本发明公开了一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法。(1)对单株植株进行初步筛选；(2)将初选植株的叶片进行一般性糖苷含量测定；优选出优良单株，占单株的0.1％～10％，利用高效液相色谱仪对糖苷做进一步分析；(3)初步获得几个糖苷含量较高的优良植株，以这些植株为材料进行组织培养扩繁；(4)将组培苗移植到大田种植，经高效液相色谱仪跟踪检测分析；(5)将所得的品系自交，获得纯合体植株。本方法能够获得甜叶菊糖苷产量高的植株，提高了糖苷含量，用于工业化加工，可以降低生产成本。

Description

一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法
技术领域
本发明涉及一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法。
背景技术
蔗糖等可以被正常人摄取、吸收、转化。过量的蔗糖导致糖尿病患者血糖上升，引起糖尿病并发症，甚至危及到生命安全。
目前糖尿病患者的数量呈逐年增加的趋势，另外正常人过量摄取可吸收性糖也不利于身体健康，为此具有与蔗糖口感相近，同时为非吸收性、无能量代谢的甜味剂--天然糖的开发利用就成为今后的发展方向。甜叶菊糖苷在人体内基本上以原体排出，不会分解而产生葡萄糖，是一种极低热量的甜味剂。随着人们生活水平的不断提高，越来越倾向于使用天然植物无能量甜味剂是势在必行。在世界上许可添加的几大类甜味剂中，一半来自化工合成，如：糖精、甜蜜素等；另一半来自于天然植物，如：蔗糖、罗汉果糖苷等。
在天然植物无能量甜味剂中甜度比较高的就有甜叶菊植物，其糖作为甜味剂应用也是近十几年的事，而且应用范围越来越广泛。由于其甜度高、无能量等特性而被广泛地应用于食品、保健品、药品、化妆品、抗氧化食品、饲料添加剂等行业。
甜叶菊植物中有几种甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(英文：Stevioside)和450倍的RA(英文：Rebaudioside A，或称为甜叶菊A3，英文：Stevioside A3)。获得高含量甜叶菊糖苷的品种，就可以降低工业化加工生产成本，提高收率，增加效益。
发明内容
本发明的目的就是提供一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法，即利用本发明创建一个甜叶菊糖苷高含量的种质资源品系。
本发明具体步骤为：
(1)根据“节数平均24节，叶片大、茎杆粗壮、生长迅速、适应性强”的原则对单株植株进行初步筛选；
(2)将初选植株的叶片使用直径0.5～1.5cm打孔器打孔，避开叶片的主脉打取1～10片，重量0.5±0.005克；将叶片破碎后，采用下列测定糖苷的试剂组成进行一般性测定。将200g酒石酸钾钠，10～30g氢氧化钠溶于0.8L蒸馏水中；搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸3～9g、结晶酚3～9g、亚硫酸钠3～9g，先后于溶液中溶解；最后再加入铁氰化钾0.1～0.5g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L所得到的溶液；
在上述的一般性测定数据结果中优选出优良单株，优良单株占单株的0.1％～10％，利用高效液相色谱仪对优良单株叶片中的甜叶菊糖苷做进一步分析；
(3)初步获得几个甜叶菊糖苷含量较高的优良植株，以这些植株为材料进行组织培养扩繁，甜叶菊再生体系的外植体为无菌苗的茎尖，培养基如下：
愈伤组织形成的培养基：MS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.25mg/L；
不定芽分化的培养基：MS+6-BA 1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L；
不定芽继代培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L；
不定芽生根培养基1/4MS+IBA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L；
MS：植物组织培养中常用的完全营养培养基，6-BA：6苄基嘌呤；NAA：萘乙酸；IBA：丁基嘌呤；
(4)将组培苗移植到大田种植，经高效液相色谱仪检测进一步分析；
(5)将所得的品系自交，经过遗传方法分析，获得纯合体植株。
本方法的开发原理：针对甜叶菊糖苷含量进行。分三次实施：组织培养前、组织培养后以及收获第一代种子。如下：
由于甜叶菊是异花授粉，长期以来严重退化，群体的形态、糖苷含量、生长速度等明显杂合。我们以糖苷含量6～11％的甜叶菊植物活体为材料，采用下列测定糖苷的试剂组成进行一般性含量测定。通过测定获得高糖苷含量的植株；再通过组织培养，获得群体，高效液相色谱仪检测进一步检验糖苷含量，自交获得纯合体植株，收获种子。
从该材料群体中测定植株的相同叶位做第一次单株选育，选出糖苷含量高的单株进行组织培养。将组组织培养苗移栽定植到大田后再进行定株定叶位测定糖苷含量，测定方法同前，作为第二次单株选育。再进一步选出糖苷含量高的单株进行扦插、无性繁殖；成株后进行第三次单株选育，测定方法同前。干叶总糖苷含量大于13％±2％，通过有性繁殖收获种子，这是组织培养后的第一代种子，从而得到甜叶菊新种质资源品系。该甜叶菊种质资源品系是生产高糖苷含量的原料，糖苷含量从6～11％提高到13％±2％。
本发明的方法可以应用如下：
1)在甜叶菊栽培和遗传育种中，以提高甜叶菊糖苷为目标的定向选育及其技术；
2)在罗汉果栽培和遗传育种中，以提高罗汉果糖苷为目标的定向选育及其技术；
3)在植物性药物的开发中，该方法的选育路线同样适用于某些植物药用成分的监控与开发，以及药用成分的富集。
本发明所获得的甜叶菊糖苷产量高，所培育甜叶菊糖苷高含量的种质资源品系由于提高了甜叶菊糖苷含量，因此作为工业化加工原材料，可以降低工业化加工成本，提高经济效益。
附图说明
图1为本发明中所涉及的两种主要甜叶菊糖苷(St和RA)的分子结构。
图2为本发明组织培养后选育出的高糖苷含量甜叶菊植株。
图3为本发明组织培养后选育出的高糖苷含量甜叶菊植株的叶片形态。
具体实施方式
实施例：
现有甜叶菊种植基地所使用的栽培方法有2种：①扦插育苗进行栽培；②用种子育苗进行栽培。甜叶菊为自交不育的异花授粉作物，群体的基因组成始终是杂合型，遗传性不易稳定，有利变异和有害变异同时被保留，因此我们使用选择有利变异优良单株的方法。针对我国甜叶菊栽培现状，依据“叶产量高、总苷含量高、抗性强”的育种的目标，制定了选育优良单株，繁育优良单株无性系，选配优良组合，繁育试验推广栽培的育种步骤。我们在甜叶菊不同的生长阶段，根据不同的生长性状，选取单株进行单株栽培和组织扩繁，对生长期各个阶段进行观察、记载，对叶片内含糖苷量进行测试，综合考虑的方法选出优良单株。对有希望的优良单株，扩繁后再测试，以确保选出的优良单株的可靠性。具有如下优点：
①所筛选出的品系叶内总糖苷含量较高；
②比现行种植的品系生长旺盛、秸秆粗壮、叶间距短、抗性强、叶产量高；
③根据甜叶菊既能有性繁殖，又能无性繁殖的特性，把选育的优良单株进行无性繁殖以保持其优良性状，逐一形成单株无性系，再通过单株有性系的自交收获种子。
具体实施过程如下：
①初始糖苷含量甜叶菊：以糖苷含量6～11％的甜叶菊植物群体为材料；
②取样时间：7～8月份的季节对本田内进行单株个体取材。
③确定群体：群体在本田内随机地数出2万株甜叶菊植物，挂牌做标记，作为被筛选的群体；
④确定个体：从③中选出2千株明显杂合个体，挂牌做标记，作为被筛选测定用的个体；
⑤确定叶位：在④的每个个体植株上，选取下位叶8-10的位置取叶片；
⑥测定用材料取样：使用直径为1cm的打孔器，避开叶片的主脉打取2片，重量0.5克。将叶片置于5ml的离心管中，所使用的离心管材质、重量等要一致；
⑦一般性测定：测定用专用试剂；将200g酒石酸钾钠，10g氢氧化钠溶于0.8L蒸馏水中；搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸3g、结晶酚3g、亚硫酸钠3g，先后于溶液中溶解；最后再加入铁氰化钾0.1g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L所得到的溶液。
测定专用试剂体积2ml于上述5ml的离心管中摇匀，100℃水浴加热5分钟，取出后立即放入4℃冰箱中冷却，之后各管在天平上加入蒸馏水约2ml，定重量至4.0g，加盖后混匀；
比色、计算：在540nm波长下，测定消光值；以浓度为横坐标，消光值为纵坐标作图。比较来自每个单株个体叶片的消光值所对应的浓度，进行比较；
⑧确定优良单株选育目标：按照消光值大小排序，选出前20个大的数据。因为有总数2千个单株个体，所以优良单株占个体选出率的1％，占群体选出率的0.1％，根据编号对应出优良单株个体；用高效液相色谱法进一步分析检测优良单株叶片内的糖苷含量；
⑨确定组织培养材料：甜叶菊再生体系的最佳外植体为无菌苗的茎尖，进行组织培养扩繁。取优良单株个体的茎尖做组织培养。培养基如下：
诱导愈伤组织形成的培养基：MS+BA 0.6mg/L+NAA0.25mg/L；
不定芽分化的培养基：MS+6-BA(1mg/L)+琼脂6g/L+蔗糖30g/L；
不定芽继代培养基：MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.05mg/L)琼脂6g/L+蔗糖30g/L；
不定芽生根培养基：1/4MS+IBA 0.1mg/L+NAA0.1mg/L。
组培苗培育成功后移植于大田种植，待长成大的植株后，对来自上述20个优良单株个体培育出的群体叶片进行随机取样，用高效液相色谱法进一步分析检测，在比较高级的仪器上再确定总糖苷含量。高效液相色谱法按照国家标准--甜叶菊糖苷GB 8270-1999进行。
⑩建立品系群体：通过对上述个体的无性繁殖--扦插育苗进行栽培扩繁，扩大品系群体。在通过品系自交获得种子，经过遗传方法分析，确定纯合体植株。
这样就得到了干叶总糖苷13％±2％含量的甜叶菊新种质资源品系。该甜叶菊种质资源品系是生产高糖苷含量的原料，糖苷含量从6～11％提高到13％±2％，从而降低工业化生产成本。

Claims (2)

1、一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法，其特征在于具体步骤为：
(1)对单株植株进行初步筛选；
(2)将初选植株的叶片使用直径0.5～1.5cm打孔器打孔，避开叶片的主脉打取1～10片，重量0.5±0.005克；将叶片破碎后，采用下列测定糖苷的试剂组成进行一般性测定；将200g酒石酸钾钠，10～30g氢氧化钠溶于0.8L蒸馏水中；搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸3～9g、结晶酚3～9g、亚硫酸钠3～9g，先后于溶液中溶解；最后再加入铁氰化钾0.1～0.5g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L所得到的溶液；
在上述的一般性测定数据结果中优选出优良单株，优良单株占单株的0.1％～10％，利用高效液相色谱仪对优良单株叶片中的甜叶菊糖苷做进一步分析；
(3)初步获得几个甜叶菊糖苷含量较高的优良植株，以这些植株为材料进行组织培养扩繁；
(4)将组培苗移植到大田种植，经高效液相色谱仪检测进一步分析；
(5)将所得的品系自交，经过遗传方法分析，获得纯合体植株。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)进行组织培养扩繁的培养基如下：甜叶菊再生体系的外植体为无菌苗的茎尖；愈伤组织形成的培养基：MS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.25mg/L；甜叶菊不定芽分化的培养基：MS+6-BA1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L；甜叶菊不定芽继代培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L，琼脂6g/L+蔗糖30g/L；甜叶菊不定芽生根培养基1/4MS+IBA0.1mg/L+NAA 0.1mg/L；
上述MS：植物组织培养中常用的完全营养培养基，6-BA：6苄基嘌呤；NAA：萘乙酸；IBA：丁基嘌呤。
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