CN101257936B - 神经植入物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物相容性神经植入物，其用于对例如意外事故损伤或者手术后发生的神经断裂或者缺陷部位进行搭桥。本发明的神经植入物含有由天然或人造蜘蛛丝构成的丝线，它使断裂的神经有可能越过缺陷部位再生，从而可能在短时间内产生功能性兴奋传导。

Description

神经植入物
本发明涉及一种生物相容性神经植入物，其用于对例如因意外事故损伤或手术后所发生的神经断裂或缺陷部位进行搭桥。本发明神经植入物适于使断裂的神经有可能越过缺陷部位而再生，因此可能在短时间内使功能性兴奋传导也越过经由神经植入物桥接的缺陷部位。 
现有技术
迄今曾经尝试过，神经上的断裂或者神经内的缺陷部位(此时分离的神经端部不能再互相连接)借助于辅助装置得以再生，从而使缺陷部位用自体神经段来桥接，例如来源于外周神经的神经段。 
此外还已知，外周神经损伤用置入的自体小静脉或胶原小管进行桥接来治疗。 
此外，由EP 1 523 999 A1还已知，血管内的移植物，即所谓的支架(Stents)，通过蜘蛛丝成分提供较大的机械强度。 
WO 01/56626只记叙了用蜘蛛丝作为缝合材料，而不是作为桥接神经断裂的植入物。 
WO 2005/094911，公开于本专利申请的优先权日之后，因此仅仅涉及有关现有技术的新颖性；它记叙了用于制备包括包裹物在内的植入物的连接材料，所述植入物应能用于神经再生。WO 2005/094911未提及，纯蜘蛛丝已适合使神经细胞越过缺陷部位生长，而是记叙了许多可供选择的连接材料，由其可制得形状稳定的植入物。 
US 2003/0100108A1记叙了制备在基质上的腱植入物，该腱植入物也包括丝线。这些腱植入物利用了丝线的机械特性，但没有利用其能力来使神经在缺陷部位上生长。 
DE 10053611A1记叙了一种导管，在其中轴突能生长。该导管，也称作导轨，由聚合的羟基羧酸组成，其中可安置经挤压加工制得的合成单丝。 
本发明所要解决的技术问题 
与已知的用于桥接神经缺陷部位的移植物相比，本发明的目的是提供一种自体移植物或者连接材料的替代物。本发明的一个特别的目的在于，提供一种在兴奋传导修复和断裂神经再生方面具有改善的特性的神经植入物。另一个目的是提供一种神经植入物，该神经植入物不需要或者不包括自体神经，而且特别优选，也不需要或不包括其他的自体组织。 
本发明的一个特别的目的在于，提供一种在制造药物组合物时应用的神经植入物，其可桥接神经内的缺陷部位，同时在这一应用时优选仅仅一次手术处理即足以能使神经再生以产生机能兴奋传导，而且特别优选的是，另外在缺陷部位范围内重建自然的神经组织。 
发明简述 
为解决上述发明目的，本发明提供一种神经植入物，这种神经植入物是蜘蛛丝。本发明特别提供了供制造药物组合物用的蜘蛛丝，其医学适应症是应该被桥接的神经缺陷。 
在第一种实施方式中，该神经植入物由丝线构成，优选由多根天然蜘蛛丝的丝线构成，它置于神经端部之间，这些神经端部限定了神经内缺陷部位的界限。在此情况下，将蜘蛛丝丝线这样对齐，从而使它跨越神经缺陷部位的间距，在这间距之上预期产生再生的神经组织。 
在第二种实施方式中，本发明神经植入物由置于软管状包裹物中的蜘蛛丝丝线构成。胶原小管适合用作这种接纳蜘蛛丝的包裹物，但优选为自体小静脉、异体无细胞小静脉或者免疫学相容的小静脉。 
在第三种实施方式中，本发明提供一种神经植入物，该神经植入物已包含自体神经细胞，优选施旺细胞。在该实施方式中，神经植入物具有软管状包裹物，其为根据第二种实施方式的包裹物，在其内部包括纵向放置的蜘蛛丝，但其中在包裹物和蜘蛛丝之间所留的空腔中填满生物相容性基质材料，例如Matrigel(可从Becton Dickinson购得，小鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤的提取物，该肉瘤是含有ECM蛋白质的肿瘤。主要成分是层粘连蛋白，其次为胶原IV、硫酸乙酰肝素-蛋白聚糖、触觉蛋白(entactin)和巢蛋白(nidogen))。 
在第三种实施方式的另一提高形式中，不单独使用基质材料，而采用基质材料与活体外培养的施旺细胞的混合物，优选是培养的自体施旺细胞， 或者培养的免疫相容性施旺细胞。该实施方式的缺点是，为获取培养的施旺细胞，必需事先手术取出神经组织，以及培养取出的施旺细胞。因此，于此场合下，在可以使用本发明神经植入物之前，必需事先进行外科手术来取得神经组织，例如外周神经，而且也必需有培养期，来产生必要数目的培养施旺细胞。 
在第四种实施方式中，本发明神经植入物是由线状蜘蛛丝构成的，所述蜘蛛丝围绕在载体元件周围。在此情况下，作为载体元件可以再度使用许多平行放置的线状蜘蛛丝丝段，也可使用自体的或者无细胞小静脉，以及由自体的或者无细胞小静脉的壁构成的条状元件，以及条状合成材料，例如外科缝合材料。 
本发明神经植入物的各实施方式，适合在在神经断裂或者缺陷部位进行外科置入后，于短时间内重新恢复功能性兴奋传导，并起着越过断裂或者缺陷部位而形成自然神经组织的作用。与此相应，本发明各实施方式可用来制备医学上用于治疗神经缺陷部位的材料，从而使得缺陷部位经由缺陷部位神经组织的定向生长而桥接。 
因此，越过2至4.5cm或更大的间距桥接哺乳动物运动神经中的缺陷部位，可至少部分地重新建立兴奋传导，而且在数小时至2～5日内越过神经断裂或缺陷部位，基本上，优选完全，恢复神经功能作用。在2至10日，优选3至4日的时间内，本发明神经植入物所占据的神经断裂或缺陷部位上通过产生功能性神经组织而再生神经组织，优选是相对于天然神经组织没有显示出组织学的差别。 
基于观察到本发明神经植入物至少是在一些神经或者植入物接受者中，能够越过神经缺陷而不经植入物接受者的神经细胞生长就可至少部分地使兴奋传导得以实现，现在可以认为，神经植入物中所含的蜘蛛丝在植入神经断裂或者缺陷部位后，能够至少部分地传导神经电脉冲。 
本发明神经植入物的一个特别优点在于，神经在短时间段内越过断裂或者缺陷部位而再生。作为断裂神经快速再生的结果，可以断定，神经断裂或者缺陷部位所围绕的组织没有显著的组织学可证明的退化。 
本发明神经植入物的一个特别优点是，于数日至仅数周内，用本发明的神经植入物连接的端部(这些端部限制神经断裂或缺陷部位的边界)在神经植入物范围内在组织学上具有与天然神经组织学上没有区别的组织，而且缺陷部位优选地用施旺细胞桥接。
所以，在运动神经的缺陷部位中植入本发明神经植入物之后，观察到因意外事故或者手术而分离的轴突被新长出的轴突取代，并且越过神经植入物在缺陷部位区域内发生天然神经组织的快速重建。 
本发明神经植入物的另一个优点是，以足够大的量无菌地提取对于其功能而言是必需的来自蜘蛛的线状蜘蛛丝(其优选保持在无菌条件下)，并可直接供本发明神经植入物之用。 
就本发明的目的而言，术语蜘蛛丝或者蜘蛛丝丝线优选从轮网蜘蛛(Radnetzspinne)采取的蜘蛛丝，例如从络新妇(Nephila)属蜘蛛，特别是对羽足络新妇蜘蛛(Nephila clavipes)采得的蜘蛛丝。此外，不太优选的是，就本发明的目的而言，术语蜘蛛丝包括改性蜘蛛丝，例如用物理方法经冷却及/或加热、牵伸或者辐射处理的蜘蛛丝，或者化学改性的蜘蛛丝，以及用生物技术从微生物、植物或者昆虫制造的蜘蛛丝蛋白所得到的丝线。此外，本发明的目的而言，属于术语蜘蛛丝还有从其他昆虫制得的蛋白丝，例如从蝴蝶毛虫，特别是蚕，或者蛾获得的蛋白丝。 
如有需要，按本发明应用于神经植入物中的蜘蛛丝可予以灭菌，优选用γ-射线来灭菌。 
发明详述 
为了桥接神经断裂或者缺陷部位，将本发明神经植入物放入神经中，包括运动神经，例如坐骨神经或者臂神经丛(plexus brachialis)，或者感觉神经，如视神经和听神经，以及植物神经。该神经植入物特别可用于哺乳动物，并优选可用于人类。 
为此，在外科手术中，其内含有线状蜘蛛丝的本发明神经植入物的第一端与神经断裂或者缺陷部位的第一端神经端部连接，以及将含有线状蜘蛛丝的神经植入物的第二端与对面的神经断裂或者缺陷部位的第二神经端部连接。通过将第一神经端部和神经植入物的第一端(也即其中含有线状蜘蛛丝)在空间上的紧密排列，以及将第二神经端部与神经植入物第二端(也即其中含有线状蜘蛛丝)在空间上的紧密排列，本发明神经植入物和神经端部之间(所述神经端部限定断裂或者缺陷部位的边界)得以连接。 
所述空间上的紧密排列，优选借助缝合固定，例如用已知的外科缝合材料，或者借助粘合剂，例如用已知的纤维蛋白胶粘剂。 
在本发明的第一实施方式中(在该实施例中本发明神经植入物仅由线状蜘蛛丝构成)，用外科手术的方法产生空间上的紧密排列，优选将限定神经断裂或者缺陷部位边界的各个神经端部与神经植入物的各个端部固定。在其中线状蜘蛛丝置于包裹物内、优选自体的或者无细胞小静脉内的本发明神经植入物的各实施方式中，作为直接空间排列、任选地通过将蜘蛛丝固定在神经端部而加以连接的可选择形式，也可将要互相连接的断裂的神经端部逐段地插入神经植入物包裹物的开放端、并将其固定在包裹物上(例如通过将神经端部与神经植入物包裹物的端部系住、或者缝合、或者粘贴)。 
在优选实施方式中，线状蜘蛛丝以1根，优选10至10000根，更优选100至1000根平行片段的形式包括在神经植入物中。另外则也可以使神经植入物内的线状蜘蛛丝成为另一种结构，例如扭绞、以多束线状蜘蛛丝的形式彼此放置，例如将蜘蛛丝以束的形式互相交织，或者将线状蜘蛛丝围绕载体元件周围一层或多层、同向或者反向缠绕。由此可形成相应于第四种实施方式的本发明神经植入物，或者作为对第二种或者第三种实施方式的补充而具有载体元件，以便使载体元件也置于包裹物内。同时可以用自体的或无细胞小静脉或者这种自体或非细胞的小静脉的桩状或条状的壁节段作为载体元件，或者可以用桩状或条状生物相容性材料，例如由线状蜘蛛丝或者外科缝合材料构成的生物相容性材料。 
下面参照附图来详细说明本发明，其中 
-图1示明本发明神经植入物第一种实施方式的示意图， 
-图2示明本发明神经植入物第二种实施方式的示意图， 
-图3示明本发明神经植入物第三种实施方式的示意图， 
-图4示明本发明神经植入物第四种实施方式的示意图。 
图1中示出本发明神经植入物中线状蜘蛛丝的示意排列，即A)蜘蛛丝1的丝段基本平行放置，B)线状蜘蛛丝1相互绞缠的丝束，以及C)线状蜘蛛丝1的绞转的丝束。 
据信，线状蜘蛛丝对神经细胞生长，特别对施旺细胞生长起着准绳或者导轨的作用，从而神经细胞可以在其上对准并定向，以便桥接两个分开的神经端部之间的断裂或者缺陷部位。 
图2中示意显示出本发明神经植入物第二种实施方式的剖面，其中线 状蜘蛛丝1置于包裹物2内，优选基本上平行于包裹物2的纵轴线。 
图3中以第二种实施方式的深化形式，示意显示本发明神经植入物的第三种实施方式，其中线状蜘蛛丝1基本上以纵向置于包裹物2内，其中蜘蛛丝1和包裹物2的内表面之间所留间隙用生物相容性基质材料3填满，任选与自体的或者免疫学相容的培养的神经细胞(优选施旺细胞)混合。 
图4示明本发明神经植入物第四种实施方式的可行实施方式，该神经植入物具有载体元件4，以便在其周围安置线状蜘蛛丝1，例如以丝束围绕载体元件4周围缠绕，或者以多个丝束同向或反向围绕载体元件4周围缠绕。该载体元件4优选是条状物，该条状物取自自体小静脉，或者无细胞小静脉的条状物，或者获自生物相容性材料，例如外科材料。图4B中显示出，载体元件4同样可由线状蜘蛛丝1构成，或者由外科缝合材料和蜘蛛丝丝线的混合物构成。 
实施例1：蜘蛛丝的生产
作为适于用于本发明神经植入物的蜘蛛丝的实施例，将雌性对羽足络新妇蜘蛛(Nephila clavipes)用胶带固定在底座上。在机械刺激丝腺之后，可取得所分泌的由蜘蛛丝组成的丝，为试验目的，将其在净化台上环绕无菌的50mLFalcon小管进行卷曲。为此，可让Falcon小管以5至20转/分钟的转数旋转。为进行下面的试验和实施例，不经另外的处理或者灭菌就可使用如此获得的线状天然蜘蛛丝。 
实施例2：桥接坐骨神经中间距为2.5cm的缺陷部位
作为带有缺陷部位的运动神经的实施例，外科切除大鼠左后腿上的一段距离为2.5cm的坐骨神经。在相同的外科手术中，在无菌条件下，将各个动物身上的各自的缺陷分别用下列加以连接，所述蜘蛛丝按照实施例1制备： 
1)一束约250至350根近似平行排列、长度约2.8cm的蜘蛛丝丝线，或者 
2)两束各约200根蜘蛛丝、长度约3cm、将其围绕一条无细胞小静脉的带(边缘长度1mm)反向缠绕。 
在此情况下，将构成缺陷部位边界的坐骨神经的神经端部面对神经植 入物的蜘蛛丝端部放置，并下述方法任择其一以将两端相互固定： 
a)将头顶头放置的两个端部用蜘蛛丝捆扎起来， 
b)通过用外科缝合材料缝合，或者 
c)通过用纤维蛋白胶粘剂胶合。 
在此情况下，观察到大鼠从麻醉中苏醒后，左后爪不像在坐骨神经断裂时的通常所见那样不自然地保持夹紧状态，而是相反爪子采取自然张开的姿态。不需要另一次手术，在2至4日之后，术后的动物其左后腿就能没有显著妨碍地自然活动。 
通过神经植入物的组织学研究确定，在植入后5至10日，用本发明神经植入物桥接的神经断裂区域中，已形成神经组织，所形成的神经组织与天然神经组织没有显著的组织学区别。 
这种神经植入物也被用于桥接家兔听神经和视神经的缺陷部位(1、3和5mm)。植入后2至5或者10日内，可观察到兴奋传导。 
在按照2)有载体元件的神经植入物情况下，已确认，无细胞小静脉小条已完全与周围的组织相适应。 
在蜘蛛丝区域中未观察到有炎症的过程。 
实施例3：有包裹物的神经植入物
作为本发明神经植入物第二种实施方式的实施例，将按照实施例1制备约800～1000根蜘蛛丝丝线裁成长度约3.5cm，并且以基本上轴向穿入无细胞小静脉中。按本发明的目的，作为神经植入物组成部分的包裹物，也可以具有纵剖面，从而可将蜘蛛丝嵌入纵向拆开的包裹物中。接着，可以闭合包裹物的纵剖面，例如不用额外措施仅通过包裹物材料的内应力使纵剖面切口边缘靠近，或者通过缝合或者粘合纵剖面，或者通过捆扎包裹物，例如用蜘蛛丝丝线或者外科缝合材料。 
可用于本发明神经植入物的无细胞小静脉或者无细胞小静脉条状物，是由外周静脉来制造。作为对此的例子，从因其他实验目的而杀死的猪取腿静脉。所述小静脉的直径约2至3mm，长度为5cm。为进行无细胞化，将小静脉置于胰蛋白酶溶液(0.05％(重量)胰蛋白酶，0.02％(重量)EDTA)中24小时，并振动温育。接着，除去胰蛋白酶溶液，并将这时已无细胞的小静脉借助在振动下用PBS温育进行净化，这样的洗涤至少重复一次。如此 无细胞小静脉可直接使用，或者在间隔时间内在-80℃下深度冷冻。 
为了将神经植入物与限定缺陷部位边界的神经端部连接起来，将诸神经端部各插入包裹物的端部，此时对其中放置的蜘蛛丝要加以安排，以使之接触神经端部，优选头对头或者端部对端部。为了固定起见，将各神经端部缝在包裹物端部上。 
该实施方式中可供择用的神经植入物，其蜘蛛丝丝线长度突出于包裹物端部，例如在每个端部上约3～5mm。然后，将神经端部这样与神经植入物连接：使处于包裹物外面的蜘蛛丝丝线的线段各保持对着神经端部的状态，并将毗邻的端部用蜘蛛丝捆扎，或者涂以纤维蛋白胶粘剂。 
根据实施例3所述将该神经植入物应用于大鼠坐骨神经缺陷时，能够桥接约5cm的间距，因而在植入后3至5日内恢复神经的功能性。 
根据实施例3，在此也没有观察到所涉及的爪子在间隔时间内出现爪样的紧紧抓住的姿态。组织学的研究表明，在此，植入后约5至10天与天然神经组织也没有显著区别。 
实施例4：带有包裹物和生物相容性基质材料的神经植入物
作为本发明神经植入物第三实施方式的实施例，按实施例3所述具有轴向排列的蜘蛛丝的、由无细胞小静脉构成的神经植入物，借助注射器填满Matrigel。 
这一神经植入物的功能试验与实施例3相比得到了类似的结果。因此，现在可以认为，生物相容性基质材料对神经植入物特性没有带来重要改进。 
实施例5：具有包裹物和生物相容基质材料的神经植入物与培养的自体施旺细胞混合
为了制备具有包裹物的神经植入物——其中在包裹物内部以轴向对齐安置了蜘蛛丝丝线，并且包裹物所余留的内部空间填以与培养的自体施旺细胞混合的生物相容性基质材料——采用了按照实施例3制得的无细胞小静脉，其中由200至300根平行的蜘蛛丝丝线构成的丝束嵌入该小静脉。 
为了生产培养的自体施旺细胞，使用了外周神经，其为手术取出的，除去神经外膜和神经束膜，并切成约1mm大小的段。将这些神经段转移到未涂覆的培养皿内的培养基(DMEM/F12，20％胎牛血清，1％青链霉素)中， 在37℃，5％CO2下温育约3周。该介质每周更换三次新鲜培养基。如果观察到成纤维细胞繁殖生长，则将神经段移置到新的培养皿中，并继续培养。 
生长出第一批施旺细胞后，将神经段在37℃，5％CO2下用胶原酶I和分散酶温育过夜。接着，借助附设的注射器使神经段重复通过针头小心进行均质化，并在PBS(磷酸盐缓冲的生理盐水)中洗涤。进行多个洗涤步骤，其间进行离心后，将细胞悬浮液转移到聚-L-赖氨酸涂覆的培养瓶中，并在37℃、5％CO2下，于M2培养基(黑素细胞生长培养基，Promocell)中进行培养。该培养基抑制污染的成纤维细胞生长，然而施旺细胞却可接着使用。 
正如前面所述，培养后的施旺细胞借助胶原酶I和分散酶分离，并用PBS洗涤。细胞悬浮液可在其间进行冷却，或者直接使用。作为生物相容性基质材料，可将Matrigel(可从Becton Dickinson购得)与施旺细胞小心地混合，使细胞密度达到约102～104/ml基质材料。将由施旺细胞和基质材料组成的该混合物，小心地吸移到包裹物中，在包裹物中已轴向安置由蜘蛛丝构成的丝线。 
在此情况下，优选的是，所述无细胞小静脉，以及相应地类似小静脉，一直到蜘蛛丝为止，都完全填满基质材料，使之具有圆形的外围。 
如此制得的神经植入物根据实施例2用来桥接坐骨神经缺陷部位。同样于短时间内，即2至4日内，神经功能得以恢复，此时同样避免了运动神经的完全官能障碍，运动神经的完全官能障碍表现为受神经支配的四肢的痉挛和保持抓紧的爪状。 
组织学的研究表明，在神经植入物的部位基本上形成了自然的神经组织。 

Claims (4)

1.用于对神经内的断裂或缺陷部位进行搭桥的神经植入物，其特征在于，所述神经植入物是由线状蜘蛛丝形成，所述线状蜘蛛丝基本上以轴线方向上置于包裹物内或围绕载体元件周围安置，并且在其纵向上基本对齐；
其中所述包裹物为异体无细胞小静脉，而载体元件为一或多个平行放置的由无细胞小静脉的壁构成的条状元件。
2.权利要求1所述的神经植入物，其特征在于，所述神经植入物是由线状蜘蛛丝组成的。
3.权利要求中1或2所述的神经植入物，其特征在于，所述线状蜘蛛丝是天然蜘蛛丝。
4.权利要求3所述的神经植入物，其特征在于，所述天然蜘蛛丝从轮网蜘蛛取得。
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